Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58754
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 1, 1
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus
* These authors contributed equally

Summary

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

Abstract

Geçici reseptör potansiyeli kanal (TRPCs) kurallı TRP Alt familya kalsiyum homeostazı, uygun fonksiyonu korumak açısından çok önemlidir özellikle mağaza işletilen kalsiyum giriş önemli bir rol oynamaktadır nonselective katyon kanalları vardır sinaptik vezikül yayın ve hücre içi sinyal yollar. Buna göre TRPC kanalları insan hastalıkları kalp hipertrofisi gibi kardiyovasküler bozuklukları, Parkinson hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkları ve spinocerebellar ataksi gibi nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere çeşitli karıştığı olmuştur. Bu nedenle, TRPC kanalları insan hastalıkları bir potansiyel farmakolojik hedefini temsil eder. Ancak, bu kanallar perdeleme moleküler mekanizmaları hala pek açık değildir. İstikrarlı, homojen ve saf protein bol miktarda almak üzere zorluk yapı belirlenmesi çalışmaları, özellikle TRPC iyon kanalları gibi memeli membran proteinlerinin için kısıtlayıcı bir faktör olmuştur. Burada, memeli iyon kanal membran proteinlerinin değiştirilmiş baculovirus Gen aktarım sistemi ve bu proteinlerin saflaştırılması kullanarak benzeşme ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından büyük ölçekli bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Biz daha da saf protein tek-parçacık cryo-elektron mikroskobu görüntüleri toplamaya ve protein yapısı belirlemek için bu görüntüleri kullanmak için bir iletişim kuralı mevcut. Yapı belirlenmesi çoğunluğuna ve iyon kanalları işlevinde mekanizmaları anlamak için güçlü bir yöntemdir.

Introduction

Kalsiyum cascades, transkripsiyon kontrolü, nörotransmitter yayın ve hormon molekül sentezi1,2,3sinyal de dahil olmak üzere en hücresel süreçler ilişkidedir. Sitozolik ücretsiz kalsiyum homeostatik bakım sağlık ve işlevi hücre için çok önemlidir. Hücre içi kalsiyum homeostazı büyük mekanizmaları biridir kalsiyum deposu ile çalışan giriş (SOCE), kalsiyum tükenmesi içeren endoplazmik retikulum (ER) Tetikleyiciler iyon kanalları açılması kolaylaştırmak için plazma membran üzerinde bir işlem daha sonra daha fazla4,5,6sinyal kullanılabilir ER kalsiyum yenilenmesi. Kalsiyum geçirgen kanalları için TRP süper ait, geçici reseptör potansiyel kanalları (TRPCs), SOCE7,8,9 büyük bir katılımcısı olarak tespit edilmiştir.

TRPC aile yedi üyeleri arasında TRPC3, TRPC6 ve TRPC7 bir homologue alt formu, onlar yetenek lipid ikincil haberci diacylglycerol tarafından (DAG), sinyal lipid bozulması ürünün etkinleştirilmesi için benzersizdir phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 son derece düz kas ve nerede12,13neurotransmission ve neurogenesis etkisi kalsiyum sinyal içinde önemli rol oynamaktadır beyin, serebral ve serebellar bölgelerinde ifade edilir. TRPC3 işlev bozukluğu merkezi sinir sistemi bozuklukları, kalp-damar hastalıkları ve bazı kanserler gibi yumurtalık adenokarsinom14,15,16bağlanmıştır. Bu nedenle, TRPC3 bu hastalıkların tedavisi için ilaç hedef olarak söz sahibidir. Özellikle hedeflenen uyuşturucu TRPC3 üzerinde hareket gelişimi lipid bağlama siteleri17,18de dahil olmak üzere onun moleküler harekete geçirmek mekanizmaları anlayış eksikliği tarafından sınırlıdır. Bu mekanizmaları19önemli anlayışlar sağlayan insan TRPC3 kanal (hTRPC3) ve onun iki lipid bağlayıcı siteleri bir kapalı durumda ilk Çözünürlük atomik yapısını bildirdin.

Yüksek çözünürlükte bir membran protein yapısını belirleyen en önemli unsur yüksek kaliteli protein elde etmektir. İfade ve arıtma yüksek kaliteli protein elde etmek gerekli koşullar ilgili tarama zaman alıcı ve pahalı bir çaba olabilir. Burada ayrıntılı olarak nasıl ifade ve kötü davrandım bizim başlangıç tarama hTRPC3 arınma için en uygun koşulları tanımlamak açıklayan bir iletişim kuralı mevcut. Biz sağlam bir temel için bizim cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) çalışmalar yatıyordu protein davranış en iyi duruma getirme ve sorun giderme hakkında birkaç anahtar nokta mevcut. Deneyleri ve verimli baculovirus memeli hücreleri20nesil tarama için en iyi duruma getirilmiş Gouaux ve meslektaşları, tarafından geliştirilen vektör (pEG), üreten bir değiştirilmiş baculoviral kullanıyoruz. Bu ifade Yöntem hızlı ve düşük maliyetli overexpression proteinlerin memeli hücre zarı için uygundur. Biz yöntemi21prescreening kullanımı ile bir floresan-algılama boyutu-dışlama Kromatografi tabanlı bu vektör (FSEC) birleştirmek. Bu yöntem faiz yapısı için erimiş bir yeşil flüoresan protein (GFP) etiketini kullanır ve küçük, tüm hücreli çözündürüldükten örneklerinde hedef proteinin görselleştirme geliştirir. Bu farklı deterjanlar ve katkı maddeleri ile thermostabilizing mutasyonlar, protein istikrar testi ile taranması için izin verir ve küçük ölçekli geçici transfection hücrelerden az sayıda kullanımına izin verir. Bu şekilde, koşullar çok sayıda hızla bir büyük ölçekli protein saflaştırma taşımadan önce taramaya tabi. İfade, filtreleme ve arıtma biz elde etmek ve bir de novo yapısal kararlılık protein oluşturmak için cryo-EM görüntüleri işlemek için kullanılan bir iletişim kuralı mevcut. Biz burada açıklanan yaklaşımlar için TRP kanal reseptörleri ve diğer membran proteinlerinin yapısal çalışmaların genelleştirilebilir bir iletişim kuralı işlevi görecek inanıyorum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DH10α yetkili hücreleri Bacmid DNA üretmek için dönüştürme

  1. Faiz gen sentez ve bir ikiz strep etiketi, His8 etiketi ve GFP Trombin bölünme sitesiyle N terminus (pFastBacI)20içeren pEG vektör değiştirilmiş bir sürümü içine subclone.
  2. Yetkili hücreleri 5 ekleyerek dönüştürmek pFastBacI hücreleri 1,5 ml tüp ve buz üzerinde 10 min için kuluçkaya DH10α 50 μL için istenen bir gen içeren plazmid ng. Isı şok 45 için hücreleri 42 ° C'de s 4-8 h bir orbital çalkalayıcı 225 rpm'de 37 ° C'de için kuluçkaya ve katabolik önleyici (SOC) orta ile süper en iyi suyu 200 μL tüp ekleyin.
  3. Hücre bacmid LB agar tabakta (50 μg/mL sefaloridin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 100 μg/mL Bluo-gal ve 40 μg/mL izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside [IPTG], agar) 5 μL plaka.
  4. 37 ° C'de 48 h plaka kuluçkaya
    Not: hala lacZ (vektör ekleme başarısız), ifade eden Bluo-gal göstergesi lekeleri kolonileri beyaz (başarıyla dönüştürülen) koloniler seçimi için izin.
  5. Herhangi bir beyaz kolonileri mavi koloniler ile temas halinde olan ve geceleme bir orbital çalkalayıcı 225 rpm'de 37 ° C'de bacmid LB Orta (50 μg/mL sefaloridin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin) 6 mL hücrelerin büyümesine kaçınarak izole bir beyaz kolonisi seçerken dikkat.

2. bakteriyel hazırlık Bacmid DNA izolasyonu için

  1. Bacmid DNA izole etmek için spin Escherichia coli hücreler 2880 x g, 10 min için aşağı.
  2. Atma süpernatant ve resuspend 200 µL Pelet hücre resuspension eriyik--dan miniprep ( Tablo malzemelerigörmek) pipetting tarafından kit. Pelet tam ve homojen askıya alınır emin olun. Ardından, hücre süspansiyon 1,5 mL tüpler içine aktarın.
  3. Hücre lizis çözüm 200 µL miniprep kit birkaç kez tüp ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın. 5 dakikaya kadar oda sıcaklığında (RT) hücreleri parçalayıcı için kuluçkaya. Nötralizasyon çözüm 200 µL miniprep kit birkaç kez tüp ters çevirme tarafından ekleyip karıştırın lizis reaksiyonu durdurmak için.
  4. Spin aşağı 10 dk 21,130 x g Masa Üstü Santrifüj az için. 2 mL tüp içinde süpernatant ile 600 μL toplamak. 600 μL fenol: kloroform: izoamil alkol çözümü ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) ve karışımı iyice DNA hücre lizis ürünlerin geri kalanı ayıklamak için.
    Dikkat: Fenol: kloroform: izoamil alkol çözüm toksik Solunduğunda, cilt ile temasında ve yutulduğunda. Bu kimyasal yanıklara neden ve kanserojen olabilir. Eldiven ve düğmeli laboratuar önlüğünü giy. Bir duman mahallede çalışıyorum. Bu tehlikeli atıklar uygun şekilde atın.
  5. Masa Üstü Santrifüj 21130 x g , 10 min için tüp spin. İki ayrı sıvı bölüm görünür. Dikkatle 300 μL üst sulu faz için yeni bir tüp aktarın. DNA yıkamak için % 100 etanol 600 μL ekleyin. Mix tüpü yavaşça tersine çevirin.
    Not: Bu bacmid DNA yamultabilirsiniz değil girdap, yap.
  6. -20 ° C-dondurucu 10 dakika süreyle yerleştirerek serin tüpler iyi Spin aşağı 10 dk 21,130 x g Masa Üstü Santrifüj az için. Süpernatant atın ve DNA Pelet korumak.
  7. 1 mL % 70 etanol Pelet yıkamak için ekleyin. Mix tüpü yavaşça tersine çevirin. Masa Üstü Santrifüj 21,130 x g , 10 min için spin. Süpernatant atın ve Pelet yayına kadar hiçbir sıvı tüp içinde görünür ve DNA Pelet yarı saydam hale gelir yaklaşık 5 min için veya kuru izin.
  8. Kuru Pelet steril, DNaz ücretsiz 50 µL resuspend, deiyonize su. DNA toplama ölçmek.
    Not: bacmid DNA dondurma değil. 4 ° C'de için birkaç gün kadar saklayın.

3. P1 Baculovirus üretmek için Bacmid ile Sf9 böcek hücrelerinin transfection

  1. Tohum 0,9 x 106 Sf9 hücreler/iyi uygun orta 2 ml ( Tablo malzemelerigörmek) 6-iyi doku kültürü plaka her şey içinde. Plaka eki tanıtmak 20 dk 27 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    Dikkat: Potansiyel bir biohazard hücre kültürleri vardır. Aseptik teknikler kullanarak bir onaylanmış laminar akış mahallede çalışma ve önerilen koruyucu ve uygun deneyler gerçekleştirmeden önce atık bertarafı için kurumsal ve toplum kuralları kontrol edin.
  2. Ek sonra transfection reaktif 8 µL eklemek ( Tablo malzemelerigörmek) plaka medya her şey 6 için 100 µL için de steril bir tüp içinde transfected. Bacmid DNA 6 μg orta ayrı steril tüp içinde 100 µL ekleyin. RT birleştirin iki çözümleri de 5 dk kuluçkaya ve RT. adlı 45 dk için kuluçkaya
  3. 6 Wells Orta 2 mL taze orta ile değiştirin. Karışım önceki adımı her şey dropwise ekleyin (iyi başına 200 µL). Yavaşça transfection çözümü Orta karıştırma sağlamak için plaka rock.
    Not: Girdap değil veya bu hücreler ayırmak neden olur çünkü plaka sallamak.
  4. Hücreler için 5 d (120 saat) 27 ° C oksijen kuluçka makinesine kuluçkaya. Bu virüs hücreleri büyük bir yüzdesi üretilen doğrulamak için hasat önce GFP floresans kontrol edin; yüzde düşükse, gerekli kuluçka süresini uzatmak (bkz. Şekil 1 c).
  5. Süpernatant içeren P1 virüs (yaklaşık her kuyudan 2 mL) toplamak. 3 mL şırınga ve küçük 0.2 µm filtresi kullanarak 2 mL tüpler içine P1 virüs içeren orta filtre. Steril fetal Sığır serum (FBS) % 1'i son bir konsantrasyon için ekleyin.
    Not: Bu stok P1 şunun 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve ışıktan korunmalıdır.

4. enfeksiyon P1 P2 Baculovirus üretmek için Baculovirus ile Sf9 böcek hücrelerinin

  1. 200 mL (veya istediğiniz birimi) Sf9 hücre, bir konsantrasyon 0,8 - 0,9 x 106 hücre/mL uygun ortamda hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) bir düz dipli Erlenmeyer kültür şişesi, yeterli boyuta içinde.
    Not: süspansiyon kültürü için kullanılan birim şişeye toplam kapasitesi % 40'ını geçmemelidir.
  2. 1: 2500 oranı (v/v) P1 virüs stokunun 3.5 Sf9 hücre süspansiyon kültürü için ekleyin. Orbital çalkalayıcı 115 rpm'de 27 ° C'de en iyi virüs ifade (genellikle bağlı olarak protein yapı 48-120 h) kez kuluçkaya.
    Not: Kültür örneği içinde virüsün GFP floresans görüntüleyerek göreli virüs ifade belirlenebilir.
  3. Hücre süspansiyon 11,520 x g de 40 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant içeren P2 virüs toplamak. Tek kullanımlık 0.2 µm filtreleri kullanarak süpernatant filtre. FBS % 0.5 son bir konsantrasyon için ekleyin.
    Not: Bu stok P2 şunun 4 ° C'de muhafaza edilmelidir ve ışıktan korunmalıdır.
  4. Sf9easy hücreleri veya bir virüs karşı kullanarak P2 virüs için bir titresi elde edilir.

5. enfeksiyon P2 Baculovirus büyük ölçekli Protein ifade ile HEK293 memeli hücrelerinin

  1. Arzu hacmi 3.5 3.8 x konsantrasyon HEK293 memeli hücre süspansiyon Kültür (4-6 L donmuş ızgaralar hazırlanması için önerilir) hazırlamak 106 hücre/mL ifade orta %1 ile desteklenmiş ( Tablo malzemelerigörmek) (v / v) steril FBS şaşkın-alt Erlenmeyer kültür şişeler, yeterli boyuta içinde.
    Not: süspansiyon kültürü için kullanılan birim şişeye hacmi % 40'ını geçmemelidir.
  2. % 8'i (v/v) P2 virüs hisse senedi eriyik--dan adım 4.3 HEK293 hücre süspansiyon kültürü için ekleyin. Orbital çalkalayıcı 135 rpm'de 37 ° C'de kuluçkaya.
  3. 10 mM sodyum bütrat 12-18 h sonrası enfeksiyon ekleyin. En iyi protein ifade (genellikle 36-72 h) 30 ° C'de kez kuluçkaya
  4. Hücreleri 2.880 x gde 20 dakika centrifuging tarafından hasat. Hücrelerin içinde yaklaşık 100 mL tris arabelleğe alınmış serum fizyolojik (TBS) hücre hasat litre başına resuspending yıkayın. Tekrar 2.880 x g de 20 dk santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet toplamak.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. Hücre topakları ek donmuş sıvı azot ve-80 ° C'de arıtma kadar saklanır.
    Dikkat: Sıvı azot kriyojenik yanık veya yaralanmalara neden olabilir. Donmalara neden olabilir. Oksijen yerinden ve hızlı boğulmasına neden olabilir. Soğuk ısı yalıtım eldiven ve yüz kalkan giyin.
  5. Küçük 1 mL hasat değişen zaman noktalarda toplamak ve sallanan veya farklı deterjanlar ve/veya katkı maddeleri huzurunda karıştırma ile 4 ° c 2 h için solubilize. Bu küçük bütün hücreli solubilized örnekler ultrasantrifüj 235,000 × g 10 dk 4 ° C ve çalışma için de tarafından 30 μL örnek boyutu-dışlama Kromatografi (sn) sütun olarak açıklık (bakınız Tablo reçetesiiçin en iyi zaman belirlemek için) ifade ve en iyi solubilization koşulları.
    Not: hTRPC3 söz konusu olduğunda, bu tarama pH değerleri ile farklı arabelleklerinden 4.0-9.5 ve 50-500 mM tuz konsantrasyonları dahil; farklı iyonik besteleri (örneğin, MgCl2 veya NaCl); farklı deterjanlar kritik micelle konsantrasyonu (CMC) değerleri 0.1 - 20 mM ile; dithiothreitol gibi katkı maddeleri azaltarak tris(2-carboxyethyl) fosfamin ve β-mercaptoethanol; ve kalsiyum şelat katkı ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA).

6. dondurulmuş hücre Pelet hTRPC3 Protein Saflaştırma

  1. 500 mM NaCl, 1 mM phenylmethylsulfonyl florür (PMSF), 0.8 mikron aprotinin, 2 μg/mL leupeptin, 2 mM pepstatin A, 20 mM Tris (pH 8.0), içeren arabellekte Pelet çözülme ve % 1'digitonin, 100 mL hücreleri litre başına arabellek kullanarak hasat. Çözdürülen sonra çözüm polimerlerin pipetting veya karıştırma kontrol edin. Buz bir heyecan bar dönen dalmış bir ölçek 4 ° C'de 2 h için solubilize olanak sağlar.
  2. Ultrasantrifüj 235,000 × g 4 ° C'de 1 h için de hücre artıkları çıkarın Protein miktarı 30 μL örnek bir sn sütun üzerinde çalıştırarak doğrulayın (bkz. Tablo reçetesi) yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) tarafından ve hedef protein GFP sinyal çıkış tarafından görselleştirmek.
  3. Solubilized protein ile kobalt benzeşme reçine için 1-2 h 4 ° C'de (süpernatant) kuluçkaya Protein bağlayıcı reçine için 30 μL örnek bir sn sütun üzerinde çalıştırarak doğrulayın.
    Not: protein bağlayıcı oluştuysa, GFP tagged protein hedef sütun akış-aracılığıyla bulunamadı, muhafaza edilecektir. Bu nedenle, GFP sinyal akışı aracılığıyla HPLC üzerinde çalıştırıldığında hedef protein boyutuna karşılık gelen pozisyonda mevcut olacak.
  4. Reçine arabellek (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 15 mM imidazole ve %0,1 digitonin) 10 sütun hacimleri ile yıkayın. Protein kaybı için 30 μL örnek bir sn sütun üzerinde çalıştırarak denetlemek.
    Not: sütun protein kaybı oluştuysa, GFP tagged protein hedef sütun üzerinde geçti yıkama arabellek bulunur. Bu nedenle, GFP sinyal yıkama arabellek HPLC üzerinde çalıştırdığınızda hedef protein boyutuna karşılık gelen pozisyonda mevcut olacak. Protein kaybı oluştuysa, yıkama arabellek imidazole konsantrasyon onun etiket bağlama benzeşme sütuna engellemeden önlemek için indirdi gerekebilir.
  5. Reçine bağlı hTRPC3 arabellek (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 250 mM imidazole ve %0,1 digitonin) ile elute. 1:20 at Trombin eklemek (GFP etiketi ayırmak için) molar oranı ve 10 mM EDTA (bir hTRPC3 teskin Ajan) eluted örnek eklemek ve 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya Protein 90 μL örnek seyreltilmiş 1: 100 bir sn sütun üzerinde çalıştırıp konumundaki hedef protein boyutuna karşılık gelen bir GFP sinyal varlığını doğrulama eluted kontrol edin.
    Not: Bu noktada, elüsyon toplam protein triptofan sinyalini da görüntülenebilir. Yalnızca hedef benzeşme saf protein elüsyon ve GFP kalır ve triptofan sinyalleri olacak profilde aynı yakınındaki. Hedef protein elüsyon büyük miktarda görmedim ama akış yoluyla veya yıkama kayboldu değil, protein büyük olasılıkla sütuna bağlı kalmıştır ve imidazole daha yüksek bir konsantrasyon içinde belgili tanımlık tampon kullanarak eluted.
  6. Eluate 500 μL için konsantre veya 2.880 x g 5 dk aralıklarla 4 ° C'de de iplik tarafından ( Tablo malzemelerigörmek) tüp daha az 15 mL 100K santrifüj filtre. Protein çözüm yukarı ve aşağı spin arasında overconcentrating önlemek için pipetting tarafından resuspend.
    Not: birim istenen son hacim yaklaşırken santrifüj süre kısalabilir.
  7. Konsantre bir sn sütuna arabelleği (20 mM Tris, pH 8.0, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA ve %0,1 digitonin) yükleyin. Çalıştırın.
  8. Tepe kesirler olarak görüntülenmeyecektir UV absorbans sinyal, bozulmamış TRPC3 tetramer içeren birleştirin ve yine en az 5 mg/mL nihai bir konsantrasyon için konsantre.

7. Protein negatif-leke elektron mikroskobu tarafından taranması

  1. Parlaklık-deşarj makinede açın. Argon ve oksijen için 30 s. Çalıştır'ı kullanarak bir karbon kaplı ızgara boşaltma için program karbon kaplama bakır 400-kafes ızgaralar üzerinde hidrofilik protein çözüm eklenmesi önce yapmak için program ayarla.
  2. Steril su damlaları beş 40 μL ve iki 40 μL damla % 1 uranyl Format çözüm ayarlamak (Laboratuvar film, yağlı kâğıt veya benzer bir yüzey üzerinde Tablo malzemelerigörmek). Adım 7.1 kılavuz almak ve protein 2.5 μL örnek 5 mg/mL (50-200 mikron) karanlık yüzü ekleyin ve 1 dakika oturmak izin.
  3. 1 dakika sonra filtre kağıdı kullanarak kılavuz kuru. Filtre kağıdı doğrudan kılavuz yüzeye dokunmayın; Bunun yerine, kağıdın sıvı damlacık kenarının üzerine getirin ve kılcal filtre kağıt halinde ızgarayı sıvıdan çekmeye eyleme izin.
  4. Kılavuz ilk damla su daldırma. Filtre kağıdı ile Kuru ve kalan su damlaları ve uranyl format ilk damla ile yineleyin. Uranyl Format sit 1 dk. için ikinci damla izin ve filtre kağıdı ile kuru. Tam hava kuru (yaklaşık 1 dakika) kılavuzuna depolamadan önce izin.
    Not: Bu boyama iletişim kuralı tüm protein-deterjan birleşimler için ideal olmayabilir. Uranyl Format farklı konsantrasyonlarda leke ve yukarıdaki adımları bir leke iyi kontrasta sahip belirtmediğiniz takdirde zaman leke pozlama için farklı uzunlukları test edilmelidir.
  5. Izgaralar üzerinde bir elektron mikroskobu Image (protein parçacık kalite kontrol etmek için Malzemeler tablobkz:). Filmler genel görünüş ve dağıtım homojen çok sayıda parçacıklar göstermek emin olun, iyi kontrast görüntülemek ve öngörülen hedef protein uygun.
  6. Düşük çözünürlüklü, iki boyutlu (2D) sınıflandırmalar parçacıklar bu kontrol etmek için (bkz: veri işleme-adım 10) 50-100 filmler kullanarak tek bir tutarlı yapısı farklı görüşlerini temsil, ön oluşturur.
    Not: Filmler ve yukarıda açıklanan protokol yeterince protein arıtma için getirilmiş güçlü bir göstergesi olarak yeterli kalite ön 2D sınıfları. Hazırlık ve cryo-EM ızgaralar testi ile taranması bu noktada garanti.

8. EM numune hazırlama

  1. Parlaklık-altın delikli karbon kılavuz debi (7.1 adımda anlatıldığı gibi Malzemeler tablobakınız).
  2. Izgara üzerine konsantre hTRPC3 protein örneği (5 mg/mL) 2.5 μL uygulanır. 1,5 için kılavuz leke s bir leke kullanarak Kuvvetleri 1 ve 5 bir bekleme süresi %100 nem ve 4 ° C, s sonra içine sıvı etan vitrifikasyon makinasıyla sıvı nitrojen tarafından soğutmalı kılavuz Dalma.
    Not: Nem, sıcaklık, leke-force, leke saat ve bekleme süresi burada listelenen yazarların hTRPC3 çalışma19için kullanılmıştır. Onlar diğer proteinler ve deterjanlar için en uygun vitreus buz üretmek için değiştirilmesi gerekebilir.
  3. Cryo-EM mikroskop kullanarak en iyi buz koşulları için Izgaralar donmuş ekran ( Tablo malzemelerigörmek) ve el ile buz kalın buz (daha küçük ve daha koyu görünen kılavuz kareler) bölgelerinde ince buzun (daha büyük ve parlak görünür kılavuz kareler) görünümü ve orta .
    Not: ince buz kez daha iyi kontrast ve çözünürlük verir iken kalın buz kez daha fazla parçacıkları taşıyabilir. Kullanım el ile tarama hangi buz belirlemek görüntülerin sonuçlarında monodispersed parçacıklar iyi kontrast ve çözünürlük ile çok sayıda koşulları. Bir kez iyi koşullar doğrulanır, resim koleksiyonu için 300 kV cryo-EM mikroskop üzerinde hareket.

9. EM veri toplama

  1. Bir otomatik satın alma programı kullanarak, Süper çözünürlük sayım modu 1.074 dönüştüm piksel boyutunda görüntü yığınları kaydetmek Å bir elektron mikroskobu üzerinde 300 işletilen kV 130.000 X nominal bir büyütme ile doğrudan elektron dedektörü.
  2. Her görüntü 8 toplam çekim hızı ile 40 karelere doz fractionate s, 0,2 ile çerçeve ve 6,76 e− Å−2 s– 1 (1.0'dan yazarların deneyinde 2,5 μm kalınlığında çeşitli nominal odak değerleri) doz hızı başına s.

10. EM veri işleme

  1. Uygulamak düzeltilmesi özetlenebilir film yığınları22 hareket ve odak değerleri veri işleme yazılımı kullanarak23 tahmin (bakınız Tablo reçetesi)24.
  2. Filmler parçacıkları seç. Bu parçacıklar aldı yazılım24kullanarak bir ilk başvuru ücretsiz 2D sınıflandırma oluşturmak için kullanın. Tüm veri kümesi için otomatik parçacık malzeme çekme için şablon olarak kullanmak için seçin ideal 2D sınıf ortalamaları.
  3. El ile otomatik aldı parçacıklar kalitesini kontrol ve kötü parçacıklar kaldırın. 2D sınıflandırma birden fazla mermi kadar çekilen parçacıklar temizlemek için kullanın.
  4. Bir başlangıç modeli25oluşturur. Konu 2D parçacıklar C1 simetri ve bir ilk imar alçak geçiren filtre 60 Å a başvuru model olarak kullanarak üç boyutlu (3D) sınıflandırma (yaklaşık 5 sınıflar) için aldım. Hangi sınıfların yüksek çözünürlüklü özelliklere sahip ve parçacıklar böyle bir sınıf içinde birleştirmek belirler.
  5. C4 simetri ile (hTRPC3) durumunda uygulanan yerel arıtma kullanarak parçacıkları daha da geliştirmek ve parçacık hizalama için yüksek çözünürlüklü bir sınır Å264.5'e ayarlayın.

11. model kurma

  1. Bir model oluşturmak ( Tablo malzemeler kullanılan yazılımlar için bakınız). HTRPC3 için transmembran etki alanı (TMD) geçici reseptör potansiyel melastatin 4 (TRPM4) kullanın yapısı protein veri Bankası (PDB) 5wp6 bir rehber27olarak. Hantal artıkları ve ikincil yapı tahmini de novo bina yol göstermesi için kullanın.
  2. Konu gerçek uzay arıtma ikincil yapı bağlar28ile ilk modeli. El ile rafine modeli inceleyin ve ( Tablo malzemeleri kullanılan yazılımlar için görmek) gerektiği gibi remodify.
  3. Fourier kabuk korelasyon (FSC) eğrileri son modelinde ve rafine yapısının doğrulama için EM harita arasındaki farkı hesaplamak için geçerlidir. (Bkz: Malzemeler tablo için kullanılan yazılım) atom modelleri geometrileri değerlendirmek29,30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İfade için protokol şematik bir bakış ve hTRPC3 arınma Şekil 1Aile gösterilir. Bir resim hTRPC3 bacmid plaka ile ideal beyaz koloniler, benzer bir bacmid DNA arıtma için seçili Şekil 1Badımında gösterilir. Bulduğumuz o 48 saat açık Bluo-gal izole kolonileri varlığını koruyarak boyama için idealdir. P2 virüs olarak görüntülenmeyecektir GFP floresan tarafından hTRPC3 için en yüksek üretimi 4 d Sf9 böcek hücreleri (Şekil 1 c) enfeksiyon sonra görüldü.

P2 baulovirus yüzde 1'desteklenen medyadan hasat FBS ve bir süspansiyon HEK293 memeli hücre bulaştırmak için kullanılır. Sodyum bütrat eklendi virüslü için 12-18 h protein ifade20artırmak için virüs sonra hücreleri. Hücreleri sonra için bir ek 36 h 30 ° C'de inkübe Hücreler hasat ve çözünürlük ve istikrar tarama FSEC (Şekil 2A)21tarafından tabi. Hücreleri CMC değerleri 0.01 - deterjan konsantrasyonu yaklaşık 10 kat CMC değeri 20 mM ile yedi farklı deterjanlar kullanarak çözündürüldükten. Bütün hücre solubilization sonra hücre lizis artıkları ultrasantrifüj tarafından kaldırıldı ve çözündürüldükten protein içeren süpernatant sn sütun üzerinde yüklü ve HPLC üzerinde n-Lauryl-β-D-maltopyranoside/kolesteril hemisuccinate (demir/CHS) çalıştırın mutlak çözünürlük ve hTRPC3 bir TRPM4 denetime (Şekil 2B) göre farklı koşullar altında en yüksek birim konumu karşılaştırmak için deterjan içeren bir arabellek. DDM/CHS en sık olduğundan farklı deterjanlar çözündürüldükten örnekleri kullanılan deterjan ne zaman zar proteinleri yapıları için DDM/CHS ilk çalışan tampon olarak kullanmayı seçti. Tüm farklı deterjan çözündürüldükten TRPC3 örnekleri gösterilen en yüksek konumlarda ya 11.9 olumlu daha küçük bir molekül ağırlığı hTRPC3 tetrameric şeklinde olduğu için hangi büyük olasılıkla çok büyük olduğunu mL, insan TRPM4 kontrol (Şekil 2A ve Şekil 2B).

Yine de, hiçbir yapı bizim sonuçları karşılaştırmak için herhangi bir TRPC kanal reseptör olduğu ve büyük molekül ağırlığı TRPC3 ya da başka etmenlerin mimarisi tarafından neden çünkü, biz 25 mL kullanarak bir küçük ölçekli arıtma hTRPC3 taşıdı DDM/CHS deney boyunca DDM/CHS kullanarak hücreleri hTRPC3 en iyi çözünürlük verdi. HTRPC3 sn profil monodisperse en yüksek gösterdi ama hala, bir daha yüksek molekül ağırlıklı TRPM4 daha temsil eden en yüksek konumda yapıldı (veri gösterilmez). Protein kalite doğrulama için hızlı bir yöntem olduğundan ve çok az miktarda protein gerektirir protein sn profili tarafından negatif-leke EM, tepe kısmını kontrol ettik. Test, iki transmembran etki aynı parçacık mevcut parçacıkları tespit edildi. Bu iki hTRPC3 parçacıklar iki sitozolik etki (3D şekil) arasındaki etkileşim ile kafa kafaya bir şekilde dimerized çıktı. Biz o zaman azalan bakiyeli reaktif dithiothreitol (DTT) ikinci küçük ölçekli arıtma, arıtma arabellek hTRPC3 dimerization bozmaya umuduyla dahil. Nitekim, daha düşük moleküler ağırlığı ile ikinci bir tepe sn ayırma tarafından ortaya çıktı. Ancak, parçacıklar sağlam bir tetramer için çok küçük göründü ve membran proteinlerinin özelliği yok gibi bir transmembran etki gösterdi. DDM/CHS değil hTRPC3 hTRPC3 için en iyi çözünürlük vererek rağmen arıtma için uygun bir deterjan olduğu ortaya çıktı.

Ardından, daha hafif bir deterjan, digitonin, hTRPC3, solubilize için çalıştı ve DDM/CHS içinde çözündürüldükten protein ile karşılaştırıldığında. Burada iki farklı çalışan tampon DDM/CHS ve digitonin, sırasıyla içeren kullanılır. Deterjan çalışan arabellekte kez protein istikrarına katkıda bulunur ve membran protein deterjanlar için FSEC solubilization değiştirirken kararsız hale gelebilir verilen bu önemliydi. Protein düşük moleküler ağırlıklı DDM/CHS veya digitonin çözündürüldükten zaman yönünde bir umut verici en yüksek değişimi gösterdi digitonin içeren bir arabellek çalışır. Tarafından çözündürüldükten ve digitonin içinde çalıştırmak protein'in konumunu olumlu, insan TRPM4 göre makul bir konuma vermiştir (Şekil 3A). O zaman küçük ölçekli bir saflaştırma 25 mL hücre kullanarak gerçekleştirerek ilerledi. Her ne kadar birden çok ve geniş doruklarına protein 2B sınıflamasına göre negatif-leke EM (Şekil 3 c ve 3D şekil) bir tek tetrameric hTRPC3 kanal özellikleri gösterdi (Şekil 3B), SEC tarafından görülmektedir. Biz bu digitonin hTRPC3 arıtma için ideal bir deterjandır sonucuna.

Biz hTRPC3 ifade kadar ölçekli ve orta ölçekli arıtma digitonin hücrelerinin 400 mL kullanarak gerçekleştirilen. Böylece, biz büyük ölçüde hTRPC3 arıtma için son koşulları anladım önce israf orta ve deterjan olmadan bir kaç dondurulmuş ızgaralar için yeterli protein almak istiyordu. Genellikle membran proteinlerinin donmuş ızgaralar hazırlanması için son derece konsantre zaman istikrarsızlık göstermek olur. Saflaştırılmış ve yoğun protein sadece doğru bir yüksek molekül ağırlıklı FSEC tarafından kaymıştır, ama aynı zamanda bir EMCCD fotoğraf makinesi ile donatılmış bir elektron mikroskop kullanarak yansıma cryo-EM ızgaralar gürültülü arka plan gösterdi. Tek gözlemlemek mümkün olsa da, bozulmamış tetrameric reseptörleri, digitonin içinde saf hTRPC3 yüksek çözünürlüklü cryo-EM çalışmaları için ideal değildi.

Daha fazla protein istikrarı geliştirmek için iletişim kuralı adım 5'te tanımlanan koşullara çok sayıda tarandı. HTRPC3 fizyolojik karakteri dayalı ekran katkı maddeleri için seçti; Örn., EDTA hTRPC3 kalsiyum için geçirgen ve kalsiyum kaldırılıyor protein stabilize çünkü seçildi. Digitonin içeren arabellekte çalışan FSEC tarafından test tüm örnekleri 10 mM EDTA hTRPC3 olduğu gibi tetrameric en yüksek konumda (Şekil 4A) istikrarı üzerinde dikkat çekici bir etki gösterdi. De önemli ölçüde cryo-EM test parçacıkları sayısı arttı ve Şekil 5' te gösterildiği gibi arka planda gürültü düşmüştür.

İfade ve arıtma için ideal koşullar tespit, büyük ölçekli bir ifade (2 L) hTRPC3 gerçekleştirilen. HTRPC3 içeren hücreleri hasat ve sonra çözündürüldükten. Ultracentrifuge açıklık lysate metal-benzeşme sütun arıtma için toplu-bağlama tarafından arıtma bir yerçekimi sütundaki ardından bir Kobalt reçine ile maruz bırakıldı. Çözündürüldükten protein sütun içinde tutma ve elüsyon benzeşme saf protein sütundan FPLC (Şekil 4B) tarafından doğrulandı. Biz hTRPC3 için yıkama arabellekte 15 mM imidazole konsantrasyon bulaşıcı proteinlerin nonspesifik reçine bağlayıcı ile kaldırmak için yeterli ve 250 mM imidazole elüsyon arabellek çözündürüldükten hTRPC3 çoğunluğu elute için yeterli bulundu protein için reçine bağlı. Tüm örnekleri FSEC tarafından kontrol edildi ve eluted protein bir keskin, monodisperse tepe doğru en yüksek konuma gösterdi. GFP etiket ve hTRPC3 protein arasında esneklik protein parçacıklar hizalama sırasında görüntü işleme daha zor hale getirebilir ve Trombin bölünme sitesi GFP ve hTRPC3 arasında yer olduğundan, az miktarda test içsel saf Trombin proteaz kullanarak kez farklı bölünme, protein. Eluted protein 1:20 molar oranı 4 ° C'de 2 h sonra makul istikrar ve tam bölünme gösterdi Trombin ile inkübe olduğunu göz önüne alındığında, biz GFP aynı koşullar kullanarak tüm saf protein i ciddi ve HPLC tarafından GFP c olmuştur onaylamak için kontrol ompletely (Şekil 4 c) kaldırıldı. Protein S tarafından daha fazla saflaştırıldı ve GFP bölünme daha küçük molekül ağırlıklı (Şekil 4 d) yönünde en yüksek pozisyon değişimi tarafından görüntülenmiştir. Küçük bir unconcentrated örnek üzerinden ana tepe kesir ızgaralar negatif-leke EM için yapmak için kullanıldı. Tetrameric hTRPC3 içeren tüm kesirler sonra kombine ve 5 mg/mL cryo-EM görüntüleme için Izgaralar hazırlamak için kullanılan son bir konsantrasyon için reconcentrated. Hala yavaş yavaş o kısmı protein gözlemledim gibi daha büyük bir molekül ağırlığı doğru kaymıştır biz sadece kesirler doğru moleküler ağırlık itibariyle toplanan ve Izgaralar hemen protein arıtma sonra dondu. Biz genellikle protein saflaştırma deneylerden tek bir gün içinde donmuş ızgaralar hazırlanması için sırası tamamlandı.

2.5 μL örnek saf hTRPC3 protein (konsantrasyonu 5 mg/mL) delikli karbon kızdırma taburcu ızgara uygulandı. Vitrifiye makine bir 1,5 kullanarak kılavuz hazırlamak için kullanılan saat altında %100 nem takip tarafından bir dalma sıvı etan kurutma s soğutmalı tarafından sıvı nitrojen. Bu adım için düşsel vitreus buz içine örnek donuyor. Görüntü yakalanan edildi 130.000 X nominal büyütme, soguk elektron mikroskop 300 işletilen tarafından kV. Görüntü yığınları 1.074 dönüştüm piksel boyutunu moduyla 1.0'dan doğrudan elektron dedektörü kullanarak 2,5 μm arasında Å ve bir nominal odak değer sayma ve otomatik alım yazılım süper çözünürlüğünde kaydedildi. Her görüntü doz 8 toplam çekim hızı ile 40 karelere şeker s (0,2 s kare başına) ve 6,76 e− Å−2 s−1doz hızı. Bu veri kümesinden bir temsilcisi test Şekil 5' te gösterilen.

Hareket düzeltme ve tahmini odak değerleri Toplam film yığınları arasında gerçekleştirilen. Yaklaşık 200 elde edilen filmler el ile parçacık malzeme çekme ve ilk başvuru ücretsiz 2D sınıflandırma31için kaynak olarak kullanıldı. Dokuz temsili 2D sınıf ortalamaları ilk bu sınıflandırmada seçilmiş ve tüm veri kümesi için otomatik parçacık malzeme çekme için şablon olarak kullanılır. El ile denetim autopicked parçacıkların belli ki kötü parçacıkları kaldırmak için gerçekleştirilen sonra 2D sınıflandırma üç tur autopicked parçacıklar (Şekil 5) seçimi arıtmak için uygulandı. Bu 2D-sınıf seçili parçacıklar yüksek geçiren filtre 60 kullanarak beş 3D sınıflarına sınıflandırılmış Å bir ilk başvuru modeli olarak. Bu beş sınıfları, bir tek yüksek çözünürlüklü özellikleri (Şekil 5) görüntülenir. Bu sınıf parçacıkları daha da yüksek çözünürlüklü bir sınırı 4.5 olan yerel arıtma tabi Å ve C4 simetri uygulanan (Şekil 5)32. Rafine model el ile muayene ve remodified. Zarif yapısı, atom modelleri33geometrileri değerlendirilmesi ve hesaplama EM harita ve son model arasındaki farkı belirlemek için FSC eğrilerinin tarafından doğrulandı.

Başlangıç modeli inşaat Kılavuzu34TMD etki TRPM4 yapısı (PDB 5wp6) kullanarak gerçekleştirildi. HTRPC3 modelinin de novo bina esas olarak hantal artıkları ve birçok α sarmal yapısında büyük ölçüde kayıt atama kolaylaştırma ile ikincil yapı tahmini tarafından yönlendirildim. İlk de novoiçinde-modeli yerleşik, sipariş, uzunluğu ve ikincil yapısal özellikleri ve hantal artıkları konumunu tahmin ile yakın anlaşma bulunmaktadır. Arıtma sırasında alt sınırından son yeniden yapılanma için tahmini çözünürlük çözünürlük tarihleri. Üç boyutlu FSC iki bağımsız olarak oluşturulan 3D harita (her veri kümesi yarısını kullanarak) arasında normalleştirilmiş çapraz korelasyon katsayısı (bir fonksiyonu kayma frekansı olarak) Fourier uzayda karşılık gelen kabukları üzerinde ölçmek için kullanıldı. 4.3 yumuşak bir maske istihdam Å yeniden ve bir ek 4.3 Å kosinüs yumuşak kenar 10 Å, o zaman bir alçak geçiren filtre ile birlikte altın standart FSC 0.143 kullanılan kesme eşik. Bu son çözünürlük raporlama için kullanıldı.

Figure 1
Şekil 1: ifade ve BacMam sistemini kullanarak arıtma hTRPC3. (A)hTRPC3 ifade ve arıtma için şematik yordamı. (B) Bacmid koloni seçimi mavi-beyaz gösterge plaka üzerinde. Bir izole beyaz kolonisi (siyah ok), bir Ankastre mavi koloniye beyaz bir koloni ya da beyaz bir koloni ile temas mavi kolonisi (kırmızı oklar) seçin. (C) GFP floresans P2 baculovirus Sf9 içinde altında 20 X büyütme hücreleri. Floresans parlak ve güçlü bir virüs için hücre zarı ve/veya hücreleri çoğunluğu iç mevcut olmalıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: hTRPC3 FSEC tarafından taranması istikrar. (A)deterjan hTRPC3 eleme. HTRPC3 bütün hücre deterjanlar kritik micelle konsantrasyonu 0.01 - 20 mM ile çeşitli çözündürüldükten oldu ve DDM/CHS-içeren arabellekte çalıştırıldı. HTRPC3 en yüksek çözünürlük DDM/CHS gösterir, ancak en yüksek yanlış konumda tetrameric hTRPC3 olmak için çok büyük görünür (mavi izleme). (B) tetrameric moleküler ağırlığı yaklaşık 540 kDa, çözündürüldükten ve çalıştırmak DDM/CHS, ile TRPM4 kontrol vardı yaklaşık 12.9 mL, TRPC3, süre bir elüsyon hacmi yaklaşık 400 kDa, çözündürüldükten ve çalıştırın tetrameric moleküler ağırlığı ile DDM/CHS, elüsyon hacmi yaklaşık 11.9 mL vardı. Daha küçük bir molekül ağırlığı ile hTRPC3 bir elüsyon TRPM4, biraz daha büyük değil biraz daha küçük, demir/CHS hTRPC3 solubilization ve arıtma için ideal bir deterjan olmayabilir düşündüren biriminiz olmasını beklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: deterjan arabellek hTRPC3 FSEC tarafından taranması. Digitonin kullanarak(a)çözünürlük ve istikrar testi hTRPC3. Digitonin arabellek çalışan ve solubilization için test edildi. HTRPC3 protein demir/CHS (sarı izleme vs mavi ve kırmızı izleri) çözündürüldükten protein ile karşılaştırıldığında daha büyük bir elüsyon hacim doğru kaymıştır digitonin çözündürüldükten tepe konumunu not. Sadece digitonin hem solubilization hem de çalışan arabellekleri kullanarak birlikte hTRPC3 FSEC (sarı izleme, yıldız işareti) tarafından doğru boyutunu gösterir. Bütün hücre çözündürüldükten hTRPC3, hTRPC3 protein benzeşme digitonin DDM/CHS içinde (mavi saf protein benzeşimi ile karşılaştırıldığında daha büyük bir elüsyon hacim doğru kaymıştır (kırmızı izleme, 14 mL) saf tepe konumunu FSEC sonuçlarını (B) benzer izleme, 12 mL) sn-ayırma tarafından ölçülen. (C) negatif-leke EM cryo-EM veri toplama önce saf protein kalitesini doğrulamak için kullanıldı. İdeal bir leke olumsuz lekeli parçacıklar (kırmızı daireler) (beyaz görünen) mevcut olmalıdır ve bir deterjan halka (siyah görünen) tarafından çevrili. Temsilcisi, ideal test bu parçacıklar bol olduğu, monodispersed ve şimdiki zamanda birden fazla yönelimleri gösterilir. (D) negatif-leke EM verilerden kalite 2D sınıfları ile açık ve tutarlı genel mimari sağlamalıdır ve protein, birden çok yönleri bulunan ve maske (siyah daire) içinde ortalanmış ortalamaları ile kapsayacak. Negatif-leke EM filmler üzerinden 2D sınıfların hTRPC3 monomerleri kafa kafaya bir dimerization gibi görünen DDM/CHS mevcut parçacıklar çözündürüldükten hTRPC3. Buna ek olarak, bir kaba (ama açık ve tutarlı) genel olarak meşe palamudu gibi tetrameric yapısı 2D sınıflarda negatif-leke EM Filmler, digitonin içinde çözündürüldükten hTRPC3 dan açıkça görülür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: arıtma hTRPC3. (A)istikrar hTRPC3 EDTA huzurunda sınama. hTRPC3 digitonin içinde (kırmızı izle) olup (mavi İzle) 10 mm EDTA içinde çözündürüldükten. Eski tetramer protein pozisyon (kırmızı izleme, yıldız işareti), tek ve daha dar bir zirve gösterdi EDTA hTRPC3 onun tetrameric biçimsel stabilize gösteren. (B) GFP floresan digitonin içinde çözündürüldükten hTRPC3 için FSEC sinyal ve digitonin arabellekte çalıştırın. Tetramer tepe metal-benzeşme sütun arıtma (mavi izleme, yıldız işareti) önce solubilized malzeme olarak görülmektedir. Bu en yüksek akış yoluyla kesir yokluğu hTRPC3 protein benzeşme sütun (kırmızı izle) tam bir bağlama gösterir. İmidazole tarafından elüsyon sonra elüsyon Peak kesirler (yeşil izle) FSEC tarafından kontrol edildi. Sağlam tetramer tepe gösterilen tüm kesirler daha fazla arıtma için toplanmıştır. (C) Test Trombin kullanarak GFP dekolte, hTRPC3. Sindirim zaman az miktarda protein 4 ° C'de kullanarak test edildi ve sindirim completeness FSEC tarafından kontrol edildi. Her izlemesinde en tepe sol hTRPC3 tetramer tepe (yıldız işareti) karşılık gelir ve sağ ücretsiz GFP en yüksek tepedir. Sindirim uzunluğu arttıkça, GFP protein i ciddi olduğunu belirten GFP boşaltmak için tetrameric protein oranı azalmıştır. 2 h sindirim GFP tam bir bölünme gösterir. Arabellek 10 mM ile çalışan (D) sn profili hTRPC3 önce veya sonra digitonin içeren içinde Trombin sindirim, EDTA eklendi. Beklendiği gibi en yüksek pozisyon Trombin sindirim (kırmızı izle) sonra küçük elüsyon hacim doğru kayar. Ana tepe (yıldız işareti) tetrameric hTRPC3 temsil eder. Kırmızı çizgiler arasında kesirler cryo-EM deneyler için toplanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: şematik cryo-EM veri toplama ve işleme için hTRPC3. Saf hTRPC3 3.660 film yığınları topluluğu yapıldı bir elektron mikroskobu ile doğrudan elektron dedektörü kullanarak. Hareket düzeltme ve Manuel seçim 3,580 filmler kaynaklanan uygulandı. Parçacıklar autopicked edildi ve 2D sınıflandırma tabi. 2D sınıflar daha fazla 3D sınıflamasına göre rafine. Tek bir beş 3D sınıfları yüksek çözünürlüklü özellikleri görüntülenir. Bu sınıf 3D incelik ve sonuçlanan bir yapıya hTRPC3 için 3,3 Å çözünürlük, Frealign yerel arıtma için seçildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yapısal proteinler cryo-EM tarafından belirlenmesi önemli ölçüde hızlandırır kadar değil protein yapısı belirlenmesi yeni kameralar ve algoritmaları geliştirilmesi sayesinde son birkaç yıl içinde yapısal biyoloji alanında devrim yarattı kolayca kristal, özellikle membran proteinlerinin. Tüm cryo-EM tekniği son gelişmeler rağmen yüksek kaliteli kez Imaging kolaylaştırmak için hazırlık saf protein kalite ve miktar yeterli zaman alıcı, masraflı ve zorlu kalır. Hızlı bir şekilde ifade etme yeteneği ve arıtma koşulları, çeşitli altında birden çok gen yapıları ekran Protokolü yukarıda açıklandığı gibi geliştirir bu sürecinin etkinliğini yüksek kaliteli hızlı ve düşük maliyetli üretim izin vererek cryo-EM çalışmalarda kullanılmak saf protein.

Burada açıklanan yöntemi az maliyetle memeli membran proteinlerinin büyük miktarlarda tarafından doğrudan transfection arındırmak için bir yol sağlar ve daha stabil transfected hücre kültürünü oluşturma tarafından birçok adım vardır, daha hızlı bir şekilde her biri için optimize edilmiş olması gerekir bir yüksek kaliteli protein verim sağlar. Üretmek ve hTRPC3 arındırmak için kullanılan biyokimyasal teknikleri içinde birkaç önemli adımlar ve kontrol noktaları vardır. İlk kritik kontrol noktası bacmid DNA yapımıdır. Sonuçlar açıklandığı gibi ideal koloni ilk adım kalite virüs nesil protein ifade için seçimdir. Seçili koloni saf bacmid DNA konsantrasyonu 1 μg/μL ise, buna ek olarak, ortaya çıkan virüs sağlam protein ifade için yeterli olmayacaktır. İkinci kritik kontrol noktası P1 ve P2 baculovirus yapımıdır. Virüs titresi GFP floresans tarafından Şekil 1 c içinde gösterildiği gibi tahmin edilebilir veya Coleman vd tarafından açıklandığı gibi ölçülebilir 35. viral titresi yanı sıra enfeksiyon zaman zaman tabii enfeksiyon uygun zaman maksimal protein ifade için belirlemek her yeni bir yapı için yapılmalıdır. Kritik kontrol noktası üç çözünürlük ve Şekil 2' de gösterilen istikrar tarama olduğunu. Deterjanlar DDM gibi yüksek bir CMC ile yüksek çözünürlük sağlayabilir, ama onlar micelles bulaşıcı bir bolluk içinde sağladığından cryo-EM görüntüleme için ideal değildir. Gibi digitonin, daha hafif bir deterjan yeterli çözünürlük protein istikrar koruyarak sağlar. Katkı maddeleri, hTRPC3, söz konusu olduğunda EDTA gibi tarama sağlam ve homojen protein, muhtemelen kalsiyum için geçirgen olduğu kalsiyum hTRPC3 kaldırarak sonuçlar bir arıtma koşulu keşfetmek için önemlidir. Kritik kontrol noktası dört belirli ve verimli protein yakalama benzeşme sütun arıtma sırasında doğrulanması ve sn-ayırma (Şekil 4) sırasında bir ideal protein tepe gözlem olduğunu. Tüm hedef protein koruyarak protein parçacıklar kirletici dahil kaçınma protein cryo-EM görüntüleme için yeterince yüksek bir verim elde etmek için önemlidir. Toplu iş bağlama süresi ve reçine çözündürüldükten protein oranı İLETİMLERİNİZE protein saklama reçine sütuna göre artırabilirsiniz. SN-ayırma en yüksek genel kalitesini Deneyimlerimize göre görüntüleme, saf protein parçacıklar kalitesini önce en iyi göstergesi olduğunu. Bir düşük ya da geniş bir tepe sn-ayırma sırasında resim başına çok az protein parçacıkların olası sorunları veya bulaşıcı protein toplama/bozulma ürün, sırasıyla gösterir. Ayrıca, değişiklikleri benzeşme etiketi yapýsý kendisi için yeterli ilgi-etiket bağlama emin olmak için bazı durumlarda gerekli kanıtladı. Cryo-EM veri kümeleri koleksiyonunu önce son denetim noktası protein parçacık kalitesi ile negatif-leke EM doğrulanmasıdır. Kesinlikle gerekli olsa da, biz bu cryo-EM tarafından veri toplama zaman ve maliyet yoğun süreçte yatırım önce spot ve doğru protein kalitesi sorunları için mükemmel bir fırsat sağlar bulabilirsiniz.

Cryo-EM yapısal çalışmalar için protein üreten bir alternatif yöntem protein yerel doku kaynaktan doğrudan arıtma vardır. Bu yöntem genellikle sorunları protein verim ile karşılaştığında iken, bu hücrelerde son derece bol veya rekombinant overexpression kullanarak üretmek zor olabilir büyük bir çok protein kompleks bir parçası olarak var proteinler için mükemmel bir alternatif olduğunu Sistem36. Ancak, orta ya da düşük miktarda fizyolojik koşullar altında tek proteinlerin için burada sunulan ifade ve arıtma sistemi bir verimlidir, memeli membran proteini üretmek için nispeten düşük maliyetli ve yüksek verim yöntemi saf Cryo-EM yapısal çalışmaları için. Burada sunulan güçlü tamamlayıcı bir saf protein sulandırma lipid nanodiscs cryo-EM veri toplama37önce içine yöntemidir. Bu yöntemi'nin altında proteinler lipid bilayer, olmasına rağmen hiçbir kanıt defa yapıları deterjan içinde çözünmüş ve nanodisc olan bir yerli gibi microenvironment ile karşılaştırıldığında deterjan micelles, muhtemelen sağlayan küçük bir disk içine imbedded farklı38,39,40. Doğrudan amfipatik polimerler başarıyla membran protein yapıları41,42belirlenmesi için kullanılan stiren maleic anhidrit (SMA) gibi kullanarak protein özü başka bir yaklaşımdır.

Bu el yazması açıklanan bu yaklaşımlar içinde a değişiklik-in diğer memeli membran proteinlerinin iyon kanalları ötesinde bizim laboratuara kolayca adapte olduğu kanıtlanmıştır. Bu nedenle, bu iletişim kuralını değerli bir araç yüksek özgüllük hedeflenen uyuşturucu tasarım altında yatan yapısal ve işlevsel analizlerde olacağına inanıyoruz. Bu nörodejeneratif hastalıkları, kardiyovasküler hastalık ve kanser, hangi iyon kanalları zor ama yüksek potansiyel uyuşturucu hedeflerdir özellikle faydalı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Biz G. Zhao ve X. Meng desteği ile David Van Andel Advanced Cryo-elektron mikroskobu Suite, veri toplama için teşekkür ederiz. VARI yüksek performanslı bilgi işlem takım Hesaplamalı destek için teşekkür ederiz. Bu el yazması büyük ölçüde geliştirilmiş Yorumlar için minnettarlığımızı i. Clemente, ö. aidat, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth ve Z. Ruan ver. Biz ö Nadziejka bu el yazması için editoryal destek için teşekkür ederiz. Bu eser iç VARI tarafından desteklenen fon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent - to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

Biyokimya sayı 143 iyon kanal membran protein protein saflaştırma yapı belirlenmesi cryo-elektron mikroskobu cryo-EM baculovirus
İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun,… More

Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter