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Cancer Research

포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지

doi: 10.3791/58758 Published: December 19, 2018

Summary

우리는 4 hydroxy tamoxifen 종속 에스트로겐 수용 체 알파 ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동 포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 분석 하는 방법을 제시.

Abstract

에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. ERα 단백질의 순서는 높은 종 가운데 보존 됩니다. 그것은 인간의 기능 및 마우스 ERαs는 동일 생각 되었습니다. 우리는 쥐와 인간 ERα ligand 바인딩 도메인 (LBD) 이합체 화 활동 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 차동 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT) 효과를 보여줍니다. M2H 분석 결과 LBD homodimerization 활동의 포유류 세포, 2 개의 단백질 식 플라스 미드 (GAL4 DNA 바인딩 도메인 [DBD] 퓨전 LBD와 VP16 transactivation 도메인 [VP16AD] 퓨전 LBD)의 transfection를 활용 하 여 효율을 보여줄 수와 GAL4 응답 요소 (GAL4RE) 융합 luciferase 기자 플라스 미드. 때 GAL4DBD 퓨전 LBD와 VP16AD 퓨전 LBD는 이합체 셀에, 복잡 한이 단백질이는 GAL4RE를 한다, 다음, VP16AD 종속 전사 활동을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. 4OHT 중재 luciferase 활성화는 마우스 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 보다 인간 ERα LBD 퓨전 단백질 식 플라스 미드 transfected 세포에서와 페 된 HepG2 세포에서 높다. 이 결과 4OHT 종속 마우스 ERα LBD homodimerization 활동의 효능은 인간의 ERα LBD 보다 나왔다. Agonistic ligands LBD 활동의 기저 수준 향상과 그 LBD 이합체 화 활동의 탐지를 방해 하기 때문에 일반적으로, M2H 분석 결과의 활용, 핵 수용 체 LBD 이합체 화 활동의 평가 위해 적합 하지 않습니다. 우리는 4OHT ERα LBD 기저 활동을 강화 하지 않습니다 발견. 그것은 결정 하 고 성공적으로 M2H 분석 결과 사용 하 여 4OHT 종속 LBD 이합체 화 활동 감지 수 있는 위한 핵심 요소 이다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 선택적 에스트로겐 수용 체 변조기 (, 4OHT)의 부분적인 주 작동 근 활동 연구에 적용할 수 있습니다.

Introduction

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에스트로겐 수용 체 알파 (ERα)는 estrogenic ligand 의존 전사 레 귤 레이 터 이다. 아미노산 sequenceof ERα이 높은 종 가운데 보존 됩니다. 인간 사이의 높은 상 동 때문에 및 ERα 마우스,이 수용 체의 기능으로 동일의 생각 하 고 그 종에서 estrogenic 물질 (, tamoxifen)의 차동 활동은 종족의 차이에 의해 발생 화학 물질 대사 보다는 ERα의 구조적 차이 의해. ERα 높은 F 도메인 A를 지정 하는 핵 수용 체 (NR) superfamily 중 공통 되는 도메인 구조를 보존 했다. E 도메인 또는 ligand 바인딩 도메인 (LBD) 포함 ligand 바인딩 주머니와 transcriptional 활성화 기능 2, AF-2 라는. F 도메인 E 도메인에 인접 한 지역화 이며이 NRs 중 가장 변수 도메인. 인간 사이도 마우스 ERα, F 도메인의 homology 다른 도메인1보다 크게 낮습니다. Ligand 바인딩 ERα LBD ligand 의존 유전자 전사 (ERα의 고전 액션) 규제에 대 한 직접 특정 스 트로 겐-응답 DNA 요소를 바인딩할 ERα 단백질의 homodimerization 향상. 결정학 연구 LBD 이합체2,3바운드 나선 estradiol (e 2)-또는 4-hydroxy-타 목 시 펜 (4OHT)-12 (AF-2 핵심 도메인)의 차동 위치를 계시 했다. ERα F 도메인 (45 아미노산) 나선 12를 직접 연결 합니다. 그러나, ERα LBD 이합체 화에 나선 12에서에서 45 아미노산 (F 도메인)의이 확장의 효과 관한 어떠한 정보도가 있다. 이 연구는 포유류 2-하이브리드 (M2H) 분석 결과 사용 하 여 종의 4OHT 종속 ERα LBD homodimerization F 도메인의 기여 보여 줍니다.

M2H 분석 결과 3 개의 다른 플라스 미드 DNAs를 소개 하는 포유류 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 설명 하는 방법: GAL4 DNA 바인딩 도메인 (DBD) 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD, 표현 하는 두 단백질 식 플라스와 GAL4RE 융합 luciferase 식 기자 플라스 미드 GAL4DBD 퓨전 ERα LBD와 VP16AD 퓨전 ERα LBD의 상호 작용 (게는 이합체)는 세포에이 단백질 복잡 한에 GAL4RE 바인딩하고, 다음, VP16AD-종속 transactivation 기능을 통해 luciferase 유전자 발현을 활성화. LBD homodimerization의 수준 luciferase 활동에 의해 평가할 수 있습니다.

효 모 2 잡종 (Y2H) 분석 결과 호스트 환경으로 누 룩을 사용 하는 동일한 원리에 따라 대체 방법입니다. Y2H 시스템을 사용 하 여 이전 보고서 인간 ERα LBD F 도메인 잘립니다 F 도메인 E2 중재 전사4방지 결론 E2-종속 coactivator 모집 증가 설명 했다. 이 결과 포유류 세포5,6에 인간 ERα F 도메인 잘릴 감쇠 transcriptional 활동 증명 다른 보고서와 일치 하지 않습니다. 최근, M2H 시스템을 사용 하 여 우리의 연구는 인간 ERα LBD의 E2-종속 coactivator 모집 활동 F 도메인 잘림 포유류 세포에 의해 감소 하 고 전사 활동1와 일치 하는 설명 했다. 이러한 관측 단백질 단백질 상호 작용의 생리 적 역할 컨텍스트에 셀 형식별 방식으로 다른 것이 좋습니다. M2H 분석 transcriptional 활동을 결정 하는 데 사용 되는 동일한 세포 컨텍스트에서 단백질 단백질 상호 작용 활동을 설명할 수 있다. 이 Y2H 또는 다른 시험관에 단백질-단백질 상호 작용 분석에 비해 M2H 분석 결과의 이점을 제공 합니다.

선택적 에스트로겐 수용 체 (serm) (, 4OHT) ERα 중재 전사 조절 하의 부분적인 주 작동 근 활동의 분자 메커니즘에 대 한 질문에 남아 있다. ERα LBD 기반 M2H 분석 다양 한 포유류 세포 유형에 SERMs의 부분적인 주 작동 근 활동의 메커니즘 연구에 적용할 수 있습니다.

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Protocol

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1. 포유류 2 하이브리드 분석 결과 대 한 플라스 미드의 준비

  1. 다음 플라스 미드를 사용 하 여: pG5 뤽, pBIND-ERαEF, 그리고 협정-ERαEF.
    참고:는 플라스 미드는 요청 시 저자에서 고 필터 종이에 전송 됩니다. pG5 뤽 기자 플라스 미드 GAL4 응답 요소 luciferase 식 장치(그림 1)융합의 5 개의 반복을 포함 하는. pBIND-ERαEF ERα LBD GAL4DBD 융합 단백질의 단백질 식 플라스 미드 이다. pBIND-ERαEF Renilla luciferase 식 단위를 포함 되어 있습니다 transfection 효율 (그림 1B)를 정상화. 협정-ERαEF ERα LBD VP16AD 융합 단백질 (그림 1C)에 대 한 단백질 식 플라스 미드 이다. 표현한 단백질 구조는 플라스 미드에서의 다이어그램은 그림 2에 표시 됩니다.
  2. 플라스 미드 DNAs를 준비 합니다.
    1. 깨끗 한가 위를 사용 하 여 용지에서 플라스 미드 로드 영역을 잘라내어 1.5 mL 튜브에 넣어. 장갑을 착용 하 고 깨끗 한 핀셋을 사용 하 여 플라스 미드 로드 종이를 선택. 잘 100 µ L 트리 스-EDTA (테) 버퍼 (pH 8.0)의 소용돌이 추가 합니다.
    2. 1 µ L 추가 단계에서 플라스 미드 DNA 솔루션의 유능한 대장균 을 1.2.1 ( 재료의 표참조) 세포와 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지.
    3. 플라스 미드-추가 열-충격 유능한 세포; 30 42 ° C 물 목욕에 tube(s)를 품 어 s 그리고, 다음, 2 분 동안 얼음에 그들을 유지.
    4. 30 분 동안 37 ° C에서 흔들어와 문화와 tube(s)를 catabolite 억압 (SOC) 매체 (실내 온도)와 슈퍼 최적의 국물의 250 µ L를 추가 합니다.
    5. 하룻밤 100 µ g/mL 암 피 실린 (10 cm 직경 접시)와 문화 37 ° C에서의 prewarmed Luria 국물 (파운드) 접시에 교양된 E. 대장균 100 µ L 플레이트.
    6. 접시에서 한 식민지를 선택 하 고 100 µ g/mL 암 피 실린과 훌륭한 국물 (TB)의 2 개 mL를 포함 하는 14 mL 튜브에 추가. 매체는 희미하게 흐리게 때까지 37 ° C에서 흔들어와 문화.
    7. 100 µ g/mL 암 피 실린과 결핵의 50 mL를 포함 하는 압력가 250 mL 유리 플라스 크를 단계 1.2.6에서에서 교양된 매체의 1 mL를 추가 합니다. 20-24 h에 대 한 37 ° C에서 흔들어와 문화.
    8. 50 mL 원뿔 튜브와 스윙 양동이 터를 사용 하 여 30 분 동안 실내 온도에 3450 x g 에서 원심 분리기를 교양된 대장균 을 전송 합니다. 매체를 버리십시오. -80 ° c.에 대장균 펠 릿 저장
    9. 셀 물의 resuspension 솔루션의 3 개 mL를 추가 ( 재료의 표참조) 대장균 에 작은 그리고 그것을 완전히 중단. 세포 세포의 용 해 솔루션의 3 개 mL를 추가 (참조 테이블의 자료), 믹스 그것을 반전 하 여 부드럽게 튜브 10 배, 5 분 동안 얼음에 그것을 유지 하 고 (시간을 어기지 유지). 추가 중화 솔루션의 6 mL ( 재료의 표참조), 도청, 꾸준히 튜브 믹스와 다음, 10 분 동안 얼음에 그것을 유지.
    10. 3450 x g 30 분 스윙 양동이 터를 사용 하 여 4 ˚C에에 튜브 원심 새로운 50 mL 원뿔 튜브를 포함 하는 DNA 솔루션을 전송 및 DNA 정제 수 지의 10 mL을 추가 ( 재료의 표참조). 부드럽게 수 지를 일시 중단 합니다.
    11. 625 x g 스윙 양동이 터를 사용 하 여 1 분 동안에 튜브 원심 솔루션을 삭제 하 고 하단에 수 지를 유지.
    12. 추가 열 세척 솔루션의 15 mL (80 mM 칼륨 아세테이트, 8.5 m m Tris HCl [pH 7.5] 40 µ M EDTA, 그리고 55% 에탄올) 50 mL 원뿔 튜브 및 수 지 일시 중지를 부드럽게 흔들어. 1.2.11 단계를 반복 합니다.
      참고: 열 세척 솔루션 준비 해야 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 사용 하 여-물 또는 nuclease 무료 물 처리.
    13. 50 mL 원뿔 튜브를 열 세척 솔루션의 5 mL을 추가 하 고 5 mL를 피펫으로와 수 지를 중지. 열 수 지를 적용 하는 진공 매니폴드에 설정 ( 재료의 표참조). 수 지 건조 될 때까지 열을 진공. 열 및 진공 열 세척 솔루션의 6 mL를 추가 합니다.
    14. 일단 수 지 시각적으로 건조, 열에서 저수지를 분리 합니다. 1.5 mL 튜브에 열 (수 지)의 아랫부분을 전송. 열 수 지를 건조 하는 microcentrifuge를 사용 하 여 2 분 동안 최대 속도로 원심
    15. 새로운 1.5 mL 튜브에 열 (수 지)의 아랫부분을 전송. 열에 nuclease 무료 물 300 µ L을 추가 하 고 전체 수 지 젖 될 때까지 기다립니다.
    16. 플라스 미드 DNA를 포함 하는 솔루션 (200-250 µ L) 수집을 1 분 동안 최대 속도로 열 원심
    17. 페 놀-클로 프롬 (1:1), 클로 프롬과 다음을 포함 하는 DNA 솔루션을 다음과 같이 처리 합니다.
      1. 포함 하는 DNA 솔루션 (200-250 µ L) (1:1) 페 놀을 클로 프롬의 동일한 볼륨을 추가 하 고 잘, 흔들는 microcentrifuge를 사용 하 여 2 분 동안 최대 속도로 원심. 상위 레이어 (DNA를 포함 하는 솔루션)을 수집 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에 추가. 1 x이이 단계를 반복 합니다.
      2. 클로 프롬의 동일한 볼륨을 포함 하는 DNA 솔루션 (200-250 µ L) 추가, 쉐이크, 그리고 분리기 최대 속도에서 1 분에 대 한 상위 레이어 (DNA를 포함 하는 솔루션)을 수집 하 고 1.5 mL 튜브에 추가.
        참고: 내 (lipopolysaccharide) 일부 세포에 세포 신호 유도 합니다. 같은 못했던된 효과 방지 하려면 단계 1.2.17 권장, 내 오염 줄일 수 있습니다.
    18. 플라스 미드 같이 에탄올 강 수 기법을 사용 하 여 DNA를 침전.
      1. 1/9 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5)의 DNA 혼합물 볼륨의 추가 및 포함 하는 DNA 솔루션을 100% 에탄올의 3 M 나트륨 아세테이트 볼륨의 20 배. 예를 들어 3m 나트륨 아세테이트의 27.8 µ L 및 100% 에탄올의 278 µ L (최종 볼륨이 555.8 µ L) DNA 솔루션의 250 µ L를 추가 합니다.
      2. 적어도 20 분 동안-80 ° C에서 유지 솔루션. 4 ˚C에서 20 분 동안 최대 속도로 원심. 솔루션을 삭제 하 고 펠 릿을 유지. 75% 에탄올의 200 µ L을 추가 하 고 튜브의 내부를 헹 굴. 4 ° C에서 20 분 동안 centrifuge, 솔루션, 삭제 하 고 펠 릿을 유지. 진공 집중 장치를 사용 하 여 DNA 펠 릿 건조.
      3. 튜브를 100-250 µ L의 TE 버퍼 (pH 8.0)를 추가 합니다. DNA 펠 릿을 녹이 고 260의 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA 농도 확인 nm. 0.5 mg/mL 주위 DNA 농도 유지 합니다.

2. 포유류 2 하이브리드 분석 결과

  1. 셀을 유지 합니다.
    1. 750ml, 페 놀 레드 무료 최소 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 175 cm2 조직 배양 플라스 크에에서 인간 간세포 암 HepG2 세포 문화 (FBS; 열 비활성화), 2 m L-글루타민, m 및 1% 페니실린-스 솔루션 (항생제) 세포를 유지 하기 위한.
    2. 문화 5% CO2세포-세포는 약 90% 합칠 때까지 보충된, 37 ° C 배양 기.
      참고: estrogenic 백그라운드 작업을 줄이기 위해, 페 놀 레드-무료 매체는 모든 M2H 실험 사용 될 해야 합니다. 이 단계는 깨끗 한 벤치/생물 안전 캐비닛 안에 수행 되어야 한다. 셀 일반 포유류 세포 문화 프로토콜7다음 유지 되어야 한다.
  2. Transfection에 대 한 셀을 준비 합니다.
    참고: 다음 절차 단계 클린 벤치/생물 안전 캐비닛 안에 수행 되어야 한다. 세포가 5% CO2배양/incubated-때마다가이 단계에서 보충된, 37 ° C 배양 기.
    1. 24 잘 번호판; 90 %confluent 셀 replate 1 셀 린스 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x.
    2. 문화 플라스 크에 0.05% 트립 신-EDTA 용액의 7 mL을 추가 하 고 실 온에서 깨끗 한 벤치에 문화 플라스 크를 유지 하면서 1-2 분에 대 한 셀을 담근 다. 트립 신-EDTA 솔루션의 일부를 제거 하 고 솔루션의 1-2 mL 문화 플라스 크에서 떠나. 1-2 분 동안 인큐베이터에서 문화 플라스 크를 품 어.
    3. 세포를 분리 하 고 현미경 세포 확인을 플라스 크의 하단을 헤로인.
      참고: 셀 여전히 플라스 크에 연결 하 고, 또 다른 1 2 분 동안 품 어 고, 다음, 단계 2.2.3를 반복.
    4. 페 놀 레드 무료 MEM 10% 보충에 셀 중단 (열 비활성화) 숯 박탈 FBS, 2 m L-글루타민, m 및 1% 페니실린 스 솔루션.
      참고: 숯 박탈 FBS는 파생 하는 혈 청 내 인 성 에스트로겐의 효과 줄이기 위해 사용 되어야 한다.
    5. 셀 수를 계산 하 고 씨앗 105 셀/잘 x 1.2의 조밀도에 24-잘 접시에 셀. 각 데이터 요소 (triplicate) 3 우물을 할당 합니다.
    6. 문화는 셀 하룻밤입니다. 2.4.1 단계를 계속 합니다.
  3. Transfection에 대 한 DNA 혼합물을 준비 합니다.
    참고: 다음 플라스 미드 DNAs는 하나의 잘 페: 100 pG5 뤽 기자 플라스 미드, 50의 ng ng GAL4DBD 융합 단백질 (pBIND)에 대 한 식 플라스 미드의 그리고 50 VP16AD 융합 단백질 (협정)에 대 한 식 플라스 미드의 ng.
    1. Ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동을 분석 하려면 다음 조합 (그림 3) 준비 합니다. 조합 (i): pG5 Luc pBIND hERαEF 협정, 및 pG5 뤽 + pBIND mERαEF + + 협정. 조합 (ii): pG5 Luc pBIND hERαEF 협정-hERαEF, 및 pG5 뤽 + pBIND mERαEF + + 협정-mERαEF. 조합 (iii): pG5 Luc pBIND 협정-hERαEF, 및 pG5 뤽 + pBIND + + 협정-mERαEF.
      참고: 조합 (i) 나타냅니다 인간 ERα LBD와 마우스 ERα LBD의 기초 실험 수준을 각각. 결과 보여주는 경우 ligand와 현저 하 게 높은 수준의 혼자,이 메서드는 그 ligand (예를 들어, diethylstilbestrol [데스])와 함께 사용 가능. 조합 (ii)는 각각 dimerized 인간 ERα LBD와 dimerized 마우스 ERα LBD의 수준을 나타냅니다. 조합 (iii) 나타냅니다 부정적인 컨트롤을; 이 세트를 사용 하 여 시스템의 배경 수준 평가를 처음으로 실험을 수행 하는 경우에.
    2. 혼합, 이전 계산 총 transfection에 우물의 수에 따라 필요한 DNA 금액. Triplicates와 5 개의 데이터 요소에서 실시 하는 실험에 대 한 조합 (i) 및 (ii)에 대 한 두 개의 1.5 µ L 튜브에 다음 플라스 미드 DNAs를 혼합: 5 (데이터 요소) x 3 (우물) x 100 ng pG5 뤽 1500 = ng (15 µ L); pBIND-mERαEF, 5 (데이터 요소) 3 (우물) x 50 ng x 750 = ng (7.5 µ L); 협정 (조합) 또는 협정-mERαEF (대 한 조합 ii), 3 (우물) x 50 ng x 5 (데이터 요소) 750 = ng (7.5 µ L).
      참고: 각 플라스 미드 DNA 용액의 농도 0.1 µ g / µ L.
    3. 에탄올 강수량 기술을 사용 하 여 DNA 혼합물을 침전. 1/9 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5)의 DNA 혼합물 볼륨의 추가 및 DNA 혼합물을 100% 에탄올의 3 M 나트륨 아세테이트 볼륨의 20 배. 다음,와 동 튜브입니다.
      참고: 예를 들어 단계 2.3.2에서에서 궁 행 하는 플라스 미드 DNA 혼합물의 30 µ L를 3 M 나트륨 아세테이트, 3.4 µ L 100% 에탄올의 34 µ L 추가 합니다. 이 단계는 불변 transfection 상태를 유지 하는 데 도움이 그리고 그것은 생물 안전 캐비닛에서이 단계를 수행할 필요가 없습니다.
    4. -20 ° c.에 하룻밤 혼합물을 유지 4 ° c.에 20 분 동안 최대 속도로 원심 (펠 릿 보이지 않습니다) 솔루션을 삭제 합니다. 추가 75% 에탄올의 120 µ L 튜브; 그런 다음 튜브의 내부를 헹 구 십시오. 4 ° c.에 20 분 동안 원심 분리기 솔루션을 삭제 하 고 30 분 동안 진공 집중 장치를 사용 하 여 DNA 혼합물을 건조.
  4. transfection를 수행 합니다.
    참고: 다음 단계는 깨끗 한 벤치 또는 생물 안전 캐비닛에서 수행 되어야 합니다.
    1. 다음 아침, 린스 (2.2.6 단계)에서 24-잘 접시에 시드 셀 2 x 0.5 mL PBS (실내 온도)의.
    2. 따뜻한 (37 ℃) 신선한 페 놀 레드 무료 MEM 10% 보충 숯 박탈 FBS (열 비활성화) 및 2 m L-글루타민을 각 영역 (0.5 mL 매체/잘) 항생제 없이 추가 합니다. 5% CO2셀을 유지-보충된, 37 ° C 배양 기.
    3. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) (페 놀 레드-무료, 글루타민 없이 아무 혈 청, 13 µ L/우물)에 (단계 2.3.4)에서 말린된 플라스 미드 DNA 혼합물을 일시 중단 합니다. DMEM transfection에 우물의 수에서의 금액을 계산 합니다.
      참고: (i) x 13 µ L 조합에 대 한 15 우물 = 195 µ L, 및 (ii) x 13 µ L 조합 15 우물 195 µ L =.
    4. Transfection 시 중단 (참조 테이블의 자료; 1.5 µ L/잘) DMEM에 (12.5 µ L/잘) 또 다른 1.5 mL 튜브에. Transfection 시 약 및 DMEM transfection에 우물의 수에서의 양을 계산 합니다.
      참고: 30 [15 우물 조합] (i)과 조합 (ii) 15 우물 transfection 시 약의 1.5 µ L + DMEM의 µ L 30 x 12.5 x 420 µ L =.
    5. (2.4.3 단계)에서 각 관 (2.4.4 단계)에서 transfection 시 매체의 동일한 금액을 추가 합니다. 실 온에서 5 ~ 10 분에 대 한 튜브를 품 어.
      참고: transfection 시 매체 + 조합 (i) DNA 혼합물의 195 µ L의 200 µ L = 395 µ L, transfection 시 매체의 200 µ L + 조합 (ii) DNA 혼합물의 195 µ L = 395 µ L. 그것은 조합 (i) 및 (ii)의 관에 transfection 시 매체의 동일한 볼륨을 추가 해야 합니다. 이 단계에서 매체를 사용 하 여 필요는 없습니다.
    6. 각 (에서 단계 2.4.2) 24-잘 접시의 (25 µ L/잘) 잘 (2.4.5 단계)에서 결합 된 혼합물을 추가 하 고 5% CO2에 6 h에 대 한 셀을 품 어-보충된, 37 ° C 배양 기.
    7. 24-잘 접시에서 transfection 매체를 제거 합니다. 따뜻한 (37 ℃) 신선한 페 놀 레드 무료 MEM 10% 보충 숯 박탈 FBS (열 비활성화), 2 mM L-글루타민, 1% 페니실린 스 솔루션 및 리간드 (에탄올에 정지) 추가 (0.5 mL 매체/잘). 5% CO216-18 h에 대 한 셀 문화-보충된, 37 ° C 배양 기.
  5. 샘플을 수확.
    1. 1 mL의 PBS로 세포를 헹 구 고, 다음, 추가 수동 세포의 용 해 버퍼 x 1의 100 µ L ( 재료의 표참조).
    2. 적극적으로 세포 분리와 동 믹서와 24-잘 접시를 흔들.
    3. 고정 플레이트 (세포 lysates) 1 x 액체 질소에 의해 또는 그들을 저장 하기 전에 분석-80 ° C에서. 분석 결과, 직전 적극적으로 흔들 판 통에 실 온에서 때까지.
      참고:이 프로세스 불규칙 luciferase 활동의 비정상적인 값을 표시 하지 못하도록 합니다.
  6. 듀얼 luciferase 분석 결과 수행 합니다.
    1. 시 약 듀얼 luciferase 분석 결과 시스템에 대 한 준비 ( 재료의 표참조).
      1. 만들기 위한 luciferase 분석 결과 기판 (라스) 버퍼, 갈색 유리병에 있는 luciferase 분석 결과 기판에 모든 luciferase 분석 결과 버퍼를 추가 합니다. -20 ° c.에 라스 버퍼 저장
        참고: 라스 버퍼 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 해야 합니다.
      2. Renilla luciferase 기판 (RLS) 버퍼를 만들고, Renilla luciferase 기판 및 Renilla luciferase 버퍼 1시 50분의 비율로 섞는다. 신선한 증후군 모든 분석 결과 대 한 버퍼링 하 고 검은 튜브 또는 튜브 은박지로 음영을 사용. RLS 버퍼 만들기 신선한 버퍼의 양을 계산 합니다.
        참고: RLS 버퍼 사용 하기 전에 실내 온도를 따뜻하게 해야 합니다.
    2. Microplate 리더에는 시 약을 설정 합니다.
      1. 워시 주입 라인 70% 에탄올; 2 x 그런 다음 세척 라인 2 x 물.
        참고: 이것은 시험 결과 방해를 방지 하는 것이 중요입니다.
      2. P-인젝터는 라스 버퍼 설정 (첫 번째 주사) 라인과 M 인젝터 라인 RLS 버퍼 설정 (두 번째 주사). 이러한 버퍼를 혼합 하지 마십시오. 하지 불안 증후군 버퍼 luciferase 활동 억제.
    3. 10 µ L의 수확 (2.5.3 단계)에서 96 잘 흰색 플라스틱 접시에 적용 됩니다.
    4. Microplate 리더에 다음 설정을 적용 합니다. P-인젝터를 사용 50 µ L, 2의 지연의 볼륨 s, 그리고 50 µ L/s의 속도. M-인젝터를 사용 50 µ L, 2의 지연의 볼륨 s, 그리고 15 미 세트의 통합 시간 설정 온도 25 ° c 50 µ L/s 속도
    5. Microplate 리더를 실행 합니다.
    6. Luciferase 활동 (IPValue)의 값과 데이터 수집 프로그램을 사용 하 여 Renilla luciferase 활동 (IMValue)의 값을 기록 ( 재료의 표참조).
    7. 데이터 수집 후 주입 라인을 세척 (단계 2.6.2.1 참조).
  7. 데이터 분석을 수행 합니다.
    1. 정규화 된 값 (IPValue/IMValue)를 사용 하 여 데이터 분석을 위해.
    2. 수준의 기초 수준 및 homodimerized ERα LBD의 계산에 대 한 1 차량 (0 nM ligand) (i) [pG5 뤽 + pBIND ERαEF + 협약] 조합의 정규화 된 값을 설정 합니다. 레벨 "상대 활동"으로 표시 됩니다.

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Representative Results

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그림 3 조합 (i) 및 (ii) 플라스 미드 페 셀 조합에 가능한 응답의 구조를 표시합니다. 실험 결과 그림 4에 나와 있습니다. 조합 (i) (pG5 뤽 + pBIND mERαEF + 협정)의 활동 보여준다 자극 10 nM E2(그림 4),ERα LBD ligand 의존 transactivation 기능 도메인, AF-2을 포함 하기 때문에. 길 항 제 (예를 들어, E2)는 ERα LBD에 어-2 도메인 전사 coactivator(s)를 보충 한다. 이 이벤트 VP16AD 퓨전 LBD와의 상호 작용 없이 transcriptional 활성화 원인과 일반적인 배경 (그림 3C)으로 인해 LBD homodimerization 활동을 평가 하기 어렵습니다. 1 조합 (ii) (pG5 뤽 + pBIND mERαEF + 협정-mERαEF)의 활동 관찰 및 10 nM E2 치료(그림 4). 조합 (i)의 활성화 없이 조합 (ii)의 활동을 탐지 하기 위한 적절 한 ligand 농도 찾을 수 있습니다 경우 주 작동 근 종속 ERα LBD homodimerization 활동을 확인할 수 있을 것 이다 (예를 들어는 조건 1의 그림 4Ae 2 nM). 따라서, M2H 분석 결과 사용 하 여 중재 하는 주 작동 근 ERα LBD homodimerization 활동을 감지 하기가 어렵습니다. 다른 한편으로, (i)와 함께 4OHT의 활동은 차량 제어와 동일 (0 nM) 수준 (그림 4B). 이 결과 ERα의 AF-2 기능 4OHT에 의해 활성화 되지 않은 것이 좋습니다. 따라서, M2H 분석 결과 4OHT와 ERα LBD의 homodimerization 활동을 분석 하기 위한 실현 가능한 옵션 (그림 3B, 3E).

마우스 ERα LBD 식 플라스 미드 (pBIND-mERαEF + mERαEF 협정) 4OHT와의 조합에서 활동 인간 ERα LBD 식 플라스 미드 (pBIND-hERαEF + 협정-hERαEF)의 조합 보다 훨씬 높았다 (그림 55B). 이 결과 마우스 ERα LBD의 4OHT 종속 homodimerization 활동 인간의 ERα LBD 보다 더 강력한 임을 나타냅니다. 또한, 우리는 인간 마우스 F 도메인 바꾼 ERα LBD 식 플라스 미드, mERαEhF (마우스 인간의 F 도메인 ERα E 도메인) 및 hERαEmF (인간 ERα E 도메인 마우스 F 도메인)를 사용 하 여 4OHT 종속 LBD homodimerization 활동 분석. MERαEhF의 homodimerization 활동 mERαEF의 그것 보다 훨씬 낮은 했다. 대조적으로, hERαEmF의 homodimerization 활동 hERαEF (그림 5C) 보다 크게 높았다. 따라서, F 도메인은 종의 4OHT 종속 ERα LBD homodimerization 활동에 영향을 미치는 것 같습니다.

이 결과 SERMs, 등 4OHT 모양의 ligands의 ERα LBD 이합체 화 활동 M2H 분석 결과 의해 검출 될 수 있다는 것이 좋습니다. 다음, agonistic 화학 제품의 ERα LBD homodimerization 활동을 분석 하는 가능한 방법을 설명 합니다. 단일-아미노산-산 성-돌연변이 ERα LBD (마우스 ERα-I362D)를 사용 하는 경우 e 2와 diethylstilbestrol (DES)의 ERα LBD 이합체 화 활동 M2H 분석 결과 의해 감지할 수 있습니다. 이 돌연변이 ERα LBD8의 e 2 종속 coactivator 모집 활동을 방해. (I) (pG5 뤽 + pBIND-mERα-I362D 협정) 조합 하지 활성화에 의해 e 2도 어떤 농도에서 데 우리가 분석 (그림 6B), WT ERα LBD (그림 6A)에서 다른 했다. DES의 ERα I362D LBD 이합체 화 활동 e 2 보다 더 강력 했다 (그림 6B). 이 돌연변이 주 작동 근 종속 ERα LBD 이합체 화 활동의 비교 연구에 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 분석 하 고이 돌연변이 ERα의 생물 학적 기능 특성 더 필요합니다.

Figure 1
그림 1 : 플라스 미드 M2H 분석 결과 대 한 사용의 도표. (A)이 패널 쇼 pG5-뤽, 기자 플라스 미드 유전자 코딩 luciferase 융합 GAL4 응답 요소 (GAL4 재)를 포함 하. (B)이이 패널 표시 pBIND-mERαEF, GAL4DBD 퓨전 mERαEF;에 대 한 단백질 식 플라스 미드 Renilla luciferase transfection 효율 정상화에 대 한 작동 합니다. (C)이이 패널 표시 협정-mERαEF, 핵 지 방화 신호 (NLS)에 대 한 단백질 식 플라스 미드-VP16AD 퓨전 mERαEF 융합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2 :이 실험에 사용 되는 ERα LBD 식 플라스 미드의 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3 : M2H 분석 결과의 계획. 이 그림 대표 조합 (i) 플라스 미드 (왼쪽)와 페 셀의 상태와 조합 (2) 플라스 미드 (오른쪽)와 페 셀입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 마우스 ERα LBD의 ligand 의존 이합체 화 활동. (A)이이 패널 표시 셀의 luciferase 활동 (i) 조합 플라스 미드 (pG5 뤽 + 협정 + pBIND-mERαEF) 또는 조합 (2) 플라스 미드 (pG5 뤽 + 협정-mERαEF pBIND-mERαEF) 또는 E2 없이 페 합니다. (B)이이 패널의 조합 (i) 플라스 미드 또는 조합 (2) 플라스 미드 또는 4OHT 없이 transfected 세포 luciferase 활동을 보여줍니다. 활동은 평균으로 표시 ± 표준 편차 (SD). 그래프 패널 A 의 이전 게시 된 데이터11에서 재창조 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 마우스와 4OHT와 인간 ERα LBD의 차동 이합체 화 활동. (A)이이 패널 표시 셀의 luciferase 활동의 조합으로 페 ERα LBD 식 플라스 미드 (협정-mERαEF + pBIND-mERαEF) 또는 인간 ERα LBD 식 플라스 미드 (협정-hERαEF + pBIND-hERαEF)의 조합으로 마우스 또는 4OHT 없이. (B)는 낮은 활동 범위 패널 A 의 인간 ERα LBD와 실험적인 기초 수준 (협정 + pBIND-mERαEF, 협정 + pBIND-hERαEF)의 이합체 화 활동을 확대 됩니다. (C)이이 패널은 마우스 인간 F 도메인 바꾼 LBD 식 플라스 미드와 페 셀 luciferase 활동을 보여줍니다. mERαEhF는 마우스 ERα E 인간의 F 도메인 도메인 융합. hERαEmF 인간 ERα E 도메인 융합 마우스 F 도메인을 나타냅니다. 활동은 평균 ± sd는.로 표시 그래프 이전 게시 데이터1에서 재현 되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6 : 검출 AF-2를 사용 하 여 ERα LBD 이합체 화 활동 주 작동 근-중재의 돌연변이 ERα LBD. (A)이이 패널 표시 셀의 luciferase 활동 (i) 조합 플라스 미드 (pG5 뤽 + 협정 + pBIND-mERαEF) 또는 조합 (2) 플라스 미드 (pG5 뤽 + 협정-mERαEF pBIND-mERαEF) 또는 ligands; 없이 페 E2 (빨간색), 데스 (보라색) (B)이이 패널 표시 조합 (i) 플라스 미드 (pG5 뤽 + 협정 + pBIND-mERα-I362D) 또는 조합 (2) 플라스 미드 (pG5 뤽 + 협정-mERα-I362D pBIND-mERα-I362D) 또는 ligands; 없이 transfected 세포의 luciferase 활동 E2 (빨간색), 데스 (보라색) 활동은 평균 ± sd는.로 표시 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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여기, 우리는 예를 들어 ERα LBD의 homodimerization 활동을 탐지 하기 위한 시험 조건에 초점을 맞추고 M2H 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 일반적으로, M2H 분석 결과 ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동의 평가 대 한 인기가 되지 않습니다. 이것은 보유 transcriptional 활성화 함수; ERα LBD 활동 방해, 경우도 M2H 분석 결과의 결과. 그러나, 우리가 여기 보여줍니다 M2H 분석 결과 LBD (예를 들어, 4OHT, SERMs)의 어 2 transactivation 기능을 활성화 하지 않는 특정 물질의 LBD 이합체 화 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. LBD (백그라운드 작업)의 본질적인 활동을 줄이기 위해, 우리 생산 제비에서 낮은 e 2 포함 된 숯 박탈 FBS를 선택 하 고 열 비활성화 숯 박탈 FBS를 사용. 이러한 요소는 약한 상호 작용 활동을 감지 하 고 WT ERα LBD를 사용 하 여 M2H 분석 결과의 성공에 중요 하다. 또한, 우리는 ERα LBD 촉진제 (E2 및 DES)의 이합체 화 활동 보여주 어-2 주 작동 근 종속 coactivator 모집 활동 방해 mERα I362D 돌연변이 사용 하 여. 이 결과 M2H 분석 결과 ligand 의존 ERα LBD 이합체 화 활동의 평가 대 한 더 많은 도움이 될 수 있는 것이 좋습니다.

NR 연구 분야에서 M2H 분석 결과 ligand 의존 coactivator의 평가 또는 NR LBDs9,10의 corepressor 모집 활동에 대 한 사용 되었습니다. PBIND는 공동 인자의 NR 상호 작용 영역 융합의 플라스 미드 pBIND-ERαEF를 사용 하는 대신 실험의이 유형에 사용 됩니다. 이 실험은 coactivator의 큰 구조 도메인 보다 NR 모티브 (LxxLL) 상호 작용을 포함 하는 짧은 단백질 요소를 사용 합니다. 1 개의 가능성은 큰 coactivator 요소 VP16AD 퓨전 LBD;의 채용 없이 전사를 활성화 있습니다. 그 결과 M2H 분석 결과를 방해 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 ERα 하는 물질의 다양 한 바인딩 동작을 분석 하는 데 사용 될 수 있습니다. 예를 들어, 셀 pG5 뤽, pBIND 융합 NR 상호 작용 주제와 협정 ERαEF 플라스 미드 페 되었고, 다음, 내 분 비 방해 화학 물질 또는 잠재적인 호르몬 치료제 등 다양 한 화학 제품으로 대우. 경우 luciferase 활동은이 분석 결과에서 화학 제품에 의해, 그것은 화학 NR 상호 작용 주제8을 ERα LBD와 상호 작용 한다 전망 이다.

M2H 분석 결과 포유류 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용을 보여 줍니다. 우리는 소개에서 언급 했 듯이, 단백질 단백질 상호 작용의 생리 적 역할 셀 유형 특정 맥락에서 달라질 수 있습니다. M2H 분석 transcriptional 활동의 분석과 같은 다른 실험에 사용 되는 동일한 세포 컨텍스트에서 단백질 단백질 상호 작용 활동의 결과 제공할 수 있습니다. 또한, 그것은 세포 신호 변조기 (예를 들어, 억제제 또는 kinases의 활성 제) 관련된 된 세포에 있는 단백질 단백질 상호 작용의 효과 분석할 수 있습니다. 이것은 다른 시험관에 단백질-단백질 상호 작용 연구에 비해 M2H 분석의 이점이 다입니다.

그러나, 그것은 단백질-단백질 상호 작용 분석 결과 통해 는 M2H 두 단백질 사이 직접적인 상호 작용을 나타내지 않을 수 있습니다 감지 하는 것을 고려 될 필요가 있다. 즉, 두 단백질 사이의 연결을 허용 하는 세포 factor(s) 존재 하는 가능성이 있다. 그러한 고려 경우, 단백질 단백질 상호 작용 연구 생체 외에서 평가 요구, GST 융해 단백질 풀 다운 분석 결과 등 이어야 한다. 또한, 분석 결과 시스템의 성능을 평가 하기 위해 셀에 pBIND 및 협정-플라스 미드-파생 단백질 식 수준 확인 하기 낫다. 상호 작용 활동을 감지할 수 없습니다, 경우에 특히 단백질 식 레벨의 정보 결과의 원인을 확인 하는 데 도움이 됩니다. 안티-Gal4DBD 항 체와 안티-VP16AD 항 체는 서쪽 오 점 분석에 사용할 수 있습니다.

실험실은 luciferase 기자 분석 실험, 전사 활동의 규제 요소 분석 또는 요인 규제에 대 한 사용할 수 있는 대 한 실험 설정 하는 경우 그것은 M2H 분석 결과 수행 하기 위해 간단 합니다. M2H 분석 결과 transcriptional 규칙 연구는 유리 첨가제 방법입니다.

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Disclosures

저자는 선언할 수 없다.

Acknowledgments

저자 감사 박사 스에요시와 왕에서 국립 환경 건강 과학 연구소 (NIEHS) 원고, 태 너 제퍼슨의 그들의 중요 한 독서에 대 한 비디오에서 절차를 수행. 이 작품은 NIEHS의 교내 연구 부문에서에서 (K.S.K.)에 국가 학회 건강 그랜트 1ZIAES070065에 의해 지원 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

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포유류 2 하이브리드 분석 결과 사용 하 여 에스트로겐 수용 체 알파의 Ligand 바인딩 도메인 이합체 화 활동을 감지
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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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