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Cancer Research

एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा के Ligand-बाइंडिंग डोमेन Dimerization गतिविधि का पता लगाने के स्तनधारी दो-संकर परख का उपयोग

Published: December 19, 2018 doi: 10.3791/58758
Automatic Translation
1, 1
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Summary

हम 4-hydroxy-tamoxifen-निर्भर एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा ligand-बाइंडिंग डोमेन dimerization गतिविधि का उपयोग स्तनधारी दो-संकर परख का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα) एक एस्ट्रोजन ligand-निर्भर प्रतिलेखन नियामक है । ERα प्रोटीन के अनुक्रम प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित है । यह सोचा गया है कि मानव और माउस ERαs के समारोह के समान है । हम अंतर 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) माउस और मानव ERα ligand-बाध्यकारी डोमेन (LBD) dimerization दो-संकर (स्तनधारी) परख का उपयोग गतिविधि पर प्रभाव प्रदर्शित करता है । M2H परख स्तनधारी कोशिकाओं में LBD homodimerization गतिविधि की क्षमता का प्रदर्शन कर सकते हैं, दो प्रोटीन अभिव्यक्ति अभिकर्मक के plasmids का उपयोग (GAL4 डीएनए-बंधन डोमेन [DBD] फ्यूजन LBD और VP16 transactivation डोमेन [VP16AD] फ्यूजन LBD) और एक GAL4-उत्तरदायी तत्व (GAL4RE) से जुड़े luciferase रिपोर्टर प्लाज्मिड. जब GAL4DBD फ्यूजन LBD और VP16AD फ्यूजन LBD कोशिकाओं में एक डिमर बनाने के लिए, इस प्रोटीन जटिल GAL4RE करने के लिए बांध और, फिर, luciferase निर्भर प्रतिलेखन गतिविधि के माध्यम से एक VP16AD जीन अभिव्यक्ति सक्रिय करता है. 4OHT-मध्यस्थता luciferase सक्रियण HepG2 कोशिकाओं है कि माउस के साथ transfected थे में अधिक है ERα LBD फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids की तुलना में मानव ERα LBD फ्यूजन प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड transfected कोशिकाओं. इस परिणाम से पता चलता है कि 4OHT-निर्भर माउस ERα LBD homodimerization गतिविधि की प्रभावकारिता मानव ERα LBD से अधिक है । सामांय में, M2H परख के उपयोग परमाणु रिसेप्टर LBD dimerization गतिविधि के मूल्यांकन के लिए आदर्श नहीं है, क्योंकि agonistic लाइगैंडों LBD गतिविधि के बेसल स्तर को बढ़ाने और है कि LBD dimerization गतिविधि का पता लगाने में बाधा उत्पंन करता है । हमने पाया है कि 4OHT ERα LBD बेसल गतिविधि में वृद्धि नहीं करता है । यह निर्धारित करने और सफलतापूर्वक M2H परख का उपयोग करने के लिए 4OHT-निर्भर LBD dimerization गतिविधि का पता लगाने में सक्षम होने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है । ERα LBD-आधारित M2H परख चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर मॉडुलन के आंशिक एगोनिस्ट गतिविधि का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है (जैसे, 4OHT) विभिन्न स्तनधारी कोशिका प्रकार में.

Introduction

एस्ट्रोजन रिसेप्टर अल्फा (ERα) एक एस्ट्रोजन ligand-निर्भर प्रतिलेखन नियामक है । एमिनो एसिड sequenceof ERα प्रजातियों के बीच अत्यधिक संरक्षित है । मानव और माउस ERα के बीच उच्च समरूपता की वजह से, इन रिसेप्टर्स के समारोह के रूप में समान के बारे में सोचा है, और उन प्रजातियों में एस्ट्रोजन पदार्थों (जैसे, tamoxifen) की विभेदक गतिविधि में प्रजातियों के मतभेदों के कारण होता है रासायनिक चयापचय के बजाय ERα के संरचनात्मक मतभेदों से । ERα उच्च डोमेन संरचनाओं कि परमाणु रिसेप्टर (NR) superfamily के बीच आम है संरक्षित है, एफ डोमेन के लिए नामित । E डोमेन या ligand-बाइंडिंग डोमेन (LBD) में ligand-बाइंडिंग पॉकेट और transcriptional सक्रियण फ़ंक्शन 2, नामक वायुसेना-2 शामिल हैं । एफ डोमेन तुरंत ई डोमेन के निकट स्थानीयकृत है और एनआरएस के बीच सबसे चर डोमेन है । यहां तक कि मानव और माउस ERα के बीच, एफ डोमेन के समरूपता है कि अंय डोमेन1की तुलना में काफी कम है । ERα के ligand-बाउंड LBD ERα प्रोटीन के homodimerization को ligand-निर्भर जीन प्रतिलेखन (ERα की शास्त्रीय क्रिया) को विनियमित करने के लिए सीधे विशिष्ट एस्ट्रोजन-उत्तरदायी डीएनए तत्व को बाँधना बढ़ाता है. Crystallographic अध्ययन एस्ट्राडियोल (E2)-या 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT)-बाउंड LBD dimers2,3के साथ कुंडल 12 (वायुसेना-2 कोर डोमेन) के अंतर स्थिति से पता चला है । ERα एफ डोमेन (४५ एमिनो एसिड) वक्र 12 सीधे कनेक्ट । हालांकि, वहां ४५ अमीनो एसिड (F डोमेन) के इस विस्तार के प्रभाव के बारे में कोई जानकारी नहीं है ERα LBD dimerization पर कुंडल 12 से । इस अध्ययन में, हम प्रजातियों के लिए एफ डोमेन के योगदान-विशिष्ट 4OHT-निर्भर ERα LBD homodimerization एक स्तनधारी दो संकर (M2H) परख का उपयोग प्रदर्शित करता है ।

M2H परख एक विधि को स्तनधारी कोशिकाओं तीन अलग प्लाज्मिड DNAs: दो प्रोटीन अभिव्यक्ति plasmids है, जो एक्सप्रेस GAL4 डीएनए बंधन डोमेन (DBD) फ्यूजन ERα LBD और VP16AD फ्यूजन ERα LBD शुरू करने में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का प्रदर्शन है, और एक GAL4RE-जुड़े luciferase अभिव्यक्ति रिपोर्टर प्लाज्मिड. जब GAL4DBD फ्यूजन ERα LBD और VP16AD फ्यूजन ERα LBD (एक डिमर बनाने) कोशिकाओं में, इस प्रोटीन जटिल बांध GAL4RE और, फिर, luciferase-निर्भर VP16AD समारोह के माध्यम से transactivation जीन अभिव्यक्ति सक्रिय करता है । luciferase गतिविधि के द्वारा LBD homodimerization के स्तर का मूल्यांकन किया जा सकता है ।

खमीर दो संकर (Y2H) परख एक वैकल्पिक एक ही सिद्धांत है कि मेजबान पर्यावरण के रूप में खमीर का उपयोग करता है पर आधारित विधि है । पिछले Y2H प्रणाली का उपयोग कर रिपोर्ट का प्रदर्शन किया है कि एफ डोमेन-छोटा मानव ERα LBD वृद्धि e2-निर्भर coactivator भर्ती, समापन कि एफ डोमेन e2-मध्यस्थ प्रतिलेखन4रोकता है । यह परिणाम जो F-डोमेन-छोटा मानव ERα के स्तनधारी कक्ष5,6में तनु transcriptional गतिविधि का प्रदर्शन किया है अंय रिपोर्ट के साथ असंगत है । हाल ही में, हमारे अध्ययन, M2H प्रणाली का उपयोग कर, यह दर्शाता है कि मानव ERα LBD के E2 पर निर्भर coactivator भर्ती गतिविधि स्तनधारी कोशिकाओं में एफ डोमेन जनचेतना से कम है और प्रतिलेखन गतिविधि1के अनुरूप है. इन टिप्पणियों का सुझाव है कि प्रोटीन प्रोटीन बातचीत की शारीरिक भूमिका एक सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके और संदर्भ में अलग है । M2H परख एक ही सेलुलर संदर्भ है कि transcriptional गतिविधि का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है में प्रोटीन प्रोटीन संपर्क गतिविधि का प्रदर्शन कर सकते हैं । यह Y2H या अन्य इन विट्रो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन विश्लेषण की तुलना में M2H परख का एक लाभ प्रदान करता है ।

वहां चयनात्मक एस्ट्रोजन रिसेप्टर ढा (SERMs) (जैसे, 4OHT) के आंशिक एगोनिस्ट गतिविधि के आणविक तंत्र के बारे में प्रश्न ERα-मध्यस्थता प्रतिलेखन को विनियमित करने के लिए रहते हैं । ERα LBD-आधारित M2H की परख विभिन्न SERMs कोशिका प्रकारों में स्तनधारी के आंशिक एगोनिस्ट कार्यकलाप के तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू की जा सकती है.

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Protocol

1. स्तनधारी दो के लिए Plasmids की तैयारी-संकर परख

  1. निम्न plasmids का उपयोग करें: pG5-ल्यूक, pBIND-ERαEF, और इमानदारी-ERαEF ।
    नोट: plasmids अनुरोध पर लेखकों से उपलब्ध है और फ़िल्टर कागज पर भेजा जाता है । pG5-ल्यूक रिपोर्टर प्लाज्मिड कि luciferase अभिव्यक्ति इकाई (चित्रा 1ए) के साथ जुड़े GAL4 उत्तरदायी तत्वों के पांच दोहराने शामिल है । pBIND-ERαEF में GAL4DBD-फ्यूजन ERα LBD प्रोटीन के लिए प्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड है । pBIND-ERαEF में अभिकर्मक दक्षता (आरेख 1B) को सामान्य करने के लिए एक Renilla luciferase व्यंजक इकाई होती है. पैक्ट-ERαEF VP16AD-फ्यूजन ERα LBD प्रोटीन (चित्रा 1सी) के लिए प्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड है । plasmids से व्यक्त प्रोटीन संरचना का आरेख चित्रा 2में दिखाया गया है ।
  2. तैयार प्लाज्मिड DNAs ।
    1. साफ कैंची का उपयोग कर कागज से प्लाज्मिड लोड क्षेत्र में कटौती और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में डाल दिया । दस्ताने पहनें और प्लाज्मिड-लोडेड पेपर लेने के लिए साफ चिमटी का इस्तेमाल करें । जोड़ें १०० µ एल के Tris-EDTA (ते) बफर (पीएच ८.०) और भंवर अच्छी तरह से ।
    2. सक्षम ई कोलाई कोशिकाओं के लिए कदम 1.2.1 से प्लाज्मिड डीएनए समाधान के 1 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) और 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूब रखने के लिए ।
    3. हीट शॉक प्लाज्मिड-जोड़ा सक्षम कोशिकाओं; ट्यूब (ओं) ४२ ° c पानी स्नान में 30 एस के लिए और, फिर, उंहें 2 मिनट के लिए बर्फ पर रखें ।
    4. 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते के साथ ट्यूब (एस) और संस्कृति के लिए catabolite दमन (समाज) मध्यम (कमरे के तापमान) के साथ सुपर इष्टतम शोरबा के २५० µ एल जोड़ें ।
    5. प्लेट १०० १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन (10 सेमी व्यास पकवान) और संस्कृति के साथ एक गर्म Luria शोरबा (पौंड) प्लेट पर कल्चरल ई. कोलाई के µ एल ३७ डिग्री सेल्सियस रातोंरात ।
    6. थाली से एक कॉलोनी उठाओ और यह एक 14 मिलीलीटर १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन के साथ भयानक शोरबा (टीबी) के 2 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर झटकों के साथ संस्कृति जब तक मध्यम बेहोश घिर है ।
    7. एक autoclaved २५० एमएल ग्लास कुप्पी युक्त ५० एमएल 1.2.6 के लिए कदम से कल्चरल मीडियम के 1 मिलीलीटर जोड़ें १०० µ जी/एमएल एम्पीसिलीन के साथ टीबी की । 20-24 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते के साथ संस्कृति
    8. एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए संस्कृतिपूर्ण ई. कोलाई हस्तांतरण और 30 स्विंग-बाल्टी रोटर का उपयोग कर मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३,४५० x g पर केंद्रापसारक । यम को त्यागें । -८० डिग्री सेल्सियस पर ई. कोलाई गोली बचाओ ।
    9. सेल resuspension समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) ई. कोलाई गोली करने के लिए और इसे पूरी तरह से निलंबित । सेल lysis समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), यह 10x औंधा द्वारा धीरे ट्यूब मिश्रण, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के लिए (समय को पाबंद रखें). बेअसर समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें), दोहन के साथ तेजी से ट्यूब मिश्रण, और फिर, यह 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखने के लिए ।
    10. 30 मिनट के लिए 4 ˚ सी में ३,४५० x जी पर ट्यूब घुमाओ-बाल्टी रोटर का उपयोग कर के लिए केंद्रापसारक । डीएनए युक्त समाधान एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब हस्तांतरण और डीएनए शुद्धि राल के 10 मिलीलीटर जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । धीरे राल निलंबित ।
    11. 1 मिनट के लिए स्विंग बाल्टी रोटर का उपयोग कर ६२५ x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । समाधान त्यागें और नीचे राल रखें ।
    12. स्तंभ वाश समाधान (८० mm पोटेशियम एसीटेट, ८.५ mm Tris-HCl [pH ७.५], ४० µ m EDTA, और ५५% इथेनॉल) की ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए 15 मिलीलीटर जोड़ें और धीरे से राल को निलंबित करने के लिए हिला । दोहराएँ चरण 1.2.11.
      नोट: diethyl pyrocarbonate (DEPC)-उपचारित पानी या nuclease-मुक्त पानी का उपयोग करके स्तंभ वाश समाधान तैयार किया जाना चाहिए ।
    13. ५० एमएल शंकु ट्यूब करने के लिए स्तंभ वॉश समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें और एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ राल निलंबित । स्तंभ के लिए राल लागू करें ( सामग्री की तालिकादेखें) कि निर्वात कई गुना पर सेट है । वैक्यूम राल सूखी जब तक कॉलम । कॉलम और वैक्यूम करने के लिए स्तंभ वॉश समाधान के 6 मिलीलीटर जोड़ें ।
    14. एक बार जब राल नेत्रहीन सूख जाता है, कॉलम से जलाशय अलग । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए स्तंभ (राल) के नीचे खंड स्थानांतरण । 2 मिनट के लिए अधिकतम गति से कॉलम केंद्रापसारक एक microcentrifuge का उपयोग करने राल पूरी तरह से सूख ।
    15. एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए स्तंभ (राल) के नीचे खंड स्थानांतरण । जोड़ें ३०० µ nuclease के एल कॉलम को नि: शुल्क पानी और जब तक पूरे राल लथपथ है रुको ।
    16. प्लाज्मिड डीएनए युक्त समाधान (२००-२५० µ एल) इकट्ठा करने के लिए 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से स्तंभ केंद्रापसारक ।
    17. phenol-क्लोरोफॉर्म (1:1) के साथ डीएनए युक्त समाधान का उपचार करें, फिर निम्नानुसार क्लोरोफॉर्म के साथ.
      1. डीएनए युक्त समाधान (२००-२५० µ एल) के लिए phenol-क्लोरोफॉर्म (1:1) की एक ही मात्रा जोड़ें, अच्छी तरह से हिला, और 2 एक microcentrifuge का उपयोग कर मिनट के लिए अधिकतम गति से केंद्रापसारक । ऊपरी परत (डीएनए युक्त समाधान) लीजिए और इसे एक नया १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए जोड़ें । इस चरण 1x दोहराएँ ।
      2. डीएनए युक्त समाधान के लिए क्लोरोफॉर्म की एक ही मात्रा जोड़ें (२००-२५० µ एल), अच्छी तरह से हिला, और 1 मिनट के लिए अधिकतम गति से केंद्रापसारक । ऊपरी परत (डीएनए युक्त समाधान) लीजिए और इसे एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें ।
        नोट: Endotoxin (lipopolysaccharide) कुछ कोशिकाओं में सेलुलर संकेतन लाती है । इस तरह के एक अप्रत्याशित प्रभाव से बचने के लिए, कदम 1.2.17 की सिफारिश की है, जो endotoxin संदूषण को कम कर सकते हैं ।
    18. इस प्रकार के रूप में इथेनॉल वर्षण तकनीक का उपयोग कर प्लाज्मिड डीएनए हाला ।
      1. डीएनए युक्त समाधान करने के लिए 3 एम सोडियम एसीटेट (पीएच ५.५) और १००% इथेनॉल के 3m सोडियम एसीटेट मात्रा के 20x के dna मिश्रण मात्रा के 1/9 जोड़ें । उदाहरण के लिए, डीएनए समाधान के २७.८ µ l को 3 मीटर सोडियम एसीटेट और २७८ µ l के १००% इथेनॉल के २५० µ l में जोड़ें (अंतिम मात्रा ५५५.८ µ l).
      2. पर समाधान रखें-८० ° c 20 मिनट के लिए कम से कम । 4 ˚ सी में 20 मिनट के लिए अधिकतम गति पर केंद्रापसारक समाधान त्यागें और गोली रखो । जोड़ें ७५% इथेनॉल के २०० µ एल और कुल्ला ट्यूब के अंदर । 4 ° c में 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक, समाधान त्यागें, और गोली रखो । एक वैक्यूम ध्यानी का उपयोग डीएनए गोली सूखी ।
      3. जोड़ें १००-२५० µ एल ते बफर (pH ८.०) च्या ट्यूब. डीएनए गोली भंग और डीएनए एकाग्रता की जांच एक spectrophotometer का उपयोग कर २६० एनएम के तरंग दैर्ध्य पर । ०.५ मिलीग्राम/एमएल के आसपास डीएनए एकाग्रता रखें ।

2. स्तनधारी दो-संकर परख

  1. कोशिकाओं को बनाए रखें ।
    1. संस्कृति मानव hepatocellular कार्सिनोमा HepG2 कोशिकाओं में एक ७५० मिलीलीटर, १७५ सेमी2 phenol लाल के साथ ऊतक संस्कृति कुप्पी-मुक्त न्यूनतम आवश्यक मीडिया (मेम) के साथ पूरक 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS; हीट निष्क्रिय), 2 मिमी एल-glutamine, और 1% कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए पेनिसिलिन-streptomycin समाधान (एंटीबायोटिक्स).
    2. संस्कृति एक 5% CO2में कोशिकाओं-पूरक, ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन जब तक कोशिकाओं लगभग ९०% धाराप्रवाह हैं ।
      ध्यान दें: एस्ट्रोजन की पृष्ठभूमि गतिविधि को कम करने के लिए, phenol लाल मुक्त माध्यम सभी M2H प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यह कदम एक साफ पीठ के अंदर किया जाना चाहिए/ कक्ष सामांय स्तनधारी कक्ष culture प्रोटोकॉल7के बाद बनाए रखा जाना चाहिए ।
  2. अभिकर्मक के लिए कक्षों को तैयार करें ।
    नोट: निंनलिखित प्रक्रियात्मक कदम साफ पीठ के अंदर किया जाना चाहिए/ कोशिकाओं को इस कदम में एक 5% सह2-पूरक, ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन में संस्कृतिपूर्ण है हर समय ।
    1. 24-well प्लेट्स करने के लिए ९०% धाराप्रवाह कोशिकाओं replate; फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ 1x कोशिकाओं कुल्ला ।
    2. ०.०५% की 7 मिलीलीटर जोड़ें trypsin-संस्कृति कुप्पी के लिए EDTA समाधान और 1-2 मिनट के लिए कोशिकाओं को सोख जबकि कमरे के तापमान पर एक स्वच्छ बेंच में संस्कृति कुप्पी रखते हुए । trypsin-EDTA समाधान का एक हिस्सा निकालें और संस्कृति कुप्पी में समाधान की 1-2 मिलीलीटर छोड़ दें । 1-2 मिनट के लिए मशीन में संस्कृति कुप्पी मशीन ।
    3. कुप्पी के नीचे एक चांटा कोशिकाओं को अलग करने और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करने के लिए ।
      नोट: अगर कोशिकाओं अभी भी कुप्पी से जुड़े हुए हैं, एक और 1-2 मिनट के लिए मशीन और, फिर, दोहराने कदम 2.2.3 ।
    4. phenol लाल मुक्त मेम में कोशिकाओं को निलंबित 10% चारकोल के साथ पूरक-छीन FBS (गर्मी निष्क्रिय), 2 मिमी एल-glutamine, और 1% पेनिसिलिन-streptomycin समाधान.
      नोट: चारकोल-छीन FBS सीरम व्युत्पंन अंतर्जात एस्ट्रोजन के प्रभाव को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    5. कक्ष संख्या और बीज कोशिकाओं को एक घनत्व पर एक 24-अच्छी तरह से थाली में गणना १.२ x 105 कोशिकाओं/ प्रत्येक डेटा बिंदु (तपसिल) के लिए तीन कुओं निरुपित ।
    6. संस्कृति रात भर कोशिकाओं । चरण 2.4.1 जारी रखें ।
  3. अभिकर्मक के लिए एक डीएनए मिश्रण तैयार करें ।
    नोट: निंनलिखित प्लाज्मिड DNAs एक अच्छी तरह से transfected में हैं: १०० pG5 के एनजी-ल्यूक रिपोर्टर प्लाज्मिड, ५० plasmids फ्यूजन प्रोटीन (GAL4DBD) के लिए अभिव्यक्ति pBIND के एनजी, और ५० plasmids फ्यूजन प्रोटीन (संधि) के लिए अभिव्यक्ति VP16AD के एनजी ।
    1. ligand-निर्भर ERα LBD dimerization गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, निम्न संयोजन तैयार करें (चित्रा 3). संयोजन (i): pG5-ल्यूक + pBIND-hERαEF + इमानदारी, और pG5-ल्यूक + pBIND-mERαEF + इमानदारी । संयोजन (ii): pG5-ल्यूक + pBIND-hERαEF + इमानदारी-hERαEF, और pG5-ल्यूक + pBIND-mERαEF + पैक्ट-mERαEF. संयोजन (iii): pG5-ल्यूक + pBIND + पैक्ट-hERαEF, and pG5-ल्यूक + pBIND + पैक्ट-mERαEF.
      नोट: संयोजन (i) क्रमशः मानव ERα LBD और माउस ERα LBD के बेसल प्रायोगिक स्तर का प्रतिनिधित्व करता है । यदि परिणाम अकेले ligand के साथ एक उल्लेखनीय उच्च स्तर से पता चलता है, इस विधि है कि ligand (जैसे, diethylstilbestrol [डेस]) के साथ प्रयोग के लिए संभव नहीं है । संयोजन (ii) क्रमशः dimerized ह्यूमन ERα LBD और dimerized माउस ERα LBD के स्तरों का प्रतिनिधित्व करता है । संयोजन (iii) नकारात्मक नियंत्रणों का प्रतिनिधित्व करता है; इस सेट का उपयोग केवल तब करें जब प्रयोग सिस्टम के पृष्ठभूमि स्तर का मूल्यांकन करने के लिए पहली बार किया जाता है ।
    2. मिश्रण करने से पहले, अभिकर्मक के लिए कुओं की संख्या के आधार पर आवश्यक कुल डीएनए राशि की गणना. triplicates में और पांच डेटा बिंदुओं पर किए गए प्रयोगों के लिए, दो १.५ में निम्न प्लाज्मिड DNAs मिश्रण (i) और (ii): pG5-ल्यूक, 5 (डेटा अंक) x 3 (वेल्स) x १०० एनजी = १,५०० एनजी (15 µ एल) के लिए संयोजन के लिए µ एल ट्यूब pBIND-mERαEF, 5 (डेटा अंक) x 3 (वेल्स) x ५० एनजी = ७५० एनजी (७.५ µ एल); समझौता (मैं संयोजन के लिए) या समझौता-mERαEF (संयोजन द्वितीय के लिए), 5 (डेटा अंक) x 3 (वेल्स) x ५० एनजी = ७५० एनजी (७.५ µ एल) ।
      नोट: प्रत्येक प्लाज्मिड डीएनए समाधान की एकाग्रता ०.१ µ g/µ l
    3. इथेनॉल वर्षण तकनीक का उपयोग कर डीएनए मिश्रण हाला । 3 एम सोडियम एसीटेट के डीएनए मिश्रण मात्रा के 1/9 जोड़ें (पीएच ५.५) और डीएनए मिश्रण करने के लिए १००% इथेनॉल के 3m सोडियम एसीटेट मात्रा के 20x । फिर, भंवर ट्यूब ।
      नोट: उदाहरण के लिए, 3 एम सोडियम एसीटेट के ३.४ µ l को जोड़ें, और १००% इथेनॉल के ३४ µ l को प्लाज्मिड डीएनए मिक्सचर उदाहरण के 30 µ l को स्टेप 2.3.2 में डालें. यह चरण एक चर अभिकर्मक स्थिति रखने के लिए मदद करता है, और यह एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में इस चरण को निष्पादित करने के लिए आवश्यक नहीं है ।
    4. मिश्रण को रात-20 डिग्री सेल्सियस पर रखें । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए अधिकतम गति से केंद्रापसारक । समाधान छोड़ें (गोली अदृश्य है) । ट्यूब करने के लिए ७५% इथेनॉल के १२० µ एल जोड़ें; फिर, ट्यूब के अंदर कुल्ला । 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक । समाधान त्यागें और 30 मिनट के लिए एक निर्वात संकेंद्रक का उपयोग डीएनए मिश्रण सूखी ।
  4. अभिकर्मक करते हैं ।
    नोट: निम्न चरणों का पालन एक क्लीन बेंच या एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए ।
    1. निंनलिखित सुबह, एक 24-अच्छी तरह से थाली में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं कुल्ला (से कदम 2.2.6) 2x पंजाबियों की ०.५ मिलीलीटर (कमरे के तापमान) के साथ ।
    2. गर्म जोड़ें (३७ ° c) ताजा phenol लाल मुक्त मेम 10% चारकोल के साथ पूरक-छीन FBS (गर्मी निष्क्रिय) और 2 मिमी एल-glutamine एंटीबायोटिक दवाओं के बिना एक अच्छी तरह से (०.५ मिलीलीटर मध्यम/ एक 5% CO2-पूरक, ३७ ° c मशीन में कोशिकाओं रखें ।
    3. Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम (DMEM) (कोई सीरम, phenol लाल मुक्त, glutamine के बिना) में सूखे प्लाज्मिड डीएनए मिश्रण (कदम 2.3.4 से) निलंबित; 13 µ l/ अभिकर्मक के लिए कुओं की संख्या से DMEM की मात्रा की गणना करें.
      नोट: संयोजन के लिए 15 कुओं (i) x 13 µ l = १९५ µ l, और संयोजन के लिए 15 कुओं (ii) x 13 µ l = १९५ µ l
    4. अभिकर्मक रिएजेंट निलंबित ( सामग्री की तालिकादेखें; १.५ µ l/अच्छी तरह से) DMEM में (१२.५ µ एल/ठीक है) एक और १.५ मिलीलीटर ट्यूब में । अभिकर्मक के लिए कुओं की संख्या से अभिकर्मक रिएजेंट और DMEM की मात्रा की गणना करें ।
      नोट: 30 [संयोजन के लिए 15 कुओं (i) और संयोजन के लिए 15 कुओं (ii)] x १.५ µ l के अभिकर्मक रिएजेंट + 30 x १२.५ µ l की DMEM = ४२० µ l
    5. अभिकर्मक रिएजेंट मध्यम (चरण 2.4.4 से) प्रत्येक ट्यूब (चरण 2.4.3 से) के बराबर राशि जोड़ें । कमरे के तापमान पर 5-10 मिनट के लिए ट्यूब की मशीन ।
      नोट: २०० µ एल ऑफ अभिकर्मक रिएजेंट मीडियम + १९५ µ एल ऑफ कॉम्बिनेशन (i) dna मिक्सचर = ३९५ µ l, और २०० µ l के अभिकर्मक reagent मीडियम + १९५ µ l का कॉम्बिनेशन (ii) dna मिक्सचर = ३९५ µ l यह संयोजन की ट्यूबों के लिए अभिकर्मक रिएजेंट मध्यम के एक बराबर मात्रा जोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है (मैं) और (द्वितीय). इस चरण में यम का उपयोग करना आवश्यक नहीं है ।
    6. संयुक्त मिश्रण जोड़ें (से कदम 2.4.5) के लिए एक अच्छी तरह से (25 µ एल/24 के अच्छी तरह से प्लेट (कदम 2.4.2 से) और 5% CO2-पूरक, ३७ डिग्री सेल्सियस में 6 एच के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
    7. अभिकर्मक मीडियम को 24 वेल प्लेट से निकाल लीजिये. गर्म जोड़ें (३७ ° c) ताजा phenol लाल मुक्त मेम 10% चारकोल के साथ पूरक-छीन FBS (गर्मी निष्क्रिय), 2 मिमी एल-glutamine, 1% पेनिसिलिन-streptomycin समाधान, और ligand (इथेनॉल में निलंबित) (०.५ मिलीलीटर मध्यम/ संस्कृति 5% सह2में 16-18 ज के लिए कोशिकाओं-पूरक, ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन ।
  5. नमूनों की कटाई ।
    1. पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं कुल्ला और, फिर, जोड़ें १०० 1x निष्क्रिय lysis बफर के µ एल ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. जोरदार कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक भंवर मिक्सर के साथ 24 अच्छी तरह से प्लेटें हिला ।
    3. तरल नाइट्रोजन द्वारा प्लेटें (सेल lysates) 1x फ्रीज या विश्लेषण से पहले-८० डिग्री सेल्सियस पर उन्हें बचाने के लिए । तुरंत परख से पहले, जोरदार एक शेखर पर प्लेटों हिला जब तक वे कमरे के तापमान पर हैं ।
      नोट: यह प्रक्रिया अनियमित रूप से प्रदर्शित होने luciferase गतिविधि के असंगत मान रोकता है ।
  6. एक दोहरे luciferase परख करते हैं ।
    1. दोहरे luciferase परख प्रणाली के लिए एजेंट तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      1. luciferase परख सब्सट्रेट (लास) बफर बनाने के लिए, luciferase परख सब्सट्रेट जो एक गिलास भूरे रंग की बोतल में है में सभी luciferase परख बफर जोड़ें । -20 ° c पर लास बफ़र सहेजें ।
        नोट: लास बफर उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान के लिए गरम किया जाना चाहिए ।
      2. Renilla luciferase सब्सट्रेट (आरएलएस) बफर बनाने के लिए, 1:50 के अनुपात में Renilla luciferase सब्सट्रेट और Renilla luciferase बफर मिश्रण. हर परख के लिए ताजा आरएलएस बफर बनाओ और एक काले ट्यूब या एक टिनफॉईल द्वारा छायांकित ट्यूब का उपयोग करें । आरएलएस बफ़र की मात्रा एक ताजा बफर बनाने की गणना ।
        नोट: आरएलएस बफर उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान को गर्म किया जाना चाहिए ।
    2. microplate रीडर में रिएजेंट सेट करें ।
      1. ७०% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन लाइनों 2x धो; फिर, पानी के साथ 2x लाइनों धो लो ।
        नोट: यह परख परिणाम परेशान करने को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।
      2. पी-इंजेक्टर लाइन (पहला इंजेक्शन) के लिए लास बफर सेट और आरएलएस बफर एम इंजेक्टर लाइन (दूसरा इंजेक्शन) के लिए सेट करें । इन बफ़र्स मिश्रण नहीं है । आरएलएस बफ़र luciferase गतिविधि को रोकता है ।
    3. ९६-अच्छी तरह से सफेद प्लास्टिक की थाली के लिए काटा नमूनों की 10 µ एल (कदम 2.5.3 से) लागू करें ।
    4. microplate रीडर के लिए निंन सेटिंग्स लागू करें । पी-इंजेक्टर के लिए, ५० µ l की मात्रा का उपयोग करें, 2 s की देरी, और ५० µ एल की गति/ एम इंजेक्टर के लिए, ५० µ एल के एक खंड का उपयोग करें, 2 एस की एक देरी, और ५० µ एल की एक गति/15 एस के एक एकीकरण समय सेट. 25 डिग्री सेल्सियस के लिए तापमान निर्धारित करें ।
    5. भागो microplate पाठक ।
    6. luciferase गतिविधि (IPValue) के मूल्यों और डेटा अधिग्रहण कार्यक्रम का उपयोग कर Renilla luciferase गतिविधि (अवमूल्यन) के मूल्यों को रिकॉर्ड ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    7. डेटा संग्रह (चरण 2.6.2.1 देखें) के बाद इंजेक्शन लाइनों को धो लें ।
  7. डेटा विश्लेषण निष्पादित करें ।
    1. डेटा विश्लेषण के लिए सामान्यीकृत मानों का उपयोग करें (IPValue/
    2. (i) संयोजन के सामान्यीकृत मूल्य सेट [pG5-ल्यूक + pBIND-ERαEF + संधि] वाहन (0 एनएम ligand) के साथ 1 के रूप में बेसल स्तर की गणना के लिए और homodimerized ERα LBD स्तर । स्तरों "सापेक्ष गतिविधि" के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं ।

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Representative Results

चित्रा 3 संयोजन (i) और संयोजन (ii) प्लाज्मिड-transfected कोशिकाओं में संभावित प्रतिक्रियाओं की योजना प्रदर्शित करता है । प्रायोगिक परिणाम चित्रा 4में दिखाया गया है । संयोजन की गतिविधि (i) (pG5-ल्यूक + pBIND-mERαEF + संधि) 10 एनएम E2 (चित्रा 4ए), क्योंकि ERα LBD ligand-निर्भर transactivation कार्यात्मक डोमेन, वायुसेना-2 में शामिल है उत्तेजना से पता चलता है । एगोनिस्ट (जैसे, E2) कि ERα LBD रंगरूटों प्रतिलेखन coactivator (ओं) को वायुसेना-2 डोमेन के लिए बांधता है । यह घटना VP16AD फ्यूजन LBD के साथ बातचीत के बिना transcriptional सक्रियण का कारण बनता है और यह LBD homodimerization गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए मुश्किल बनाता है क्योंकि विशिष्ट पृष्ठभूमि (चित्रा 3सी). संयोजन (ii) (pG5-ल्यूक + pBIND-mERαEF + संधि-mERαEF) की गतिविधि 1 एनएम और 10 एनएम E2 उपचार (चित्रा 4ए) के साथ मनाया गया । यह एगोनिस्ट-निर्भर ERα LBD homodimerization गतिविधि का निर्धारण करने के लिए संभव हो सकता है यदि संयोजन (i) के सक्रियकरण के बिना (द्वितीय) युग्म की गतिविधि का पता लगाने के लिए उपयुक्त ligand एकाग्रता पाया जा सकते है (जैसे, चित्रा 4एमें 1 एनएम E2 की हालत) । इस प्रकार, यह एगोनिस्ट-मध्यस्थता ERα LBD homodimerization गतिविधि का उपयोग M2H परख का पता लगाने के लिए मुश्किल है । दूसरी ओर, 4OHT के साथ संयोजन (i) की गतिविधि वाहन नियंत्रण (0 एनएम) स्तर (चित्रा 4बी) के रूप में ही था । इन परिणामों का सुझाव है कि वायुसेना-2 ERα के समारोह 4OHT द्वारा सक्रिय नहीं है । इस प्रकार, M2H परख 4OHT (चित्रा 3बी, 3E) के साथ ERα LBD के homodimerization गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक व्यवहार्य विकल्प है ।

mERαEF के साथ माउस ERα LBD अभिव्यक्ति plasmids (pBIND-mERαEF + संधि-4OHT) के संयोजन से गतिविधि काफी अधिक थी मानव ERα LBD अभिव्यक्ति plasmids (pBIND-hERαEF + संधि-hERαEF) (चित्रा 5ए, 5B) के संयोजन से । यह परिणाम इंगित करता है कि माउस ERα LBD की 4OHT-निर्भर homodimerization गतिविधि मानव ERα LBD से अधिक प्रबल है । इसके अलावा, हम 4OHT-निर्भर LBD homodimerization गतिविधि मानव-माउस f-डोमेन-बदली ERα LBD अभिव्यक्ति plasmids, mERαEhF (मानव f डोमेन के साथ माउस ERα ई डोमेन) और hERαEmF (मानव ERα ई डोमेन के साथ माउस एफ डोमेन) का उपयोग कर विश्लेषण किया । mERαEhF की homodimerization गतिविधि mERαEF की तुलना में काफी कम थी । इसके विपरीत, hERαEmF की homodimerization गतिविधि hERαEF (चित्रा 5सी) से काफी अधिक थी । इस प्रकार, यह F डोमेन की तरह लगता है प्रजातियों पर एक प्रभाव विशिष्ट 4OHT-निर्भर ERα LBD homodimerization गतिविधि है ।

इन परिणामों का सुझाव है कि 4OHT की तरह लाइगैंडों के ERα LBD dimerization गतिविधि SERMs, M2H परख द्वारा पता लगाया जा सकता है । अगले, हम agonistic रसायनों के ERα LBD homodimerization गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए एक संभव तरीका प्रदर्शित करता है । ERα LBD dimerization की गतिविधियों E2 और diethylstilbestrol (DES) M2H परख द्वारा पता लगाया जा सकता है जब एक एकल अमीनो एसिड-ERα LBD (माउस ERα-I362D) रूपांतरित का उपयोग कर । इस उत्परिवर्तन ERα LBD8के E2 पर निर्भर coactivator भर्ती गतिविधि बाधित । संयोजन (i) (pG5-ल्यूक + pBIND-mERα-I362D + संधि) E2 से न तो किसी भी एकाग्रता हम (चित्रा 6ख), जो WT ERα LBD (चित्रा 6ए) से अलग था विश्लेषण पर सक्रिय नहीं था । देस की ERα-I362D LBD dimerization गतिविधि E2 (चित्रा ६बी) से भी अधिक प्रबल थी. इस उत्परिवर्ती एगोनिस्ट-निर्भर ERα LBD dimerization गतिविधि के एक तुलनात्मक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, यह आगे विश्लेषण और इस उत्परिवर्ती ERα की जैविक कार्यशीलता के लक्षण वर्णन की आवश्यकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : plasmids के आरेख M2H परख के लिए इस्तेमाल किया । (क) इस पैनल से पता चलता है pG5-ल्यूक, रिपोर्टर प्लाज्मिड है कि एक GAL4-उत्तरदाई तत्व (GAL4 पुनः) एक luciferase कोडन जीन के साथ जुड़े हुए हैं । (ख) इस पैनल से पता चलता है pBIND-mERαEF, GAL4DBD फ्यूजन mERαEF के लिए प्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड; Renilla luciferase अभिकर्मक दक्षता को सामान्य करने के लिए काम करता है । (ग) इस पैनल से पता चलता है समझौता-mERαEF, परमाणु स्थानीयकरण संकेत (एनएलएस) के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिड-फ्यूजन VP16AD फ्यूजन mERαEF. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : इस प्रयोग में प्रयुक्त ERα LBD व्यंजक का आरेख plasmids. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : M2H परख की योजना है । यह आंकड़ा संयोजन (i) plasmids (बाएं) और कोशिकाओं संयोजन के साथ transfected (ii) plasmids (दाएं) के साथ transfected कोशिकाओं के प्रतिनिधि शर्त दिखाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : माउस ERα LBD के Ligand-आश्रित dimerization गतिविधि । (क) यह पैनल transfected के साथ संयोजन (i) plasmids (pG5-ल्यूक + इमानदारी + pBIND-mERαEF) या संयोजन (ii) plasmids (pG5-ल्यूक + पैक्ट-mERαEF + pBIND-mERαEF) के साथ या बिना E2 के कक्षों की luciferase गतिविधि को दिखाता है. (ख) यह पैनल transfected के साथ संयोजन (i) plasmids या संयोजन (ii) plasmids के साथ या बिना 4OHT के कक्षों की luciferase गतिविधि को दिखाता है. गतिविधि मानक विचलन (एसडी) मतलब ± के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । पैनल A का ग्राफ पहले से प्रकाशित डेटा11से बना दिया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : 4OHT के साथ माउस और मानव ERα LBD के अंतर dimerization गतिविधि । (क) यह पैनल माउस ERα के संयोजन के साथ transfected कोशिकाओं की luciferase गतिविधि को दिखाता है LBD एक्सप्रेशन plasmids (इमानदारी-mERαEF + pBIND-mERαEF) या मानव ERα LBD अभिव्यक्ति plasmids (इमानदारी-hERαEF + pBIND-hERαEF) के संयोजन के साथ या बिना 4OHT । (ख) पैनल एक की कम गतिविधि रेंज मानव ERα LBD और प्रयोगात्मक बेसल स्तर (संधि + pBIND-mERαEF, संधि + pBIND-hERαEF) के dimerization गतिविधि दिखाने के लिए बढ़ाया है । (ग) यह पैनल माउस के साथ transfected कोशिकाओं की luciferase गतिविधि दिखाता है-मानव एफ-डोमेन-बदली LBD अभिव्यक्ति plasmids. mERαEhF अर्थ माउस ERα E डोमेन मानव F डोमेन के साथ जुड़े हुए । hERαEmF मानव ERα ई डोमेन माउस F डोमेन के साथ जुड़े अर्थ है । गतिविधि मतलब ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । रेखांकन पहले से प्रकाशित डेटा1से निर्मित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : एगोनिस्ट-मध्यस्थता ERα LBD dimerization गतिविधि का पता लगाने का उपयोग कर एक वायुसेना-2 रूपांतरित ERα LBD. (क) यह पैनल transfected के साथ संयोजन (i) plasmids (pG5-ल्यूक + इमानदारी + pBIND-mERαEF) या संयोजन (ii) plasmids (pG5-ल्यूक + इमानदारी-mERαEF + pBIND-mERαEF) के साथ या बिना लाइगैंडों के कोशिकाओं की luciferase गतिविधि को दिखाता है; E2 (लाल), डेस (बैंगनी). (ख) यह पैनल transfected के साथ संयोजन (i) plasmids (pG5-ल्यूक + इमानदारी + pBIND-mERα-I362D) या संयोजन (ii) plasmids (pG5-ल्यूक + इमानदारी-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) के साथ या बिना लाइगैंडों के कक्षों की luciferase गतिविधि को दिखाता है; E2 (लाल), डेस (बैंगनी). गतिविधि मतलब ± एसडी के रूप में प्रतिनिधित्व किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

इस के साथ साथ, हम M2H परख के लिए प्रोटोकॉल वर्णित है, एक उदाहरण के रूप में ERα LBD के homodimerization गतिविधि का पता लगाने के लिए परख शर्तों पर ध्यान केंद्रित । सामांय में, M2H परख ligand-निर्भर ERα LBD dimerization गतिविधि के आकलन के लिए लोकप्रिय नहीं है । यह एक transcriptional सक्रियण समारोह रखने ERα LBD के कारण है; जो की गतिविधि परेशान करता है, कुछ मामलों में, M2H परख के परिणाम है । हालांकि, जैसा कि हम यहां प्रदर्शित, M2H परख कुछ पदार्थ है कि वायु सेना-2 LBD के transactivation समारोह को सक्रिय नहीं करते की LBD dimerization गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे, 4OHT, SERMs) । LBD की आंतरिक गतिविधि (पृष्ठभूमि गतिविधि) को कम करने के लिए, हम उत्पादन बहुत से सबसे कम E2 युक्त चारकोल-छीन लिया FBS का चयन किया और गर्मी-निष्क्रिय चारकोल छीन लिया FBS । इन कारकों M2H WT ERα LBD का उपयोग परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है और कमजोर संपर्क गतिविधि का पता लगाने । इसके अतिरिक्त, हम एगोनिस्ट के ERα LBD dimerization गतिविधि (E2 और डेस) mERα-I362D उत्परिवर्ती, जो वायुसेना-2 के लिए एगोनिस्ट-निर्भर coactivator भर्ती गतिविधि बाधित का उपयोग कर दिखाया । इन परिणामों का सुझाव है कि M2H परख ligand-निर्भर ERα LBD dimerization गतिविधि के आकलन के लिए और अधिक उपयोगी हो सकता है ।

nr अनुसंधान क्षेत्र में, M2H परख nr LBDs9,10की ligand-निर्भर coactivator या corepressor भर्ती गतिविधि के आकलन के लिए इस्तेमाल किया गया है. cofactor के NR सहभागिता क्षेत्र के साथ जुड़े pBIND के प्लाज्मिड का उपयोग करने के बजाय इस प्रकार के प्रयोग के लिए उपयोग किया जाता है pBIND-ERαEF. इस प्रयोग के coactivator के एक बड़े संरचनात्मक डोमेन के बजाय NR बातचीत आकृति (LxxLL) युक्त लघु प्रोटीन तत्व का उपयोग करता है. एक संभावना है कि बड़ा coactivator तत्व VP16AD फ्यूजन LBD की भर्ती के बिना प्रतिलेखन सक्रिय कर सकते हैं; कि M2H परख से परिणाम परेशान सकता है । वैकल्पिक रूप से, इस प्रोटोकॉल ERα करने के लिए पदार्थों की एक किस्म की बाध्यकारी गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कोशिकाओं pG5-ल्यूक के साथ transfected थे, pBIND-जुड़े NR बातचीत आकृति, और समझौता-ERαEF plasmids और, फिर, इस तरह के अंत में स्रावी-बाधित रसायनों या संभावित हार्मोनल चिकित्सकीय के रूप में विभिन्न रसायनों के साथ इलाज किया. यदि luciferase गतिविधि इस परख में एक रासायनिक द्वारा वृद्धि हुई है, तो यह है कि रासायनिक ERα LBD के साथ बातचीत करने के लिए NR बातचीत आकृति8भर्ती होना चाहिए की भविष्यवाणी की है ।

M2H परख स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत को दर्शाता है । जैसा कि हम परिचयमें उल्लेख किया है, प्रोटीन की शारीरिक भूमिका-प्रोटीन बातचीत एक सेल प्रकार के विशिष्ट संदर्भ में अलग हो सकता है । M2H परख एक ही सेलुलर संदर्भ है कि अंय प्रयोगों, जैसे transcriptional गतिविधि के विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है में प्रोटीन प्रोटीन इंटरेक्शन गतिविधि के परिणाम प्रदान कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह सेल संकेत मॉडुलन के प्रभाव का विश्लेषण कर सकते हैं (जैसे, अवरोधकों या kinases के उत्प्रेरक) कोशिकाओं में प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के साथ शामिल. इस M2H की तुलना में अंय इन विट्रो प्रोटीन प्रोटीन संपर्क अध्ययन में परख का एक फायदा है ।

हालांकि, यह माना जाता है कि प्रोटीन प्रोटीन बातचीत M2H परख के माध्यम से पता चला दो प्रोटीन के बीच एक सीधी बातचीत का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है की जरूरत है । दूसरे शब्दों में, वहां संभावना है कि सेलुलर फैक्टर (ओं) मौजूद है कि दो प्रोटीन के बीच एक कनेक्शन की अनुमति दे रहे हैं । अगर ऐसा विचार उत्पन्न होता है, तो इन विट्रो प्रोटीन-प्रोटीन इंटरेक्शन स्टडीज के मूल्यांकन की आवश्यकता होनी चाहिए, जैसे जीएसटी-फ्यूजन प्रोटीन pulldown परख. इसके अलावा, यह pBIND की अभिव्यक्ति स्तर की जांच करने के लिए बेहतर है-और संधि-कोशिकाओं में प्लाज्मिड-व्युत्पंन प्रोटीन परख प्रणाली के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए । खासकर जब इंटरेक्शन गतिविधि का पता नहीं चल पाता है तो प्रोटीन एक्सप्रेशन लेवल्स की जानकारी रिजल्ट का कारण तय करने में मदद करती है । एंटी-Gal4DBD एंटीबॉडी और एंटी-VP16AD एंटीबॉडी का इस्तेमाल एक वेस्टर्न ब्लाटर एनालिसिस के लिए किया जा सकता है ।

यदि प्रयोगशाला प्रायोगिक सेट luciferase रिपोर्टर परख के लिए है, जो नियामक तत्वों या विनियमन कारकों की प्रतिलेखन गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह काफी M2H परख प्रदर्शन सरल है । M2H परख transcriptional विनियमन अध्ययन के लिए एक लाभप्रद additive विधि है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है.

Acknowledgments

लेखक डीआरएस. Sueyoshi और वांग राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) में पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए धंयवाद, और टांनर जेफरसन वीडियो पर प्रक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए । इस काम को नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट 1ZIAES070065 (K.S.K.) ने NIEHS के अंदर रिसर्च के डिविजन से सपोर्ट किया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. , Humana Press. (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).

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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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