Summary
Nous présentons une méthode pour analyser la 4-hydroxy-tamoxifène-dépendants oestrogène receptor ligands domaine dimérisation activité alpha utilisant l’analyse de deux-hybride chez les mammifères.
Abstract
Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. La séquence de la protéine ERα est hautement conservée entre les espèces. On a pensé que la fonction de l’homme et la souris ERαs est identique. Nous démontrons l’effet différentiel 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) souris et ERα ligands domaine (LBD) dimérisation activités humaines utilisant le mammifère-hybride (M2H) test. Le dosage M2H peut démontrer l’efficacité de l’activité de homodimérisation LBD dans les cellules de mammifères, utilisant la transfection des plasmides d’expression de deux protéines (GAL4 DNA-binding domain [DBD] fusion LBD et VP16 transactivation domaine [VP16AD] fusion LBD) et un GAL4-responsive element (GAL4RE) fondue plasmide rapporteur luciférase. Lors de la fusion de GAL4DBD LBD et la fusion de VP16AD LBD font un dimère dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression des gènes par le biais de l’activité de transcription dépendant de VP16AD une luciférase. L’activation de la luciférase induite par le 4OHT est plus élevée dans les cellules HepG2 qui ont été transfectées avec les plasmides souris ERα LBD fusion protein expression que dans les ERα LBD fusion protein expression plasmide transfecté des cellules humaines. Ce résultat suggère que l’efficacité de la souris 4OHT-dépendante de l’activité homodimérisation ERα LBD est plus élevée que l’humain ERα LBD. En général, l’utilisation du dosage M2H n’est pas idéale pour l’évaluation de l’activité de dimérisation du récepteur nucléaire LBD, car des ligands agonistes améliorent le niveau de base de l’activité LBD et gêner la détection de l’activité de dimérisation LBD. Nous avons trouvé que 4OHT n’améliore pas l’activité basale ERα LBD. C’est un facteur clé pour être capable de déterminer et de détecter l’activité de dimérisation de LBD 4OHT-dépendant pour l’utilisation avec succès le test M2H. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (p. ex., 4OHT) dans divers types de cellules de mammifères.
Introduction
Œstrogènes alpha du récepteur (ERα) est un régulateur oestrogéniques ligand-dépendants de transcription. L’acides aminés sequenceof ERα est hautement conservée entre les espèces. En raison de l’homologie supérieur entre l’homme et souris ERα, la fonction de ces récepteurs est considérée comme identique, et l’activité différentielle des substances oestrogéniques (par exemple, le tamoxifène) chez ces espèces est causée par des différences dans l’espèce métabolismes chimiques plutôt que par des différences structurelles de ERα. ERα a hautement conservée les structures de domaine qui sont fréquents chez la superfamille des récepteurs nucléaires (NR), désignée A pour domaines de F. E domaine ou domaine de liaison du ligand (LBD) comprend la poche de liaison du ligand et la fonction d’activation transcriptionnelle 2, nommée AF-2. Le domaine de F est localisé juste à côté du domaine E et le domaine plus variable chez le NRs. Même entre l’homme et la souris ERα, l’homologie du domaine F est sensiblement inférieur à celui des autres domaines1. Le LBD ligand lié de ERα améliore l’homodimérisation de la protéine ERα pour lier l’élément spécifique de l’ADN sensibles aux oestrogènes directement pour la régulation de la transcription du gène de ligand-dépendants (action classique de ERα). Des études cristallographiques ont révélé le positionnement différentiel d’hélice 12 (noyau de la AF-2) avec l’estradiol (E2) - ou 4-hydroxy-tamoxifen (4OHT) - lié LBD dimères2,3. Le domaine ERα F (45 acides aminés) Connectez hélice 12 directement. Cependant, il n’y a aucune information concernant l’effet de cette extension de 45 acides aminés (domaine de F) de l’hélice 12 sur la dimérisation ERα LBD. Dans cette étude, nous démontrons la contribution du domaine F l’homodimérisation de ERα LBD 4OHT-dépendante spécifique à l’espèce à un mammifère-hybride (M2H) dosage.
L’essai de M2H est une méthode pour montrer les interactions protéine-protéine dans les cellules de mammifères présentant les trois différents plasmide DNAs : deux plasmides d’expression protéique, qui exprime la fusion de GAL4 DNA-binding domain (DBD) la fusion ERα LBD LBD ERα et VP16AD, et un Plasmide de journaliste d’expression luciférase fusionnés avec le GAL4RE. Lorsque la fusion GAL4DBD ERα LBD et la fusion de VP16AD ERα LBD interagissent (faire un dimère) dans les cellules, ce complexe protéique se lie à la GAL4RE et, ensuite, active l’expression de gène de luciférase grâce à la fonction de transactivation VP16AD-dépendante. Le niveau de LBD homodimérisation peut être évalué par l’activité de la luciférase.
L’essai de (Y2H) de deux-hybride de levure est une méthode alternative basée sur le même principe qui utilise la levure comme l’environnement hôte. Les rapports précédents, en utilisant le système Y2H démontré que F-domaine-tronqué humains ERα LBD augmente recrutement de coactivateur E2-dépendante, concluant que le domaine F empêche la transcription induite par l’E24. Ce résultat est incompatible avec d’autres rapports qui ont démontré l’activité transcriptionnelle atténuée de F-domaine-tronqué humain ERα dans les cellules de mammifères5,6. Récemment, notre étude, en utilisant le système M2H, a démontré que l’activité de recrutement de coactivateur E2-dépendante des humains ERα LBD est diminuée par troncature domaine F en cellules mammifères et est compatible avec l’activité de transcription1. Ces observations suggèrent que le rôle physiologique de l’interaction protéine-protéine est différente dans un contexte et de manière spécifique au type de cellule. Le dosage M2H peut démontrer l’activité interaction protéine-protéine dans le même contexte cellulaire qui est utilisé pour la détermination de l’activité transcriptionnelle. Cela procure un avantage du dosage M2H comparé à la Y2H ou autres analyses d’interaction de protéine-protéine in vitro .
Il reste des questions concernant les mécanismes moléculaires de l’activité agoniste partielle des modulateurs des récepteurs œstrogènes (SERMs) (p. ex., 4OHT) à réglementer ERα-mediated transcription. LBD ERα M2H analyses peuvent être appliquées pour étudier le mécanisme de l’activité agoniste partielle des SERMs dans divers types de cellules de mammifères.
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Protocol
1. préparation des plasmides pour le dosage de deux-hybride chez les mammifères
- Utilisez les plasmides suivants : pG5-Luc pBIND-ERαEF et pacte-ERαEF.
Remarque : Les plasmides sont disponibles auprès des auteurs sur demande et sont envoyés sur papier filtre. pG5-Luc est le plasmide de journaliste qui contient cinq répétitions de GAL4 responsive éléments fusionnés avec l’unité d’expression luciférase (Figure 1A). pBIND-ERαEF est le plasmide d’expression de protéine des protéines fusionné avec GAL4DBD ERα LBD. pBIND-ERαEF contient une unité d’expression Renilla luciférase pour normaliser l’efficacité de la transfection (Figure 1B). pACT-ERαEF est le plasmide d’expression de protéine des protéines fusionné avec VP16AD ERα LBD (Figure 1C). Le diagramme de la structure de la protéine exprimée de plasmides est illustré à la Figure 2. - Préparer le plasmide DNAs.
- Découper dans la zone de plasmide-chargé du papier avec des ciseaux propres et mettez-la dans un tube de 1,5 mL. Porter des gants et pincettes propre permet de ramasser le papier chargé de plasmide. Ajouter 100 µL de tampon Tris-EDTA (TE) (pH 8,0) et des vortex.
- Ajouter 1 µL de la solution d’ADN de plasmide de l’étape 1.2.1 compétente Escherichia coli cellules (voir Table des matières) et maintenir le tube sur la glace pendant 15 minutes.
- Cellules compétentes de choc thermique le plasmide-ajout ; incuber les tubes dans le bain-marie à 42 ° C pendant 30 s et, ensuite, gardez-les sur glace pendant 2 min.
- Ajouter 250 µL de bouillon super optimal avec moyen de répression (SOC) catabolique (température ambiante) dans l’ou les tubes et de la culture avec agitation à 37 ° C pendant 30 min.
- Plaque 100 µL de la culture E. coli sur une assiette de bouillon (LB) de Luria préchauffée avec 100 µg/mL ampicilline (plat de 10 cm de diamètre) et à la culture à 37 ° C pendant la nuit.
- Prélever une colonie sur la plaque et l’ajouter dans un tube de 14 mL contenant 2 mL du bouillon formidable (TB) avec de l’ampicilline 100 µg/mL. Culture sous agitation à 37 ° C jusqu'à ce que le milieu est légèrement brouillée.
- Ajouter 1 mL de milieu cultivé de l’étape 1.2.6 à une fiole de verre stérilisés à l’autoclave de 250 mL contenant 50 mL de la tuberculose avec de l’ampicilline 100 µg/mL. Culture sous agitation à 37 ° C pendant 20 à 24 heures.
- Transférer la culture e. coli dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 3 450 x g à température ambiante pendant 30 min à l’aide du rotor swing-seau. Jeter le milieu. Sauver le culot d’e. coli à-80 ° C.
- Ajouter 3 mL de solution de remise en suspension de cellules (voir Table des matières) pour les e. coli à pellets et à interrompre complètement. Ajouter 3 mL de solution de lyse cellulaire (voir Table des matières), mélanger délicatement en inversant le tube de 10 x et le maintenir sur la glace pendant 5 min (garder le temps ponctuellement). Ajouter 6 mL de solution de neutralisation (voir Table des matières), mélanger le tube régulièrement avec taraudage et gardez-le ensuite, sur la glace pendant 10 min.
- Centrifuger le tube à 3 450 x g à 4 ° c pendant 30 min à l’aide du rotor swing-seau. Transférer la solution contenant de l’ADN dans un nouveau tube conique de 50 mL et ajouter 10 mL de résine de purification de l’ADN (voir Table des matières). Suspendre la résine doucement.
- Centrifuger le tube à 625 x g pendant 1 min par le rotor de la balançoire-seau. Jeter la solution et garder la résine en bas.
- Ajouter 15 mL de solution de lavage de colonne (acétate de potassium 80 mM, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA et 55 % d’éthanol) pour les 50 mL conique tube et secouez-le doucement pour suspendre la résine. Répétez l’étape 1.2.11.
Remarque : La solution de lavage de colonne doit être préparée à l’aide de diéthyl pyrocarbonate (DEPC)-traitement eau ou eau exempte de nucléase. - Ajouter 5 mL de solution de lavage de colonne dans le tube conique de 50 mL et suspendre la résine avec une pipette de 5 mL. Appliquer de la résine dans la colonne (voir Table des matières) qui est situé sur la tubulure de vide. Vide de la colonne jusqu'à ce que la résine sèche. Ajouter 6 mL de solution de lavage de colonne à la colonne et le vide.
- Une fois la résine sèche visuellement, détachez le réservoir de la colonne. Transférer la partie inférieure de la colonne (résine) dans un tube de 1,5 mL. Centrifuger la colonne à vitesse maximale pendant 2 minutes en utilisant une micro-centrifugeuse sécher la résine.
- Transférer la partie inférieure de la colonne (résine) dans un nouveau tube de 1,5 mL. Ajouter 300 µL d’eau exempte de nucléase à la colonne et attendre que la résine toute est trempée.
- Centrifuger la colonne à vitesse maximum pendant 1 min recueillir le plasmide d’une solution contenant de l’ADN (200-250 µL).
- Traiter la solution contenant de l’ADN avec du phénol-chloroforme (1:1), puis avec du chloroforme comme suit.
- Ajouter le même volume de phénol-chloroforme (1:1) à la solution contenant l’ADN (200-250 µL), bien mélanger et centrifuger à vitesse maximale pendant 2 min à l’aide d’une micro-centrifugeuse. Recueillir la couche supérieure (solution contenant de l’ADN) et l’ajouter à un nouveau tube de 1,5 mL. Répétez cette étape 1 x.
- Ajouter le même volume de chloroforme à la solution contenant l’ADN (200-250 µL), secouez bien et centrifuger à vitesse maximum pendant 1 min. récupérer la couche supérieure (solution contenant de l’ADN) et l’ajouter à un tube de 1,5 mL.
NOTE : Endotoxine (lipopolysaccharide) induit la signalisation cellulaire dans certaines cellules. Pour éviter un tel effet imprévu, étape 1.2.17 est recommandée, ce qui peut réduire la contamination de l’endotoxine.
- Précipiter l’ADN en utilisant la technique de précipitation d’éthanol comme suit de plasmide.
- Ajouter 1/9 du volume de mélange de l’ADN d’acétate de sodium 3M (pH 5,5) et 20 x du volume de l’acétate de sodium 3M d’éthanol à 100 % à la solution contenant de l’ADN. Par exemple, ajouter 27,8 µL d’acétate de sodium 3M et 278 µL d’éthanol à 100 % à 250 µL de la solution d’ADN (le volume final est 555,8 µL).
- Conserver la solution à-80 ° C pendant 20 min au moins. Centrifuger à vitesse maximum pendant 20 min à 4 ° c. Jeter la solution et garder le diabolo. Ajouter 200 µL d’éthanol 75 % et rincez l’intérieur du tube. Centrifuger pendant 20 min à 4 ° C, jeter la solution et garder le diabolo. Sécher le culot d’ADN à l’aide d’une pompe à vide.
- Ajouter 100-250 µL de tampon TE (pH 8,0) dans le tube. Dissoudre le culot d’ADN et vérifier la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre à une longueur d’onde 260 nm. Garder la concentration d’ADN autour de 0,5 mg/mL.
2. chez les mammifères-hybride Assay
- Maintenir les cellules.
- La culture de cellules de HepG2 de carcinome hépatocellulaire humaine dans un 750 mL, 175 cm2 vitroplants fiole avec les médias essentielles minimales exempt de rouge de phénol (MEM) additionnés de sérum de veau fœtal 10 % (FBS ; inactivés par la chaleur), 2 mM de L-glutamine et 1 % solution de pénicilline-streptomycine (antibiotiques) pour maintenir les cellules.
- La culture de cellules dans un 5 % CO2-complétée, incubateur de 37 ° C jusqu'à ce que les cellules sont environ 90 % anastomosé.
Remarque : Afin de réduire l’activité oestrogénique de fond, un milieu sans rouge de phénol devrait servir pour toutes les expériences M2H. Cette étape doit être exécutée à l’intérieur d’une armoire de sécurité propre banc/biologique. Les cellules doivent être maintenues après les cellules de mammifères générales culture protocole7.
- Préparer les cellules pour la transfection.
Remarque : Les étapes suivantes de la procédure est souhaitable à l’intérieur de l’armoire de sécurité propre banc/biologique. Les cellules sont cultivées/incubés dans un 5 % CO2-complétée, incubateur de 37 ° C dans cette étape chaque fois.- Replate les cellules confluentes de 90 % pour les plaques 24 puits ; rincer les cellules 1 x avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Ajouter 7 mL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % pour le flacon de culture et tremper les cellules pendant 1-2 min tout en gardant le flacon de culture dans un banc propre à température ambiante. Enlever une partie de la solution de trypsine-EDTA et laisser 1 à 2 mL de la solution dans le flacon de culture. Incuber le flacon de culture dans un incubateur pendant 1-2 min.
- Smack le fond du flacon pour détacher les cellules et vérifier les cellules au microscope.
Remarque : Si les cellules sont encore attachés au ballon, incuber pendant 1-2 min et, ensuite, répétez l’étape 2.2.3. - Suspendre les cellules dans le MEM exempt de rouge de phénol additionné de 10 % FBS charcoal-dépouillé (inactivés par la chaleur), 2 mM de L-glutamine et la solution de pénicilline-streptomycine 1 %.
NOTE : FBS dépouillé de charbon de bois doit être utilisé pour réduire l’effet de l’oestrogène endogène dérivé de sérum. - Compter le nombre de cellules et les cellules dans une plaque 24 puits à une densité de 1,2 x 105 cellules/puits des graines. Affecter des trois puits pour chaque point de données (en triple).
- La culture des cellules pendant la nuit. Passez à l’étape 2.4.1.
- Préparer un mélange d’ADN pour la transfection.
Remarque : Le suivant plasmide DNAs transfected dans un puits : 100 ng de plasmide de journaliste de pG5-Luc, 50 ng de plasmides d’expression des protéines de fusion GAL4DBD (pBIND) et 50 ng de plasmides d’expression des protéines de fusion VP16AD (pACT).- Pour analyser l’activité de dimérisation ERα LBD ligand-dépendants, préparer les combinaisons suivantes (Figure 3). Combinaison (i) : pG5-Luc pBIND-hERαEF pacte et pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + pacte. Combinaison (ii) : pG5-Luc pBIND-hERαEF pacte-hERαEF et pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + pacte-mERαEF. Combinaison (iii) : pG5-Luc pBIND pACT-hERαEF et pG5-Luc + pBIND + + pacte-mERαEF.
NOTE : Combinaison i représente le basal expérimental niveau humain ERα LBD et souris ERα LBD, respectivement. Si le résultat montre un niveau remarquablement élevé avec le ligand seule, cette méthode est infaisable pour une utilisation avec ce ligand (p. ex., le diéthylstilbestrol [DES]). Combinaison (ii) représente les niveaux de dimérisé humaine ERα LBD et souris dimérisée ERα LBD, respectivement. Combinaison (iii) représente la valeur du contrôle négatif ; Utilisez ce jeu uniquement lorsque l’expérience est réalisée pour la première fois d’évaluer le niveau de fond du système. - Pour calculer le total, avant de les mélanger, quantité d’ADN requis dépend du nombre de puits pour la transfection. Des expériences menées dans la géométrie et à cinq observations, mélanger l’ADN plasmidiques suivantes dans des tubes de deux 1.5 µL des regroupements (i) et (ii) : pG5-Luc, 5 (points de données) x 3 (puits) x 100 ng = 1 500 ng (15 µL) ; pBIND-mERαEF, 5 (points de données) x 3 (puits) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL) ; Pacte (pour combinaison i) ou pacte-mERαEF (pour combinaison ii), 5 (points de données) x 3 (puits) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL).
Remarque : La concentration de chaque solution d’ADN de plasmide est de 0,1 µg/µL. - Précipiter le mélange de l’ADN en utilisant la technique de précipitation d’éthanol. Ajouter 1/9 du volume de mélange de l’ADN d’acétate de sodium 3M (pH 5,5) et 20 x du volume de l’acétate de sodium 3M de 100 % d’éthanol dans le mélange de l’ADN. Ensuite, le tube vortex.
NOTE : par exemple, ajouter 3,4 µL d’acétate de sodium 3M et 34 µL d’éthanol à 100 % pour les 30 µL du mélange de l’ADN de plasmide illustré à l’étape 2.3.2. Cette étape permet de maintenir une condition de transfection invariable, et il n’est pas nécessaire d’effectuer cette étape dans une armoire de sécurité biologique. - Garder le mélange durant la nuit à-20 ° C. Il centrifuger à vitesse maximum pendant 20 min à 4 ° C. Jeter la solution (la pastille est invisible). Ajouter 120 µL d’éthanol 75 % dans le tube ; Ensuite, rincez l’intérieur du tube. Centrifuger pendant 20 min à 4 ° C. Jeter la solution et sécher le mélange de l’ADN à l’aide d’une pompe à vide pendant 30 min.
- Pour analyser l’activité de dimérisation ERα LBD ligand-dépendants, préparer les combinaisons suivantes (Figure 3). Combinaison (i) : pG5-Luc pBIND-hERαEF pacte et pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + pacte. Combinaison (ii) : pG5-Luc pBIND-hERαEF pacte-hERαEF et pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + pacte-mERαEF. Combinaison (iii) : pG5-Luc pBIND pACT-hERαEF et pG5-Luc + pBIND + + pacte-mERαEF.
- Effectuer la transfection.
Remarque : Les étapes suivantes devraient être effectuées dans un banc propre ou une armoire de sécurité biologique.- Le lendemain matin, rincer les cellules ensemencées dans une plaque 24 puits (de l’étape 2.2.6) 2 x avec 0,5 mL de PBS (température ambiante).
- Ajouter tiède (37 ° C) frais MEM exempt de rouge de phénol additionné de 10 % de charbon de bois dépouillé FBS (inactivés par la chaleur) et 2 mM de L-glutamine sans antibiotiques dans chaque cupule (moyenne de 0,5 mL/puits). Garder les cellules dans un 5 % CO2-complétée, incubateur de 37 ° C.
- Suspendre le mélange d’ADN de plasmide séchées (de l’étape 2.3.4) au moyen de l’aigle modifié de Dulbecco (DMEM) (pas de sérum, rouge de phénol-libre, sans glutamine ; 13 µL/puits). Calculer les montants de DMEM du nombre de puits pour la transfection.
NOTE : 15 puits pour combinaison (i) x 13 µL = 195 µL et 15 puits pour combinaison (ii) x 13 µL = 195 µL. - Suspendre le réactif de transfection (voir Table des matières; 1,5 µL/puits) en DMEM (12,5 µL/puits) dans un autre tube de 1,5 mL. Calculer la quantité de réactif de transfection et DMEM du nombre de puits pour la transfection.
NOTE : 30 [15 puits pour combinaison] (i) et 15 puits pour combinaison (ii) x 1,5 µL de réactif de transfection + 30 x 12,5 µL de DMEM = 420 µL. - Ajouter une quantité égale du milieu réactif de transfection (de l’étape 2.4.4) dans chaque tube (de l’étape 2.4.3). Incuber les tubes pendant 5-10 min à température ambiante.
NOTE : 200 µL de milieu réactif de transfection + 195 µL de combinaison mélange d’ADN (i) = 395 µL et 200 µL de milieu réactif de transfection + 195 µL de combinaison mélange d’ADN (ii) = 395 µL. Il est important d’ajouter un volume égal de milieu réactif de transfection pour les tubes de combinaison (i) et (ii). Il n’est pas nécessaire d’utiliser le support dans cette étape. - Ajouter le mélange combiné (de l’étape 2.4.5) dans chaque puits (25 µL/puits) de la plaque 24 puits (de l’étape 2.4.2) et incuber les cellules pendant 6 h dans le 5 % CO2-complétée, incubateur de 37 ° C.
- Retirer le support de transfection de la plaque 24 puits. Ajouter tiède (37 ° C) frais MEM exempt de rouge de phénol additionné de 10 % de charbon de bois dépouillé FBS (inactivés par la chaleur), 2 mM de L-glutamine, solution de 1 % la pénicilline-streptomycine et ligand (suspendu en éthanol) (0,5 mL moyen/puits). La culture des cellules pendant 16 à 18 h dans le 5 % CO2-complétée, incubateur de 37 ° C.
- Récolter des échantillons.
- Rincer les cellules avec 1 mL de PBS et, ensuite, ajouter 100 µL de 1 x tampon de lyse passive (voir Table des matières).
- Agiter vigoureusement les plaques 24 puits avec un vortex pour détacher les cellules.
- Geler les plaques (lysats cellulaires) 1 x en azote liquide ou les sauver à-80 ° C avant l’analyse. Immédiatement avant l’essai, agiter vigoureusement les plaques sur un agitateur jusqu'à ce qu’ils soient à température ambiante.
Remarque : Ce processus empêche apparaissant irrégulièrement des valeurs anormales de l’activité de la luciférase.
- Effectuez un double-de luciferase.
- Préparer des réactifs pour le système de double-de luciferase (voir Table des matières).
- Pour faire le tampon du substrat (LAS) luciférase, ajouter tous les luciférase du tampon dans le substrat de dosage de luciférase qui se trouve dans une bouteille de verre brun. Enregistrer le tampon de LAS à-20 ° C.
Remarque : La mémoire tampon de LAS doit être réchauffée à température ambiante avant utilisation. - Pour faire le tampon de substrat (RLS) Renilla luciférase, mélanger Renilla luciférase substrat et Renilla luciférase tampon dans un ratio de 01:50. Assurez-vous RLS frais de tampon pour chaque dosage et utiliser un tube noir ou un tube ombré de feuille d’étain. Calculer le montant de tampon RLS faisant un tampon frais.
Remarque : Le tampon de la RLS doit être réchauffé à température ambiante avant utilisation.
- Pour faire le tampon du substrat (LAS) luciférase, ajouter tous les luciférase du tampon dans le substrat de dosage de luciférase qui se trouve dans une bouteille de verre brun. Enregistrer le tampon de LAS à-20 ° C.
- Définissez les réactifs dans le lecteur de microplaques.
- Lignes de lavage l’injection 2 x avec l’éthanol à 70 % ; Ensuite, laver les lignes 2 x avec de l’eau.
NOTE : C’est important d’éviter de perturber les résultats de titrage. - Ensemble les LAS de la mémoire tampon dans le P-injecteur ligne (première injection) et définir la mémoire tampon de RLS à la ligne M-injecteur (2ème injection). Ne pas mélanger ces tampons. Tampon RLS inhibe l’activité de la luciférase.
- Lignes de lavage l’injection 2 x avec l’éthanol à 70 % ; Ensuite, laver les lignes 2 x avec de l’eau.
- Appliquer 10 µL d’échantillons récoltés (de l’étape 2.5.3) à la plaque en plastique blanche 96 puits.
- Appliquer les paramètres suivants pour le lecteur de microplaques. Pour le P-injecteur, utiliser un volume de 50 µL, un délai de 2 s et une vitesse de 50 µL/s. Pour le M-injecteur, utiliser un volume de 50 µL, un délai de 2 s et une vitesse de 50 µL/s. régler un temps d’intégration de 15 s. ensemble la température à 25 ° C.
- Lancez le lecteur de microplaques.
- Enregistrer les valeurs de l’activité de la luciférase (IPValue) et les valeurs de l’activité de la luciférase Renilla (IMValue) en utilisant le programme d’acquisition de données (voir la Table des matières).
- Laver les lignes d’injection après la collecte des données (voir l’étape 2.6.2.1).
- Préparer des réactifs pour le système de double-de luciferase (voir Table des matières).
- Effectuer l’analyse des données.
- Utilisez les valeurs normalisées (IPValue/IMValue) pour l’analyse des données.
- Définissez la valeur normalisée de combinaison (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + Pacte] avec véhicule (ligand de 0 nM) 1 pour le calcul du niveau de base et le homodimerized ERα LBD niveau. Les niveaux sont représentés comme « Activité Relative ».
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Representative Results
La figure 3 affiche le régime des sanctions possibles dans la combinaison (i) et les cellules (ii) plasmide transfectées combinaison. Les résultats expérimentaux sont indiquées à la Figure 4. L’activité de l’Association (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + Pacte) montre la stimulation de 10 nM E2 (Figure 4A), car la LBD ERα contient le domaine fonctionnel de transactivation de ligand-dépendants, AF-2. Agoniste (p. ex., E2) qui se lie à la LBD ERα recrute coactivator(s) transcription au domaine AF-2. Cet événement provoque l’activation de la transcription sans interaction avec la fusion de VP16AD LBD et il est difficile d’évaluer l’activité de homodimérisation LBD à cause de l’arrière-plan non spécifique (Figure 3C). L’activité de combinaison (ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pacte-mERαEF) a été observée avec 1 nM et 10 nM E2 traitement (Figure 4A). Il serait possible de déterminer l’activité agoniste dépendant de homodimérisation ERα LBD si la concentration de ligand approprié pour la détection de l’activité de combinaison (ii) sans l’activation de la combinaison (i) se trouve (par exemple, la condition de 1 nM E2 dans la Figure 4A). Ainsi, il est difficile de détecter l’activité homodimérisation de ERα LBD médiée par un agoniste, utilisant le test M2H. En revanche, l’activité de l’Association (i) avec 4OHT était le même que le contrôle du véhicule (0 nM) niveau (Figure 4B). Ces résultats suggèrent que la fonction AF-2 de ERα n’est pas activée par 4OHT. Ainsi, le dosage M2H est une option envisageable pour analyser l’activité de l’homodimérisation de ERα LBD avec 4OHT (Figure 3B, 3E).
L’activité de la combinaison de souris ERα LBD plasmides d’expression (pBIND-mERαEF + pacte-mERαEF) avec 4OHT était significativement plus élevée que la combinaison des plasmides d’expression humaines ERα LBD (pBIND-hERαEF + pacte-hERαEF) (Figure 5A, 5 b). Ce résultat indique que l’activité de l’homodimérisation de 4OHT dépendant de souris ERα LBD est plus puissante que l’humain ERα LBD. En outre, nous avons analysé en utilisant des plasmides d’expression F-domaine-troqué ERα LBD homme-souris, mERαEhF (souris domaine ERα E avec le domaine F humain) et hERαEmF (domaine de ERα E humaine avec domaine de souris F) de l’activité de homodimérisation des LBD 4OHT-dépendante. L’activité de l’homodimérisation de mERαEhF était significativement inférieure à celui des mERαEF. En revanche, l’activité de l’homodimérisation de hERαEmF était significativement plus élevée que hERαEF (Figure 5C). Ainsi, il semble que le domaine de F a une influence sur l’activité spécifique à l’espèce 4OHT-dépendante ERα LBD homodimérisation.
Ces résultats suggèrent que l’activité de dimérisation ERα LBD de ligands 4OHT-comme, par exemple SERMs, peut être détectée par le test M2H. Ensuite, nous démontrons une façon possible d’analyser l’activité de homodimérisation ERα LBD de substances chimiques agressives. Activités de dimérisation ERα LBD de E2 et le diéthylstilbestrol (DES) peuvent être détectées par le test M2H lorsque vous utilisez un single-amino-acide-muté ERα LBD (souris ERα-I362D). Cette mutation perturbe l’activité de recrutement de coactivateur E2-dépendante de ERα LBD8. Association (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + Pacte) n’était pas activée par E2, ni à n’importe quelle concentration nous avons analysé (Figure 6B), qui ne différait pas de WT ERα LBD (Figure 6A). L’activité de dimérisation de LBD ERα-I362D DES était plus puissante que E2 (Figure 6B). Ce mutant peut être utilisé pour une étude comparative de l’activité de dimérisation ERα LBD agoniste-dépendante ; Toutefois, elle exige plus loin l’analyse et la caractérisation de la fonctionnalité biologique de ce mutant ERα.
Figure 1 : Diagramme des plasmides utilisés pour le dosage de M2H. (A) ce panneau montre pG5-Luc, le plasmide de journaliste qui contient un élément favorisant le GAL4 (RE GAL4) fusionné avec une luciférase gène codant. (B), ce panneau affiche pBIND-mERαEF, le plasmide d’expression de protéine pour mERαEF de GAL4DBD de fusion ; Renilla luciférase travaille pour normaliser l’efficacité de transfection. (C), ce panneau affiche pACT-mERαEF, le plasmide d’expression de protéine pour le signal de localisation nucléaire (SNA)-fusion VP16AD fusion mERαEF. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Diagramme de plasmides d’expression ERα LBD utilisé dans cette expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Schéma du dosage M2H. Cette figure montre le représentant condition des cellules transfectées avec combinaison i plasmides (à gauche) et les cellules transfectées avec combinaison II plasmides (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Activité de dimérisation du ligand-dépendants de souris ERα LBD. (A), ce panneau affiche que l’activité de la luciférase des cellules transfectée avec les plasmides de combinaison (i) (pG5-Luc + pacte pBIND-mERαEF) ou combinaison (ii) plasmides (pG5-Luc + pacte-mERαEF + mERαEF-pBIND) avec ou sans E2. (B) ce panneau montre l’activité de la luciférase des cellules transfectées avec combinaison i plasmides ou combinaison (ii) plasmides avec ou sans 4OHT. L’activité est représentée sous forme de moyenne ± l’écart-type (SD). Le graphique du panneau A a été recréé à partir de données publiées antérieurement11. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Activité de dimérisation différentielle de souris et humains ERα LBD avec 4OHT. (A), ce panneau affiche l’activité de la luciférase des cellules transfectée avec la combinaison de la souris plasmides d’expression ERα LBD (Pacte-mERαEF + pBIND-mERαEF) ou la combinaison des plasmides d’expression humaines ERα LBD (Pacte-hERαEF + hERαEF-pBIND) avec ou sans 4OHT. Gamme d’activité (B), la basse de panneau A est amplifié pour montrer l’activité de la dimérisation des humains ERα LBD et les niveaux de base expérimentales (pBIND-mERαEF, pacte, pacte + pBIND-hERαEF). (C) ce panneau montre l’activité de la luciférase des cellules transfectées avec les plasmides d’expression F-domaine-troqué LBD souris-humain. mERαEhF désigne les souris ERα E domaine fusionnés avec le domaine F humain. hERαEmF dénote humain domaine ERα E fusionné avec souris domaine F. L’activité est représentée comme la moyenne ± la SD Les graphiques ont été recréés de données publiées antérieurement1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Détection de l’activité de dimérisation médiée par un agoniste ERα LBD en utilisant une AF-2 muté ERα LBD. (A), ce panneau affiche que l’activité de la luciférase des cellules transfectée avec les plasmides de combinaison (i) (pG5-Luc + pacte pBIND-mERαEF) ou combinaison (ii) plasmides (pG5-Luc + pacte-mERαEF + mERαEF-pBIND) avec ou sans ligands ; E2 (rouge), DES (violet). (B) ce panneau montre l’activité de la luciférase des cellules transfectées avec combinaison i plasmides (pG5-Luc + pacte pBIND-mERα-I362D) ou combinaison (ii) plasmides (pG5-Luc + pacte-mERα-I362D I362D-mERα-pBIND) avec ou sans ligands ; E2 (rouge), DES (violet). L’activité est représentée comme la moyenne ± le SD. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans les présentes, nous décrit le protocole de l’essai M2H, mettant l’accent sur les conditions de test pour la détection de l’activité de l’homodimérisation de ERα LBD à titre d’exemple. En règle générale, l’essai de M2H n’est pas populaire pour l’évaluation de l’activité de dimérisation ERα LBD ligand-dépendants. Cela est dû à la ERα LBD possédant une fonction d’activation de la transcription ; dont l’activité perturbe, dans certains cas, les résultats du dosage M2H. Toutefois, comme nous le démontrons ici, le dosage M2H peut être utilisé pour analyser l’activité de dimérisation LBD de certaines substances qui ne pas activer la fonction de transactivation AF-2 de LBD (p. ex., 4OHT, SERMs). Pour réduire l’activité intrinsèque de LBD (activité de fond), nous avons sélectionné la FBS plus bas charcoal-dépouillé de E2 contenant dans les lots de production et utilisé FBS de charbon de bois-dépouillé inactivés par la chaleur. Ces facteurs sont importants pour la réussite du test M2H utilisant le WT ERα LBD et pour détecter les activités de l’interaction faible. En outre, nous avons montré la LBD ERα activité dimérisation des agonistes (E2 et DES) en utilisant le mutant mERα-I362D, qui perturbe l’activité de recrutement coactivateur agoniste-dépendante à l’AF-2. Ces résultats suggèrent que le dosage M2H serait plus utile pour l’évaluation de l’activité de dimérisation ERα LBD ligand-dépendants.
Dans le champ de recherche NR, le dosage M2H a été utilisé pour l’évaluation de ligand-dépendants coactivateur ou activité de recrutement des co-répresseurs LBDs NR9,10. Le plasmide de pBIND fusionnée avec la région interaction NR le cofacteur est utilisé pour ce type d’expérience au lieu d’utiliser le pBIND-ERαEF. Cette expérience utilise l’élément de protéine court contenant le NR interagissant motif (LxxLL) plutôt qu’un plus grand domaine structural du co-activateur. Il est possible que le plus grand élément de coactivateur peut activer la transcription sans le recrutement de la fusion de VP16AD LBD ; qui pourrait perturber les résultats de l’essai M2H. Par ailleurs, ce protocole pourrait servir pour analyser l’activité de liaison d’une variété de substances pour le ERα. Par exemple, les cellules ont été transfectées avec les plasmides pACT-ERαEF pG5-Luc et pBIND fusionnés avec des motif NR qui interagissent et, ensuite, traitées avec divers produits chimiques, tels que les perturbateurs endocriniens ou de la thérapeutique hormonale possible. Si l’activité de la luciférase est augmentée par un produit chimique dans ce test, il est prédit que le produit chimique devrait être interagissant avec le LBD ERα pour recruter le NR interaction motif8.
Le dosage M2H illustre les interactions protéine-protéine dans les cellules de mammifères. Comme nous l’avons mentionné dans l' Introduction, le rôle physiologique des interactions protéine-protéine peut être différent dans un contexte de cellule-spécifiques au type. M2H dosages peuvent fournir les résultats de l’activité d’interaction protéine-protéine dans le même contexte cellulaire qui est utilisé pour d’autres expériences, telles que l’analyse de l’activité transcriptionnelle. En outre, il peut analyser l’effet de la signalisation cellulaire modulateurs (p. ex., inhibiteurs ou activateurs des kinases) impliqués dans des interactions de protéine-protéine dans les cellules. Il s’agit d’un avantage du dosage M2H comparé à d’autres études d’interaction de protéine-protéine in vitro .
Cependant, il faut considérer que les interactions protéine-protéine détectée via le M2H dosage ne peut pas représenter une interaction directe entre les deux protéines. En d’autres termes, il y a la possibilité qu’il existe des facteurs cellulaires qui permettent une connexion entre deux protéines. Si une telle contrepartie se pose, puis l’évaluation de in vitro études sur les interactions protéine-protéine devrait être requise, par exemple l’analyse de pulldown de protéine de fusion GST. En outre, il est préférable de vérifier le niveau d’expression des protéines pBIND - et pacte-dérivée d’un plasmide dans les cellules pour évaluer la performance du système de dosage. Surtout quand l’activité d’interaction ne peuvent pas être détectée, l’information des niveaux d’expression de la protéine aide à déterminer la cause du résultat. Anticorps anti-Gal4DBD et les anticorps anti-VP16AD peuvent être utilisés pour une analyse par western blot.
Si le laboratoire a le montage expérimental pour des dosages de rapporteur luciférase, qui peut être utilisé pour analyser l’activité de transcription des éléments de régulation ou de régulation des facteurs, c’est très simple d’effectuer le test M2H. L’essai de M2H est une méthode additive avantageuse pour les études de la régulation transcriptionnelle.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les Drs Sueyoshi et Wang à l’Institut National de Environmental Health Sciences (NIEHS) pour leur lecture critique du manuscrit et Jefferson Tanner pour effectuer des interventions sur la vidéo. Ce travail a été soutenu par le 1ZIAES070065 d’instituts nationaux de santé Grant (au KSK) de la Division de la recherche intra-muros du NIEHS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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