Summary
4-ヒドロキシ タモキシフェン-依存性エストロゲン受容体 α リガンド結合ドメイン二量体化アクティビティ哺乳類の 2 つのハイブリッド試金を使用しての解析法を提案します。
Abstract
エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。ERα タンパク質のシーケンスは、種間保存性が高い。それは人間の機能およびマウス ERαs が同じであると考えられています。マウスと人間の ERα リガンド結合ドメイン (LBD) 二量体化活動哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた差動 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT) の効果を実証します。M2H アッセイは 2 つ蛋白質発現プラスミド (GAL4 DNA 結合ドメイン [DBD] 融合 LBD と VP16 転写活性化ドメイン [VP16AD] フュージョン LBD) のトランスフェクションを利用した哺乳類セルの LBD ダイマー化活動の効率性を示すことができるとGAL4 応答性エレメント (GAL4RE) は、ルシフェラーゼ レポーター プラスミドを融合しました。GAL4DBD 融合 LBD と LBD VP16AD 融合細胞の二量体を作る、この蛋白質の複合体は、GAL4RE に結合し、その後、VP16AD 依存性転写活動を通じてルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化します。4OHT を介したルシフェラーゼ活性は、マウス ERα LBD 融合タンパク質発現プラスミドよりひと ERα LBD 融合タンパク質発現 transfected プラスミッド細胞を導入させた HepG2 細胞で高い。4OHT 依存マウス ERα LBD ダイマー化活動の有効性は人間の ERα LBD よりも高いと考えられる。一般に、M2H アッセイの使用率は核内受容体 LBD 二量体化活動の評価にとって理想的 LBD 活動の基底のレベルを高め、LBD 二量体化活性の検出を妨げ敵対配位子。その 4OHT に ERα LBD 基底活性強化ないとわかりました。決定および M2H アッセイを正しく使用するための 4OHT 依存 LBD 二量体化活動を検出することの重要な要因であります。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞選択的エストロゲン受容体モジュレーター (例えば4OHT) の部分アゴニスト活性を研究する適用できます。
Introduction
エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。アミノ酸順序 ERα 種間保存性が高い。人間で高い相同性のため ERα をマウス、これらの受容体の機能は、同じものとして考えられてし、の種の違いによって引き起こされるそれらの種のエストロゲン様物質 (例えばタモキシフェン) 差分の活動化学代謝 ERα の構造的な違いではなく。ERα は高度 A を F ドメインに指定 (NR) 核内受容体スーパーファミリーの間で共通のドメイン構造に保存します。E ドメインまたはリガンド結合ドメイン (LBD) は、リガンド結合ポケットと転写活性化機能 2、AF 2 という名前です。F ドメインは、E ドメインに隣接はローカライズされ、NRs の間でほとんどの変数のドメインです。人間の間でもマウスの ERα、F ドメインの相同性は、他のドメイン1のそれよりも有意に低かった。リガンド ERα LBD は、リガンド依存性遺伝子の転写 (ERα の古典的なアクション) を規制するために直接特定のエストロゲン応答性 DNA 要素をバインドする ERα 蛋白質のダイマー化を向上させます。結晶構造解析は、LBD ダイマー2,3をバインド配置ヘリックス 12 (AF 2 コア ドメイン) または 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT)、エストラジ オール (E2) との差異を明らかにしました。ERα F ドメイン (45 アミノ酸) ヘリックス 12 に直接接続します。ただし、ERα LBD ートコフェロール ヘリックス 12 から 45 アミノ酸 (F ドメイン) のこの拡張機能の影響に関する情報はありません。本研究では、哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた特異的 4OHT 依存 ERα LBD ダイマー化を F ドメインの寄与を示しています。
M2H アッセイは哺乳類細胞の 3 つの異なるプラスミド Dna を導入することでタンパク質間相互作用を実証する方法: 2 つのタンパク質発現プラスミド、GAL4 DNA 結合ドメイン (DBD) 融合 ERα LBD と VP16AD の融合 ERα LBD を表現してGAL4RE 融合ルシフェラーゼ発現レポーター プラスミド。GAL4DBD 融合 ERα LBD と VP16AD 融合 ERα LBD が対話する (二量体を作る)、セルのこの蛋白質の複合体、GAL4RE にバインドし、その後、アクティブにルシフェラーゼ遺伝子発現 VP16AD 依存型転写活性化関数を。LBD ダイマー化のレベルは、ルシフェラーゼ活性によって評価できます。
酵母 2 ハイブリッド (Y2H) アッセイは、酵母を使用して、ホスト環境と同じ原理に基づく代替方法です。Y2H システムを使用して以前のレポートは、人間 ERα LBD の F ドメイン切り捨て増加 E2 依存コアクチベーター募集 F ドメインが E2 を介した転写4を防止することを締結することを示した。この結果、哺乳類細胞5,6F ドメイン切り捨て人間 ERα の減衰転写活性を示している他のレポートと一致。最近、M2H システムを使用して、我々 の研究は、人間 ERα LBD の E2 依存コアクチベーター採用活動が哺乳動物細胞での F ドメイン切り捨てによる減少は、転写アクティビティ1と一致を示した。タンパク質間相互作用の生理的役割細胞型固有の方法でコンテキストとは異なることが示唆されました。M2H アッセイは、転写活性を決定するために使用される同じ細胞コンテキストのタンパク質-タンパク質相互作用アクティビティをデモンストレーションできます。これは、Y2H や他の in vitroタンパク質-タンパク質相互作用解析に比べて M2H アッセイの利点を提供します。
選択的エストロゲン受容体モジュレーター (Serm) (例えば4OHT) ERα を介した転写を調節する部分アゴニスト活性の分子メカニズムに関する質問が残っています。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞タイプの Serm の部分アゴニスト活性のメカニズムを研究に適用あります。
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Protocol
1 哺乳類の 2 つのハイブリッド試金のためのプラスミッドの準備
- 次のプラスミドを使用: 協定 ERαEF へ ERαEF、pG5 リュック。
注: プラスミッドはリクエストの作成者から利用でき、ろ紙上に送信されます。pG5 リュックは、ルシフェラーゼ発現ユニット (図 1A) と敏感な要素が融合した GAL4 の 5 つの繰り返しを含む記者プラスミドです。ERαEF は ERα LBD の GAL4DBD 融合タンパク質のタンパク質発現プラスミドです。ERαEF には、トランスフェクション効率 (図 1B) を正規化 Renilla ルシフェラーゼ発現ユニットが含まれています。協定 ERαEF です (図 1C) ERα LBD の VP16AD 融合タンパク質のタンパク質発現プラスミドです。プラスミッドから表現された蛋白質の構造の図を図 2に示します。 - 保有するプラスミド Dna を準備します。
- きれいなはさみを使って紙からプラスミド ロード領域を切り取って、1.5 mL のチューブに入れてください。手袋を着用し、清潔なピンセットを使用してプラスミッド ロード紙を拾います。100 μ L のトリス EDTA (TE) バッファー (pH 8.0) と渦をも追加します。
- 1 μ L を追加プラスミド DNA の解決のステップからの有能なエシェリヒア属大腸菌の 1.2.1 (材料の表を参照) を細胞し、15 分間氷の上の管を保ちます。
- プラスミド追加熱衝撃を与える有能なセル;30 の 42 ° C の水浴で尿管を孵化させなさい s と、その後、2 分間氷の上にそれらを保ちます。
- 尿管と 37 ° c 30 分振とうしながら文化に超最適カタボライト抑制 (SOC) 媒体 (室温) スープの 250 μ L を追加します。
- 一晩 100 μ g/mL アンピシリン (10 cm 直径の皿) と 37 ° C で文化 prewarmed ルリヤ (LB) のスープ プレート培養大腸菌の 100 μ L をプレートします。
- プレートからコロニーをピックアップし、素晴らしいスープ (TB) 100 μ g/mL アンピシリン 2 mL を含む 14 mL チューブにそれを追加します。媒体はかすかに白濁するまで、37 ° C で揺れと文化。
- 1.2.6 のステップから 100 μ g/mL アンピシリンと TB の 50 mL を含むオートクレーブ 250 mL ガラス フラスコに培地 1 mL を追加します。20-24 h の 37 ° C で揺れと文化。
- 50 mL コニカル チューブとスイング バケツの回転子を使用して 30 分間室温で 3,450 × gで遠心分離培養大腸菌に転送します。媒体を破棄します。大腸菌ペレット-80 ° C で保存します。
- セル再懸濁溶液 3 mL を追加 (材料表参照)エシェリヒア属大腸菌ペレットし、完全にそれを中断します。セル換散溶液 3 mL を追加 (材料の表を参照)、ミックス静か逆さにすることでチューブ 10 x 5 分間氷の上保管して (時間どおり時間を保つ)。中和溶液 6 mL を追加 (材料の表を参照)、タップと着実にチューブをミックスし、その後、10 分間氷の上にそれを維持します。
- スイング バケツの回転子を使用して 30 分間、4 ° C で 3,450 × gでチューブを遠心します。新しい 50 mL の円錐管に DNA を含む溶液を移し、DNA 精製樹脂 10 mL を追加 (材料の表を参照してください)。優しく樹脂を中断します。
- 625 x gスイング バケツの回転子を使用して 1 分でチューブを遠心します。液を捨て、下部に樹脂を維持します。
- カラム洗浄溶液 15 mL を追加 (80 mM 酢酸カリウム、8.5 mM トリス-HCl [pH 7.5]、40 μ M EDTA と 55% エタノール) 50 mL コニカル チューブと樹脂を中断する軽く振る。1.2.11 のステップを繰り返します。
注意: カラム洗浄液はピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) を使用してを準備する必要があります-水やヌクレアーゼ フリー水を扱われます。 - 50 mL の円錐管に列洗浄溶液 5 mL を追加し、5 mL ピペットを使い、樹脂を中断します。列に樹脂を適用真空マニホールドに設定されている (表の資料を参照してください)。樹脂乾燥するまで列を真空します。列と真空にカラム洗浄溶液 6 mL を追加します。
- 樹脂の乾燥は視覚的に、一度列から貯水池をデタッチします。(樹脂) の列の下のセクションを 1.5 mL チューブに転送します。最大速度遠心機を使用して、樹脂の乾燥は完全に 2 分で列を遠心します。
- (樹脂) の列の下のセクションを新しい 1.5 mL チューブに転送します。列にヌクレアーゼ フリー水の 300 μ L を追加し、全体の樹脂が浸漬するまで待ちます。
- プラスミド DNA 含有溶液 (200-250 μ L) を収集するために 1 分の最高の速度で列を遠心します。
- フェノール - クロロホルム (1:1)、クロロホルムとそれから DNA 含有溶液を次のとおり扱います。
- DNA 含有溶液 (200-250 μ L) にフェノール-クロロホルム (1:1) の同じボリュームを追加、よく、振るし、遠心機を使って 2 分の最大速度の遠心分離機します。上層 (DNA 含有溶液) を収集し、それを新しい 1.5 mL チューブに追加します。1 x この手順を繰り返します。
- よく、振ると最大速度で 1 分間遠心する上層 (DNA 含有溶液) を収集し、それを 1.5 mL チューブに追加、DNA 含有溶液 (200-250 μ L) にクロロホルムの同じボリュームを追加します。
注: 内毒素 (リポ多糖) は、いくつかの細胞の細胞内シグナル伝達を誘導します。このような予期せぬ影響を避けるためには、エンドトキシン汚染を減らすことができる、ステップ 1.2.17 がお勧め。
- プラスミド DNA のエタノール沈殿法を次のように使用を沈殿させます。
- 3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.5) の DNA の混合物の量の 1/9 を追加し、3 M ナトリウム酢酸量の DNA を含むソリューションに 100% エタノールの 20 倍。たとえば、(最終巻は 555.8 μ L) DNA の解決の 250 μ L に 27.8 μ L の 3 M 酢酸ナトリウムとエタノール 100% の 278 μ L を追加します。
- 少なくとも 20 分間-80 ° c のソリューションを保持します。4 ° C で 20 分の最大速度の遠心分離機します。液を捨て、ペレットを維持します。75% エタノール 200 μ L を追加し、チューブの内側を洗います。4 ° C で 20 分間遠心、液を捨て、ペレットを維持します。真空濃縮を使用して DNA の餌を乾燥させます。
- チューブに TE バッファー (pH 8.0) の 100-250 μ L を追加します。DNA の餌を溶解し、260 の波長分光光度計を用いた DNA 濃度をチェック nm。0.5 mg/mL 中の DNA 濃度に保ちます。
2 哺乳類 2 ハイブリッド試金
- セルを維持します。
- 750 mL, 10% 牛胎児血清を添加したフェノールレッド フリー最低限不可欠なメディア (MEM) 175 cm2培養フラスコでひと肝細胞癌 HepG2 細胞の培養 (FBS; 熱不活化)、2 ミリメートル L-グルタミン, 1%ペニシリン ・ ストレプトマイシン液 (抗生物質) のセルを維持するため。
- 5% CO2の細胞の培養-補われた、37 ° C インキュベーター細胞が約 90% 合流まで。
注: エストロゲンのバック グラウンド アクティビティを減らすためには、すべて M2H 実験にフェノールレッド フリー メディアを使用する必要があります。クリーン ベンチ/生物学的安全キャビネットの中は、この手順を実行する必要があります。セルは、次の一般的な哺乳類の細胞培養プロトコル7維持しなければなりません。
- Transfection のためにセルを準備します。
注: 次の手順は、クリーン ベンチ/生物学的安全キャビネット内実行必要があります。細胞が 5% CO2の培養/ふ化-毎回この手順で補われた、37 ° C インキュベーター。- 24 ウェル プレートに; 90% コンフルエント細胞を replate します。リンスの細胞 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で x。
- 培養用フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA 溶液 7 mL を追加し、室温で、クリーン ベンチで培養用フラスコを維持しながら 1-2 分の細胞を浸します。トリプシン EDTA 溶液の一部を削除し、培養用フラスコに 1-2 mL のソリューションを残します。1-2 分のためのインキュベーターで培養用フラスコを孵化させなさい。
- セルをデタッチして、顕微鏡下で細胞に、フラスコの底に舌鼓します。
注: 場合、セルはまだフラスコに接続されて、別の 1-2 分間インキュベートし、手順 2.2.3。 - 10% を添加したフェノールレッド無料の MEM のセルを中断 (熱不活化) 炭剥奪 FBS、2 ミリメートル L-グルタミンと 1% ペニシリン ストレプトマイシン溶液。
注: 炭剥奪 FBS は血清由来の内因性エストロゲンの影響を軽減する使用する必要があります。 - セル数をカウントで 1.2 105細胞/ウェル倍の密度で 24 ウェル プレートでセルをシードします。各データ ポイント (帳票) の 3 つの井戸を割り当てます。
- 一晩培養します。2.4.1 手順に進みます。
- トランスフェクションの DNA の混合物を準備します。
注: 次のプラスミド Dna は 1 つの井戸のトランスフェクション: 100 pG5 リュック記者プラスミド 50 ng GAL4DBD 融合蛋白質 (へ) の発現プラスミドの ng と 50 VP16AD 融合蛋白質 (協定) の発現プラスミドの ng。- リガンド依存性 ERα LBD 二量体化活性を分析するには、(図 3) の次の組み合わせを準備します。(I) の組み合わせ: pG5 リュック + へ hERαEF + 協定と pG5 リュック + へ mERαEF 協定。組み合わせ (ii): pG5 リュック + へ hERαEF + 協定-hERαEF と pG5 リュック + へ mERαEF 協定 mERαEF。組み合わせ (iii): pG5 リュック + へ + 協定-hERαEF と pG5 リュック + へ協定 mERαEF。
注: 組み合わせ (i) 基底実験のレベルを表す人間の ERα LBD とマウス ERα LBD それぞれ。結果は、単独で配位子と非常に高レベルを示している場合、このメソッドはそのリガンド (例えば、ジエチルスチルベス トロール [DES]) で使用可能。(Ii) の組み合わせは、それぞれ二量化した人間 ERα LBD とパイエルス マウス ERα LBD のレベルを表します。(Iii) の組み合わせを表しますマイナス コントロールです。初めてシステムのバック グラウンド レベルを評価するための実験を行う場合にのみこの設定を使用します。 - 合計を計算、混合する前にトランスフェクション用井戸の数に基づいて、必要な DNA 量。トリプリケート、5 つのデータ点の実験、ミックスの組み合わせ (i) と (ii) の 2 つの 1.5 μ 管次プラスミド Dna: pG5 リュック、3 (ウェルズ) x 100 ng × 5 (データ ポイント) = 1,500 ng (15 μ L);mERαEF、3 (ウェルズ) x 50 ng × 5 (データ ポイント) = 750 ng (7.5 μ L);協定 (i) または協定-mERαEF (組み合わせ ii) の組み合わせの 3 (ウェルズ) x 50 ng × 5 (データ ポイント) = 750 ng (7.5 μ L)。
注: 各プラスミド DNA 溶液の濃度は、0.1 μ g/μ L です。 - エタノール沈殿法を用いた DNA の混合物を沈殿させます。3 M 酢酸ナトリウム (pH 5.5) の DNA の混合物の量の 1/9 を追加し、3 M ナトリウム酢酸量の DNA の混合物に 100% エタノールの 20 倍。その後、渦管。
注: たとえば、2.3.2 の手順で代表されるプラスミッド DNA の混合物の 30 μ L に 3.4 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム、および 100% のエタノールの 34 μ L を追加します。この手順は不変のトランスフェクション条件を維持するのに役立ちます、それは生物学的安全キャビネットでこの手順を実行する必要はありません。 - -20 ° C で混合物を一晩保持します。4 ° C で 20 分最大速度で遠心します。(ペレットが見える) ソリューションを破棄します。管; 75% のエタノールの 120 μ L を追加します。その後、チューブの中をすすいでください。4 ° C で 20 分間遠心液を捨て、30 分間真空濃縮を使用して DNA の混合物を乾燥します。
- リガンド依存性 ERα LBD 二量体化活性を分析するには、(図 3) の次の組み合わせを準備します。(I) の組み合わせ: pG5 リュック + へ hERαEF + 協定と pG5 リュック + へ mERαEF 協定。組み合わせ (ii): pG5 リュック + へ hERαEF + 協定-hERαEF と pG5 リュック + へ mERαEF 協定 mERαEF。組み合わせ (iii): pG5 リュック + へ + 協定-hERαEF と pG5 リュック + へ協定 mERαEF。
- 遺伝子導入を行います。
注: 次の手順は、生物学的安全キャビネットやクリーン ベンチで実行する必要があります。- 次の朝、リンス (からステップ 2.2.6) 24 ウェル プレートに播種された細胞 0.5 mL の PBS (室温) で 2 倍。
- FBS (熱不活化)、2 ミリメートル L グルタミンも (0.5 mL 中/ウェル) 抗生物質なしに、暖かい (37 ° C) 10% を添加した新鮮なフェノールレッド フリー MEM 炭除去を追加します。5% CO2の細胞を維持-補われたの 37 ° C の定温器。
- ダルベッコ変法イーグル培地 (フェノールレッド フリー、グルタミンなしないの血清; 13 μ L/ウェル) (DMEM) で (手順 2.3.4) から乾燥プラスミド DNA の混合物を中断します。トランスフェクション用井戸の数から DMEM の量を計算します。
注: 15 井戸 (i) x 13 μ L の組み合わせ = 195 μ L、および (ii) x 13 μ L の組み合わせに対して 15 井戸 = 195 μ L。 - トランスフェクション試薬を中断 (材料の表を参照してください 1.5 μ L/ウェル) DMEM で (12.5 μ L/ウェル) 別 1.5 mL チューブに。トランスフェクション試薬とトランスフェクション用井戸の数から DMEM の量を計算します。
注: 30 [組み合わせの 15 井戸] (i) ・ 15 井戸の組み合わせ (ii) x トランスフェクション試薬の 1.5 μ L + DMEM の 30 × 12.5 μ L = 420 μ L。 - トランスフェクション試薬の媒体を (ステップ 2.4.4) から (ステップ 2.4.3) から各管の等しい量を追加します。室温で 5-10 分間チューブを孵化させなさい。
注: トランスフェクション試薬中 + 195 μ L 混合物 (i) DNA の組み合わせの 200 μ L = 395 μ L、200 μ L トランスフェクション試薬中の + 195 μ L の DNA (ii) 混合物の組み合わせ = 395 μ L。組み合わせ (i) と (ii) の管にトランスフェクション試薬中の等しい量を追加することが重要です。この手順では媒体を使用する必要はありません。 - (ステップ 2.4.2) から 24 ウェル プレートのも (25 μ L/ウェル) (ステップ 2.4.5) から結合された混合物を追加し、5% CO2で 6 h 細胞をインキュベート-補われたの 37 ° C の定温器。
- 24 ウェル プレートからトランスフェクション メディアを削除します。配位子 (エタノールで中断) 1% ペニシリン-ストレプトマイシン液、2 mM L グルタミン FBS (熱不活化) に、暖かい (37 ° C) 10% を添加した新鮮なフェノールレッド フリー MEM 炭除去を追加 (0.5 mL 中/よく)。5% CO2で 16-18 時間培養-補われたの 37 ° C の定温器。
- サンプルを収穫します。
- 1 ml の PBS のセルを洗浄し、次に、受動的な換散バッファー x 1 の 100 μ L を追加 (材料の表を参照してください)。
- 積極的にセルをデタッチする渦のミキサーで 24 ウェル プレートを振る。
- 凍結板 (セル lysates) 解析の前に-80 ° C で 1 x 液体窒素またはそれらを保存します。すぐに前に試金、精力的に振ってプレート シェーカーで常温になるまで。
メモ: このプロセスは、不規則なルシフェラーゼ活性の異常値を表示できなくなります。
- デュアル-ルシフェラーゼ アッセイを実行します。
- デュアル-ルシフェラーゼ アッセイ用試薬 (材料の表を参照してください)。
- ルシフェラーゼ アッセイ基板 (LAS) バッファーを作るために茶色のガラス瓶にはルシフェラーゼ アッセイ基板ルシフェラーゼ アッセイ バッファーのすべてを追加します。-20 ° C でラス バッファーを保存します。
注: ラス バッファーは、使用する前に室温に暖められる必要があります。 - Renilla ルシフェラーゼ基板 (RLS) バッファーを作るため Renilla ルシフェラーゼ基板と 1:50 の比率で Renilla ルシフェラーゼ バッファーをミックスします。新鮮な RLS すべてのアッセイのためのバッファーおよび黒いチューブやアルミホイルの木陰のある管を使用を確認します。新鮮なバッファーを作る RLS バッファーの量を計算します。
注: RLS バッファーは、使用する前に室温に暖められる必要があります。
- ルシフェラーゼ アッセイ基板 (LAS) バッファーを作るために茶色のガラス瓶にはルシフェラーゼ アッセイ基板ルシフェラーゼ アッセイ バッファーのすべてを追加します。-20 ° C でラス バッファーを保存します。
- マイクロ プレート リーダーで、試薬を設定します。
- 洗浄注入ラインの 2 倍の 70% エタノールでライン 2 を洗い流し水で x。
注: これは、アッセイの結果を不安を防ぐために重要です。 - P インジェクターに、ラスベガスのバッファー (最初の注射) を行し、M インジェクター ラインに RLS バッファーを設定 (注入は 2 番目)。これらのバッファーを混在させないでください。RLS のバッファーは、ルシフェラーゼ活性を阻害します。
- 洗浄注入ラインの 2 倍の 70% エタノールでライン 2 を洗い流し水で x。
- 96 ウェル白いプラスチック プレートを (ステップ 2.5.3) から収穫されたサンプルの 10 μ L を適用します。
- マイクロ プレート リーダーに次の設定を適用します。P-インジェクターの使用量 50 μ L、2 の遅延 s、および 50 μ L/s の速度。M-インジェクターの使用量 50 μ L、2 の遅延 s、15 s. セットの統合時間温度を 25 ° C に設定 50 μ L/s の速度
- マイクロ プレート リーダーを実行します。
- ルシフェラーゼ活性 (IPValue) の値とデータ収集プログラムを使用して Renilla ルシフェラーゼ活性 (IMValue) の値を記録 (材料の表を参照してください)。
- データ収集後注入ラインを洗う (2.6.2.1 の手順を参照してください)。
- デュアル-ルシフェラーゼ アッセイ用試薬 (材料の表を参照してください)。
- データ解析を実行します。
- 正規化された値 (IPValue/IMValue) を使用して、データ分析のため。
- レベル homodimerized ERα LBD と基底レベルの計算のための 1 として車両 (0 nM ligand) と組み合わせて (i) [pG5 リュック + へ ERαEF 協定] の正規化された値を設定します。レベルは、「相対的な活動」として表されます。
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Representative Results
図 3では、組み合わせ (i) と (ii) プラスミド トランスフェクト細胞の組み合わせで可能な応答のスキームが表示されます。実験の結果は図 4のとおりです。(I) (pG5 リュック + へ mERαEF 協定) の組み合わせの活動刺激を示しています 10 nM E2 (図 4A) ERα LBD に AF 2 リガンド依存性転写機能ドメインが含まれているため。アゴニスト (例えばE2) ERα LBD にバインドする募集転写 coactivator(s) AF 2 ドメインにしています。このイベントは VP16AD 融合 LBD と相互作用せず転写活性化を引き起こすし、非特異的なバック グラウンド (図 3C) ため LBD ダイマー化活性を評価することは困難になります。(Ii) (pG5 リュック + へ mERαEF 協定 mERαEF) の組み合わせの活動は 1 で観察した nM、10 nM E2 処置 (図 4A)。(I) の組み合わせの活性化なしの組み合わせ (ii) の活動を検出するための適切なリガンド濃度を見つけることができますアゴニスト依存性 ERα LBD ダイマー化活性を決定する可能になる (例えば、条件 1 の nM E2図 4A)。したがって、M2H アッセイを用いた ERα LBD のダイマー化のアゴニストを介した活動を検出することは困難です。その一方で、(i) と 4OHT の組み合わせの活動車両制御と同じであった (0 nM) レベル (図 4B)。これらの結果は、4OHT で ERα の AF 2 関数は呼び出されずをお勧めします。したがって、M2H 試金は 4OHT と ERα LBD のダイマー化活動を分析するための実現可能なオプション (図 3B、3 e)。
マウス 4OHT の発現プラスミドを ERα LBD (へ mERαEF + 協定 mERαEF) の組み合わせから活動が人間 ERα LBD 発現プラスミド (へ hERαEF + 協定 hERαEF) の組み合わせよりも有意に高かった (図 5A, 5 b)。この結果は、マウス ERα LBD の 4OHT 依存ダイマー化アクティビティが人間 ERα LBD よりも強力であることを示します。さらに、4OHT 依存性 LBD ダイマー化活性発現プラスミド ERα LBD の F ドメイン交換人間マウス、mERαEhF (マウス ERα E ドメインを人間の F ドメイン) と hERαEmF (マウス F ドメインと人間ドメイン ERα E) を使用して分析を行った。MERαEF よりも mERαEhF のダイマー化活性が低かった.対照的に、hERαEmF のダイマー化活動だった hERαEF (図 5C) より有意に高かった。したがって、F ドメイン種特異的 4OHT 依存性 ERα LBD ダイマー化活性の影響があるようです。
M2H アッセイで Serm など、4OHT のような配位子の ERα LBD 二量体化の活動を検出できることが示唆されました。次に、敵対化学物質の ERα LBD ダイマー化活性を分析する方法を示す.単一アミノ酸-酸-変異 ERα LBD (マウス ERα I362D) を使用する場合、M2H アッセイによって E2 のジエチルスチルベス トロール (DES) ERα LBD 二量体化活動を検出できます。この突然変異は、ERα LBD8E2 依存コアクチベーター採用活動を混乱させます。(I) (pG5 リュック + へ-mERα-I362D + 協定) の組み合わせがアクティブではなかった E2 も任意の濃度で DES を行った (図 6B)、WT ERα LBD (図 6A) から異なるだった。DES の ERα I362D LBD 二量体化活性は E2 よりも強い (図 6B)。この変異はアゴニスト依存 ERα LBD 二量体化活動の比較研究に使用できます。ただし、それはこの突然変異体 ERα の生物学的機能の特性を解析からさらに必要があります。
図 1: M2H アッセイに使用するプラスミドのダイアグラム。(A) このパネル ショー pG5-リュック、ルシフェラーゼの遺伝子のコーディングと融合した GAL4 応答要素 (GAL4 RE) を含む記者プラスミド。(B) このパネルへ-mERαEF、GAL4DBD 融合 mERαEF; のタンパク質発現プラスミドを示していますRenilla ルシフェラーゼは、トランスフェクション効率を正規化できます。(C) このパネルが協定-mERαEF、核局在化信号 (NLS) のタンパク質発現プラスミドを示しています-VP16AD 融合 mERαEF を融合。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: この実験で使用される ERα LBD 発現プラスミドのダイアグラム。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: M2H アッセイのスキーム。(左) の組み合わせ (i) プラスミドをトランスフェクトしたセルの条件とセル (右) の組み合わせ (ii) プラスミドをトランスフェクトした代表者を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: マウス ERα LBD のリガンド依存性二量体化活動。(A) このパネル、細胞のルシフェラーゼ活性発現プラスミド (i) の組み合わせ (pG5 リュック + 協定へ mERαEF) または組み合わせ (ii) プラスミド (pG5 リュック + 協定 mERαEF へ mERαEF) E2 の有無を示しています。(B) このパネルの組み合わせ (i) プラスミッドまたは 4OHT の有無の組み合わせ (ii) プラスミドをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性を示しています。活動は平均値として表されます ± 標準偏差 (SD)。パネルAのグラフは、以前発行したデータ11から再現しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 4OHT と人間の ERα LBD とマウスの差分二量体化活動。(A) このパネル番組の組み合わせと transfected セルのルシフェラーゼ活性マウス ERα LBD 発現プラスミド (協定 mERαEF + へ mERαEF) または人間 ERα LBD 発現プラスミド (協定 hERαEF + へ hERαEF) の組み合わせで、なし 4OHT。人間 ERα LBD と実験的基底レベル (協定 + へ mERαEF、協定へ hERαEF) の二量体化のアクティビティを表示するパネルAの (B) 低活動範囲が拡大されます。(C) このパネルはマウス人間 F ドメイン スワップ LBD 発現プラスミドをトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性を示しています。mERαEhF マウス ERα E を示す人間の F ドメインとドメインの融合。hERαEmF は、人間の ERα E ドメイン融合マウス F ドメインを表します。アクティビティは、平均 ± SD として表されます。グラフは、以前発行したデータ1から再現されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: AF 2 を使用してアゴニストを介した ERα LBD 二量体化活性の検出変異 ERα LBD 。(A) このパネル表示セルのルシフェラーゼ活性発現プラスミド (i) の組み合わせ (pG5 リュック + 協定へ mERαEF) または組み合わせ (ii) プラスミド (pG5 リュック + 協定 mERαEF へ mERαEF) 配位子の有無E2 (赤)、DES (紫)。(B) このパネルの組み合わせ (i) プラスミド (pG5 リュック + 協定へ mERα I362D) または組み合わせ (ii) プラスミド (pG5 リュック + 協定 mERα I362D へ mERα I362D) 配位子の有無をトランスフェクトした細胞のルシフェラーゼ活性を示しています。E2 (赤)、DES (紫)。活動は平均 ± SD として表されるこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで、我々 は例として ERα LBD のダイマー化アクティビティを検出するアッセイ条件に焦点を当て M2H 試金のためのプロトコルを説明します。一般に、M2H アッセイは、リガンド依存性 ERα LBD 二量体化活動の評価のため人気がないです。これは転写活性化機能を有する ERα LBD 原因です。活動はいくつかのケースで、M2H アッセイの結果を妨げます。しかし、我々 がここに示すよう M2H アッセイは LBD (例えば4OHT、Serm) の AF 2 転写活性化関数をアクティブにしない特定の物質の LBD 二量体化活動の分析に使用できます。LBD (バック グラウンド アクティビティ) の本質的な活動を減らすためには、我々 は生産ロットから最低 E2 含む木炭除去 FBS を選択され、炭剥奪 FBS の熱不活化を使用します。これらの要因は、弱い相互作用の活動を検出する WT ERα LBD を使用して M2H アッセイの成功に重要です。さらに、我々 は ERα LBD 作動薬 (E2 および DES) の二量体化活性を示した AF 2 アゴニスト依存コアクチベーター採用活動を混乱させる mERα I362D の変異体を用いたします。M2H アッセイはリガンド依存性 ERα LBD 二量体化活性の評価に役立つかもしれないが示唆されました。
NR 研究分野で M2H アッセイは、コアクチベーター リガンド依存性の評価や NR リガンド9,10のコリプレッサー募集活動のため使用されています。補因子の NR の相互作用領域と融合へのプラスミドは、このタイプへ ERαEF を使用しての代わりに実験に使用されます。この実験は、コアクチベーターの大きい構造のドメインではなくモチーフ (LxxLL) を相互作用する NR を含む短い蛋白質の要素を使用します。1 つの可能性は大きいコアクチベーター要素ことがあります VP16AD 融合 LBD; の募集なしの転写を活性化することそれは M2H アッセイの結果を乱すことが。また、様々 な物質、ERα の結合活性を分析するためこのプロトコルを使用することができます。たとえば、セルが pG5 リュックへ融合 NR の相互作用のモチーフ、および協定 ERαEF プラスミドをトランスフェクトしたで処理し、内分泌かく乱化学物質または潜在的なホルモン治療などの様々 な化学物質。このアッセイで化学ルシフェラーゼ活性は増加したが、それは化学物質が NR 相互作用モチーフ8を採用する ERα LBD と相互に作用するを予測されています。
M2H アッセイは、哺乳類細胞でのタンパク質間相互作用を示しています。導入で述べたように、蛋白質蛋白質の相互作用の生理学的な役割がセル タイプ固有のコンテキストで異なる場合があります。M2H アッセイは、転写活性の解析など、他の実験で使用される同じ携帯電話のコンテキストでタンパク質-タンパク質相互作用活動の結果を提供できます。さらに、それは細胞シグナリング変調器 (例えば、阻害剤またはキナーゼの活性剤)、細胞内タンパク質間相互作用に関与の効果を分析できます。これ他の in vitroタンパク質間相互作用の研究と比較して M2H アッセイの利点です。
しかし、それはタンパク質-タンパク質相互作用検出を介してM2H 試金は 2 つの蛋白質間の直接対話を表さないことがあることを考慮する必要があります。つまり、2 つの蛋白質間の接続を許可する細胞因子が存在する可能性があります。そのような意識が発生した場合次の in vitroタンパク質間相互作用研究の評価は GST 融合蛋白質のプルダウン試金など、必要なはずです。さらに、アッセイ システムのパフォーマンスを評価する細胞へと協定-プラスミド-由来タンパク質の発現レベルをチェックすることをお勧めします。交流活動を検出できないときに特にタンパク質発現レベルの情報は、結果の原因を特定するのに役立ちます。抗 Gal4DBD 抗体および抗 VP16AD 抗体は、西部のしみの分析に使用できます。
研究室では規制要素の転写活性を分析に使用することができますルシフェラーゼ レポーター試金のための実験の設定要因を調整、それは非常に簡単 M2H 分析を実行する場合。M2H アッセイは、転写調節研究有利な添加方法です。
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Disclosures
著者申告するものがあります。
Acknowledgments
著者は、原稿とタナー ジェファーソンの彼らの重要な読書のためのビデオの手順を実行するため夫妻末吉と王で、国立環境衛生研究所 (NIEHS) をありがとうございます。この作品は、(K.S.K.) に、NIEHS の学内研究部門からの国内機関の健康の付与 1ZIAES070065 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pG5-Luc | Promega | E249A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pBIND | Promega | E245A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| pACT | Promega | E246A | Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | |
| Centrifuge Rotor | SORVALL | 75006445 | |
| Swing Buckets | SORVALL | 75006441 | |
| Cell Resuspension Solution (CRA) | Promega | A7112 | |
| Cell Lysis Solution (CLA) | Promega | A7122 | |
| Neutralization Solution (NSA) | Promega | A7131 | |
| Column Wash Solution (CWB) | Promega | A8102 | |
| Wizard Midipreps DNA Purification Resin | Promega | A7701 | |
| Wizard Midicolumns | Promega | A7651 | |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200038 | |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| BenchMark fetal bovine serum (FBS) | Gemini-Bio | 100-106 | Heat inactivated |
| Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-119 | Heat inactivated |
| DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red | Gibco | 31053028 | for transfection |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | |
| Passive Lysis 5X Buffer | Promega | E1941 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1980 | |
| SpectraMax L microplate reader | Molecular Devices | ||
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices |
References
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