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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

Published: December 19, 2018 doi: 10.3791/58758
Automatic Translation
1, 1
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Summary

Apresentamos um método para analisar a 4-hidroxi-tamoxifeno-dependente de estrogênio receptor alfa ligand domínio dimerização actividade de ligação usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido.

Abstract

Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência da proteína ERα é altamente conservada entre as espécies. Acredita-se que a função de humanos e mouse ERαs é idêntico. Vamos demonstrar o efeito diferencial 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) no mouse e ERα ligação ligante domínio (LBD) dimerização atividade humana usando o mamíferas dois-híbrido (M2H) ensaio. O ensaio de M2H pode demonstrar a eficiência da atividade homodimerization LBD em células de mamíferos, utilizando o transfection de plasmídeos de expressão duas proteínas (GAL4 DNA-ligando domínio [DBD] fusão LBD e VP16 transactivation domínio [VP16AD] fusão LBD) e um O elemento GAL4-responsivos (GAL4RE) fundido plasmídeo do repórter do luciferase. Quando a fusão GAL4DBD LBD e a fusão de VP16AD LBD fazem um dímero nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa uma expressão de gene do luciferase através da atividade de transcrição dependente de VP16AD. A ativação do luciferase mediada por 4OHT é maior nas células HepG2 que foram transfectadas com plasmídeos de expressão de proteínas de fusão da LBD ERα o rato do que em ERα LBD fusão proteína expressão plasmídeo transfectada células humanas. Este resultado sugere que a eficácia do mouse 4OHT-dependente da atividade de homodimerization ERα LBD é superior a humana ERα LBD. Em geral, a utilização do ensaio M2H não é ideal para a avaliação da actividade de dimerização do receptor nuclear LBD, porque ligantes agonísticos melhorar o nível basal da atividade LBD e que impede a detecção de atividade de dimerização LBD. Encontramos que essa 4OHT não aumentar a atividade basal ERα LBD. Isso é um fator chave para ser capaz de determinar e detectar a atividade de dimerização LBD 4OHT-dependente para com êxito usando o ensaio de M2H. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar a atividade agonista parcial de moduladores de receptor de estrogênio seletivo (por exemplo, 4OHT) em vários tipos de células de mamíferos.

Introduction

Alfa do receptor de estrógeno (ERα) é um regulador de estrogênicos transcrição dependente de ligante. A sequência de aminoácidos ERα é altamente conservada entre as espécies. Por causa da maior homologia entre humanos e mouse ERα, a função destes receptores é pensada como idêntico, e a atividade diferencial de substâncias estrogênicas (por exemplo, tamoxifeno) dessas espécies é causada por diferenças da espécie em metabolismos químicos em vez das diferenças estruturais de ERα. ERα tem altamente conservadas estruturas de domínio que são comuns entre a superfamília do receptor nuclear (NR), designada aos domínios de F. E domínio ou domínio ligand-ligando (LBD) inclui o bolso de vinculação de ligante e a função de ativação transcricional 2, chamado de AF-2. O domínio de F é localizado imediatamente adjacente ao domínio E e é o domínio mais variável entre as NRs. Mesmo entre humanos e mouse ERα, a homologia do domínio de F é significativamente menor do que a outros domínios1. O limite a ligante LBD de ERα aumenta a homodimerization da proteína ERα para vincular o elemento específico de DNA hormona-responsivo diretamente para regular a transcrição do gene do ligante-dependentes (ação clássica de ERα). Cristalográficos estudos revelaram o diferencial de posicionamento da hélice 12 (domínio do núcleo do AF-2) com estradiol (E2) - ou 4-hidroxi-tamoxifeno (4OHT) - limite LBD dímeros2,3. O domínio ERα F (45 aminoácidos) conectar diretamente a hélice 12. No entanto, não há nenhuma informação sobre o efeito desta extensão de 45 aminoácidos (domínio de F) da hélice 12 sobre a dimerização ERα LBD. Neste estudo, demonstramos a contribuição do domínio de F para a espécie 4OHT-dependente ERα LBD homodimerization usando um mamífero dois-híbrido (M2H) ensaio.

O ensaio de M2H é um método para demonstrar as interações da proteína-proteína em células de mamíferos introduzindo os DNAs plasmideo diferentes três: dois plasmídeos de expressão de proteínas, que expressam a fusão de domínio (DBD) GAL4 DNA-ligando ERα LBD e VP16AD fusão ERα LBD, e um Plasmídeo do repórter do luciferase fundido GAL4RE expressão. Quando a fusão GAL4DBD ERα LBD e a fusão de VP16AD ERα LBD interagem (fazer um dímero) nas células, este complexo proteico vincula o GAL4RE e, em seguida, ativa a expressão do gene do luciferase através da função de transactivation VP16AD-dependente. O nível de homodimerization LBD pode ser avaliado pela atividade do luciferase.

O ensaio da dois-híbrido de levedura (Y2H) é um método alternativo baseado no mesmo princípio que usa fermento como o ambiente de host. Usando o sistema de Y2H de relatórios anteriores demonstraram que F-domínio-truncada humana ERα LBD aumenta o recrutamento de coactivator E2-dependente, concluindo que o domínio de F impede a transcrição mediada por E24. Esse resultado é incompatível com outros relatórios que demonstraram a atividade transcricional atenuada do F-domínio-truncada ERα humana no pilhas mamíferas5,6. Recentemente, nosso estudo, utilizando o sistema M2H, demonstrou que a atividade de recrutamento coactivator E2 dependentes de humanos ERα LBD é diminuída por truncamento de domínio F em células de mamíferos e é consistente com a atividade de transcrição1. Estas observações sugerem que o papel fisiológico da interação da proteína-proteína difere em uma maneira de tipo específico de célula e contexto. O ensaio M2H pode demonstrar a atividade de interação da proteína-proteína no mesmo contexto celular que é usado para determinar a atividade transcricional. Isso fornece uma vantagem do ensaio M2H comparado com o Y2H ou outras análises de interação em vitro da proteína-proteína.

Continua a haver perguntas sobre os mecanismos moleculares da atividade agonista parcial de moduladores de receptor seletivo de estrogênio (SERMs) (por exemplo, 4OHT) para regular a transcrição mediada por ERα. Ensaios de M2H ERα LBD-based podem ser aplicados para estudar o mecanismo da atividade agonista parcial de SERMs em vários tipos de células de mamíferos.

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Protocol

1. preparação de plasmídeos para o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido

  1. Use os seguintes plasmídeos: pG5-Luc, pBIND-ERαEF e ERαEF-pacto.
    Nota: Os plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação, em autores e são enviados em papel de filtro. pG5-Luc é o plasmídeo do repórter que contém cinco repetições de GAL4 elementos responsivos fundiram-se com a unidade de expressão do luciferase (Figura 1A). pBIND-ERαEF é o plasmídeo de expressão de proteínas para proteínas GAL4DBD-fundida ERα LBD. pBIND-ERαEF contém uma unidade de expressão Renilla luciferase para normalizar a eficiência de transfeccao (Figura 1B). Pacto-ERαEF é o plasmídeo de expressão de proteínas para as proteínas VP16AD-fundida ERα LBD (Figura 1C). O diagrama da estrutura de proteínas expressas desde o plasmídeo é mostrado na Figura 2.
  2. Prepare o DNAs plasmideo.
    1. Cortar a área do plasmídeo-carregado do papel com uma tesoura limpa e colocá-lo em um tubo de 1,5 mL. Use luvas e usar uma pinça limpa para pegar o jornal do plasmídeo-carregado. Adicione 100 µ l de tampão Tris-EDTA (TE) (pH 8.0) e vórtice bem.
    2. Adicionar 1 µ l da solução de DNA de plasmídeo da etapa 1.2.1 para competentes de Escherichia coli eritrócitos (ver Tabela de materiais) e mantenha o tubo no gelo por 15 min.
    3. Células competentes de calor-choque o plasmídeo-adicionado; Incubar os tubos em banho de água a 42 ° C por 30 s e, em seguida, mantê-los no gelo por 2 min.
    4. Adicione 250 µ l de caldo super ideal com meio de repressão (SOC) catabolite (temperatura ambiente) para os tubos e cultura com agitação a 37 ° C por 30 min.
    5. Placa de 100 µ l da culta E. coli em um prato de caldo de carne (LB) de Luria escaldado com 100 µ g/mL ampicilina (prato de 10 cm de diâmetro) e cultura a 37 ° C durante a noite.
    6. Escolher uma colônia da placa e adicioná-lo em um tubo de 14 mL contendo 2 mL de caldo fantástico (TB) com ampicilina 100 de µ g/mL. Cultura com agitação a 37 ° C até o meio sumida está nublado.
    7. Adicione 1 mL do meio de cultura de passo 1.2.6 para um balão de vidro esterilizada 250 mL contendo 50 mL de TB com ampicilina 100 de µ g/mL. Cultura com agitação a 37 ° C durante 20-24 h.
    8. Transferi o culto Escherichia coli para um tubo cónico de 50 mL e centrifugar 3.450 x g em temperatura ambiente por 30 min usando o rotor de balanço-balde. Descarte o meio. Salvar a pelota de Escherichia coli a-80 ° C.
    9. Adicionar 3 mL de solução de ressuspensão de célula (ver Tabela de materiais) para a e. coli da pelota e suspendê-lo completamente. Adicionar 3 mL de solução de lise celular (ver Tabela de materiais), mistura o tubo suavemente por inversão-10x e mantê-lo no gelo por 5 min (manter o tempo pontual). Adicionar 6 mL de solução de neutralização (ver Tabela de materiais), misturar o tubo firmemente com a batida e em seguida, mantê-lo no gelo por 10 min.
    10. Centrifugar o tubo a 3.450 x g a 4 ˚ c por 30 min usando o rotor de balanço-balde. Transferir a solução contendo DNA para um novo tubo cónico de 50 mL e adicionar 10 mL de resina de purificação de DNA (ver Tabela de materiais). Suspenda a resina suavemente.
    11. Centrifugar o tubo a 625 x g por 1 min usando o rotor de balanço-balde. Descartar a solução e manter a resina na parte inferior.
    12. Adicionar 15 mL da solução de lavagem de coluna (acetato de potássio 80 mM, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA e 55% de etanol) para tubo cónico de 50ml e agitar suavemente para suspender a resina. Repita a etapa 1.2.11.
      Nota: A solução de lavagem da coluna deve ser preparada usando pyrocarbonate de dietilo (DEPC)-Tratado de água ou água livre de nuclease.
    13. Adicionar 5 mL da solução de lavagem da coluna com o tubo cónico de 50 mL e suspender a resina com uma pipeta de 5 mL. Aplique a resina à coluna (consulte Tabela de materiais) que é definido em um tubo de vácuo. Vácuo a coluna até que a resina seque. Adicione 6 mL de solução de lavagem de coluna para a coluna e o vácuo.
    14. Uma vez que a resina seca visualmente, retire o reservatório da coluna. Transfira a seção inferior da coluna (resina) para um tubo de 1,5 mL. Centrifugue a coluna na velocidade máxima por 2 min usando microcentrifuga secar a resina.
    15. Transferi a seção inferior da coluna (resina) para um novo tubo de 1,5 mL. Adicionar 300 µ l de água nuclease-livre para a coluna e esperar até que a resina toda encharcada.
    16. Centrifugue a coluna na velocidade máxima durante 1 min coletar o plasmídeo de DNA contendo solução (200-250 µ l).
    17. Trate a solução que contém ADN com fenol-clorofórmio (1:1), depois com clorofórmio como segue.
      1. Adicionar o mesmo volume de fenol-clorofórmio (1:1) para a solução que contém ADN (200-250 µ l), agite bem e centrifugar a velocidade máxima durante 2 min usando microcentrifuga. Recolher a camada superior (solução contendo DNA) e adicioná-lo para um novo tubo de 1,5 mL. Repita este passo 1x.
      2. Adicione o mesmo volume de clorofórmio à solução contendo DNA (200-250 µ l), agitar bem, centrifugar a velocidade máxima por 1 min. pegue a camada superior (solução contendo DNA) e adicioná-lo para um tubo de 1,5 mL.
        Nota: Endotoxinas (lipopolissacarídeo) induz a sinalização celular em algumas células. Para evitar tais efeitos imprevisíveis, etapa 1.2.17 é recomendada, que pode reduzir a contaminação de endotoxinas.
    18. Precipitar o plasmídeo de DNA utilizando a técnica de precipitação do etanol como segue.
      1. Adicionar 1/9 do volume de mistura de DNA de acetato de sódio 3M (pH 5,5) e 20 x do volume de acetato de sódio 3M de 100% de etanol à solução contendo DNA. Por exemplo, adicione 27,8 µ l de acetato de sódio 3M e 278 µ l de etanol 100% a 250 µ l da solução de DNA (o volume final é 555.8 µ l).
      2. Manter a solução a-80 ° C durante 20 minutos pelo menos. Centrifugar a velocidade máxima por 20 min no 4 ˚ c. Descartar a solução e manter a pelota. Adicionar 200 µ l de etanol 75% e lave o interior do tubo. Centrifugar por 20 min a 4 ° C, descartar a solução e manter a pelota. Seca o sedimento de DNA usando um concentrador a vácuo.
      3. Adicione 100-250 µ l de tampão TE (pH 8.0) para o tubo. Dissolver o sedimento de DNA e verificar a concentração de DNA usando um espectrofotômetro no comprimento de onda de 260 nm. Manter a concentração de DNA em torno de 0,5 mg/mL.

2. mamífero ensaio do dois-híbrido

  1. Manter as células.
    1. Cultura de células de HepG2 de carcinoma hepatocelular humano em um 750 mL, frasco de cultura de tecidos de2 175 cm com a mídia essencial mínimo livre de vermelho de fenol (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; inactivadas pelo calor), 2 mM L-glutamina e 1% solução de penicilina-estreptomicina (antibióticos) para manter as células.
    2. Cultura de células em um 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C até que as células são aproximadamente 90% de Confluencia.
      Nota: Para reduzir a atividade estrogênica fundo, vermelho de fenol-livre médio deve ser usado para todos os experimentos M2H. Esta etapa deve ser executada dentro de uma câmara de segurança limpa banco biológico. As células devem ser mantidas a cultura de pilha mamífera geral protocolo7a seguir.
  2. Prepare as células para transfeccao.
    Nota: As seguintes etapas processuais devem ser realizadas dentro da câmara de segurança limpa banco biológico. As células são cultivadas/incubadas em um 5% CO2-incubadora de 37 ° C completados, nesta etapa de cada vez.
    1. Replate confluentes a 90%, para as placas de 24 poços; Enxagúe as células 1 x com tampão fosfato salino (PBS).
    2. Adicionar 7 mL de solução de tripsina-EDTA 0,05% para o frasco de cultura e Embeba as células para 1-2 min, mantendo o frasco de cultura em uma bancada limpa, à temperatura ambiente. Remover uma parte da solução do trypsin-EDTA e deixar 1 a 2 mL da solução no frasco de cultura. Incube o frasco de cultura na incubadora para 1-2 min.
    3. Bata o fundo do frasco para separar as células e verificar as células sob o microscópio.
      Nota: Se as células ainda estão conectadas para o balão, incubar durante mais 1-2 minutos e, em seguida, repita a etapa 2.2.3.
    4. Suspender as células em vermelho de fenol-livre MEM suplementado com 10% 1% solução de penicilina-estreptomicina, 2 mM L-glutamina e carvão vegetal-despojado FBS (inactivadas pelo calor).
      Nota: Carvão vegetal-despojado FBS deve ser utilizado para reduzir o efeito do estrógeno endógeno derivado de soro.
    5. Contar o número de células e células em uma placa de 24 em uma densidade de 1,2 x 105 células/poço de sementes. Atribua três poços para cada ponto de dados (três vias).
    6. Cultura que das células durante a noite. Vá para a etapa 2.4.1.
  3. Prepare uma mistura de ADN para transfeccao.
    Nota: O seguinte plasmídeo DNAs são transfectadas em um poço: 100 ng de pG5-Luc repórter do, 50 ng do plasmídeo de expressão de proteínas da fusão GAL4DBD (pBIND) e 50 ng do plasmídeo de expressão de proteínas da fusão VP16AD (Pacto).
    1. Para analisar a atividade de dimerização do ligante-dependentes ERα LBD, prepare as combinações a seguir (Figura 3). Combinação (i): pG5-Luc pBIND-hERαEF Pacto e pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + pacto. Combinação (ii): pG5-Luc pBIND-hERαEF pacto-hERαEF e pG5-Luc + pBIND-mERαEF + + mERαEF-pacto. Combinação (iii): pG5-Luc pBIND pacto-hERαEF e pG5-Luc + pBIND + + pacto-mERαEF.
      Nota: Combinação (i) representa o nível basal de experimental de humano ERα LBD e mouse ERα LBD, respectivamente. Se o resultado mostra um nível extremamente elevado com ligante sozinho, esse método é inviável para uso com o ligante (por exemplo, dietilestilbestrol [DES]). Combinação (ii) representa os níveis de humano dimerized ERα LBD e mouse dimerized ERα LBD, respectivamente. Combinação (iii) representa controles negativos; Use este conjunto apenas quando a experiência é realizada pela primeira vez avaliar o nível de fundo do sistema.
    2. Antes de misturar, calcular o total de quantidade de DNA necessária com base no número de poços para transfeccao. Para experimentos conduzidos em triplica e em dados de cinco pontos, misturar o plasmídeo seguir DNAs em tubos de dois 1,5 µ l para combinações (i) e (ii): pG5-Luc, 5 (pontos de dados) x 3 (poços) x 100 ng = 1.500 ng (15 µ l); pBIND-mERαEF, 5 (pontos de dados) x 3 (poços) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l); Pacto (para combinação i) ou pacto-mERαEF (para combinação ii), 5 (pontos de dados) x 3 (poços) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l).
      Nota: A concentração de cada solução de DNA de plasmídeo é de 0,1 µ g / µ l.
    3. Precipitar a mistura de DNA utilizando a técnica de precipitação de etanol. Adicionar 1/9 do volume de mistura de DNA de acetato de sódio 3M (pH 5,5) e 20 x do volume de acetato de sódio 3M de 100% de etanol à mistura do DNA. Em seguida, o vórtice do tubo.
      Nota: por exemplo, adicione 3,4 µ l de acetato de sódio 3M e 34 µ l de etanol 100% para os 30 µ l de mistura de DNA de plasmídeo exemplificada na etapa 2.3.2. Essa etapa ajuda a manter uma condição de transfeccao invariável, e não é necessário executar esta etapa em uma câmara de segurança biológica.
    4. Manter a mistura durante a noite a-20 ° C. Centrifugar, a velocidade máxima por 20 min a 4 ° C. Descarte a solução (a pelota é invisível). Adicionar 120 µ l de etanol a 75% para o tubo; em seguida, lave o interior do tubo. Centrifugar por 20 min a 4 ° C. Descartar a solução e seque a mistura de DNA usando um concentrador a vácuo durante 30 min.
  4. Execute o transfection.
    Nota: As seguintes etapas devem ser executadas em uma bancada limpa ou uma câmara de segurança biológica.
    1. Na manhã seguinte, lave as células semeadas em uma placa de 24 (da etapa 2.2.6) 2x com 0,5 mL de PBS (temperatura ambiente).
    2. Adicione carvão quente (37 ° C) fresco livre de vermelho de fenol MEM suplementado com 10%-despojado FBS (inactivadas pelo calor) e 2 mM L-glutamina sem antibióticos a cada poço (média de 0,5 mL/poço). Manter as células em um 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C.
    3. Suspenda a mistura de DNA de plasmídeo secas (da etapa 2.3.4) no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) (sem soro, vermelho de fenol-livre, sem glutamina; 13 µ l/poço). Calcule as quantidades de DMEM do número de poços para transfeccao.
      Nota: 15 poços para combinação de (i) x µ l 13 = 195 µ l e 15 poços para combinação (ii) x µ l 13 = 195 µ l.
    4. Suspender o reagente de transfeccao (ver Tabela de materiais; 1,5 µ l/poço) em DMEM (12,5 µ l/poço) em outro tubo de 1,5 mL. Calcule a quantidade de reagente de transfeccao e DMEM do número de poços para transfeccao.
      Nota: 30 [15 poços para combinação] (i) e 15 poços para combinação (ii) x 1,5 µ l de reagente de transfeccao + 30 x 12,5 µ l de DMEM = 420 µ l.
    5. Adicione uma quantidade igual do meio de reagente de transfeccao (da etapa 2.4.4) para cada tubo (da etapa 2.4.3). Incube os tubos por 5-10 min à temperatura ambiente.
      Nota: 200 µ l de meio de reagente de transfeccao + 195 µ l de combinação mistura de DNA (i) = 395 µ l e 200 µ l de meio de reagente de transfeccao + 195 µ l de combinação mistura de DNA (ii) = 395 µ l. É importante adicionar um igual volume de meio de reagente de Transfeccao para os tubos de combinação (i) e (ii). Não é necessário usar o meio nesta etapa.
    6. Adicione a mistura combinada (da etapa 2.4.5) a cada poço (25 µ l/poço) da placa de 24 poços (da etapa 2.4.2) e incube as celulas para 6 h no 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C.
    7. Remova a placa de 24 o transfeccao. Adicionar carvão quente (37 ° C) fresco livre de vermelho de fenol MEM suplementado com 10%-despojado FBS (inactivadas pelo calor), 2 mM L-glutamina, solução de 1% penicilina-estreptomicina e ligante (suspendido em etanol) (média de 0,5 mL/poço). Cultura de células para 16-18 h no 5% CO2-completados, incubadora de 37 ° C.
  5. Colheita das amostras.
    1. Enxagúe as células com 1 mL de PBS e, em seguida, adicionar 100 µ l de tampão de Lise passiva 1x (ver Tabela de materiais).
    2. Agite vigorosamente as placas de 24 poços com um misturador do vortex para separar as células.
    3. Congelar as placas (lisados celulares) 1x por nitrogênio líquido ou salvá-los a-80 ° C, antes da análise. Imediatamente antes do ensaio, agite vigorosamente as placas num agitador até que estejam à temperatura ambiente.
      Nota: Este processo impede irregularmente aparecendo valores anômalos de atividade de luciferase.
  6. Realize um ensaio de dual-luciferase.
    1. Preparar os reagentes para o sistema dual-luciferase ensaio (ver Tabela de materiais).
      1. Para fazer o tampão de substrato (LAS) do ensaio de luciferase, adicione todos os buffer de ensaio do luciferase no substrato de ensaio de luciferase que está em um frasco de vidro marrom. Salvar o buffer de LAS a-20 ° C.
        Nota: O buffer de LAS deve ser aquecido à temperatura ambiente antes do uso.
      2. Para fazer o buffer de substrato (RLS) Renilla luciferase, misture Renilla luciferase substrato e buffer de Renilla luciferase na proporção de 01:50. Faça RLS frescos de buffer para cada ensaio e usar um tubo preto ou um tubo sombreado por papel alumínio. Calcule a quantidade de buffer de RLS, fazendo uma nova reserva.
        Nota: O buffer RLS deve ser aquecido à temperatura ambiente antes do uso.
    2. Defina os reagentes no leitor de microplacas.
      1. Lavagem a injeção linhas 2x com etanol a 70%; em seguida, lave as linhas 2 x com água.
        Nota: Isto é importante para evitar perturbar os resultados do ensaio.
      2. Conjunto as LAS do buffer para o P-injector linha (primeira injeção) e definir o buffer RLS para a linha M-injector (segunda injeção). Não misture esses buffers. Buffer de RLS inibe a atividade do luciferase.
    3. Aplicam-se 10 µ l de amostras colhidas (da etapa 2.5.3) para a placa de plástico branca de 96 poços.
    4. Aplique as seguintes configurações para o leitor de microplacas. Para o P-injector, usar um volume de 50 µ l, um atraso de 2 s e uma velocidade de 50 µ l/s. Para o M-injector, usar um volume de 50 µ l, um atraso de 2 s e uma velocidade de 50 µ l/s. definir um tempo de integração do conjunto s. 15 a temperatura a 25 ° C.
    5. Execute o leitor de microplacas.
    6. Registrar os valores da atividade do luciferase (IPValue) e os valores da atividade do luciferase Renilla (IMValue) usando o programa de aquisição de dados (consulte a Tabela de materiais).
    7. Lave as linhas de injeção após a coleta de dados (consulte a etapa 2.6.2.1).
  7. Realizar análise de dados.
    1. Use os valores normalizados (IPValue/IMValue) para análise de dados.
    2. Defina o valor normalizado de combinação (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pacto] com veículo (ligante de 0 nM) como 1 para o cálculo do nível basal e o homodimerized ERα LBD nível. Os níveis são representados como "Actividade relativa".

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Representative Results

Figura 3 exibe o esquema de respostas possíveis na combinação (i) e células de combinação (ii) do plasmídeo-transfectadas. Os resultados experimentais são mostrados na Figura 4. A atividade de combinação (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pacto) mostra a estimulação por 10 nM E2(Figura 4),porque o ERα LBD contém o domínio funcional dependente de ligante transactivation, AF-2. Agonista (por exemplo, E2) que vincula o ERα LBD recrutas transcrição coactivator(s) ao domínio AF-2. Este evento faz com que a ativação transcricional sem interação com a VP16AD fusão LBD e torna difícil avaliar a atividade de homodimerization LBD devido o fundo inespecífico (Figura 3C). A atividade de combinação (ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + mERαEF-pacto) observou-se com 1 nM e 10 nM E2 tratamento(Figura 4). Seria possível determinar a atividade de homodimerization ERα LBD agonista-dependente se a concentração de ligante adequado para detectar a atividade de combinação (ii) sem a ativação da combinação (i) pode ser encontrada (por exemplo, o condição de 1 nM E2 na Figura 4A). Assim, é difícil detectar a agonista-mediada ERα LBD homodimerization atividade usando o ensaio de M2H. Por outro lado, a atividade da combinação (i) com 4OHT foi o mesmo que o controle do veículo (0 nM) nível (Figura 4B). Estes resultados sugerem que a função de AF-2 de ERα não é ativada por 4OHT. Assim, o ensaio M2H é uma opção viável para analisar a atividade de homodimerization de ERα LBD com 4OHT (Figura 3B, 3E).

A atividade da combinação de rato ERα LBD expressão plasmídeos (pBIND-mERαEF + mERαEF-pacto) com 4OHT foi significativamente maior do que a combinação de plasmídeo de expressão ERα LBD humana (pBIND-hERαEF + pacto-hERαEF) (Figura 5A, 5B). Este resultado indica que a atividade de homodimerization 4OHT-dependente do mouse ERα LBD é mais potente que o humano ERα LBD. Além disso, analisamos a atividade de homodimerization do 4OHT-dependente LBD usando o humano-mouse F-domínio-trocou ERα LBD plasmídeo de expressão, mERαEhF (rato domínio ERα E com domínio de F humano) e hERαEmF (domínio humano de ERα E com domínio do mouse F). A atividade de homodimerization de mERαEhF foi significativamente menor do que mERαEF. Em contraste, a atividade de homodimerization de hERαEmF foi significativamente maior do que hERαEF (Figura 5-C). Assim, parece que o domínio de F tem uma influência sobre a atividade de homodimerization espécie 4OHT-dependente ERα LBD.

Estes resultados sugerem que a atividade de dimerização ERα LBD de 4OHT-como ligantes, como SERMs, pode ser detectada pelo ensaio M2H. Em seguida, vamos demonstrar uma possível maneira de analisar a atividade do homodimerization ERα LBD de químicos agonísticos. Atividades de dimerização ERα LBD de E2 e dietilestilbestrol (DES) podem ser detectadas por ensaio M2H quando usando um único-amino-ácido-uma mutação ERα LBD (rato ERα-I362D). Esta mutação interrompe a atividade de recrutamento coactivator E2-dependente de ERα LBD8. Combinação (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + pacto) não foi ativada pelo E2 nem DES em qualquer concentração foram analisados (Figura 6B), que era diferente do WT ERα LBD (Figura 6A). A atividade de dimerização LBD ERα-I362D do DES foi mais potente que o E2 (Figura 6B). O mutante pode ser usado para um estudo comparativo da atividade de dimerização do agonista-dependente ERα LBD; no entanto, requer mais análise e caracterização da funcionalidade biológica deste mutante ERα.

Figure 1
Figura 1 : Diagrama de plasmídeos utilizados para o ensaio de M2H. (A) este painel mostra pG5-Luc, o repórter do que contém um elemento GAL4-responsivos (RE GAL4) fundido-se com um codificação de gene de luciferase. (B), este painel mostra pBIND-mERαEF, o plasmídeo de expressão de proteínas para GAL4DBD mERαEF de fusão; Renilla luciferase trabalha para normalizar a eficiência do transfection. (C), este painel mostra o pacto-mERαEF, o plasmídeo de expressão de proteínas para o sinal de localização nuclear (NLS)-fundido VP16AD fusão mERαEF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Diagrama de plasmídeo de expressão ERα LBD usado neste experimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Esquema do ensaio M2H. Esta figura mostra o representante condição das células transfectadas com combinação (i) plasmídeos (à esquerda) e as células transfectadas com plasmídeos (ii) combinação (à direita). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Atividade de dimerização ligand-dependente do mouse ERα LBD. (A), este painel mostra que a atividade do luciferase das células transfectada com plasmídeos de combinação (i) (pG5-Luc + pacto + pBIND-mERαEF) ou combinação (ii) plasmídeos (pG5-Luc + pacto-mERαEF + pBIND-mERαEF) com ou sem E2. (B) este painel mostra a atividade do luciferase das células transfectadas com combinação (i) plasmídeos ou combinação (ii) plasmídeos com ou sem 4OHT. A atividade é representada como a média ± o desvio padrão (SD). Foi recriado o gráfico do painel A partir de dados previamente publicados11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Atividade diferencial dimerização de rato e humanos ERα LBD com 4OHT. (A), este painel mostra a atividade do luciferase das células transfectada com a combinação de mouse plasmídeo de expressão ERα LBD (Pacto-mERαEF + pBIND-mERαEF) ou a combinação de plasmídeo de expressão ERα LBD humano (Pacto-hERαEF + pBIND-hERαEF) com ou sem 4OHT. Intervalo de atividade (B) a baixa do painel A é ampliado para mostrar a atividade de dimerização do humano ERα LBD e experimentais níveis basais (Pacto pBIND-mERαEF, pacto + pBIND-hERαEF). (C) este painel mostra a atividade do luciferase das células transfectadas com plasmídeos de expressão F-domínio-trocado LBD rato-humanos. mERαEhF denota rato ERα E domínio fundiu-se com o domínio de F humano. hERαEmF denota humano domínio ERα E fundida com mouse domínio de F. A atividade é representada como a média ± SD. Os gráficos foram recriados de dados previamente publicados1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Deteção da mediada por agonista ERα LBD dimerização atividade usando um AF-2 uma mutação ERα LBD. (A), este painel mostra que a atividade do luciferase das células transfectada com plasmídeos de combinação (i) (pG5-Luc + pacto + pBIND-mERαEF) ou combinação (ii) plasmídeos (pG5-Luc + pacto-mERαEF + pBIND-mERαEF) com ou sem ligantes; E2 (vermelho), DES (roxo). (B) este painel mostra a atividade do luciferase das células transfectadas com combinação (i) plasmídeos (pG5-Luc + pacto + pBIND-mERα-I362D) ou combinação (ii) plasmídeos (pG5-Luc + pacto-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) com ou sem ligantes; E2 (vermelho), DES (roxo). A atividade é representada como a média ± SD. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de M2H, incidindo sobre as condições de ensaio para a detecção da atividade de homodimerization de ERα LBD como um exemplo. Em geral, o ensaio M2H não é popular para a avaliação da atividade de dimerização ERα LBD ligand-dependente. Isto é devido a ERα LBD possuindo uma função de ativação transcricional; perturba a atividade dos quais, em alguns casos, os resultados do ensaio M2H. No entanto, como demonstramos aqui, o ensaio M2H pode ser usado para analisar a atividade de dimerização LBD de certas substâncias que não ativar a função de transactivation do AF-2 de LBD (e.g., 4OHT, SERMs). Para reduzir a atividade intrínseca de LBD (atividade de fundo), selecionamos o menor E2-contendo carvão-despojado FBS dos lotes de produção e usado FBS inactivadas pelo calor de carvão-despojado. Esses fatores são importantes para o sucesso do ensaio M2H usando o WT ERα LBD e para detectar atividade de força nuclear fraca. Além disso, mostramos o ERα LBD atividade dimerização dos agonistas (E2 e DES) usando o mutante mERα-I362D, que interrompe a atividade de recrutamento coactivator agonista-dependente para o AF-2. Estes resultados sugerem que o ensaio M2H poderia ser mais útil para a avaliação da atividade de dimerização ERα LBD ligand-dependente.

No domínio da investigação NR, o ensaio M2H tem sido usado para a avaliação do ligante-dependentes coactivator ou atividade de recrutamento corepressor de LBDs NR9,10. O plasmídeo de pBIND fundido com a região de interação NR do cofactor é usado para este tipo de experimento, em vez de usar o pBIND-ERαEF. Este experimento usa o elemento de proteína curta contendo o NR interagindo motivo (LxxLL) ao invés de um maior domínio estrutural do coactivator. Uma possibilidade é que o maior elemento coactivator pode ativar a transcrição sem o recrutamento da fusão VP16AD LBD; que poderiam atrapalhar os resultados do ensaio de M2H. Alternativamente, este protocolo pode ser usado para analisar a actividade de ligação de uma variedade de substâncias para o ERα. Por exemplo, as células foram transfectadas com pG5-Luc, motivo de interação de NR pBIND-fundida e plasmídeos pacto-ERαEF e, em seguida, tratadas com vários produtos químicos, tais como o sistema endócrino ou potencial terapêutica hormonal. Se a atividade do luciferase é aumentada por um produto químico neste ensaio, então prevê-se que a química deve estar interagindo com o ERα LBD para recrutar o NR interagindo motivo8.

O ensaio de M2H demonstra as interações da proteína-proteína em células de mamíferos. Como mencionado na introdução, o papel fisiológico de interações da proteína-proteína pode ser diferente em um contexto de célula tipo-específicas. M2H ensaios podem fornecer os resultados da atividade de interação da proteína-proteína no mesmo contexto celular que é usado para outras experiências, como a análise da atividade transcricional. Além disso, ele pode analisar o efeito de sinalização de célula moduladores (por exemplo, inibidores ou ativadores de quinases) envolvidos com interações da proteína-proteína nas células. Esta é uma vantagem do ensaio M2H em comparação com outros estudos de interacção em vitro da proteína-proteína.

No entanto, ele precisa ser considerado que as interações da proteína-proteína detectada através da M2H ensaio pode não representar uma interação direta entre duas proteínas. Em outras palavras, há a possibilidade de que o factor celular existe estão permitindo uma conexão entre duas proteínas. Se tal uma consideração surge, então, a avaliação dos estudos de interacção em vitro da proteína-proteína deve ser necessária, tais como o ensaio de pulldown GST-fusão da proteína. Além disso, é melhor verificar o nível de expressão de pBIND e pacto plasmídeo-derivada de proteínas nas células para avaliar o desempenho do sistema de ensaio. Especialmente quando a atividade de interação não pode ser detectada, as informações dos níveis de expressão de proteínas ajudam a determinar a causa do resultado. Anticorpo anti-Gal4DBD e anticorpo anti-VP16AD podem ser usados para uma análise ocidental do borrão.

Se o laboratório tem a montagem experimental para os ensaios do repórter do luciferase, que pode ser usado para analisar a atividade de transcrição de elementos reguladores ou fatores de regulação, é bastante simples de realizar o ensaio M2H. O ensaio de M2H é um método aditivo vantajoso para estudos de regulamento transcriptional.

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Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgments

Os autores agradecer Sueyoshi DRS e Wang no nacional Instituto de Ciências de saúde ambiental (NIEHS) por sua leitura crítica do manuscrito e Tanner Jefferson para realizar procedimentos no vídeo. Este trabalho foi apoiado pela 1ZIAES070065 de institutos nacionais de saúde Grant (para K.S.K) da divisão de pesquisa Intramural do NIEHS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

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References

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Cancer Research questão 142 mamíferos do ensaio do dois-híbrido alfa do receptor de estrógeno receptor nuclear domínio ligand-ligando dimerização tamoxifeno modulador de receptor de estrogênio seletivo
Detectando a actividade de dimerização de domínio ligante-ligação do Receptor de estrogênio alfa usando o ensaio dos mamíferos do dois-híbrido
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Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

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