Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Att upptäcka Ligand-bindande domänen Dimerization aktiviteten av östrogen Receptor alfa med däggdjur två-Hybrid-analys

Published: December 19, 2018 doi: 10.3791/58758
Automatic Translation
1, 1
1Reproductive Developmental Biology Laboratory, National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health (NIH)

Summary

Vi presenterar en metod för att analysera 4-hydroxi-tamoxifen-beroende östrogen receptor ligand-bindande domänen dimerization alfaaktiviteten med däggdjur två-hybrid-analys.

Abstract

Östrogen receptor alfa (ERα) är en östrogena ligandberoende transkription regulator. Sekvensen av ERα protein är starkt bevarad bland arter. Det har varit tänkt att fungera av mänskliga och mus ERαs är identiska. Vi visar differentiell 4-hydroxi-tamoxifen (4OHT) på mus och mänsklig ERα ligand-bindande domänen (LBD) dimerization verksamhet med däggdjur två-hybrid (M2H) analys. M2H analysen kan påvisa effektiviteten hos LBD homodimerization aktivitet i däggdjursceller, utnyttja transfection av två protein uttryck plasmider (GAL4 DNA-bindande domänen [DBD] fusion LBD och VP16 transkription domänen [VP16AD] fusion LBD) och en GAL4-responsive element (GAL4RE) smält luciferas reporter plasmid. När GAL4DBD fusion LBD och VP16AD fusion LBD gör en dimer i cellerna, detta proteinkomplex binder till GAL4RE och sedan aktiverar ett luciferas genuttryck genom aktiviteten VP16AD beroende transkription. 4OHT-medierad luciferas aktiveringen är högre i HepG2 celler som var transfekterade med musen ERα LBD fusion protein uttryck plasmidsna än i de mänskliga ERα LBD fusion protein uttryck plasmid transfekterade cellerna. Detta resultat tyder på att effekten av 4OHT-beroende musen ERα LBD homodimerization aktivitet är högre än mänsklig ERα LBD. Utnyttjandet av M2H analysen är i allmänhet inte idealisk för utvärdering av nukleär receptor LBD dimerization aktivitet, eftersom agonistiska ligander öka den basala nivån för aktiviteten LBD och som försvårar upptäckten av LBD dimerization aktivitet. Vi hittade att 4OHT inte ökar ERα LBD basal aktivitet. Det är en nyckelfaktor för att kunna avgöra och detektera 4OHT-beroende LBD dimerization aktiviteten för framgångsrikt med M2H analys. ERα LBD-baserade M2H analyser kan användas för att studera aktiviteten partiell agonist av selektiv östrogen receptor modulatorer (t.ex., 4OHT) i olika proteintillverkningen.

Introduction

Östrogen receptor alfa (ERα) är en östrogena ligandberoende transkription regulator. Den amino syran sequenceof ERα är mycket bevarad bland arter. På grund av den högre homologi mellan människa och mus ERα, funktionen av dessa receptorer är tänkt som identiska och differentiell aktiviteten av östrogena substanser (t.ex.tamoxifen) hos dessa arter orsakas av artens skillnader i kemiska ämnesomsättning snarare än av de strukturella skillnaderna i ERα. ERα har starkt konservativa domän strukturer som är vanliga bland nukleär receptor (NR) överfamiljen, designerat A till F domäner. Den E domänen eller ligand-bindande domän (LBD) inkluderar ligand-bindande fickan och transkriptionell aktiveringen funktion 2, heter AF-2. Domänen F är lokaliserad direkt anslutning till E-domänen och är mest variabla domänen bland NRs. Även mellan mänskliga och mus ERα, homologi mellan domänen F är betydligt lägre än för andra domäner1. Den ligand-bundna LBD av ERα förbättrar homodimerization av proteinet ERα att binda det specifika östrogenkänsliga DNA elementet direkt för att reglera den ligandberoende gentranskription (klassisk åtgärd av ERα). Kristallografiska studier har avslöjat den differentiella positionering av helix 12 (AF-2 core-domän) med estradiol (E2)- eller 4-hydroxi-tamoxifen (4OHT) - bundna LBD dimerer2,3. Domänen ERα F (45 aminosyror) ansluta helix 12 direkt. Dock finns det ingen information om effekten av denna utvidgning av 45 aminosyror (F domän) från spiralen 12 på den ERα LBD dimerization. I denna studie visar vi bidrag F domänen till den artspecifika 4OHT-beroende ERα LBD homodimerization med ett däggdjur två-hybrid (M2H) analys.

M2H analysen är en metod att påvisa protein-protein interaktioner i däggdjursceller införa de tre olika kontrollplasmid-DNA: två protein uttryck plasmider, som uttrycker GAL4 DNA-bindande domänen (DBD) fusion ERα LBD och VP16AD fusion ERα LBD, och en GAL4RE-smält luciferas uttryck reporter plasmid. När GAL4DBD fusion ERα LBD och VP16AD fusion ERα LBD interagera (göra en dimer) i cellerna, detta proteinkomplex binder till GAL4RE och, sedan, aktiverar luciferas genuttryck genom funktionen VP16AD-beroende transkription. Nivån på LBD homodimerization kan utvärderas av aktiviteten luciferas.

Den jäst två-hybrid (Y2H)-analysen är en alternativ metod baserat på samma princip som använder jäst som värdmiljön. Tidigare rapporter med hjälp av Y2H systemet visade att F-domän-stympad människa ERα LBD ökar E2-beroende coactivator rekrytering, sluta att F domänen förhindrar E2-medierad transkription4. Detta resultat är oförenligt med andra rapporter som visat försvagat transkriptionell aktiviteten av F-domän-trunkeras mänskliga ERα i däggdjursceller5,6. Nyligen visat vår studie, använda M2H, att aktiviteten E2-beroende coactivator rekrytering av mänskliga ERα LBD är minskade F domän trunkering i däggdjursceller och överensstämmer med transkription aktivitet1. Dessa observationer tyder på att den fysiologiska rollen protein-protein interaktioner skiljer sig i en cell typspecifika sätt och sammanhang. M2H analysen kan påvisa protein-protein interaktioner aktivitet i samma cellulära sammanhang som används för att bestämma aktiviteten transkriptionell. Detta ger en fördel M2H analysens jämfört med Y2H eller annan in vitro- protein-protein interaktioner analyser.

Det finns fortfarande frågor rörande de molekylära mekanismerna för aktiviteten partiell agonist av selektiva östrogenreceptormodulatorer (SERMs) (t.ex., 4OHT) att reglera ERα-medierad transkription. ERα LBD-baserade M2H analyser kan användas för att studera mekanismen för partiell agonist aktiviteten av SERMs i olika proteintillverkningen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av plasmider för däggdjur två-hybrid-analysen

  1. Använda de följande plasmidsna: pG5-Luc, pBIND-ERαEF och pakten-ERαEF.
    Obs: Plasmidsna är tillgängliga från författarna på begäran och skickas på filterpapper. pG5-Luc är reporter plasmiden som innehåller fem repetitioner av GAL4 responsive element smält med luciferas uttryck enheten (figur 1A). pBIND-ERαEF är protein uttryck plasmiden för GAL4DBD-smält ERα LBD proteiner. pBIND-ERαEF innehåller ett Renilla luciferas uttryck för att normalisera transfection effektivitet (figur 1B). Pakten-ERαEF är protein uttryck plasmiden för de VP16AD-smält ERα LBD proteinerna (figur 1C). Diagrammet av den uttryckta proteinstrukturen från plasmidsna visas i figur 2.
  2. Förbereda kontrollplasmid-DNA.
    1. Klipp ut området plasmid-loaded från med ren sax-papper och sätta det i en 1,5 mL tub. Använd handskar och använda ren pincett för att plocka upp plasmiden-laddat papper. Tillsätt 100 µL av Tris-EDTA (TE) buffert (pH 8,0) och skaka väl.
    2. Tillsätt 1 µL av plasmid DNA lösningen från steg 1.2.1 till behöriga Escherichia coli celler (se Tabell av material) och hålla röret på is i 15 min.
    3. Heat-shock den plasmid-lade behöriga celler; Inkubera i rör i 42 ° C vattenbad för 30 s och sedan hålla dem på isen i 2 min.
    4. Tillsätt 250 µL av super optimal buljong med catabolite förtryck (SOC) medium (rumstemperatur) till rör och kultur med skakningar vid 37 ° C i 30 min.
    5. Tallrik 100 µL av den odlade E. coli på förvärmd Luria buljong (LB) plåt med 100 µg/mL ampicillin (10 cm-diameter maträtt) och kultur vid 37 ° C under natten.
    6. Plocka en koloni från plattan och Lägg det i en 14 mL tub innehållande 2 mL fantastisk buljong (TB) med 100 µg/mL ampicillin. Kultur med skakningar vid 37 ° C tills mediet är svagt dystra.
    7. Tillsätt 1 mL av det odlade mediet från steg 1.2.6 till en Ånghärdad 250 mL glas kolv innehållande 50 mL TB med 100 µg/mL ampicillin. Kultur med skakningar vid 37 ° C i 20-24 h.
    8. Överföra den odlade E. coli till en 50 mL konisk rör och centrifugera vid 3 450 x g i rumstemperatur i 30 min med swing-hink rotorn. Kassera medium. Spara E. coli pelleten vid-80 ° C.
    9. Tillsätt 3 mL cell resuspension lösning (se Tabell för material) till den E. coli pellet och avbryta det helt. Tillsätt 3 mL cell lysis lösning (se Tabell för material), mix röret försiktigt genom att invertera det 10 x, och hålla den på is för 5 min (hålla tiden punctually). Tillsätt 6 mL neutralisering (se Tabell för material), blanda röret stadigt med avlyssning, och sedan hålla den på is i 10 min.
    10. Centrifugera röret vid 3 450 x g vid 4 ° c i 30 min med swing-hink rotorn. Överföra DNA-innehållande lösningen till en 50 mL konisk reservrör och tillsätt 10 mL av DNA rening harts (se Tabell för material). Avbryta kådan försiktigt.
    11. Centrifugera röret vid 625 x g för 1 min med swing-hink rotorn. Kassera lösningen och hålla kådan längst ner.
    12. Tillsätt 15 mL kolumn tvättlösning (80 mM kalium acetat, 8,5 mM Tris-HCl [pH 7,5], 40 µM EDTA, och 55% etanol) till 50 mL koniska rör och skaka den försiktigt för att avbryta kådan. Upprepa steg 1.2.11.
      Obs: Kolumn tvättlösningen måste förberedas genom dietyleter pyrocarbonate (DEPC)-behandlat vatten eller nuclease-gratis vatten.
    13. Tillsätt 5 mL kolumn tvättlösning till 50 mL koniska röret och avbryta kådan med en 5 mL Pipettera. Gälla kolumnen kådan (se Tabell för material) som ställs på vakuum grenröret. Vakuum kolumnen tills kådan torka. Tillsätt 6 mL kolumn tvättlösning till kolumn och vakuum.
    14. När kådan torkar visuellt, lossa behållaren från kolumnen. Överföra den nedre delen av kolumnen (kåda) till en 1,5 mL tub. Centrifugera kolumnen med maximal hastighet i 2 min med en mikrocentrifug torka kådan.
    15. Överföra den nedre delen av kolumnen (kåda) till en ny 1,5 mL tub. Tillsätt 300 µL nuclease-fritt vatten i kolumnen och vänta tills den hela kådan är blöt.
    16. Centrifugera kolumnen med maximal hastighet för 1 min att samla plasmiden DNA-innehållande lösning (200-250 µL).
    17. Behandla den DNA-innehållande lösningen med fenol-kloroform (1:1), sedan med kloroform som följer.
      1. Tillsätt samma mängd fenol-kloroform (1:1) till DNA-innehållande lösning (200-250 µL), skaka väl och centrifugera vid maxhastighet för 2 min med en mikrocentrifug. Samla in det övre lagret (DNA-innehållande lösning) och lägga till en ny 1,5 mL tub. Upprepa detta steg 1 x.
      2. Tillsätt samma mängd kloroform till DNA-innehållande lösning (200-250 µL), skaka ordentligt och centrifugera med maximal hastighet i 1 min. samla det övre lagret (DNA-innehållande lösning) och lägga till den i en 1,5 mL tub.
        Obs: Endotoxin (lipopolysackarid) inducerar cellulär signalering i vissa celler. För att undvika sådana oförutsedda effekter, rekommenderas steg 1.2.17, vilket kan minska endotoxin kontaminering.
    18. Fällningen av plasmid DNA med hjälp av etanol nederbörd teknik enligt följande.
      1. Lägg till 1/9 av DNA blandning volym 3 M natriumacetat (pH 5,5) och 20 x 3M natrium acetat volym 100% etanol till DNA-innehållande lösning. Exempelvis lägga till 27,8 µL 3 M natriumacetat och 278 µL av 100% etanol till 250 µL av DNA lösningen (den slutliga volymen är 555.8 µL).
      2. Förvara lösningen vid-80 ° C i 20 min minst. Centrifugera vid maximal hastighet i 20 min vid 4 ˚C. Kassera lösningen och hålla pelleten. Tillsätt 200 µL av 75% etanol och skölj insidan av röret. Centrifugera i 20 minuter vid 4 ° C, kassera lösningen och hålla pelleten. Torr DNA pelleten med en vakuum koncentrator.
      3. Tillsätt 100-250 µL av TE buffert (pH 8,0) till röret. Lös upp DNA pelleten och kontrollera DNA koncentrationen med en spektrofotometer vid en våglängd på 260 nm. Hålla DNA koncentrationen runt 0,5 mg/mL.

2. däggdjur två-hybrid-analys

  1. Upprätthålla cellerna.
    1. Kultur mänskliga hepatocellulära carcinom HepG2 celler i en 750 mL, 175 cm2 vävnadsodling kolv med fenolrött-fri minsta nödvändiga media (MEM) kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS; Värmeinaktiverade), 2 mM L-glutamin, och 1% penicillin-streptomycin lösning (antibiotika) för att upprätthålla cellerna.
    2. Odla cellerna i en 5% CO2-kompletterade, 37 ° C inkubator tills cellerna är cirka 90% konfluenta.
      Obs: För att minska östrogena bakgrund aktivitet, fenolrött-fria medier ska användas för alla M2H experiment. Detta steg bör utföras inuti en ren bänk och biologiska säkerhetsskåp. Cellerna bör bibehållas efter allmänna däggdjursceller kultur protokoll7.
  2. Förbereda cellerna för transfection.
    Obs: Följande processuella åtgärder bör utföras inuti den rena bänk och biologiska säkerhetsskåp. Cellerna är odlade/inkuberas i en 5% CO2-kompletterade, 37 ° C inkubator i detta steg varje gång.
    1. Replate 90% konfluenta celler till 24-väl plåtarna. Skölj cellerna 1 x med fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. Tillsätt 7 mL 0,05% trypsin-EDTA-lösning till kultur kolven och njut cellerna för 1-2 min samtidigt hålla kultur kolven i en ren bänk vid rumstemperatur. Ta bort en del av trypsin-EDTA-lösningen och lämna 1-2 mL av lösningen i kolven, kultur. Inkubera kultur kolven i inkubatorn för 1-2 min.
    3. Smack botten av kolven så att lossa cellerna och kontrollera cellerna i Mikroskop.
      Obs: Om cellerna är fortfarande kopplade till kolven, inkubera i en annan 1-2 min, och upprepa sedan steg 2.2.3.
    4. Avbryta cellerna i fenolrött-Fri MEM kompletteras med 10% träkol-skrapat FBS (Värmeinaktiverade), 2 mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin lösning.
      Obs: Kol-skrapat FBS måste användas för att minska effekten av serum-derived endogent östrogen.
    5. Räkna antalet cell och utsäde celler i en 24-well platta på en densitet på 1,2 x 105 celler per brunn. Tilldela tre brunnar för varje datapunkt (tre exemplar).
    6. Odla cellerna över natten. Fortsätt till steg 2.4.1.
  3. Förbereda en DNA-blandning för transfection.
    Obs: Följande plasmiden DNAs är transfekterade i en brunn: 100 ng av pG5-Luc reporter plasmid, 50 ng av uttrycket plasmider för GAL4DBD fusionsproteiner (pBIND), och 50 ng av uttrycket plasmider för VP16AD fusionsproteiner (pACT).
    1. För att analysera aktiviteten ligandberoende ERα LBD dimerization, förbereda följande kombinationer (figur 3). Kombination (i): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pakten, och pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten. Kombination (ii): pG5-Luc + pBIND-hERαEF + pakten-hERαEF, och pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten-mERαEF. Kombination (iii): pG5-Luc + pBIND + pakten-hERαEF, och pG5-Luc + pBIND + pakten-mERαEF.
      Notera: Kombination a representerar den basal experimentell nivån av mänskliga ERα LBD och mus ERα LBD, respektive. Om resultatet visar en anmärkningsvärt hög nivå med ligand ensam, är denna metod omöjligt för användning med att ligand (t.ex., dietylstilbestrol [DES]). Kombination (ii) motsvarar nivåerna av dimerized mänskliga ERα LBD och dimerized mus ERα LBD, respektive. Kombination (iii) representerar negativa kontroller; använda detta endast när experimentet utförs för första gången att utvärdera bakgrundsnivån av systemet.
    2. Före blandning, beräkna totalen DNA belopp krävs baserat på antalet brunnar för transfection. För experiment som utförs i exemplar och fem datapunkter, blanda följande plasmiden DNAs i två 1,5 µL rör för kombinationer (i) och (ii): pG5-Luc, 5 (datapunkter) x 3 (brunnar) x 100 ng = 1,500 ng (15 µL); pBIND-mERαEF, 5 (datapunkter) x 3 (brunnar) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL); Pakten (för kombination i) eller pakten-mERαEF (för kombination ii), 5 (datapunkter) x 3 (brunnar) x 50 ng = 750 ng (7,5 µL).
      Obs: Koncentrationen av varje plasmid DNA lösning är 0.1 µg/µL.
    3. Fällningen DNA blandningen med etanol nederbörd tekniken. Lägg till 1/9 av DNA blandning volym 3 M natriumacetat (pH 5,5) och 20 x 3M natrium acetat volym 100% etanol till DNA blandningen. Sedan, vortex röret.
      Obs: till exempel lägga till 3,4 µL 3 M natriumacetat och 34 µL av 100% etanol den 30 µL av plasmid DNA blandning exemplifieras i steg 2.3.2. Detta steg hjälper till att hålla en oföränderlig transfection villkor, och det är inte nödvändigt att utföra detta steg i biologiska säkerhetsdragskåp.
    4. Hålla blandningen över natten vid-20 ° C. Centrifugera det med maximal hastighet i 20 min vid 4 ° C. Kassera lösningen (pelleten är osynlig). Lägga till 120 µL av 75% etanol i röret; Skölj sedan, insidan av röret. Centrifugera under 20 minuter vid 4 ° C. Kassera lösningen och torka DNA blandningen med en vakuum koncentrator för 30 min.
  4. Utföra transfection.
    Obs: Följande steg bör utföras i en ren bänk eller biologiska säkerhetsdragskåp.
    1. Följande morgon, skölj cellerna seedade i en 24-well platta (från steg 2.2.6) 2 x med 0,5 mL PBS (rumstemperatur).
    2. Lägg varmt (37 ° C) färska fenolrött-Fri MEM kompletteras med 10% träkol-skrapat FBS (Värmeinaktiverade) och 2 mM L-glutamin utan antibiotika till varje brunn (0,5 mL medium per brunn). Hålla cellerna i en 5% CO2-kompletterade, 37 ° C inkubator.
    3. Avbryta torkade plasmid DNA blandningen (från steg 2.3.4) i Dulbeccos modifierade örnens medium (DMEM) (inget serum, fenolrött-fri, utan glutamin; 13 µL per brunn). Beräkna mängder DMEM från antalet brunnar för transfection.
      Obs: 15 brunnar för kombination a x 13 µL = 195 µL och 15 brunnar för kombination (ii) x 13 µL = 195 µL.
    4. Avbryta transfection reagens (se Tabell för material; 1,5 µL per brunn) i DMEM (12,5 µL per brunn) i en annan 1,5 mL tub. Beräkna mängden transfection reagens och DMEM från antalet brunnar för transfection.
      Obs: 30 [15 brunnar för kombination] (i) och 15 brunnar för kombination (ii) x 1,5 µL transfection reagens + 30 x 12,5 µL av DMEM = 420 µL.
    5. Lägga till en lika stor mängd transfection reagens medellång (från steg 2.4.4) till varje rör (från steg 2.4.3). Inkubera rören för 5-10 min i rumstemperatur.
      Obs: 200 µL transfection reagens medium + 195 µL av kombination a DNA blandning = 395 µL och 200 µL transfection reagens medium + 195 µL av kombination (ii) DNA blandning = 395 µL. Det är viktigt att lägga en lika stor volym av transfection reagens medium till rören i kombination (i) och (ii). Det är inte nödvändigt att använda upp mediet i detta steg.
    6. Tillsätt den kombinerade blandningen (från steg 2.4.5) till varje brunn (25 µL per brunn) av 24-väl plattan (från steg 2.4.2) och inkubera cellerna för 6 h i 5% CO2-kompletterade, 37 ° C inkubator.
    7. Ta bort transfection mediet från 24-väl plattan. Lägg varmt (37 ° C) färska fenolrött-Fri MEM kompletteras med 10% träkol-skrapat FBS (Värmeinaktiverade), 2 mM L-glutamin, 1% penicillin-streptomycin lösning och ligand (tillfälligt i etanol) (0,5 mL medium per brunn). Odla cellerna för 16-18 h i 5% CO2-kompletterade, 37 ° C inkubator.
  5. Skörda proverna.
    1. Skölj cellerna med 1 mL PBS och, sedan, tillsätt 100 µL av 1 x passiv lyseringsbuffert (se Tabell för material).
    2. Skaka de 24 brunnar med en vortex mixer att lossa cellerna.
    3. Frysa plattorna (cell lysates) 1 x av flytande kväve eller spara dem vid-80 ° C före analys. Omedelbart före analysen, skaka det plattorna på en skakapparat tills de är rumstempererade.
      Obs: Denna process förhindrar oregelbundet förekommer avvikande värden för luciferas aktivitet.
  6. Utföra en dual-luciferas-analysen.
    1. Förbereda reagenser för dual-luciferas assay-systemet (se Tabell för material).
      1. För att göra luciferas analysbuffert substrat (LAS), tillsätt alla luciferas analysbuffert i luciferas assay substratet som är i en brun glasflaska. Spara LAS bufferten vid-20 ° C.
        Obs: LAS bufferten bör värmas till rumstemperatur före användning.
      2. För att göra Renilla luciferas (RLS) Substratbufferten, blanda Renilla luciferas substrat och Renilla luciferas buffert i förhållandet 1:50. Se färska RLS buffert för varje analys och använda en svart slang eller ett rör som skuggas av aluminiumfolie. Beräkna mängden RLS buffert att göra en fräsch buffert.
        Obs: RLS bufferten bör värmas till rumstemperatur före användning.
    2. Ställa reagenser i microplate reader.
      1. Tvätta injektionsstället rader 2 x med 70% etanol; Tvätta sedan, linjerna 2 x med vatten.
        Obs: Detta är viktigt att förhindra att störande test resultaten.
      2. LAS buffert till P-injektorn linje (första injektion) och ställa in RLS bufferten till raden M-injektor (andra injektionen). Blanda inte dessa buffertar. RLS buffert hämmar luciferas aktivitet.
    3. Tillsätt 10 µL av skördade prover (från steg 2.5.3) till 96 brunnar vit plast plattan.
    4. Gäller följande inställningar för mikroplattan läsaren. För P-injektorn, använda en volym på 50 µL, en fördröjning på 2 s, och en hastighet av 50 µL/s. För M-injektorn, använda en volym på 50 µL, en fördröjning på 2 s, och en hastighet av 50 µL/s. Ange ett integration tid av 15 s. temperaturen till 25 ° C.
    5. Kör den microplate reader.
    6. Registrera värdena för aktiviteten luciferas (IPValue) och värden för Renilla luciferas aktivitet (IMValue) med programmet data förvärv (se Tabell för material).
    7. Tvätta injektionsstället raderna efter datainsamlingen (se steg 2.6.2.1).
  7. Utföra dataanalyser.
    1. Använd normaliserade värden (IPValue/IMValue) för analys av data.
    2. Ange det normaliserade värdet av kombination (i) [pG5-Luc + pBIND-ERαEF + pakten] med fordon (0 nM ligand) som 1 för beräkningen av den basala nivån och homodimerized ERα LBD. Nivåerna är representerade som ”relativa aktiviteten”.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 3 visar systematiken i möjliga svar i kombination (i) och kombination (ii) plasmid-transfekterade celler. Experimentella resultat visas i figur 4. Aktiviteten av kombination (a pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten) visar stimulering av 10 nM E2 (figur 4A), eftersom den ERα LBD innehåller domänen ligandberoende transkription funktionella, AF-2. Agonist (t.ex., E2) som binder till den ERα LBD rekryterar transkription coactivator(s) till domänen AF-2. Denna händelse orsakar transkriptionell aktiveringen utan interaktion med VP16AD fusion LBD och gör det svårt att utvärdera aktiviteten LBD homodimerization på grund av ospecifik bakgrunden (figur 3C). Aktiviteten i kombination (ii) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + pakten-mERαEF) observerades med 1 nM och 10 nM E2 behandling (figur 4A). Det skulle vara möjligt att fastställa aktiviteten agonist-beroende ERα LBD homodimerization om lämpliga ligand koncentrationen för att upptäcka aktiviteten i kombination (ii) utan aktivering av kombination (jag) kan hittas (t.ex., den villkoret 1 nM E2 i figur 4A). Det är således svårt att upptäcka agonist-medierad ERα LBD homodimerization aktiviteten med M2H analys. Däremot, aktiviteten av kombination a med 4OHT var densamma som fordonskontroll (0 nM) nivå (figur 4B). Dessa resultat tyder på att ERα AF-2 funktion inte aktiveras av 4OHT. M2H analysen är således ett genomförbart alternativ för att analysera homodimerization aktiviteten av ERα LBD med 4OHT (figur 3B, 3E).

Aktiviteten från en kombination av mus ERα LBD uttryck plasmider (pBIND-mERαEF + pakten-mERαEF) med 4OHT var betydligt högre än kombinationen av mänskliga ERα LBD uttryck plasmider (pBIND-hERαEF + pakten-hERαEF) (figur 5A, 5B). Detta resultat indikerar att 4OHT-beroende homodimerization aktiviteten av mus ERα LBD är mer potent än mänsklig ERα LBD. Dessutom analyserade vi 4OHT-beroende LBD homodimerization aktivitet med de mänskliga-musen F-domän-bytte ERα LBD uttryck plasmidsna, mERαEhF (mus ERα E domän med mänskliga F domän) och hERαEmF (human ERα E domän med musen F domän). Homodimerization aktiviteten av mERαEhF var betydligt lägre än för mERαEF. Däremot var homodimerization aktiviteten av hERαEmF betydligt högre än hERαEF (bild 5C). Det verkar således som domänen F har ett inflytande på artspecifika 4OHT-beroende ERα LBD homodimerization aktivitet.

Dessa resultat tyder på att ERα LBD dimerization aktiviteten av 4OHT-liknande ligander, såsom SERMs, kan upptäckas av M2H analysen. Nästa, vi visar ett möjligt sätt att analysera ERα LBD homodimerization aktiviteten av agonistiska kemikalier. ERα LBD dimerization verksamhet E2 och dietylstilbestrol (DES) kan upptäckas av M2H analysen när du använder en enda-amino-syra-muterade ERα LBD (mus ERα-I362D). Denna mutation stör aktiviteten E2-beroende coactivator rekrytering av ERα LBD8. Kombination (i) (pG5-Luc + pBIND-mERα-I362D + pakten) aktiverades inte av E2 heller DES vid någon koncentration analyserade vi (figur 6B), som var annorlunda från WT ERα LBD(figur 6). ERα-I362D LBD dimerization aktivitet DES var mer potent än E2 (figur 6B). Denna mutant kan användas för en jämförande studie av agonist-beroende ERα LBD dimerization verksamhet. Det kräver dock ytterligare analys och karakterisering av biologiska funktionerna i denna mutant ERα.

Figure 1
Figur 1 : Diagram över plasmider som används för analysen M2H. (A) denna panel visar pG5-Luc, reporter plasmiden som innehåller ett GAL4-responsive element (GAL4 RE) smält med ett luciferas kodning genen. (B) denna panel visar pBIND-mERαEF, protein uttryck plasmiden för GAL4DBD fusion mERαEF; Renilla luciferas fungerar för att normalisera transfection effektivitet. (C), denna panel visar pakten-mERαEF, protein uttryck plasmiden för cellkärnelokalisering signalen (NLS)-smält VP16AD fusion mERαEF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Diagram över ERα LBD uttryck plasmider används i detta experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Systemet M2H analysens. Denna figur visar representant villkora av cellerna transfekterade med kombination a plasmider (vänster) och cellerna transfekterade med kombination (ii) plasmider (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Ligandberoende dimerization aktiviteten av mus ERα LBD. (A) denna panel visar luciferas aktiviteten i cellerna transfekterade med kombination (i) plasmider (pG5-Luc + pakten + pBIND-mERαEF) eller kombination (ii) plasmider (pG5-Luc + pakten-mERαEF + pBIND-mERαEF) med eller utan E2. (B) i denna panel visas luciferas aktiviteten av de celler som transfekterade med kombination a plasmider eller kombination (ii) plasmider med eller utan 4OHT. Aktiviteten är representerade som medelvärdet ± standardavvikelsen (SD). Grafen av sidopanelen A har återskapats från tidigare publicerade data11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Differential dimerization aktiviteten av mus och mänskliga ERα LBD med 4OHT. (A) denna panel visar luciferas aktiviteten i cellerna transfekterade med kombination av mus ERα LBD uttryck plasmider (pakt-mERαEF + pBIND-mERαEF) eller en kombination av mänskliga ERα LBD uttryck plasmider (pakt-hERαEF + pBIND-hERαEF) med eller utan 4OHT. (B), låg aktivitet utbud av sidopanelen A förstoras för att Visa dimerization aktiviteten av mänskliga ERα LBD och experimentella basala nivåer (pakten + pBIND-mERαEF, pakten + pBIND-hERαEF). (C) i denna panel visas luciferas aktiviteten av de celler som transfekterade med mus-mänskliga F-domän-bytte LBD uttryck plasmider. mERαEhF betecknar mus ERα E domän smält med mänskliga F domän. hERαEmF betecknar mänsklig ERα E domän smält med musen F domän. Aktiviteten är representerade som det medelvärde ± SD. Diagrammen har återskapats från tidigare publicerade data1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Påvisande av agonist-medierad ERα LBD dimerization aktivitet med en AF-2 muterade ERα LBD. (A) denna panel visar luciferas aktiviteten i cellerna transfekterade med kombination (i) plasmider (pG5-Luc + pakten + pBIND-mERαEF) eller kombination (ii) plasmider (pG5-Luc + pakten-mERαEF + pBIND-mERαEF) med eller utan ligander; E2 (röd), DES (lila). (B) i denna panel visas luciferas aktiviteten av de celler som transfekterade med kombination a plasmider (pG5-Luc + pakten + pBIND-mERα-I362D) eller kombination (ii) plasmider (pG5-Luc + pakten-mERα-I362D + pBIND-mERα-I362D) med eller utan ligander; E2 (röd), DES (lila). Verksamheten representeras som den medelvärde ± SD. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Häri, beskrev vi protokollet för M2H analysen, med fokus på analys villkoren för att upptäcka homodimerization aktiviteten av ERα LBD som ett exempel. M2H analysen är i allmänhet inte populär för bedömning av ligandberoende ERα LBD dimerization aktivitet. Detta beror på den ERα LBD besitter en transkriptionell aktiveringen funktion; vars verksamhet stör, i vissa fall resultaten av M2H analysen. Men, som vi visar här, M2H analysen kan användas för att analysera LBD dimerization aktiviteten av vissa ämnen som inte aktiverar funktionen AF-2 transkription av LBD (t.ex., 4OHT, SERMs). För att minska den inneboende aktiviteten av LBD (bakgrund aktivitet), vi valt den lägsta E2-innehållande kol-skrapat FBS från partierna som produktion och används Värmeinaktiverade träkol-skrapat FBS. Dessa faktorer är viktiga för en framgångsrik M2H analysens använder de WT ERα LBD och upptäcka svaga växelverkan aktivitet. Dessutom visade vi den ERα LBD dimerization aktivitet av agonister (E2 och DES) med hjälp av mERα-I362D mutant, som stör aktiviteten agonist-beroende coactivator rekrytering till AF-2. Dessa resultat tyder på att M2H analysen kunde vara mer användbara för bedömning av ligandberoende ERα LBD dimerization aktivitet.

I fältet NR forskning har M2H analysen använts för att bedöma ligandberoende coactivator eller corepressor rekrytering aktivitet av NR LBDs9,10. Plasmiden av pBIND smält med NR samverkande regionen av kofaktor används för denna typ av experiment istället för att använda den pBIND-ERαEF. Detta experiment använder elementet kort protein innehållande NR interagerar motiv (LxxLL) snarare än en större strukturella domän till coactivator. En möjlighet är att elementet större coactivator kan aktivera transkription utan rekrytering av VP16AD fusion LBD; som kan störa resultaten från M2H analysen. Alternativt kunde detta protokoll användas för att analysera bindande aktiviteten av en mängd olika ämnen till ERα. Cellerna var exempelvis transfekterade med pG5-Luc, pBIND-smält NR samverkande motiv och pakten-ERαEF plasmider och, sedan behandlas med olika kemikalier, till exempel hormonstörande kemikalier eller potentiella hormonella therapeutics. Om aktiviteten luciferas ökas av en kemikalie i denna analys, sedan förutspås det att kemikalien bör interagerar med den ERα LBD att rekrytera den NR samverkande motiv8.

M2H analysen visar protein-protein interaktioner i däggdjursceller. Som vi nämnde i inledningen, kan protein-protein interaktioner fysiologiska roll vara olika i en cell-typ-specifika sammanhang. M2H analyser kan tillhandahålla resultaten av protein-protein interaktioner aktivitet i samma cellulära sammanhang som används för andra experiment, såsom analys av transkriptionell aktivitet. Det dessutom kan analysera effekten av cellsignalering modulatorer (t.ex., hämmare eller aktivatorer av kinaser) med protein-protein interaktioner i cellerna. Detta är en fördel M2H analysens jämfört med andra in vitro- protein-protein interaktionsstudier.

Det måste dock beaktas att de protein-protein interaktionerna identifieras via M2H assay inte kan representera direkt interaktion mellan två proteiner. Med andra ord, finns det möjlighet att cellulära faktorer finns som tillåter en anslutning mellan två proteiner. Om sådant övervägande uppstår, då bör utvärderingen av in vitro- protein-protein interaktionsstudier krävs, till exempel GST-fusion protein pulldown analysen. Dessutom är det bättre att kontrollera uttryck av pBIND - och pakten-plasmid-härledda proteiner i cellerna för att utvärdera systemet assay. Särskilt när aktiviteten interaktion inte kan upptäckas, informationen protein uttryck nivåer hjälper till att fastställa orsaken till resultatet. Anti-Gal4DBD antikropp och anti-VP16AD antikroppar kan användas för en western blot-analys.

Om laboratoriet har den experimentella set-up för luciferas reporter analyser, som kan användas för att analysera aktiviteten transkription av reglerande element eller reglera faktorer, det är ganska enkelt att utföra M2H analysen. M2H analysen är en fördelaktig additiv metod för Transkriptionsreglering studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att deklarera.

Acknowledgments

Författarna tackar Drs. Sueyoshi och Wang på nationella Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) för deras kritisk läsning av manuskript och Tanner Jefferson för att utföra procedurer på videon. Detta arbete stöds av de nationella institut för hälsa Grant 1ZIAES070065 (till K.S.K.) från NIEHS Division av intramurala forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pG5-Luc Promega E249A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pBIND Promega E245A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
pACT Promega E246A Component of CheckMate Mammalian Two-Hybrid System
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010
Centrifuge Rotor SORVALL 75006445
Swing Buckets SORVALL 75006441
Cell Resuspension Solution (CRA) Promega A7112
Cell Lysis Solution (CLA) Promega A7122
Neutralization Solution (NSA) Promega A7131
Column Wash Solution (CWB) Promega A8102
Wizard Midipreps DNA Purification Resin Promega A7701
Wizard Midicolumns Promega A7651
MEM, no glutamine, no phenol red Gibco 51200038
L-glutamine (200 mM) Gibco A2916801
0.5% Trypsin-EDTA (10x) Gibco 15400054
Penicillin-Streptomycin (100x) Sigma-Aldrich P0781
BenchMark fetal bovine serum (FBS) Gemini-Bio 100-106 Heat inactivated
Charcoal:dextran stripping fetal bovine serum Gemini-Bio 100-119 Heat inactivated
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red Gibco 31053028 for transfection
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668027
Passive Lysis 5X Buffer Promega E1941
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega E1980
SpectraMax L microplate reader Molecular Devices
SoftMax Pro Software Molecular Devices

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arao, Y., Korach, K. S. The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation. Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).
  2. Brzozowski, A. M., et al. Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor. Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).
  3. Shiau, A. K., et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen. Cell. 95 (7), 927-937 (1998).
  4. Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization. Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).
  5. Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists. Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).
  6. Koide, A., et al. Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions. Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).
  7. Mitry, R. R., Hughes, R. D. Human Cell Culture Protocols. , Humana Press. (2011).
  8. Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element. Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).
  9. Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists. Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).
  10. Chang, C. Y., et al. Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta. Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).
  11. Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity. The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).

Tags

Cancerforskning fråga 142 däggdjur två-hybrid assay östrogen receptor alfa nukleär receptor ligand-bindande domän dimerization tamoxifen selektiv östrogen receptor modulator
Att upptäcka Ligand-bindande domänen Dimerization aktiviteten av östrogen Receptor alfa med däggdjur två-Hybrid-analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting… More

Arao, Y., Korach, K. S. Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay. J. Vis. Exp. (142), e58758, doi:10.3791/58758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter