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Immunology and Infection

Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro

Published: November 26, 2018 doi: 10.3791/58759
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Biochemistry and Cell Biology, OVGU University of Magdeburg

Summary

Zona marginale B cellule (MZBs) rispondono alla forza di taglio flusso di ri-orientare il loro percorso di migrazione il flusso. Questo protocollo viene illustrato come registrare e analizzare la migrazione utilizzando un'unità fluidica, pompa, sistema di formazione immagine del microscopio e software libero.

Abstract

Zona marginale B cellule (MZBs) sono una popolazione delle cellule di B che risiedono nelle zone marginali splenici del mouse che avvolgono i follicoli. Per raggiungere i follicoli, MZBs necessario migrare fino la forza di taglio di flusso sanguigno. Presentiamo qui un metodo per analizzare questa migrazione di MZB flusso-indotta in vitro. In primo luogo, MZBs sono isolati dalla milza del mouse. In secondo luogo, MZBs sono sistemati su ligandi delle integrine nelle diapositive di camera di flusso, esposti per inclinare il flusso e imaged sotto un microscopio durante la migrazione. In terzo luogo, immagini di MZBs la migrazione vengono elaborati utilizzando la cella automatica MTrack2 tracking plugin per ImageJ e le tracce di cella risultante vengono quantificate utilizzando lo strumento di chemiotassi Ibidi. I dati di migrazione rivelano quanto velocemente si muovono le cellule, come spesso cambiano direzione, se il vettore di flusso di taglio influisce sulla loro direzione di migrazione e quali ligandi delle integrine sono coinvolti. Anche se usiamo MZBs, il metodo può essere facilmente adattato per l'analisi di migrazione di qualsiasi del leucocita che risponde alla forza del flusso di shear.

Introduction

Cellule del sistema immunitario sono più le cellule nel corpo umano e spesso devono vedersela con forza di taglio dal flusso sanguigno e linfatico. Tuttavia, ci sono relativamente pochi studi sulla migrazione indotta da forza di taglio di leucociti1,2,3,4,5. Presentiamo qui un protocollo affidabile e quantitativo per analizzare la risposta di una cellula immune al flusso in vitro. Esecuzione del saggio non necessita di fabbricazione dei componenti, e tutte le attrezzature e materiali di consumo sono commercialmente disponibili. Il protocollo, tra cui analisi di purificazione e migrazione di cellule, possa essere eseguito in un solo giorno. Infine, anche se Descriviamo la migrazione delle cellule di B di zona marginale (MZBs), il protocollo può essere adattato per analizzare la migrazione contro flusso di altri tipi di cellule del sistema immunitario. Pertanto, è possibile utilizzare questo test per analizzare sistematicamente una vasta gamma dei leucociti con un pannello completo delle condizioni.

MZBs sono una popolazione delle cellule di B che, nel topo, si trovano solo nella milza e navetta tra all'interno dei follicoli e le zone marginali6,7,8,9. La zona marginale è uno strato di cellule immunitarie circa 5 – 10 cellule spesse. Lo strato delle cellule avvolge il follicolo e consiste principalmente di MZBs e macrofagi, ma anche cellule T (iNKT) naturali invarianti dell'uccisore, cellule dendritiche (DCs) e neutrofili, tra gli altri10. Le cellule nella zona marginale sono esposte al flusso di sangue unidirezionale che proviene dalle arterie spleniche che terminano in un seno marginale che circonda il follicolo. Il sangue scorre dai fori nel seno marginale attraverso la zona marginale ed è quindi raccolti nei seni venosi nella polpa rossa e ripristinato la circolazione11. Il libero flusso di sangue lava sopra la MZBs e li espone agli antigeni trasportati nel sangue. Il MZBs portano l'antigene nel follicolo da automaticamente la spola tra la zona marginale ed interno del follicolo, che non è esposto a sangue. Così, come MZBs navetta verso il follicolo, deve migrano fino la forza di taglio del flusso sanguigno12 (Figura 1A).

In questo protocollo, descriviamo come determinare quantitativamente come cellule immuni come MZBs rispondere a nessun flusso o ad alto flusso in vitro, al fine di rivelare come sono programmati per eseguire la migrazione in vivo. Nel primo passaggio, MZBs sono purificati da una milza del mouse usando i branelli magnetici accoppiati agli anticorpi da corredi disponibili nel commercio. Il MZBs appena isolate sono introdotte nel pozzo di una diapositiva di camera di flusso, permesso di insediarsi sul ligandi delle integrine ed esposti al flusso del tampone di migrazione utilizzando un sistema di pompa (Figura 2A). Le cellule sono Imaging utilizzando un sistema di time-lapse video microscopia. Le immagini vengono poi elaborate per l'analisi con un plugin di ImageJ gratuito,13,MTrack214, rintracciare automaticamente le celle. Le tracce possono essere quantificate quindi con il libero Ibidi chemiotassi strumento15 per determinare vari parametri tra cui velocità, rettilineità e indice di migrazione. Questi valori possono essere utilizzati per determinare gli effetti inibitori della migrazione, stimolatori delle cellule, chemochine e altri prodotti chimici che influiscono sulla migrazione della migrazione di shear-flusso indotto al fine di comprendere le forze che controllano il movimento delle cellule immuni in vivo.

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Protocol

Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di animali siano state preventivamente approvati dal Landesverwaltungsamt Halle (Sassonia-Anhalt), Germania, in conformità con tutte le linee guida della facoltà di medicina della Università OVGU di Magdeburgo.

1. MZB cella purificazione

  1. Isolare i leucociti.
    1. Sacrificare un 8 a 16 settimana-vecchio mouse e rimuovere la milza16. Dissociare la milza in 5 mL di tampone cella ghiacciata [tampone fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina di siero privo di acido grasso bovino (BSA)], utilizzando un dissociatore di tessuto o schiacciare delicatamente la milza attraverso una maglia di filtro cella 70 µm in un pozzetto su una piastra a 6 pozzetti con lo stantuffo da una siringa da 5 mL.
    2. Trasferire le cellule nel buffer di cella in una provetta conica da 15 mL. Raccogliere le cellule supplementari aggiungendo un altro 5 mL di buffer di cella ghiacciata per il tubo di dissociatore di tessuto o la maglia di nylon nel pozzo. Trasferire gli ulteriori 5 mL di buffer di cella più cellule nella provetta conica. Centrifugare a 300 x g per 10 min a temperatura ambiente (20 ° C, RT) e scartare il surnatante.
  2. Eseguire la lisi delle cellule di anima rosse.
    1. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC) (150 mM NH4Cl, 10mm KHCO3, 0.1 mM EDTA) che è pre-riscaldato RT. Aggiungi un ulteriore 1,5 mL di tampone di lisi RBC e per mescolare. Incubare a temperatura ambiente (20 ° C) per un totale di 2 min, compreso il tempo necessario per risospendere il pellet.
    2. Aggiungere 7,5 mL di tampone cella ghiacciata alla sospensione per interrompere la lisi delle cellule. Centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 10 minuti e scartare il surnatante.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di cella e aggiungere un ulteriore 9 mL di tampone di cella. Pipettare la sospensione cellulare 10 mL attraverso un filtro di pre-separazione 30 µm in una nuova provetta conica 15ml per rimuovere i detriti cellulari.
    4. Centrifugare le cellule a 300 x g e a 4 ° C per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone di cella. Mantenere le cellule freddo a tutte le successive fasi della procedura fino al incubazione nelle diapositive di camera di flusso.
  3. Purificare MZBs.
    1. Aggiungere 50 µ l di anticorpi biotina-accoppiati da un kit disponibile in commercio contro tutte le cellule indesiderate, tra cui CD43 (sulle cellule non-B), CD4 (sulle cellule di T), CD93 (su cellule di B acerbe) e Ter119 (sugli eritrociti), alla sospensione di cellule in una provetta conica. Scuotere o a scatti la provetta delicatamente per mescolare, ma faccio Centrifugare le cellule. Disporre il tubo conico su un letto di ghiaccio ad un angolo quasi piatto e roccia a 25 rpm per 15 min.
    2. Aggiungere biglie magnetiche accoppiati agli anticorpi anti-biotina in un volume totale di 100 µ l di sospensione cellulare. Continuare al rock la sospensione cellulare a 25 giri in ghiaccio per 20 min. lavare le cellule aggiungendo 5 mL di tampone di cella, centrifugazione a 300 x g e 4 ° C per 10 min, e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di cella.
    3. Impoveriscono la sospensione cellulare delle cellule magnetiche-perlina-accoppiati mantenendo loro su una colonna magnetica. Scartare etichettati cellule (tutte le cellule non-B e le cellule di B acerbe). Raccogliere le cellule non marcato (cellule di B mature) in una provetta conica da 15 mL che è stato pre-rivestiti con una breve applicazione di 5 mL di tampone di cella, al fine di impedire l'adesione non specifico di MZBs.
    4. Lavare la sospensione cellulare con 5 mL di tampone di cella. Centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 90 µ l di tampone di cella e aggiungere 10 µ l di anti-CD23-accoppiati perline. Sospensione di cellule di roccia delicatamente il ghiaccio per 20 min a 25 giri/min.
    5. Lavare la sospensione cellulare con 5 mL di tampone di cella. Centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di tampone di cella.
    6. Impoveriscono la sospensione cellulare delle cellule magnetiche-perlina-accoppiati mantenendo loro su una colonna magnetica. Scartare le cellule con etichettate (cellule follicolari B). Raccogliere le cellule non marcato (MZBs), in un tubo conico da 15 mL che è stato pre-rivestito con una breve applicazione di 5 mL di tampone di cella. Rimuovere 50 µ l di cellule per il conteggio e il controllo di purezza.
  4. Macchia la MZBs ordinato per verificare la purezza.
    1. Aggiungere il 10% del volume (5 µ l) del blocco Fc a 10.000 cellule in 50 µ l e incubare a 4 ° C per 5 min. aggiungere 50 µ l di tampone di cella contenente 0,3 µ l di B220-FITC (0.15 µ g), CD21-PE (0.06 µ g) e CD23-APC (0.06 µ g) in un volume totale di 105 µ l (ogni anticorpo diluito 1: 350) , o qualsiasi altra combinazione di fluorofori per distinguere tra le cellule B follicolare e MZBs. macchia le celle a 4 ° C al buio per 15 min.
    2. Lavare le cellule marcate una volta con 1 mL di tampone di cella. Centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min e scartare il surnatante. Risospendere in 300 µ l di tampone di cella e acquisire campioni utilizzando un citometro a flusso e metodi standard. Cancello su linfociti dal vivo, poi su B220+ cellule e infine su CD23basso CD21alte cellule (Figura 1B).
      Nota: La procedura in genere produce 500.000 MZBs per milza da un mouse C57B/6.
  5. Preparare la MZBs flusso migrazione.
    1. Lavare purificato MZBs una volta in 1 – 2 mL di tampone di migrazione freddo [Hanks' bilanciato cationi contenente soluzione salina (HBSS), 10 mM Hepes, 0,2% acidi grassi BSA] per garantire che il buffer di migrazione contenenti cationi non è diluito da residuo tampone PBS privo di catione. Centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 10 minuti e scartare il surnatante. Risospendere MZBs in tampone di migrazione freddo a una concentrazione di 50.000 MZBs a 30 µ l (equivalente all'importo caricato in un pozzetto di una diapositiva di camera di flusso).
      Nota: Il recente isolate MZBs deve essere utilizzato appena possibile. Tuttavia, sono ancora capaci di migrazione per fino a 8 ore o più dopo l'inizio dell'esperimento per come sono tenute sul ghiaccio. Temperature ottimali dovrebbero essere testate per altri tipi di cellule. Ad esempio, potrebbe essere meglio tenere cellule T coltivate a 37 ° C fino all'inizio della migrazione.

2. flusso esperimento

  1. Diapositive di cappotto con ligandi delle integrine.
    1. Il giorno prima dell'esperimento, scongelare un'aliquota di ICAM-1 (400 µ g/mL). Un fattore di 1: 80 in PBS per raggiungere una concentrazione finale di 5 µ g/mL, diluire ICAM-1. Aggiungere 30 µ l di ICAM-1 per una camera in una diapositiva di flusso per ogni film di migrazione richiesto. Incubare il vetrino in una camera umida a 4 ° C durante la notte.
      Nota: Ogni diapositiva contiene 6 camere e fino a 8 film in un'unica sessione possa essere facilmente registrato.
  2. Bloccare i pozzetti.
    1. Il giorno dell'esperimento, è necessario lavare la camera aggiungendo 100 µ l di PBS in un pozzetto e prelevare 100 µ l da altro pozzo della camera. Aggiungere 100 µ l di tampone bloccante (2% acidi grassi BSA in PBS) per una camera e incubare il vetrino in una camera umida a temperatura ambiente per 1,5 h.
    2. Lavare la camera aggiungendo 100 µ l di PBS in un pozzetto, ritirarla dall'altro bene, poi aggiungere 100 µ l di tampone di migrazione alla camera. Archiviare le diapositive in una camera umida a temperatura ambiente fino a quando l'esperimento.
  3. Preparare l'unità fluidica.
    1. Collegare una pompa del liquido, fissare l'unità fluidica e attivare il software di pompa. Lavare il tubo una volta con 5 – 10 mL di tampone di migrazione, poi aggiungere 11,7 mL di tampone di migrazione ugualmente entrambi serbatoi e rimuovere le bolle d'aria.
    2. Clampare il tubo circa 10 cm dal pezzo connettore. Posizionare l'unità fluidica nella camera di incubazione riscaldata sul microscopio.
    3. Impostare la scelta di diapositiva "µ-slide vi 0.4" e del tubo di "bianco" nel software. Impostare la sollecitazione di taglio desiderata (ad es., 4 dyn cm-2). Impostare il tempo di formazione immagine di 30 min.
    4. Impostare il fattore di taratura del tubo di determinazione del tasso di flusso attraverso la tubazione in mL/min misura il tempo richiesto per 2 mL di tampone per fluire da un serbatoio di altro e dividere per 2. Effettuare almeno 4 misure di precisione. Utilizzare la portata effettiva per impostare la portata desiderata e shear stress inserendo i valori nel software di pompa.
  4. Preparare il sistema di imaging.
    1. Pre-riscaldare la camera di incubazione del microscopio, unità fluidica e aliquote di buffer di migrazione a 37 ° C (Figura 2B). Prova la pompa fluidica assicurandosi che il tampone di migrazione scorre avanti e indietro nei serbatoi e che non ci sono nessun aria bolle nel sistema.
  5. Caricare le celle sulla diapositiva.
    1. Pulire il fondo della diapositiva con un tessuto imbevuto di etanolo. Aggiungere 30 µ l di sospensione cellulare in un pozzetto dell'alloggiamento e prelevare 30 µ l dal altri bene. Incubare il vetrino con una copertura su per evitare l'evaporazione a 37 ° C per 30 min consentire le celle da collegare.
    2. Lentamente aggiungere il tampone di migrazione pre-riscaldato a ciascun pozzetto del vetrino camera flusso fino a quando un menisco positivo aumenta dal pozzo e rimuovere eventuali bolle d'aria con la punta della pipetta.
  6. Allegare la diapositiva all'unità fluidica.
    1. Morsetto della diapositiva per il tavolino del microscopio. Rimuovere il contrassegno lato della tubazione fluidico dal pezzo connettore e riempire fino alla fine con tampone di migrazione fino a quando un menisco positivo senza bolle d'aria sorge fuori alla fine.
    2. Capovolgere l'estremità del tubo sopra e inserirlo nel pozzo superiore della camera del flusso, rastrellamento buffer rovesciato con un fazzoletto di carta. Pur mantenendo il tubo bloccato, è necessario ripetere la procedura per la marcata estremità del tubo.
  7. Le celle di immagine.
    1. Passare il sistema di imaging a "Live" per impostare lo stato attivo sulle cellule. Selezionare un campo di vista che è al centro della diapositiva. De-fuoco le cellule leggermente per migliorare il contorno nero della cella e produrre un interno bianco, che possa poi essere con soglia a una forma di cellule rotonde nere su sfondo bianco per l'utilizzo con un programma di rilevamento automatizzato.
    2. Avviare il programma imaging di sequenza e record 1 immagine ogni 5 s per 30 min utilizzando il 10x obiettivo asciutto. Rimuovere la pinza dal tubo e accendere la pompa, poi cellule non aderenti saranno lavare e cellule aderenti inizierà a migrare. Immagine per 30 minuti o più a lungo usando un 10 x obiettivo o superiore, come desiderato. Etichetta e salvare il filmato.
  8. Scollegare l'unità fluidica dalla diapositiva.
    1. Alla fine del programma di imaging, reimpostare la pompa per il prossimo esperimento: ri-collegare il morsetto per il tubo, rimuovere il tubo dalla diapositiva, fissare nuovamente il pezzo di connettore, aprire il morsetto e usare il comando manuale della pompa per spingere alcuni mL di tampone da una riserv oir a altro per rimuovere le bolle d'aria. Ri-collegare il morsetto e posare il tubo bloccato sul tavolino del microscopio per il prossimo film.
      Nota: Il protocollo può essere sospeso a tempo indeterminato qui. Se usando un inibitore o un modificatore della migrazione cellulare, a seconda della modalità di azione, aggiungerlo alla sospensione cellulare prima di stabilirsi nella camera di migrazione o nel buffer di migrazione nell'unità fluidica.

3. migrazione Track Analysis

Nota: Le cellule possono essere rilevate automaticamente tramite il plugin MTrack2 o a mano usando il plugin di rilevamento manuale17. Automatico rilevamento funziona bene con MZBs perché queste cellule sono principalmente rotonde e rimangono in questo modo durante la migrazione, rendendolo facile da soglia l'immagine delle cellule agli oggetti neri su sfondo bianco. Inseguimento automatico è più difficile se altri tipi di cellule sono utilizzati, come colta, attivare le cellule T CD8 +, perché allungare durante la migrazione di queste cellule e diventano un po' trasparente, rendendo difficile definire i bordi. In questo caso, entrambi (1) le cellule possono essere colorate con un colorante fluorescente intra-vitale per produrre immagini che possono essere con soglia per mostrare gli oggetti neri su sfondo bianco, o (2) altri programmi per delineare le cellule come rilevamento di segmentazione e/o bordo di immagine può essere utilizzato. Inseguimento manuale è un'opzione utile quando si produce un'immagine ad alto contrasto dei contorni delle cellule non è possibile.

  1. Eseguire la verifica manuale utilizzando il plugin.
    1. Installare il plugin "Manuale di rilevamento" in ImageJ e Apri il filmato in ImageJ. Sotto il menu "Manuale di rilevamento", selezionare "Aggiungi nuova traccia". Clicca al centro di una cella come i progressi di film automaticamente di frame-by-frame. Quando la cella è stata selezionata in ogni fotogramma, selezionare "Aggiungi nuova traccia" per iniziare a seguire una nuova cella.
    2. Dopo le tracce sono state registrate, è possibile copiare i risultati di output in un foglio di calcolo di dati. Modificare il formato di visualizzazione decimale per tutte le celle del foglio a zero posti dopo il separatore decimale. Salvare il file come un file. txt "fermata-separati da tabulazione" per la successiva analisi.
      Nota: In genere, 50 – 100 cellule vengono rilevate, che dura circa 1 h per completare per un film di 20 min di circa 240 fotogrammi.
  2. Eseguire il rilevamento automatico utilizzando il plugin MTrack2. Scaricare e installare il plugin di kt MTrack2 secondo le istruzioni nel file (Vedi File di codifica supplementare).
    1. Soglia le immagini del film di migrazione delle cellule. Aprire lo stack di immagine in ImageJ. Processo le immagini in ImageJ per convertire il video da colore ad immagini ad alto contrasto che mostrano le cellule come oggetti neri su sfondo bianco (Figura 3A).
      1. Affilare le immagini due volte, Smacchia le immagini e convertire le immagini a 8 bit. Selezionare il "immagine | Put e regolare la luminosità/contrasto"sottomenu il cursore del contrasto al massimo contrasto, quindi le cellule appariranno come oggetti bianchi su sfondo nero. Selezionare il "immagine | regolare la soglia di"sotto-menu per garantire che le celle vengono visualizzati come oggetti neri su sfondo bianco.
    2. Eseguire la cella automatica di rilevamento plugin "MTrack2 kt" (Vedi File di codifica supplementare). Impostare i seguenti parametri nella schermata Opzioni.
      1. Impostare il minimo a 1 pixel di dimensione delle particelle e la dimensione delle particelle massima a 30 pixel per MZBs.
      2. Per velocità (massima distanza tra 2 particelle su fotogrammi successivi del film), se la densità delle cellule sul vetrino è alta, impostare questo valore basso per evitare di avere la traccia "saltare" da una cellula a altra. Per MZBs, impostare questo valore a 10 pixel per acquisire valori erratici, sebbene MZBs generalmente non supererà i 2 pixel su fotogrammi successivi che sono 5 s apart.
      3. Per il numero minimo di fotogrammi che una particella deve essere presente per essere rintracciati, impostare questo valore al numero di fotogrammi nel film per MZBs (ad es., 240) per un film di 20 min con 12 fotogrammi/min. Tuttavia, se le cellule sono abbastanza veloce per lasciare il campo di vista prima della fine dell'imaging, quindi impostare il numero minimo di fotogrammi a meno che la durata del film. Ad esempio, con rapido movimento le cellule T, impostare il numero minimo presso l'equivalente di 5-10 min di imaging.
        Nota: Registrare una macro di questi passaggi (soglia e MTrack2-kt) per automatizzare questa parte della procedura e risparmiare tempo (vedere File di codifica supplementare). Utilizzando la macro per monitorare automaticamente un filmato in ImageJ richiede meno di un minuto.
    3. Copiare i risultati di output in un foglio di calcolo di dati. Modificare il formato di visualizzazione decimale per tutte le celle del foglio a zero posti dopo il separatore decimale. Aggiungere una riga vuota nella parte superiore delle tracce cella nel foglio di calcolo ed eliminare la colonna "D". Salvare il file come un file. txt "fermata-separati da tabulazione" per la successiva analisi nello strumento Ibidi chemiotassi.
      Nota: Il plugin MTrack2 uscite le tracce di cella nelle righe di 75 colonne parallele. Per l'analisi nello strumento Ibidi chemiotassi, le tracce del cellulare devono essere in una singola colonna. Per convertire l'output, il plugin di MTrack2 è stato modificato per uscita sia nel formato originale o come una singola colonna (figura 3B) (Vedi File di codifica supplementare "MTrack2 kt", che è scritto in Java). Copiare il file. Java nella cartella plugin di ImageJ. In ImageJ, selezionare "Plugin > Compile and Run". ImageJ riavvio e la versione modificata di MTrack2 dovrebbe apparire nel menu Plugins.
  3. Per analizzare le tracce di cella con lo strumento Ibidi chemiotassi, Scarica la strumento di migrazione e chemiotassi Ibidi v 2.0 ("stand alone") e aprire il programma.
    1. Selezionare "Importa dati" e navigare per i file di traccia cella. txt. Possono essere selezionati più file allo stesso tempo. I file importati vengono visualizzati nel riquadro "DataSet" in rosso. Selezionare tutti loro e immettere i valori corretti nel menu "Inizializzazione" qui sotto per applicare le seguenti impostazioni.
    2. Immettere il numero esatto o un intervallo del numero di fette (il numero di fotogrammi nel film).
    3. Nel menu di calibrazione (X / Y calibrazione), immettere la dimensione di un pixel. Individuare queste informazioni nel file delle proprietà del film. Per MZBs, è stato usato un obiettivo 10x, dando una dimensione di pixel di 1.14 µm. Nel "menu di calibrazione | Intervallo di tempo", immettere l'intervallo di tempo tra i fotogrammi del film.
    4. Applicare le impostazioni. Selezionare "Traccia dati" Vedi i terreni di pista e confermare che i file di traccia verranno aperti. Da questo punto, sono disponibili molte opzioni, che sono descritti nella documentazione per il programma, tra cui le tracce di marcatura con diversi colori in base a proprietà diverse e sono visualizzati i valori individuali o medio per velocità, trasmettere la migrazione Indice, immediatezza e più (Figura 3B).
      Nota: La MZBs prendere circa 10 min per rilevare e rispondere al flusso, presumibilmente da loro complessi di integrina al punto di flusso in avanti della cella di polarizzazione. Un grafico dell'indice di migrazione nel corso del tempo vi mostrerà un calo iniziale sotto zero, corrispondente a un paio di minuti che la cella è esposta al flusso, seguita da un graduale aumento verso l'alto fino a quando i valori di indice di migrazione in avanti sono positivi. Quindi, può essere ottima per escludere questi primi minuti nei calcoli finali, a meno che questo processo sia di interesse.

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Representative Results

Abbiamo usato il protocollo descritto sopra per confrontare la migrazione di MZBs su ICAM-1-coated diapositive senza flusso (0 dyn/cm2) ed esposti per inclinare il flusso (4 dyn/cm2). Cellule sono state rilevate automaticamente con MTrack2 e la traccia risultante file erano il overlaid sui film di migrazione delle cellule di nessun flusso (0 dyn/cm2) e (4 dyn/cm2) per visualizzare la distribuzione e la forma delle tracce (Figura 4A). Tracce di cella furono poi importate nello strumento Ibidi chemiotassi (ICT) per generare pista trame di ogni film (Figura 4B). L'indice medio di migrazione (chiamato "FMIy" al ICT), velocità, rettilineità (chiamato "immediatezza" al ICT) e distanza rettilinea (chiamato "Euclidean distance" in ICT) di tracce di cella da 4 film ciascuno per entrambe le condizioni sono state calcolate nella Strumento di chemiotassi utilizzando il comando "valori misurati". Questi valori medi sono stati poi copiati in GraphPad Prism per la generazione di grafici e calcolo significatività statistica (Figura 4).

Figure 1
Figura 1: la spola di MZB. (A) modello di MZB spola tra la zona marginale e il follicolo nella milza. MZBs richiedono interiorizzazione di S1PR1, un recettore per S1P e CXCR5 funzionale, un recettore per la chemochina CXCL13, al fine di immettere il follicolo. Inoltre, per raggiungere il follicolo, MZBs necessario migrare contro la forza del flusso di sangue che emana dai pori nel seno marginale che avvolge il follicolo. Se un MZB perde adesione ICAM-1, il ligand per integrina LFA-1, viene inserito nella polpa rossa dalla forza del flusso, dove gli importi aumentati di VCAM-1, il ligand per VLA-4, non avrebbero sostenuto la migrazione. (B) ordinato flusso cytometry gating strategia per testare la purezza di MZBs usando gli anticorpi contro B220, CD23 e CD21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: installazione della camera system, pompa, microscopio e incubazione fluidica. (A) immagine del sistema pompa (Ibidi18) composto da una pompa con unità fluidica collegato e computer portatile che esegue il software di controllo della pompa. Immagine di ingrandimento superiore: la diapositiva di camera di flusso a 6 camere di flusso, il primo dei quali è collegato il tubo dell'unità fluidica. (B) installazione tipica per la misurazione in vitro migrazione di MZBs contro il flusso. Un microscopio equipaggiato con una camera di riscaldamento (scatola nera) contenente l'unità fluidica collegata ad una pompa (oggetto quadrato blu in basso a destra del microscopio) fuori il microscopio. Immagine di ingrandimento superiore: l'unità fluidica dentro il microscopio camera di riscaldamento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: quantificazione dei dati di imaging. (A) immagini rappresentative di un fotogramma da un filmato di migrazione MZBs prima (a sinistra) e dopo (a destra) soglia l'immagine per convertire le celle in oggetti neri su sfondo bianco. Scala bar in entrambe le immagini ingrandimento basso e alto = 100 µm. (B) pannello sinistro: immagine di output dei risultati tipici dal plugin MTrack2 (uscita singola colonna). Pannello di destra: immagine dello strumento Ibidi chemiotassi e migrazione 2.0 dopo l'input di MTrack2 risultati mostrano una trama traccia di migrazione di MZBs e un "valori misurati" visualizzare finestra mostrando le medie dei parametri tra cui velocità, indice di migrazione e immediatezza ( scatole di verde), tra gli altri. Impostazioni di calibrazione riportate includono la risoluzione di 1.14 µm per pixel e un intervallo di tempo di 5 s (0,083 min) al frame del filmato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: esempio di risultati utilizzando il protocollo per misurare la spola MZB. (A) rappresentante alambicchi di MZBs migrazione con una sovrapposizione di tracce dal plugin di ImageJ "MTrack2 kt". Nota: i colori di pista erano fissati arbitrariamente dal "Manuale di rilevamento" plugin per ImageJ. Scala bar in entrambi intarsiato di basso e alto ingrandimento = 100 µm. (B) rappresentante traccia trame di migrazione MZBs dallo strumento Ibidi chemiotassi e migrazione 2.0. Linee rosse e linee nere rappresentano tracce di celle che terminano di sotto o sopra l'asse orizzontale, rispettivamente. In (A) e (B): a sinistra, MZBs la migrazione senza flusso (0 dyn/cm2); diritto, MZBs la migrazione a un flusso di2 4 dyn/cm. (C) migrazione indice (FMIy), velocità, rettilineità (immediatezza) e distanza per MZBs la migrazione senza flusso (0 dyn/cm2) o di flusso (4 dyn/cm2) (n = 4 topi in 4 esperimenti separati). Barre di errore = media ± SD; Test t di Student, * * p < 0.01, * * * p < 0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

File supplementare 1: MTrack2_kt.java. Per favore clicca qui per scaricare questo file.  

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Discussion

Descriviamo qui un metodo per analizzare la migrazione delle cellule di rilevare la forza del flusso di shear e rispondere, modificando la loro migrazione. Un'analisi di MZBs ha mostrato che MZBs migrare spontaneamente su ICAM-1 e in presenza di flusso, migrerà il flusso. Nel nostro precedente lavoro, abbiamo mostrato che MZBs non migrano il flusso su VCAM-1, ma invece rimangono fissi in luogo. La zona marginale splenica murina contiene principalmente ICAM-1, mentre la polpa rossa contiene sia ICAM-1 e VCAM-1. Da questi dati, potrebbe essere arguito che MZBs migrerebbero il flusso mentre nella zona marginale, ma non nella polpa rossa. L'analisi è stata convalidata in vivo usando MZBs con adesione difettosi che erano dirigono a polpa rossa splenica dalla forza del flusso12. Per questi motivi, MZBs rappresentano un buon controllo positivo per testare il sistema di migrazione di flusso descritto qui, anche se il sistema è utilizzato per studiare un tipo di cella diversa.

L'aspetto più critico della procedura è garantire la coerenza nella cella di manipolazione sulla diapositiva. Poiché gli aspetti quantificabili della migrazione cellulare dipendono il grado a cui le cellule aderiscono alla diapositiva, alcuna diminuzione di adesione cellulare renderebbe difficile ottenere risultati riproducibili. Adesione cellulare in diminuzione potrebbe derivare da incoerenza in molteplici fattori, tra cui le temperature di buffer di migrazione o la casella di incubazione riscaldata (freddo riduce adesione), livelli di cationi in sospensione delle cellule (cationi interessano integrina associazione), far scorrere la gestione (toccando o flettendo la diapositiva potrebbe sloggiare le cellule) e densità di cella (collisioni tra cellule potrebbero influenzare parametri di migrazione). Altri punti sensibili durante la procedura includono il pipettaggio non buffer nei pozzetti diapositiva con troppa forza prima del fissaggio della tubazione (poiché questo potrebbe ridurre adesione delle cellule) e mantenendo il tempo necessario per la procedura di protocollo coerenza in ogni esperimento ( tempo di assestamento di cella potrebbe interessare adesione). In sintesi, ogni possibile influenza su adesione delle cellule dovrà essere tenuto in modo coerenza in tutto ripetizioni per produrre dati di migrazione cellulare affidabile.

Questo metodo è facile da configurare, dato che utilizza apparecchiature disponibili in commercio e forniture e nessuno dei passaggi richiedono istruzione avanzata. Per l'analisi di MZB, nonché altri tipi cellulari come coltivate CD8+ T cellule, rivestimento le diapositive con vari ligandi delle integrine sono sufficiente osservare la migrazione il flusso. Studiare la risposta di migrazione indotta da flusso di vari ligandi delle integrine conduce a identificazione diretta delle integrine attive sulla superficie delle cellule, possibilmente rivelare meccanismi pertinenti alle funzioni in vivo come con migrazione di MZB il flusso su ICAM-1 ma non VCAM-1. Tuttavia, è anche possibile aggiungere uno strato di cellule endoteliali alle camere di flusso. Un esempio di migrazione delle cellule immuni che è influenzato dal flusso di shear è stravaso delle cellule T attraverso strati endoteliali3. Questa procedura è stata utilizzata per svelare l'attivazione delle chemochine, selectine e adesione delle cellule T tramite le integrine e alla migrazione dei linfociti modello attraverso la barriera emato - encefalica. L'unica limitazione per le cellule che possono essere analizzati con questo metodo è che devono essere in grado di percepire la forza del flusso come un segnale direzionale.

Anche se il metodo descritto qui è usato per caratterizzare il comportamento cellulare come velocità e rotazione, può anche essere esteso all'analisi degli aspetti molecolari della migrazione. Complessi molecolari rilevanti per la migrazione indotta da flusso, tra cui le integrine come LFA-1 e loro adattatori del citoscheletro, sarebbe situati all'interno di 200 nM della superficie della diapositiva, suscettibile di visualizzazione con microscopia di TIRF. Questa aggiunta al metodo sarebbe l'ideale per lo studio delle cellule dai topi con mutazioni in proteine integrina - o citoscheletro-relative. Come molti cellule immuni di migrano nelle varie fasi nel loro sviluppo attraverso il sangue o linfa scorre, la migrazione in vitro descritta può essere utilizzato per testare sistematicamente molti tipi di leucociti coltivati o primari per risposta al flusso e rivelano come le cellule sono programmato per eseguire la migrazione in una risposta immunitaria in vivo. In conclusione, il dosaggio descritto qui fornisce un metodo semplice e affidabile per l'analisi di migrazione indotta da flusso di MZBs che può estendersi anche ad altri tipi di cellule.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 a K.-D.F.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm VWR 10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm Miltenyi 130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit Miltenyi 130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC Biolegend 103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC BD Biosciences 558658
CD23, clone B3B4, PE Biolegend 101608
HBSS Biochrom L2035
D-PBS 1x Gibco by Life Technologies 14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free Roth "0052.3"
ICAM-1 R&D Systems 796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated Ibidi 80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm Ibidi 10963
Ibidi Pump system Ibidi 10902

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References

  1. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  2. Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged. Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).
  3. Steiner, O., et al. Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium. Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).
  4. Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration. Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).
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  8. Cyster, J. G., Schwab, S. R. Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs. Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).
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  18. ibidi. ibidi Pump System. , Available from: https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. (2018).

Tags

Immunologia e infezione problema 141 cellule B zona marginale migrazione flusso di shear integrine aderenza adesione intercellulare molecule-1 (ICAM-1) vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1)
Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro
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Tedford, K., Tech, L., Steiner, M.,… More

Tedford, K., Tech, L., Steiner, M., Korthals, M., Fischer, K. D. Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (141), e58759, doi:10.3791/58759 (2018).

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