Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

تحليل وزارة شؤون المرأة طريقة فعالة للمساعدة في تحديد الأنواع أو التمييز المظهرية. هذا البروتوكول يصف الأساليب لدراسة التفاصيل المورفولوجية الخاصة ثلاثة أنواع تمثيلية من الكائنات الحية وستطبق على نطاق واسع لدراسة ملامح كثيرة العضوي وأنواع الأنسجة.

Abstract

المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) هي تقنية متاحة على نطاق واسع تم تطبيقه لدراسة العينات البيولوجية بدءاً من البروتينات الفردية إلى الخلايا والأنسجة والعضيات والكائنات كلها حتى. ويركز هذا البروتوكول على طريقتين التجفيف الكيميائية هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) والكحول تي-بوتيل (يضاف) وتطبيقها لتصوير الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة على حد سواء باستخدام sem. في هذه المقالة، نحن تصف كيفية إصلاح وتغسل ويذوي، جاف، جبل، وتفل معطف والصورة ثلاثة أنواع من الكائنات الحية: البكتيريا الزرقاء (ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، جولينكينا sp.، و sp. غير معروف)، يوجلينويدس اثنين من جنس مونومورفينا (أينيجماتيكا م. و. م. بسيودوبيروم)، وذبابة الفاكهة (melanogaster المورفولوجية). والغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقة سريعة وغير مكلفة وبسيطة للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل وحجم، والخصائص السطحية للعينات التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية من أجل الخصائص المورفولوجية تقييم. النجاح في إنجاز هذا البروتوكول يسمح للآخرين باستخدام SEM لتصور عينات بتطبيق هذه التقنيات على النظام الخاص بهم.

Introduction

المسح الإلكتروني المجهري (SEM) يستخدم مركزة شعاع من الإلكترونات ذات الطاقة العالية لإنشاء صورة من الإلكترونات الثانوية التي تظهر مورفولوجية والطوبوغرافيا ل نموذج1. يمكن استخدام وزارة شؤون المرأة لمباشرة تحديد الحجم الفعلي عينة والبنية السطحية، وشكل ثلاثي الأبعاد، ويوفر دقة أكبر وأكبر عمق الميدان مقارنة بالفحص المجهري الخفيفة. نموذج آخر الميكروسكوب الإلكتروني (م)، يستخدم مجهر إلكتروني (TEM) تركز الإلكترونات التي تمر من خلال العينة، توليد الصور مع التفاصيل الدقيقة للهيكل الداخلي. في حين تيم بدقة أعلى من الضوء أو وزارة شؤون المرأة، ويمكن استخدامها لحل هياكل صغيرة مثل ذرة واحدة، فقد العيوب الرئيسية الثلاثة: إعداد عينة واسعة النطاق ومجال رؤية صغيرة وعمق ضحل من الميدان2،3. على الرغم من أن البعض تصور وجود بروتوكولات استخدام وزارة شؤون المرأة لدراسة محددة الخلايا أو العضيات، أو الأنسجة4،5،6،،من78،9، 10 ، هذا البروتوكول فريدة من نوعها في ذلك يمكننا وصف الأساليب التي يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمجموعة كبيرة من الكائنات الحية من أجل تقييم الخصائص المورفولوجية.

ووزارة شؤون المرأة قد وجدت تطبيقات واسعة النطاق لفحص المواد غير العضوية، بما في ذلك جسيمات نانوية11،12،13من البوليمرات، والعديد من التطبيقات في العلوم الجيولوجية والصناعية، والمواد14، 15،16. في علم الأحياء، استخدمت وزارة شؤون المرأة منذ فترة طويلة كوسيلة لفحص العينات البيولوجية بدءاً من البروتينات الفردية لكل الكائنات17،18. وزارة شؤون المرأة ذات قيمة خاصة لأنه يمكن استخدام التفاصيل السطحية المورفولوجية لإبلاغ الاكتشافات العلمية. تحليل وزارة شؤون المرأة طريقة سريعة وغير مكلفة وبسيطة للحصول على معلومات مفصلة عن هيكل وحجم، والخصائص السطحية لمجموعة واسعة من العينات البيولوجية.

عادة يعمل وزارة شؤون المرأة تحت التفريغ العالي (10-6 عربة الحد الأدنى) لدعم متماسك شعاع من الإلكترونات عالية السرعة، لا يسمح أي السوائل (الماء، الزيوت، الكحول) في قاعة عينة، كسوائل منع تشكيل فراغ. وهكذا، يجب أن المجففة جميع العينات التي درست باستخدام SEM، عادة باستخدام سلسلة متدرجة من إيثانول تليها عملية تجفيف لإزالة في الإيثانول. هناك عدة طرق لتجفيف الأنسجة البيولوجية لاستخدامها في وزارة شؤون المرأة، بما في ذلك تجفيف الهواء، ليوفيليزيشن، واستخدام جهاز (وثيقة البرنامج القطري) التجفيف النقطة الحرجة، أو الكيميائية التجفيف باستخدام t-بوتيل الكحول (TBA) أو، هيكساميثيلديسيلازاني (همدس)19 20 , 21 , 22-في معظم الأحيان، اختيار أسلوب التجفيف التجريبية منذ كل عينة بيولوجية قد تتفاعل بشكل مختلف لكل أسلوب التجفيف. لأي نموذج معين، كل هذه الأساليب قد يكون من المناسب، حتى مقارنة مزايا وعيوب كل منها ويكون مفيداً في تحديد الأسلوب المناسب.

بينما الهواء تجفيف عينة في درجة حرارة الغرفة أو في فرن تجفيف (60 درجة مئوية) هو الأسلوب الأبسط، معظم العينات البيولوجية تظهر الأضرار التي يسببها تجفيف مثل شريفلينغ وانهيار، أدى إلى تشويه للعينة. عملية lyophilization أيضا إزالة الماء (أو الجليد) من عينة، ولكن يتطلب عينات لتكون مجمدة في فلاش وتوضع تحت الفراغ لإزالة الثلج عن طريق عملية التسامي، من المحتمل أن تكون ضارة العينة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن يكون المستخدم الوصول إلى ليوفيليزير. الأسلوب الأكثر استخداماً للتجفيف عينات لوزارة شؤون المرأة نقطة حرجة التجفيف (وثيقة البرنامج القطري). في وثيقة البرنامج القطري، يتم استبدال الإيثانول في عينة السائل من ثاني أكسيد الكربون (CO2)، وتحت درجة حرارة معينة وضغط الظروف المعروفة النقطة الحرجة (31.1 درجة مئوية وهذه المبادرة 1,073)، أول أكسيد الكربون2 يبخر دون خلق التوتر السطحي، مما المحافظة على فعالية الميزات البنيوية والهيكلية للعينة. بينما وثيقة البرنامج القطري هو عموما الطريقة القياسية، فقد عدة عيوب. أولاً، العملية تتطلب الوصول إلى نقطة حرجة مجفف، التي ليست مكلفة فقط، بل يتطلب أيضا استخدام ثاني أكسيد الكربون السائل. ثانيا، أن حجم العينة التي يمكن أن تجفف يقتصر على حجم الدائرة النقطة الحرجة مجفف. وثالثاً، يمكن أن يسبب تبادل السوائل خلال وثيقة البرنامج القطري الاضطرابات التي يمكن أن تلحق الضرر العينة.

تجفيف المواد الكيميائية ويوفر مزايا عديدة أكثر من وثيقة البرنامج القطري ويخدم كبديل مناسب أصبح يستخدم على نطاق واسع في إعداد نموذج وزارة شؤون المرأة. ويتيح استخدام ديهيدرانتس الكيميائية مثل القابلات التقليديات وهمدس بديلاً سريعة وغير مكلفة وبسيطة لأساليب أخرى، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للعينة. ونحن مؤخرا أظهرت أن لم يكن هناك فرق في سلامة الأنسجة أو جودة الصورة النهائية التقاطها عند استخدام وثيقة البرنامج القطري أو القابلات التقليديات كأسلوب التجفيف في نسيج الشبكية المورفولوجية الكبار23. وخلافا لوثيقة البرنامج القطري، القابلات التقليديات وهمدس لا تتطلب أداة تجفيف أو السائل CO2 وتوجد أية قيود على الحجم العينة أن تجفف. بالإضافة إلى الحصول على المواد الكيميائية، فقط غطاء الأبخرة الكيميائية القياسية ومعدات الحماية الشخصية المناسبة (القفازات، ومعطف مختبر، ونظارات واقية) المطلوبة لإكمال عملية التجفيف. بينما كل من القابلات التقليديات وهمدس القابلة للاشتعال، يضاف أقل سمية وأقل تكلفة (حوالي 1/3 تكلفة همدس) من همدس.

في هذه المقالة، نحن تصف كيفية إصلاح وتغسل ويذوي، جاف، جبل، وتفل معطف والصورة ثلاثة أنواع من الكائنات الحية: البكتيريا الزرقاء (ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، جولينكينا sp.، و sp. غير معروف)، يوجلينويدس اثنين من جنس مونومورفينا (أينيجماتيكا م. و. م. بسيودوبيروم)، وذبابة الفاكهة (melanogaster المورفولوجية). هذه الكائنات تمثل نطاقا واسعاً في الحجم (0.5 ميكرومتر إلى 4 مم) والتنوع الخلوية (وحيدة الخلية إلى متعددة الخلايا)، ولكن كلها بسهولة قابلة للتحليل ووزارة شؤون المرأة مع اختلافات صغيرة فقط بحاجة لإعداد العينات. هذا البروتوكول يصف الأساليب لاستخدام الجفاف الكيميائية والتحليل ووزارة شؤون المرأة للنظر في تفاصيل المورفولوجي لثلاثة أنواع من الكائنات الحية، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع في دراسة كثير العضوي وأنواع الأنسجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-الإعداد والتثبيت

  1. إعداد البكتيريا الزرقاء.
    1. تنمو الثقافات أونيالجال في وسائل الإعلام F/224،25 في درجة حرارة 28 درجة مئوية في 14:10 ح الخفيفة دورة الظلام. نقل الثقافة يكفي لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل أن بعد السماح لمدة 15 دقيقة على تسوية، بيليه البكتيرية حوالي 0.05 مل في الحجم. قم بإزالة الوسائط واستبدال 1.5 مل مثبت (glutaraldehyde 1.25%، 0.1 M الفوسفات المخزن المؤقت pH 7.0)، برفق عكس عدة مرات، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. نقل الخلايا الثابتة مع ماصة زجاجية في منصة ترشيح 10 مل (الشكل 1) التي تحتوي على عامل تصفية البولي 25 مم مع المسام ميكرومتر 0.8 أو 0.2، اعتماداً على حجم الخلايا. ختم الذراع الجانب والقمع بسدادات مطاطية لاحتواء الثقافة في القمع. إزالة مثبت بفراغ لطيف في دورق الترشيح، بعد إزالة السدادات على حد سواء.
      ملاحظة: إذا لم تكن كثافة الخلية على تصفية البولي الأمثل، قم بضبط مقدار ابتداء من الثقافة المستخدمة.
  2. تعد الطحالب وحيدة الخلية (يوجلينويدس).
    1. تنمو الثقافات أونيالجال في وسائل الإعلام العربية-626 مع 150 مل لتر-1 من التربة والمياه المتاحة تجارياً المتوسطة إضافة إلى وسائل الإعلام، عند درجة حرارة 22 درجة مئوية في 14:10 ح الخفيفة دورة الظلام. نقل 2 مل من الكثافة السكانية المنخفضة (OD600 < 0.5) الثقافة مع ماصة زجاجية في منصة ترشيح 10 مل (الشكل 1) التي تحتوي على عامل تصفية البولي 25 مم مع 8 ميكرومتر المسام. ختم الذراع الجانب والقمع بسدادات مطاطية لاحتواء الثقافة في القمع.
      ملاحظة: إذا لم تكن كثافة الخلية على تصفية البولي الأمثل، قم بضبط مقدار ابتداء من الثقافة المستخدمة.
    2. إضافة ثلاث قطرات من 4% أكسيد الاوزميوم (أوسو4) مباشرة إلى الثقافة والسماح لاحتضانها لإزالة الحد الأدنى 30 مثبت بفراغ لطيف في دورق الترشيح، بعد إزالة كلا السدادات.
      ملاحظة: أوسو4 هو السمية حادة (عن طريق الجلد، عن طريق الفم، واستنشاق الطرق)، أكالة للجلد، وتضر بالعيون، ومحسس الجهاز تنفسي. وينبغي التعامل مع أوسو4 في غطاء الأبخرة كيميائية باستخدام معدات الوقاية الشخصية الملائمة بما في ذلك القفازات، ومعطف مختبر، وحماية العين.
  3. إعداد melanogaster المورفولوجية (ذبابة الفاكهة)23.
    1. تخدير الكبار الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون 100%. مكان تخديره من البالغين (حوالي 10 إلى 30 الذباب) في أنبوب الطرد مركزي القنينة أو 1.5 مل ملولبة بلاستيكية صغيرة.
    2. تزج تخديره من الذباب في 1 مل مثبت (glutaraldehyde 1.25%، 0.1 M الفوسفات المخزن المؤقت pH 7.2) ح 2 (أو بين عشية وضحاها) في 4 درجات مئوية. إذا كان الذباب تطفو على السطح لمثبت، إضافة بضع قطرات من 2.5% البولي إثيلين غليكول ثالثي-أوكتيلفينيل الاثير لإضعاف التوتر السطحي لمثبت السماح لغمر المجموع من الأنسجة. إزالة مثبت استخدام بيبيت زجاج.

2-الغسيل والجفاف

  1. أغسل ويذوي البكتيريا الزرقاء.
    1. تغسل العينة ثابتة ثلاث مرات مع 5 مل من 0.1 متر الفوسفات المخزن المؤقت pH 7.0 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. الاحتفاظ بقارورة والقمع امبولات للاحتفاظ المياه والصرف الصحي. إزالة كل غسل من فراغ لطيف في دورق الترشيح، بعد إزالة السدادات على حد سواء.
    2. يذوي العينة مع الحفاظ على الغمر المستمر باستخدام سلسلة متدرجة من إيثانول، لمدة 10 دقائق في حجم 5 مل في القمع. تركيزات الإيثانول متدرج: 25%، 50%، 75%، 95%، والتغييرات 2 الإيثانول 100%. الاحتفاظ بقارورة والقمع امبولات تحتوي على الإيثانول في القمع، منع الخسارة على حد سواء عن طريق التبخر والتدفق السلبي من خلال عامل تصفية.
    3. إزالة الإيثانول بفراغ لطيف في دورق الترشيح، بعد إزالة السدادات على حد سواء. نقل عامل تصفية/العينة ألومنيوم القابل للصرف يزن صحن يحتوي على الإيثانول 100% فقط ما يكفي لتغطية العينة قبل التجفيف.
  2. أغسل ويذوي الطحالب وحيدة الخلية (يوجلينويدس).
    1. تغسل العينة ثابتة ثلاث مرات مع 5 مل مياه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. الاحتفاظ بقارورة والقمع امبولات تحتوي على الغسيل في القمع. إزالة كل غسل من فراغ لطيف في دورق الترشيح، بعد إزالة السدادات على حد سواء.
    2. يذوي العينة مع الحفاظ على الغمر المستمر باستخدام سلسلة متدرجة من إيثانول لمدة 10 دقائق في حجم 5 مل في القمع. تركيزات الإيثانول متدرج: 25%، 50%، 75%، 95%، والتغييرات 2 الإيثانول 100%. الاحتفاظ بقارورة والقمع امبولات تحتوي على الإيثانول في القمع، منع الخسارة على حد سواء عن طريق التبخر والتدفق السلبي من خلال عامل تصفية.
    3. إزالة الإيثانول بفراغ لطيف في دورق الترشيح، بعد إزالة السدادات على حد سواء. نقل عامل تصفية/العينة ألومنيوم القابل للصرف يزن صحن يحتوي على الإيثانول 100% فقط ما يكفي لتغطية العينة قبل التجفيف.
  3. أغسل ويذوي melanogaster المورفولوجية (ذبابة الفاكهة).
    1. تغسل العينة ثابتة ثلاث مرات مع 1 مل من 0.1 متر الفوسفات المخزن المؤقت pH 7.2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إزالة كل غسل مع ماصة زجاجية، مع الحرص على عدم إزالة الذباب.
    2. يذوي العينة باستخدام سلسلة متدرجة من إيثانول، لمدة 10 دقيقة في حجم 1 مل في أنبوب [ميكروفوج]. تركيزات الإيثانول: 25%، 50%، 75%، 80%، 95%، 100%. إزالة الإيثانول مع ماصة زجاجية، مع الحرص على عدم إزالة الذباب.
    3. الاحتفاظ بالعينة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل مع الإيثانول 100% فقط ما يكفي لتغطية العينة قبل التجفيف.

3-التجفيف

  1. إجراء التجفيف الكيميائية باستخدام t-بوتيل الكحول (TBA)27.
    1. استبدال الحل الإيثانول 100% مع حل 1:1 من الإيثانول TBA و 100% لأدنى 20 استبدال تكرار الحل 1:1 مع 100 ٪ TBA على 20 دقيقة مرتين. يبقى الحل في 37 درجة مئوية حيث أن عدم تجميد القابلات التقليديات.
      ملاحظة: قد يضاف 100% نقطة تجميد 25.5 درجة مئوية؛ الحل 1:1 لن تجمد في درجة حرارة الغرفة. يضاف هو قابل للاشتعال ويسبب تهيج العين خطيرة وضارة إذا استنشق وقد يسبب تهيج الجهاز التنفسي أو النعاس أو الدوخة. ينبغي التعامل مع القابلات التقليديات في غطاء الأبخرة كيميائية باستخدام معدات الوقاية الشخصية الملائمة بما في ذلك القفازات، ومعطف مختبر، وحماية العين.
    2. نقل العينة في القابلات التقليديات، إذا كان في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، إلى ألومنيوم القابل للصرف وزنها الطبق. مرة واحدة في الطبق وزنها الألومنيوم، إزالة القابلات التقليديات واستبدل بما يكفي TBA 100% جديدة لتغطية العينة. تجميد TBA عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. نقل إلى مجفف فراغ (جرة بيل) مع حزم هلام المجمدة لإبقاء TBA المجمدة. إخلاء والحفاظ على الفراغ بمضخة دوارة للسماح للعينة الجافة بالتسامي الفراغ من القابلات التقليديات المجمدة لمالا يقل عن 3 ح أو بين ليلة وضحاها.
  2. إجراء التجفيف الكيميائية باستخدام هيكساميثيلديسيلازاني (همدس)20.
    1. يستعاض عن الحل الإيثانول 100% مع حل 1:2 من همدس والايثانول 100% 20 دقيقة ليحل محل الحل 1:2 مع حل همدس 2:1 الإيثانول 100% عن 20 دقيقة 2:1 الحل مع 100% همدس ل 20 دقيقة كرر مرة واحدة.
      ملاحظة: هو همدس القابلة للاشتعال والسمية حادة (المسار عن طريق الجلد). وينبغي التعامل مع همدس في غطاء الأبخرة كيميائية باستخدام معدات الوقاية الشخصية الملائمة بما في ذلك القفازات، ومعطف مختبر، وحماية العين.
    2. نقل العينة في همدس، إذا كان في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، إلى ألومنيوم القابل للصرف وزنها الطبق. مرة واحدة في الألومنيوم يزن صحن، استبدال 100% همدس بما يكفي طازجة 100% همدس لتغطية العينة.
    3. نقل العينة إلى مجفف غير فراغ من البلاستيك أو الزجاج مع ديسيككانت جديدة (5-6 سم العميق) ووضع في غطاء الأبخرة كيميائية. وبدلاً من ذلك، وضع العينة مباشرة في غطاء الأبخرة كيميائية الجافة مع غطاء فضفاض، مثل مربع، لمنع الأنقاض من الوقوع في العينة. تسمح العينة الجافة ح 12 إلى 24.

4-تصاعد

  1. جبل البكتيريا الزرقاء ويوجلينويدس.
    1. التسمية أسفل أما الألومنيوم 12 أو 25 مم تصاعد كعب روتين للإشارة إلى ما يوضع على أعلى. قطع تصفية البولي مع الخلايا المجففة إلى أرباع مع شفرة حلاقة نظيفة أو مشرط إذا استخدام كعب روتين 12 مم، أو وضع عامل التصفية كامل إذا كان استخدام كعب روتين 25 مم.
    2. ضع كل مرشح على لاصق أو علامة لاصقة الكربون المضمونة إلى الأعلى من كعب روتين.
  2. جبل melanogaster المورفولوجية (ذبابة الفاكهة).
    1. قم بتسمية الجزء السفلي من الألومنيوم تصاعد كعب الروتين للإشارة إلى ما يوضع على أعلى.
      ضع الذباب المجفف في الموضع الذي تريده من علامة التبويب لاصقة لاصقة أو الكربون المضمون بالجزء العلوي من كعب روتين تحت مجهر تشريح مع ملاقط الدقة.
    2. تطبيق لاصقة موصلة الفضة، أي الفضة الطلاء، حول الحواف الخارجية لبذرة. قم بتوصيل الطلاء الفضة الذباب باستخدام مسواك لضمان التوصيل. عدم السماح بالطلاء للمس في مجال التصوير المطلوب.
    3. وضع كعوب الروتين في مربع حامل كعب ثم ضع مربع حامل كعب مفتوحة في مجفف. السماح الطلاء الفضة الجاف على الأقل 3 ساعات أو بين عشية وضحاها للحصول على أفضل النتائج.

5-تفل طلاء

  1. إعداد جهاز طلاء الرش، بإجراء مسح أربعة أو خمسة من غاز الأرجون. إذا كانت الرطوبة عالية (أي الهواء الغرفة يشعر رطبة، عادة نحو 50% رطوبة نسبية)، إجراء مسح ستة إلى سبعة. تفل معطف بذرة اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. تستخدم عينات معطف استناداً إلى العينة:
    1. للمرشحات بالبكتيريا الزرقاء، تعيين جهاز ضبط الوقت تفل معطف من 180 s مباشرة على.
    2. بالنسبة للمرشحات مع الطحالب حقيقية النواة، أي، يوجلينويدس، تعيين جهاز ضبط الوقت تفل معطف 120 s s مستقيمة على، ثم 20 في الأطراف الثلاثة بزاوية 45 درجة.
    3. بالنسبة لعينات كبيرة، أي رؤساء يطير، تعيين جهاز ضبط الوقت تفل معطف 60 s s مستقيمة على، ثم 30 في كل جانب بزاوية 45 درجة.
      ملاحظة: بعد الانتهاء من الطلاء، ينبغي أن تكون بذرة رمادي فاتح اللون.

6-التصوير

  1. صورة العينات باستخدام المسح الإلكتروني المجهري يحتوي على كاشف الإلكترونات الثانوية (جنوب شرق).
    1. للبكتيريا الزرقاء، تطبيق الإعدادات التالية: 3-5 كيلوفولت مسرع الجهد (AC) والتحقيق الحالي (PC) 20-30 والمسافة العمل 5 مم (WD). بالنسبة يوجلينويدس، استخدم 3 كيلو فولت تيار متردد، 30 PC، و 5 ملم WD. للذباب، استخدم 5 كيلو فولت تيار متردد، 30 PC، و 5 إلى 10 ملم WD.
  2. ضبط التكبير تبعاً للحجم من التفصيل أو الكائن تصور. ضبط ستيجماتورس وفتحات، والتركيز حتى يتم إنتاجه صورة واضحة. التقاط الصورة باستخدام إعدادات عالية الاستبانة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة من sem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

البكتيريا الزرقاء هي مجموعة بدائية من الكائنات الحية ذات الأهمية الحاسمة للكربون على الصعيد العالمي، والأكسجين، ودورات النيتروجين28،29. أنواع البكتيريا الزرقاء306000 المقدرة، الأكثر غمد موسيلاجينوس التي تغطي وتوصيل الخلايا مع بعضها والهياكل الأخرى31، الذي جنبا إلى جنب مع الشكل، ويمكن أن تحل مجهريا32. حجم الخلية، والشكل، وأصباغ هذا التمييز بين الأنواع الفردية وفي الموائل المائية، يمكن تصور سيانوباكتيريال "تزهر"28. تصنيف سيانوباكتيريال الحديثة يجمع بين جميع ميزات مورفولوجية يمكن استخدام الفحص المجهري الخفيفة، تيم، ووزارة شؤون المرأة، فضلا عن البيانات الجزيئية33. مماثلة إلى غمده الصمغ من البكتيريا الزرقاء، شرائط جليده يوجلينويد أنواع المعونة في تصميم نسأله. يوجلينويدس يجلد المائية التي تمتلك قدرا كبيرا من التنوع المورفولوجي والسلوكية، وتحليل ووزارة شؤون المرأة قد أثبتت أنها مفيدة في تصنيف الأنواع المتميزة. على وجه التحديد، يوجلينويدس تمتلك هياكل رواية تحت على غشاء البلازما تتكون من شرائط البروتينية موازية و microtubules، دعا ال35،34،جليده36. عدد وترتيب، وحجم شرائط جليده المقارنة مورفولوجية حرجة، وجنبا إلى جنب مع البيانات الجزيئية النشوء والتطور، وتستخدم لبناء نسأله يوجلينوزوا37.

الخطوة الأولى في إعداد البكتيريا الزرقاء و euglenoids يتطلب تصفية الكائنات الحية من المتوسطة على النمو وتتم عن طريق تجميع منصة ترشيح (الشكل 1A). تطلع يستخدم لسحب المتوسطة من خلال عامل تصفية البولي، ترك الكائنات الحية على السطح لعامل التصفية. يجب تحديد حجم المسام تصفية البولي أن الكائنات الحية سليمة لن تمر من خلال (قارن الشكل 1 باء و جيم 1). ويبين الشكل 2 نتائج تمثيلية من ثلاثة أجناس مختلفة من البكتيريا الزرقاء. اثنين من المياه العذبة والبحرية. تفاصيل الخلية، بما في ذلك الشكل والملمس من السطح مرئية، وكذلك في غمد الصمغ أو إسقاطات من الخلايا. الشكل 3 يوضح كيفية استخدام وزارة شؤون المرأة لتصور شرائط جليده من نوعين من أنواع مختلفة من يوجلينويد. ترتيب حلزوني جليده تجرد هذا الدمج في النهاية الخلفية لتشكل وسيلة مساعدة ذيل في تصميم نسأله عند مقارنة أينيجماتيكا مونومورفينا (الشكل 3 ألف و 3 باء) مع بسيودوبيروم مونومورفينا ( الشكل 3 و 3D).

بالإضافة إلى الخصائص المورفولوجية التي تحدد الأنواع، مورفولوجية نموذج الكائنات مثل melanogaster المورفولوجية الخارجية يمكن استخدامها لتحديد المعدلات الوراثية باستخدام الخلايا العصبية photoreceptors التي تضم مجمع المورفولوجية العين38. ولما العين أنسجة غير الضروري في الذباب، فمن الممكن للتعبير عن البروتينات السامة في خلايا الشبكية واستخدام وزارة شؤون المرأة لدراسة التغيرات المورفولوجية له التعديل الوراثي على العين. عيون الذبابة العادية تتميز بمجموعة مرتبة من شعيرات والعدسات (الشكل 4 أ)، إلا أن تعبير البروتينات المرتبطة بمرض الزهايمر إنشاء ما يسمى بالنمط الظاهري 'العين الخام' (الشكل 4 باء). الجينات التي قمعها (الشكل 4) أو تعزيز (الشكل 4) النمط الظاهري العين الخام قد تلعب دوراً فسيولوجية في تطور المرض وإمكانية للمخدرات تستهدف39. كما هو موضح في الشكل 4 أمثلة من المزالق المحتملة لتجنب بما في ذلك مثال للهيكل المنهار للعين من تقنية التجفيف غير لائق (4E الشكل) والكترون الشحن من طلاء الرش غير كافية التي تظهر أثناء الحصول على الصور (الشكل 4F وز 4).

Figure 1
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي لتلاعب الترشيح ووزارة شؤون المرأة لعامل تصفية البولي. (A) وهذا الجهاز يستخدم لفصل صغيرة أو وحيدة الخلية الحية مثل البكتيريا الزرقاء ويوجلينويدس بعيداً عن المتوسطة على النمو. تطبيق فراغ على ذراع الجانب قارورة ستسحب محتويات القمع من خلال تصفية البولي وإلى قاعدة دورق الترشيح، ترك الكائنات الحية على السطح لعامل التصفية. وانقطع تصفية (ب) وزارة شؤون المرأة للمسام 0.8 ميكرومتر مع لا نموذج عينة بسبب سوء التصرف. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. (ج) SEM 0.8 ميكرومتر المسامية عامل التصفية مع البكتيريا الزرقاء الحالية. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : وزارة شؤون المرأة صورة مجهرية للبكتيريا الزرقاء- (أ، ب) ميسيدوسيدا توكسيفيلوم، أنواع المياه العذبة الخيطية من ولاية كولورادو مع غمد مرئية من الصمغ (M). تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومتر. (ج، د) بالمياه العذبة جولينكينا sp. من ولاية أوهايو. فرد الخلايا في بعض الأحيان شكل المستعمرات التي عقدت معا بطبقة رقيقة من الصمغ (M). مثل خيوط نتوءات (الأسهم البيضاء) تمديد للخلايا الفردية. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. (ه، و) غير معروف الخيطية الأنواع من مصب ملوحة عالية في المياه الساحلية في ولاية تكساس. خلية فردية (الأسهم السوداء) وتقسيم الخلايا (رؤوس بيضاء) مرئية. شريط مقياس في لوحة E = 2 ميكرومتر. مقياس بار في الفريق و = 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : صورة مجهرية SEM من جليده شرائط من نوعين من يوجلينويدس- (أ، ب) أينيجماتيكا مونومورفينا. (أ) الصور التكبير المنخفض الخلية بأكملها. شريط المقياس = التكبير عالية 5 ميكرومتر. (ب) النهاية الخلفية. شريط المقياس = 3 ميكرومتر. (ج، د) بسيودوبيروم مونومورفينا. (ج) صور تضخم منخفضة للخلية بأكملها. شريط المقياس = التكبير عالية 10 ميكرون. (د) النهاية الخلفية. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : تحليل وزارة شؤون المرأة لتعديل العين المورفولوجية المظهرية. بالمقارنة مع المظهر الخارجي العادي لمجموعة مرتبة من شعيرات وعدسات العين يطير (A)، التعبير عن تاو البروتينات السامة يسبب موت الخلايا العصبية مستقبله، توليد النمط الظاهري 'العين الخام' (ب). التعبير عن المعدلات الوراثية التي قمع (ج) أو (د) العين الخام تاو تعزز دليلاً على الجينات التي قد تلعب دوراً في تاو السمية العصبية. أسلوب غير لائق أثناء التجفيف خطوات يمكن أن تؤدي إلى انهيار الهيكل للعين (ه) بينما طلاء كفاية العينة سوف يسبب الشحن، الذي يظهر كالفرقة (ز) الأسود أو الأبيض (F) أثناء الحصول على الصور، كما هو موضح بالسهم. شريط المقياس = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا يمكننا وصف بروتوكول باستخدام وزارة شؤون المرأة للحصول على معلومات مفصلة حول الخصائص المورفولوجية الخارجية من ثلاثة أنواع من الكائنات الحية أن الآخرين يمكن أن تنطبق على دراسة السمات لأنواع عديدة من الكائنات الحية أو الأنسجة. في كل خطوة من البروتوكول، هناك نقاط محتملة للخطأ التي قد تنشأ والتي تناقش بالتفصيل أدناه.

بينما وحدات التخزين لمثبت ويغسل الواردة هنا محددة، بشكل عام مثبت ويغسل ينبغي أن يكون 5-10 × حجم العينة. جميع الأوقات التثبيت، والغسيل، والجفاف هي استناداً إلى تجربتنا، إذا تنشأ مشاكل، مثلاً، شريفلينغ للعينة، فقد تحتاج إلى زيادة المرات في كل خطوة للتجفيف أو التجفيف. اعتماداً على نموذج وحيد الخلية الخاصة بك، قد تحتاج إلى القيام بتثبيت glutaraldehyde وتثبيت بعد في أكسيد الازميوم. إذا تم تثبيت مبارزة اللازمة بعد الخطوة 1.1.2 الإجراء البكتيريا الزرقاء مع تغطية كمية تساوي 2% أوسو4 في نفس المخزن المؤقت وننطلق من الخطوة 1.2.2 الداخلي خلية مفردة. من عمل لا يظهر هنا، وقد وجدنا أن المورفولوجية يمكن أما توضع مباشرة في أنيسثيتيزيشن التالية مثبت أو يمكن تجميدها إلى أجل غير مسمى في-20 درجة مئوية في أنبوب [ميكروفوج] ووضعها في مثبت في وقت لاحق مع أي اختلاف في الانتهاء جودة الصورة.

خلال خطوات الغسل والجفاف، من الضروري التحرك من خلال سلسلة الإيثانول متدرج ببطء ودون تخطي تركيز لاحظ. إذا هي نزعت العينات بسرعة كبيرة جداً، فإنه يؤثر سلبا على العناصر الهيكلية الكامنة في الأنسجة وسوف تنكمش العينة أو تذبل أو الانهيار. ويرد مثال لانهيار الأنسجة في 4E الشكل. وبالإضافة إلى ذلك، لمنع إدخال من التحف الفنية مثل التثاقل وتسطيح للخصائص المورفولوجية، أنها حاسمة بالنسبة لإجازة فقط الإيثانول ما يكفي لتغطية العينة بين الخطوات أثناء الجفاف والتجفيف.

عند استخدام جهاز الحفر الترشيح، ستعقد قطره الماء على القاعدة عامل التصفية في مكان عند تجميع. أيضا، يجب وضع عامل التصفية مع الجانب لامعة حتى وينبغي إضافة جميع السوائل بلطف، مع الحرص على التعامل مع عامل التصفية مع الرعاية لمنع تجرف العينة. على الرغم من أننا وجدنا نتائج التجفيف باستخدام همدس أو القابلات التقليديات لتكون من نوعية متساوية، ونحن نوصي باستخدام TBA: حين همدس والقابلات التقليديات القابلة للاشتعال، يضاف هو حوالي ثلث السامة، وأقل تكلفة من همدس.

خلال تصاعد التعتيم عند استخدام مادة لاصقة موصلة الفضة (أيضا الطلاء الفضة تسمى)، كن حذراً عند تطبيق النموذج الخاص بك يمكن بسهولة أن تغطي (المدفونة) في الطلاء، وبالتالي التفاصيل الدقيقة في التشكل. قد تختلف أوقات طلاء الرش استناداً إلى النموذج الخاص بك، والقيم الواردة هنا هي استناداً إلى خبرتنا. إحدى النتائج السلبية المحتملة لطلاء الرش غير كافية ظاهرة تسمى الشحن، الذي غالباً ما يظهر كخط أسود أو أبيض (في بعض الأحيان فلاش) في الصورة النهائية (انظر الشكل 4F و G للحصول على أمثلة). إذا كانت كمية الشحن الملاحظ الحد الأدنى، قد يكون من الممكن التخفيف من الآثار عن طريق ضبط معلمات المجهر المختلفة، مثل تخفيض الجهد المتسارع أو شعاع الحالية، وزيادة قوة العدسة مكثف، و/أو استخدام أصغر الفتحة موضوعية. معظم SEMs المستخدمة للعينات البيولوجية قد كشف الإلكترونات الثانوية، ولكن بعض SEMs أيضا قد تكون مجهزة بتشتت ارتدادي للكشف عن أو كشف البيئية الثانوية الإلكترون، والتي يمكن تعديلها للتقليل أو للقضاء على آثار الحد الأدنى الشحن. إذا كانت آثار مشحون أكثر وضوحاً، فمن المحتمل أن يكون هناك أسس الفقراء من العينة أو القليل جداً تفل طلاء لإنتاج الإلكترونات الثانوية، مما تسبب في الإلكترونات مشحونة لبناء في العينة ويفرج عنها عفويا، وإنتاج التشويه في الصورة أثناء اقتناء. شحن وضوحاً في معظم الأحيان تحل بطلاء سمكا أو أسس أفضل بطلاء الفضة. لأن كل الكثير والقليل جداً من طلاء الرش يمكن أن تؤثر سلبا على جودة الصورة، فمن الأفضل لتحسين كمية الطلاء يطبق عن طريق ضبط متغيرات الوقت (10 إلى 180 s) وضغط (70 إلى 150 متور) المغطى الرش لتحقيق أوبتيم شركة الطلاء. كما لا يمكن إزالة الطلاء مجرد تطبيقها على العينة، المستحسن تشغيل اختبار مع عينة واحدة قبل طلاء جميع العينات.

معلمات وزارة شؤون المرأة مثل التعجيل بالتيار الكهربائي (في وادي الملوك)، التحقيق الحالي (PC)، والعمل عن بعد (WD) يجب تعديلها للحصول على أفضل صورة ممكنة، كما يقترح الإعدادات هنا ابتداء من معلمات استناداً إلى تجربتنا. في حين تعتمد على العناية في إعداد نوعية العينة، جودة الصورة النهائية تعتمد على الخبرة والمهارة للمشغل ووزارة شؤون المرأة. وبالتالي، نوصي بالعمل مع فني SEM أو قضاء بعض الوقت في تطوير المهارات الخاصة بك ووزارة شؤون المرأة. كافة البيانات (بما في ذلك إعداد العينة والتصوير) المبينة في هذه الورقة تم إنشاؤها بواسطة الطلبة الجامعيين في برنامج "علم الأحياء المجهري" في جامعة كارنيجي ميلون، بتوجيه من هيئة التدريس ولدينا فني الفحص المجهري.

البروتوكولات المذكورة هنا تشمل استخدام المواد الكيميائية الضارة، وينبغي دائماً مراعاة تدابير السلامة المناسبة لحماية المستخدمين، ولا سيما الطلاب الذين قد يكون التعامل مع هذه المواد الكيميائية. بينما البروتوكولات تحديد الشواغل المتعلقة بالسلامة المرتبطة بكل مادة كيميائية عند الاستخدام لأول مرة، المستخدمين ينبغي دائماً: (1) استخدام غطاء الأبخرة كيميائية، (2) الوصول إلى دش المياه والصرف الصحي وسلامة عين طوارئ، (3) استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة بما في ذلك قفازات النتريل ومعطف مختبر العين الحماية، و (4) يعرف أين يمكن العثور على إجراءات السلامة كتابية شاملة للتعامل مع الإجراءات، مكان مخصص استخدام المناطق، تسرب، إجراءات إزالة التلوث، وإجراءات التخلص من النفايات.

وفي الختام، توضح هذه الكائنات كيف معلومات حول طبوغرافية ثلاثية الأبعاد للسطوح الخارجية لكل مفيد لتحليل التجميع أو معدل النشوء والتطور. للبكتيريا الزرقاء، يمكن استخدام ميزات مصممة من وزارة شؤون المرأة بالاقتران مع بيانات إضافية من الخفيفة الميكروسكوب، تيم، والدراسات الجزيئية لتحديد وتوصيف، واسم البكتيريا الزرقاء. Euglenoids عدد، والعرض، والترتيب (حلزونية أو على التوالي)، والزخرفة، إذا كان حاضرا، جليده شرائط يمكن استخدامها مع البيانات المورفولوجية الأخرى، وإذا كانت البيانات الجزيئية الضرورية، لتحديد وتوصيف، واسم يوجلينويدس. وعلاوة على ذلك، يمكن إعداد أنواع أخرى من الطحالب وحيدة الخلية وبرزويات أو اللافقاريات الصغيرة ودرست بطريقة مماثلة لتحديد الميزات المورفولوجية الخارجية مثل سياط، تغذية بنية، والزخرفة الخارجية، أو تفاصيل الملاحق في حالة اللافقاريات الصغيرة. وأخيراً، قد SEM تطبيقات واسعة النطاق لدراسة التفاصيل المورفولوجية، مثل عين النظام النموذجي المورفولوجية، تميز المعدلات الوراثية أمراض المرض. البروتوكولات المذكورة هنا الاستفادة من الكائنات الحية التي تختلف اختلافاً كبيرا فيما يتعلق بالتعقيد، ولكن جميعها قابلة للتحليل ووزارة شؤون المرأة لجمع معلومات مفيدة المورفولوجية التي حاسمة بالنسبة للاكتشافات العلمية التي تغطي العديد من سوبديسسيبلينيس مختلفة من علم الأحياء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل بمنحه إلى MLS وجائزة الباحث الصيف إلى MAK من مكتب البحوث والدراسات العليا في جامعة ميشيغان الوسطى. البكتيريا الزرقاء التي تم توفيرها زيمبا ومختبر العوالق، وجزء من المركز "الدراسات الساحلية"، تكساس A & M جامعة في كوربوس كريستي. يوجلينويدس التي تم توفيرها بمختبر تريمير، وجامعة ولاية ميشيغان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

علم الأحياء، العدد 143، المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، البكتيريا الزرقاء، يوجلينويد، وذبابة الفاكهة، و المورفولوجية، النقطة الحرجة التجفيف (وثيقة البرنامج القطري)، هيكساميثيلديسيلازاني (همدس)، تي-بوتيل الكحول (يضاف)
إعداد الكائنات الحية بدائية وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائية للتحليل المورفولوجي في المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter