Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM analyse is een effectieve methode om te helpen bij de identificatie van soorten of fenotypische discriminatie. Dit protocol beschrijft de methoden voor de behandeling van specifieke morfologische details van drie representatieve soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van functies van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Abstract

Scanning elektronen microscopie (SEM) is een algemeen beschikbare techniek die is toegepast om te bestuderen van biologische monsters variërend van individuele eiwitten tot cellen, weefsels, organellen en zelfs hele organismen. Dit protocol is gericht op twee chemische drogen methoden, hexamethyldisilazane (HMDS) en t-butylalcohol (TBA), en hun toepassing aan imaging van zowel prokaryote en eukaryote organismen met behulp van SEM. In dit artikel beschrijven we hoe te repareren, wassen, uitdrogen, droog, mount, sputter vacht, en beeld van drie soorten organismen: blauwalgen (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. en een onbekende sp.), twee euglenoids uit het geslacht Monomorphina (M. aenigmatica en M. pseudopyrum), en de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een snelle, goedkope en eenvoudige methode voor het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur, de grootte en oppervlakte kenmerken van specimens die in grote lijnen kunnen worden toegepast op een groot aantal organismen voor morfologische beoordeling. Succesvolle afronding van dit protocol zal toestaan dat anderen te gebruiken SEM te visualiseren van monsters door deze technieken toe te passen aan hun systeem.

Introduction

Een gerichte lichtbundel van hoog-energetische elektronen een Scannende Elektronen Microscoop (SEM) gebruikt voor het genereren van een afbeelding van secundaire elektronen die toont de morfologie en de topografie van een monster1. SEM kan worden gebruikt om rechtstreeks bepalen de fysieke omvang van een steekproef, de oppervlaktestructuur, driedimensionale vorm, en het biedt grotere resolutie en grotere diepte van het veld ten opzichte van de lichte microscopie. Een andere vorm van elektronenmicroscopie (EM), transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) gebruikt gerichte elektronen die passeren van het monster, afbeeldingen met fijne details van interne structuur te genereren. Terwijl TEM hogere resolutie dan licht of SEM heeft en kan worden gebruikt om op te lossen structuren zo klein als enkele atomen, heeft drie grote nadelen: uitgebreide monstervoorbereiding, een kleine gezichtsveld en een ondiepe diepte van veld2,3. Hoewel andere gevisualiseerd protocollen bestaan met behulp van SEM te bestuderen van specifieke weefsels, cellen en organellen4,5,6,7,8,9, 10 , dit protocol is uniek in die zin dat we beschrijven methoden die in grote lijnen kunnen worden toegepast op een groot aantal organismen voor morfologische beoordeling.

SEM heeft brede toepassingen voor de behandeling van anorganische materialen met inbegrip van nanodeeltjes11,12, polymeren13en talrijke toepassingen in geologische, industriële en materiële wetenschappen14, gevonden 15,16. In de biologie, heeft SEM lange tijd gebruikt als een methode voor de behandeling van biologische monsters variërend van individuele eiwitten tot hele organismen17,18. SEM is van bijzonder belang omdat morfologische oppervlak details kunnen worden gebruikt om wetenschappelijke ontdekking. SEM analyse is een snelle, goedkope en eenvoudige methode om het verkrijgen van gedetailleerde informatie over de structuur, de grootte en oppervlakte van de kenmerken van een breed scala van biologische monsters.

Omdat een SEM normaal onder hoog vacuüm (10-6 Torr minimale opereert) ter ondersteuning van een coherente lichtstraal high-speed elektronen, zijn geen vloeistoffen (olie, water, alcoholen) toegestaan in de monsterkamer, zoals vloeistoffen te voorkomen een vacuüm oprichten dat. Aldus, moeten alle monsters onderzocht met behulp van SEM worden gedehydrateerde, meestal met behulp van een reeks van de gesorteerde ethanol gevolgd door een droogprocédé te verwijderen van de ethanol. Er zijn verschillende methoden voor het drogen van biologische weefsels voor gebruik in de SEM, met inbegrip van lucht drogen, lyofilisatie, gebruik van een kritisch punt drogen (CPD) apparaat, of chemische drogen met behulp van de t-butylalcohol (TBA) of hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. selectie van een droogrek methode is meestal empirische aangezien elk biologische monster verschillend op elke drogen methode reageren kan. Voor elk monster, kan al deze methoden passend zijn, dus het vergelijken van de voor- en nadelen van elk nuttig is in het selecteren van de juiste methode.

Terwijl lucht drogen een monster bij kamertemperatuur of in een droogstoof (60 ° C) de eenvoudigste methode is, meeste biologische monsters Toon drogen-veroorzaakte schade zoals shriveling en instorten, wat resulteert in een verstoring van het model. Het proces van lyofilisatie ook water (of ijs) verwijdert uit een monster, maar vereist te worden flash-bevroren monsters en onder vacuüm te verwijderen het ijs via het proces van sublimatie, potentieel schadelijke het monster geplaatst. Bovendien moet de gebruiker beschikken over een lyophilizer. De meest gebruikte methode voor het drogen van de monsters voor SEM is kritisch punt drogen (CPD). In CPD, wordt de ethanol in een monster vervangen met vloeibare kooldioxide (CO2) en, onder specifieke temperatuur en druk voorwaarden bekend als het kritische punt (31.1 ° C en 1,073 psi), CO2 verdampt zonder het maken van de oppervlaktespanning, waardoor effectief handhaven de morfologische en structurele kenmerken van de steekproef. Terwijl CPD over het algemeen de standaardmethode is, heeft meerdere nadelen. Ten eerste, het proces vereist toegang tot een kritisch punt droger, die is niet alleen duur, maar ook noodzakelijk het gebruik van vloeibare kooldioxide. Ten tweede, de grootte van de steekproef die kan worden gedroogd is beperkt tot de grootte van de kamer van het kritieke punt droger. Ten derde kan de uitwisseling van vloeistoffen tijdens CPD turbulentie die schade aan het monster toebrengen kan.

Chemische droging biedt vele voordelen ten opzichte van de BPR en fungeert als een geschikt alternatief dat steeds wijd in de bereiding van de monsters van de SEM gebruikt is. Het gebruik van chemische dehydrants zoals TBA en HMDS biedt een snel, goedkoop en eenvoudig alternatief voor andere methoden, terwijl nog het handhaven van de structurele integriteit van het monster. We onlangs bleek dat er geen verschil in de integriteit van het weefsel of de kwaliteit van het uiteindelijke beeld gevangen genomen toen met CPD of TBA als de drogen methode in volwassen Drosophila retinale weefsel23was. In tegenstelling tot de CPD, TBA en HMDS hoeft niet een droogrek instrument of vloeibare CO2 en er is geen beperking op de grootte van de steekproef worden gedroogd. Naast het verkrijgen van de chemicaliën, zijn alleen een standaard chemische zuurkast en passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril) vereist om te voltooien van het droogproces. Terwijl zowel de HMDS als de TBA ontvlambaar zijn, TBA minder giftig en minder duur is (ongeveer 1/3 de kosten van HMDS) dan HMDS.

In dit artikel beschrijven we hoe te repareren, wassen, uitdrogen, droog, mount, sputter vacht, en beeld van drie soorten organismen: blauwalgen (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. en een onbekende sp.), twee euglenoids uit het geslacht Monomorphina (M. aenigmatica en M. pseudopyrum), en de fruitvlieg (Drosophila melanogaster). Deze organismen vertegenwoordigen een breed scala in omvang (0,5 µm tot 4 mm) en cellulaire verscheidenheid (eencellige aan meercellige), maar allemaal gemakkelijk vatbaar voor SEM analyse met slechts kleine variaties die nodig zijn voor de voorbereiding van het monster. Dit protocol beschrijft de methoden voor het gebruik van chemische uitdroging en SEM analyse te onderzoeken van morfologische details voor drie soorten organismen en zou breed toepasbare beoordeling van veel organisch en weefseltypes (HLA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding en fixatie

  1. Bereiden van cyanobacteriën.
    1. Grow eensoortige culturen in F/2 media24,25 bij een temperatuur van 28 ° C op een 14:10 h licht donker cyclus. Overbrengen in voldoende cultuur een 1,5 mL microcentrifuge buis zodanig dat na het toestaan van 15 min te regelen, de bacteriële pellet ongeveer 0,05 mL in grootte. Verwijder het medium en vervangen met 1,5 mL fixeer (1,25% Glutaaraldehyde, 0,1 M fosfaatbuffer pH 7.0), voorzichtig omkeren van meerdere keren en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
    2. Overdracht van de vaste cellen met een glazen pipet in een 10 mL filtratie tuig (Figuur 1) die met een filter 25 mm polycarbonaat met 0.8 of 0,2 µm poriën, afhankelijk van de grootte van de cellen. Verzegel de zijarm en trechter met rubber stoppen te bevatten van de cultuur in de trechter. Het fixeer door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen.
      Opmerking: Als de celdichtheid op het polycarbonaat-filter niet optimaal is, de hoeveelheid van het starten van cultuur gebruikt aanpassen.
  2. Eencellige algen (euglenoids) voor te bereiden.
    1. Grow eensoortige culturen in AF-6 media26 met 150 mL L-1 van verkrijgbare bodem-water medium toegevoegd aan de media, bij een temperatuur van 22 ° C op een 14:10 h licht donker cyclus. Pipetteer 2 mL van lage dichtheid (OD600 < 0,5) cultuur met een glazen pipet in een 10 mL filtratie tuig (Figuur 1) die met een filter 25 mm polycarbonaat met 8 µm poriën. Verzegel de zijarm en trechter met rubber stoppen te bevatten van de cultuur in de trechter.
      Opmerking: Als de celdichtheid op het polycarbonaat-filter niet optimaal is, de hoeveelheid van het starten van cultuur gebruikt aanpassen.
    2. Voeg drie druppels van 4% osmium tetroxide (OsO4) rechtstreeks naar de cultuur en laat Incubeer voor 30 min. het fixeer door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen.
      Opmerking: OsO4 is een acute toxine (dermaal, orale en inhalatie routes), corrosief voor de huid, schadelijk voor de ogen, en een respiratoire sensibiliserende. OsO4 moeten worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.
  3. Bereiden van Drosophila melanogaster (fruitvlieg)23.
    1. Anesthetize volwassen vliegen met behulp van 100% kooldioxide. Plaats verdoofd volwassenen (ongeveer 10 tot 30 vliegen) in een kleine plastic schroefdop ampul of 1,5 mL centrifugebuis.
    2. Dompel onder narcose vliegen in 1 mL fixeer (1,25% Glutaaraldehyde, 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,2) voor 2 h (of 's nachts) bij 4 ° C. Als de vliegen op het oppervlak van de fixeer drijven, voeg een paar druppels van 2,5% polyethyleenglycol tert-octylphenyl ether te verzwakken de oppervlaktespanning van de fixeerspray waardoor totale onderdompeling van het weefsel. Verwijder de fixeer die met behulp van een glazen pipet.

2. wassen en uitdroging

  1. Wassen en uitdrogen van cyanobacteriën.
    1. Wassen van de vaste monster driemaal met 5 mL 0,1 M fosfaatbuffer pH 7.0 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. Houd de kolf en de trechter kolven voor het wassen. Elke wassen door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen.
    2. Het uitdrogen van het monster met behoud van continue onderdompeling met behulp van een getrapte ethanol-serie, gedurende 10 minuten in een volume van 5 mL in de trechter. De graded ethanol concentraties zijn: 25%, 50%, 75%, 95% en 2 wijzigingen van 100% ethanol. De kolf en de trechter kolven bevatten de ethanol in de trechter, gegevensverlies voorkomen houden beide via verdamping en passieve stroom door het filter.
    3. Ethanol door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen. Het filter/monster overbrengen in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel met net genoeg 100% ethanol ter dekking van het monster vóór het drogen.
  2. Wassen en uitdrogen eencellige algen (euglenoids).
    1. Wassen het vaste monster driemaal met 5 mL gedeïoniseerd water op kamertemperatuur voor elke 10 min. Houd de kolf en de trechter kolven om te bevatten het wassen in de trechter. Elke wassen door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen.
    2. Het uitdrogen van het monster met behoud van continue onderdompeling met behulp van een reeks graded ethanol gedurende 10 minuten in een volume van 5 mL in de trechter. De graded ethanol concentraties zijn: 25%, 50%, 75%, 95% en 2 wijzigingen van 100% ethanol. De kolf en de trechter kolven bevatten de ethanol in de trechter, gegevensverlies voorkomen houden beide via verdamping en passieve stroom door het filter.
    3. De ethanol door zachte vacuüm op de kolf filtratie verwijderen na het verwijderen van beide stoppen. Het filter/monster overbrengen in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel met net genoeg 100% ethanol ter dekking van het monster vóór het drogen.
  3. Wassen en uitdrogen Drosophila melanogaster (fruitvlieg).
    1. Wassen het vaste monster driemaal met 1 mL 0,1 M fosfaatbuffer pH 7,2 bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Verwijder elke wassen met een glazen pipet, voorzichtig niet te verwijderen van de vliegen.
    2. Uitdrogen van het monster met behulp van een getrapte ethanol-serie, gedurende 10 minuten in een volume van 1 mL in een microfuge buis. De concentraties van ethanol: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Verwijder de ethanol met een glazen pipet, voorzichtig niet te verwijderen van de vliegen.
    3. Behouden van het monster in de buis 1,5 mL microcentrifuge met net genoeg 100% ethanol ter dekking van het monster vóór het drogen.

3. het drogen

  1. Chemische drogen met behulp van de t-butyl alcohol (TBA)27uitvoeren
    1. De 100% ethanol oplossing vervangen door een oplossing van 1:1 van TBA en 100% ethanol voor 20 min. vervangen de oplossing van 1:1 met 100% TBA voor 20 min. tweemaal herhalen. Bewaar deze oplossing bij 37 ° C, zodat TBA niet bevriest.
      Opmerking: 100% TBA heeft een vriespunt van 25,5 ° C; de 1:1 oplossing zal niet bevriezen bij kamertemperatuur. TBA ontvlambaar is, veroorzaakt ernstige oogirritatie is schadelijk bij inademing en irritatie van de luchtwegen, slaperigheid of duizeligheid kan veroorzaken. TBA moet worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.
    2. Breng het monster in TBA, als in een 1,5 mL microcentrifuge buis, in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel. Eenmaal in de aluminium wegende schotel, TBA verwijderen en vervangen door net genoeg verse 100% TBA ter dekking van het monster. Het bevriezen van de TBA bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    3. Overbrengen naar een vacuüm exsiccator (Stolp) bevroren gel packs te houden TBA bevroren. Evacueren en onderhouden vacuüm met een roterende pomp om het monster aan droog door vacuüm sublimatie van de bevroren TBA voor ten minste 3 uur of 's nachts.
  2. Uitvoeren van chemisch drogen met behulp van hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. Vervang de 100% ethanol oplossing met een oplossing van 1:2 van HMDS en 100% ethanol voor 20 min. vervangt de 1:2-oplossing met een 2:1-oplossing van HMDS en 100% ethanol voor 20 min. vervangen de 2:1 oplossing met 100% HMDS voor 20 min. eenmaal herhaald.
      Opmerking: HMDS is brandbaar en een acute toxine (dermale route). HMDS moeten worden behandeld in een chemische zuurkast met behulp van passende persoonlijke beschermingsmiddelen zoals handschoenen, laboratoriumjas en oogbescherming.
    2. Breng het monster in HMDS, als in een 1,5 mL microcentrifuge buis, in een wegwerp aluminium met een gewicht van schotel. Zodra in het aluminium met een gewicht van schotel, het vervangen van de 100% HMDS met net genoeg verse 100% HMDS ter dekking van het monster.
    3. Het monster overbrengen in een plastic of glas niet-vacuüm exsiccator met verse droogmiddel (5-6 cm diep) en leg in in een chemische zuurkast. Leg het monster ook rechtstreeks in een chemische zuurkast te drogen met een losse deksel, zoals een vak om te voorkomen dat vuil op het monster valt. Toestaan dat de steekproef te drogen voor 12 tot 24 h.

4. montage

  1. Mount cyanobacteriën en euglenoids.
    1. Label de onderkant van beide een 12 - of 25-mm aluminium montage van stub om aan te geven wat wordt geplaatst op de top. Snijd het polycarbonaat filter met de gedroogde cellen in wijken met een schone scheermesje of scalpel als met behulp van een beginnetje van 12 mm, of schakel het gehele filter als met behulp van een beginnetje van 25 mm.
    2. Plaats elk filter op lijm of een koolstof zelfklevende tab bevestigd aan de bovenkant van een beginnetje.
  2. Mount Drosophila melanogaster (fruitvlieg).
    1. Label onderin de aluminium montage stub om aan te geven wat wordt geplaatst op de top.
      Plaats de droge vliegen in de gewenste positie op lijm of koolstof zelfklevende tabblad beveiligd naar de top van een stub onder een ontleden Microscoop met precisie pincet.
    2. Toepassing zilveren geleidende lijm, dat wil zeggen, zilver verf, rond de buitenranden van de deelnemer. De zilveren verf verbinden met het vliegen met behulp van een tandenstoker te waarborgen van de geleidendheid. De verf te raken het gewenste opnamegebied niet toegestaan.
    3. De categorie: plaats in een beginnetje houder doos en plaats van het vak van de houder open stub in een exsiccator. Toestaan dat de zilveren verf droog ten minste 3 uur of 's nachts voor het beste resultaat.

5. sputter Coating

  1. Het apparaat sputter coating voor te bereiden door het uitvoeren van vier tot vijf flushes van argon gas. Als de luchtvochtigheid hoog is (dat wil zeggen, de kamer lucht vochtig, meestal ongeveer voelt 50% relatieve vochtigheid), uitvoeren van zes tot zeven flushes. Sputter coat de categorie: volgens de instructies van de fabrikant.
  2. Jas steekproeven gebaseerd op specimen gebruikt:
    1. Voor filters met cyanobacteriën, stelt u de timer sputter jas voor 180 s straight op.
    2. Voor filters met eukaryote algen, dat wil zeggen, euglenoids, stelt u de timer sputter jas voor 120 s rechtdoor, dan 20 s aan drie zijden onder een hoek van 45 °.
    3. Voor grote monsters, dat wil zeggen, vliegen hoofden, stelt u de timer sputter jas voor 60 s rechtdoor, dan 30 s aan elke kant in een hoek van 45 °.
      Opmerking: Nadat de coating is voltooid, categorie: moet lichtgrijs van kleur.

6. imaging

  1. Foto's met behulp van een Scannende Elektronen Microscoop waarin een detector secundaire elektron (SE).
    1. Voor cyanobacteriën, gelden de volgende instellingen: 3-5 kV versneller spanning (AC), 20-30 sonde huidige (PC) en 5 mm afstand (WD). Gebruik voor euglenoids, 3 kV AC, 30 PC en 5 mm WD. Voor vliegen, gebruik maken van 5 kV AC, 30 PC en 5 tot 10 mm WD.
  2. Aanpassen vergroting afhankelijk van de grootte van het detail of object dat u wilt worden gevisualiseerd. Pas de stigmators, de openingen en de focus totdat een duidelijk beeld ontstaat. Vastleggen van de afbeelding met hoge resolutie instellingen volgens de instructies van de fabrikant van de SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Blauwalgen zijn een prokaryote groep van organismen die essentieel voor de mondiale koolstof, zuurstof en stikstof cycli28,29 zijn. Van de geschatte 6000 soorten cyanobacteriën30, de meeste hebben een mucilaginous omhulsel dat dekken en de cellen met elkaar verbinden en aan andere structuren31, die samen met de vorm, kunnen worden opgelost microscopisch32. Celgrootte, vorm en pigmenten aanwezig onderscheiden van afzonderlijke soorten en aquatische habitats, kunnen worden gevisualiseerd als cyanobacteriën "bloemen"28. De moderne cyanobacteriën indeling combineert alle morfologische kenmerken mogelijk met behulp van de lichte microscopie, TEM, SEM, alsmede moleculaire gegevens33. Gelijkaardig aan de mucilage mantel van cyanobacteriën, pellicle strips van euglenoid soorten steun in fylogenie bepaling. Euglenoids zijn aquatische flagellaten die beschikken over een grote hoeveelheid morfologische en gedragsmatige diversiteit, en SEM analyse heeft bewezen nuttig bij de indeling van verschillende soorten. Specifiek, bezitten euglenoids roman structuren onder hun plasmamembraan die uit evenwijdige eiwithoudende stroken en microtubuli bestaat, genaamd de pellicle34,35,,36. Het aantal, de regeling, en de grootte van pellicle strips zijn kritische morfologische comparatoren, en samen met moleculaire fylogenetische gegevens, worden gebruikt voor de bouw van de fylogenie voor Euglenozoa37.

De eerste stap in de voorbereiding van zowel de euglenoids als de blauwalgen vereist de organismen van hun groeimedium filteren en wordt bereikt door het monteren van een filtratie tuig (figuur 1A). Aspiratie is gebruikt voor het trekken van het medium door een filter van polycarbonaat, verlaten de organismen op het oppervlak van het filter. De poriegrootte van het polycarbonaat-filter moet worden geselecteerd zodat de intact organismen niet zal passeren (Vergelijk figuur 1B en 1 C). Figuur 2 toont representatieve resultaten van drie verschillende geslachten van cyanobacteriën. Twee zijn zoetwater en een marine is. Details van de cel, met inbegrip van vorm en textuur van het oppervlak zijn zichtbaar, evenals een omhulsel van mucilage of prognoses uit de cellen. Figuur 3 illustreert hoe SEM wordt gebruikt voor het visualiseren van de pellicle strips van twee verschillende euglenoid soorten. De spiraalvormige regeling van de pellicle strips die samenvoegen aan het achterste uiteinde vormen een staatssteun in fylogenie vastberadenheid bij het vergelijken van Monomorphina aenigmatica (figuur 3A en 3B) met Monomorphina pseudopyrum ( Figuur 3 c en 3D).

Naast morfologische kenmerken waarmee de soort, kan de externe morfologie van modelorganismen zoals Drosophila melanogaster worden gebruikt voor het identificeren van genetische parameters met behulp van de researchdieren neuronen die deel uitmaken van de compound Drosophila 38van het oog. Aangezien het oog een niet-essentiële weefsel in vliegt is, is het mogelijk giftige proteïnen in netvlies cellen te gebruiken SEM te onderzoeken van de morfologische veranderingen die genetische modificatie op het oog heeft. Normale vliegen ogen worden gekenmerkt door een geordende matrix van varkenshaar en lenzen (figuur 4A), maar uitdrukking van eiwitten die zijn gekoppeld aan de ziekte van Alzheimer maken wat heet de 'ruwe eye' fenotype (figuur 4B). Genen die onderdrukken (figuur 4C) of uit te breiden (Figuur 4 d) het fenotype ruwe oog kunnen een fysiologische rol spelen in de progressie van de ziekte en hebben potentieel voor drug targeting39. Ook te zien in Figuur 4 zijn voorbeelden van potentiële valkuilen te vermijden met inbegrip van een voorbeeld van de samengevouwen structuur van het oog van onjuiste drogen techniek (figuur 4E) en elektron onvoldoende sputter coating die tijdens het verschijnt opladen Beeldacquisitie (figuur 4F en 4 G).

Figure 1
Figuur 1 : Schematische weergave van de filtratie rig en SEM van een polycarbonaat filter. (A) dit apparaat wordt gebruikt om te scheiden van de kleine of één eencellige organismen zoals cyanobacteriën en euglenoids uit de buurt van hun groeimedium. Toepassing van een vacuüm op de zijarm van de kolf zal het trekken van de inhoud van de trechter door het filter van polycarbonaat en in de base van de filtratie kolf, verlaten de organismen op het oppervlak van de filter. (B) SEM van een porie 0.8 µm filter met geen enkel monster als het monster was verloren vanwege verkeerde behandeling. Schaal bar = 20 µm. (C) SEM van een 0.8 µm porie filter met cyanobacteriën aanwezig. Schaal bar = 20 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : SEM opname van cyanobacteriën. (A, B) Toxifilum mysidocida, een draadvormige zoetwater soorten uit Colorado met een zichtbaar schede mucilage (M). Schaal bars = 5 µm. (C, D) A Swimming Golenkina sp. uit Ohio. Individuele cellen soms formulier kolonies bij elkaar gehouden door een dun laagje mucilage (M). Filament-achtige uitsteeksels (witte pijlen) verlengen de afzonderlijke cellen. Schaal bars = 10 µm. (E, F) onbekende filamenteuze soorten vanaf de monding van een hoge zoutgehalte in de kustwateren van Texas. Individuele cel (zwarte pijlen) en de scheidslijn cellen (witte pijlpunten) zijn zichtbaar. Schaal bar in paneel E = 2 µm. schaal balk in deelvenster F = 1 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 : SEM-opname van de pellicle strips van twee soorten euglenoids. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) lage vergroting beelden van de gehele cel. Schaal bar = 5 µm. (B) hoge vergroting van het posterieure einde. Schaal bar = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) lage vergroting beelden van de gehele cel. Schaal bar = 10 µm. (D) hoge vergroting van het posterieure einde. Schaal bar = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 : SEM analyse van fenotypische wijziging van het oog Drosophila . In vergelijking met de normale externe weergave van de geordende matrix van borstels en lenzen van het vliegen oog (A), resulteert uitdrukking van de giftige proteïne tau in de dood van de fotoreceptor neuronen, het genereren van de 'ruwe eye' fenotype (B). Expressie van genetische modifiers die onderdrukken (C) hetzij verbeteren (D) het tau ruwe oog levert het bewijs van genen die een rol bij tau neurotoxiciteit spelen kunnen. Onjuiste techniek tijdens het drogen stappen kan leiden tot een ineenstorting van de structuur van het oog (E) terwijl onvoldoende coating van het monster opladen veroorzaken zal, die wordt weergegeven als een wit (F) of zwart (G) band tijdens Beeldacquisitie, zoals aangegeven door de pijl. Schaal bar = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We beschreven hier een protocol met behulp van SEM voor gedetailleerde informatie over externe morfologische kenmerken van drie soorten organismen die anderen toepassen kunnen om de functies van veel soorten organismen of weefsels te onderzoeken. Binnen elke stap van het protocol zijn er potentiële punten van fout die zich kunnen voordoen en worden besproken in detail besproken.

Terwijl de volumes voor fixeer en wast hier gegeven specifieke zijn, moet in het algemeen de fixeer en wast 5-10 x het volume van het specimen. Fixatie, wassen en uitdroging allertijden zijn gebaseerd op onze ervaring, als er problemen ontstaan, bijvoorbeeld shriveling van het monster, moet u wellicht te verhogen van de tijden bij elke stap van het drogen of drogen. Afhankelijk van uw eencellige monster, kunt u zowel een Glutaaraldehyde fixatie en een na fixatie in osmium tetroxide doen. Als een duel fixatie is nodig na stap 1.1.2 van de procedure van cyanobacteriën Bedek met een gelijke hoeveelheid 2% OsO4 in de dezelfde buffer en u verder vanaf stap 1.2.2 van de eencellige procedure. Van het werk hier niet getoond, hebben we gevonden dat Drosophila kan ofwel direct in kleefpoeders volgende afstomping geplaatst worden of kan worden voor onbepaalde tijd bij-20 ° C in een microfuge buis bevroren en in fixeerspray op een later tijdstip met geen verschil in klaar geplaatst beeldkwaliteit.

Tijdens het wassen en uitdroging stappen is het noodzakelijk om te bewegen door de graded ethanol-serie langzaam en zonder overslaan van een bekende concentratie. Als de monsters zijn te snel uitgedroogd, dit van negatieve invloed op de onderliggende structurele componenten in het weefsel en specimen zal verschrompelen, verdorren of samenvouwen. Een voorbeeld van de ineenstorting van het weefsel wordt weergegeven in figuur 4E. Bovendien, om te voorkomen dat de invoering van artefacten zoals samendoen en afvlakking van morfologische kenmerken, is het kritisch te verlaten net genoeg ethanol ter dekking van het monster tussen stappen tijdens uitdroging en drogen.

Wanneer u het tuig filtratie, zal een druppel water op basis het filter op zijn plaats houden, bij het monteren. Ook het filter met de glimmende kant naar boven moet worden geplaatst en alle vloeistoffen zachtjes, moeten worden toegevoegd voorzichtig om het filter met zorg om te voorkomen dat het monster weg te wassen. Hoewel we de resultaten van het drogen met behulp van HMDS of TBA van gelijke kwaliteit hebt gevonden, raden we TBA: terwijl zowel HMDS en TBA ontvlambaar zijn, TBA is ongeveer één derde de kosten en minder toxisch dan HMDS.

Tijdens montage wanneer met behulp van zilveren geleidende lijm (ook genaamd zilver verf), wees voorzichtig met het toe te passen zoals uw monster kan gemakkelijk (begraven) in de verf worden gedekt, verduisterend waardoor fijne details in de morfologie. Sputter coating tijden kunnen variëren op basis van uw monster, en hier vermelde waarden zijn gebaseerd op onze ervaring. Een potentiële negatieve uitkomst van onvoldoende sputter coating is een verschijnsel genaamd opladen, die vaak als een witte of zwarte streep (soms een flash) weergegeven in de uiteindelijke afbeelding (Zie figuur 4F en G voor voorbeelden). Als de hoeveelheid opladen waargenomen minimaal is, het mogelijk is dat de afzwakking van de gevolgen door aanpassing van diverse parameters van de Microscoop, zoals het verlagen van de versnellende spanning of stroom, verhoging van de sterkte van de lens condensor en/of met behulp van een kleinere breedte objectieve diafragma. Meeste SEMs gebruikt voor biologische monsters hebben secundaire electron detectoren, maar sommige SEMs kunnen ook worden uitgerust met backscatter detectoren of milieu secundaire electron detectoren, die allemaal kunnen worden aangepast om te verminderen of elimineren van de effecten van minimale opladen. Indien de opladen effecten meer uitgesproken zijn, is het waarschijnlijk dat er slechte aarding van het monster is of te weinig sputter coating voor de productie van de secundaire elektronen, waardoor de geladen elektronen in het model opbouwen en spontaan worden vrijgegeven, het produceren van vervorming in de afbeelding tijdens overname. Uitgesproken opladen is meestal opgelost met een dikkere coating of beter aarding met zilver verf. Want zowel te veel als te weinig sputter coating negatieve invloed op de kwaliteit van het beeld hebben kan, het is het beste voor het optimaliseren van de hoeveelheid coating toegepast door aanpassing van de variabelen van de tijd (10 tot 180 s) en druk (70 tot 150 mTorr) van de sputter coater om een optim al de coating. Zoals de coating kan niet worden verwijderd, één keer toegepast op het voorbeeld, wordt een testlooppas aanbevolen met één sample voordat de coating alle van de monsters.

SEM parameters zoals versnelling van spanning (in kV), sonde huidige (PC), en werken afstand (WD) moet worden aangepast om het beste beeld mogelijk, zoals de instellingen die hier gegeven worden voorgesteld vanaf parameters gebaseerd op onze ervaring. Terwijl de kwaliteit van het monster afhankelijk van de zorgvuldigheid in voorbereiding is, de kwaliteit van het uiteindelijke beeld is afhankelijk van de ervaring en behendigheid van de SEM-operator. Wij raden dus, werken met een SEM-technicus of besteden tijd aan het ontwikkelen van uw eigen SEM vaardigheden. Alle gegevens (inclusief monstervoorbereiding en beeldvorming) in dit document getoond werden gegenereerd door studenten in het programma van de biologie microscopie op CMU, onder begeleiding van docenten en onze technicus microscopie.

De hier beschreven protocollen omvatten het gebruik van potentieel schadelijke chemische stoffen, en de passende veiligheidsmaatregelen moeten altijd worden waargenomen om gebruikers, met name studenten die kunnen worden omgaan met deze chemicaliën te beschermen. Terwijl de protocollen veiligheidsrisico's die zijn gekoppeld aan elke chemische stof bij het eerste gebruik opgeven, moeten gebruikers altijd: (1) gebruik een chemische zuurkast, (2) toegang hebben tot een noodsituatie eye wash en veiligheid douche, (3) het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen met inbegrip van nitril handschoenen, laboratoriumjas, en het oog bescherming, en (4) weet waarheen voor vondst schriftelijke veiligheidsprocedures, inclusief de afhandeling van procedures, aangewezen gebieden, gebruiken Mors procedures, procedures van de decontaminatie, en afval verwijdering procedures.

Kortom, illustreren deze organismen hoe informatie over de drie-dimensionale topografie van de externe oppervlakken van elk is nuttig voor fylogenetische analyse van de groepering of modifier. Voor cyanobacteriën, bepaald op basis van de SEM functies kunnen worden gebruikt in combinatie met aanvullende gegevens van de lichte microscopie, TEM, en moleculaire studies te identificeren, karakteriseren en naam van de cyanobacteriën. Voor euglenoids, het nummer, breedte, regeling (spiraalvormige of rechte) en versieringen, indien aanwezig, van de pellicle strips kunnen worden gebruikt met andere morfologische gegevens, en indien nodig moleculaire gegevens, te identificeren, karakteriseren en de naam van euglenoids. Bovendien kunnen andere soorten eencellige algen en protozoa of micro-ongewervelde dieren worden voorbereid en onderzocht op een vergelijkbare manier om te bepalen van externe morfologische kenmerken zoals flagellen, structuur, externe versieringen of details voor voeding aanhangsels in het geval van micro-ongewervelde dieren. Tot slot, SEM heeft brede toepassingen voor de behandeling van morfologische details, zoals het oog van de modelsysteem Drosophila, te karakteriseren van genetische parameters van ziekte pathologie. De hier beschreven protocollen gebruiken organismen die sterk met betrekking tot de complexiteit variëren, maar allemaal vatbaar voor SEM analyse voor het verzamelen van nuttige morfologische informatie die essentieel is voor wetenschappelijke ontdekking verspreid over vele verschillende subdisciplines van biologie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door een subsidie voor MLS en een zomer Scholar Award te MAK van de Office of Research en Graduate studie aan Central Michigan University. Cyanobacteriën werden geleverd door de Zimba en plankton lab, een deel van het centrum voor kust Studies, Texas A & M University in Corpus Christi. Euglenoids werden geleverd door de Triemer lab, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Biologie kwestie 143 Scanning elektronen microscopie (SEM) cyanobacteriën euglenoid fruitvlieg Drosophila kritische punt drogen (CPD) hexamethyldisilazane (HMDS) t-butylalcohol (TBA)
Voorbereiding van de prokaryote en eukaryote organismen met behulp van chemisch drogen voor de morfologische analyse van Scanning elektronen microscopie (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter