Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utarbeidelse av Prokaryotic og Eukaryotic organismer med kjemiske tørking for morfologisk analyse skanning elektronmikroskop (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM er en effektiv metode for å hjelpe i arter identifikasjon eller fenotypiske diskriminering. Denne protokollen beskriver metodene for å undersøke bestemte morfologiske detaljer av tre representant organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke funksjonene i mange organismebiologi og vev.

Abstract

Skanning elektronmikroskop (SEM) er en allment tilgjengelig teknikk som brukes for å studere biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til celler, vev, organeller og hele organismer. Denne protokollen fokuserer på kjemiske drying metodene, hexamethyldisilazane (HMDS) og t-butyl alkohol (TBA) og deres bruk bildebehandling av både prokaryotic og eukaryotic organismer med SEM. I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Formålet med denne protokollen er å beskrive en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner prøver som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer for morfologiske vurdering. Vellykket gjennomføring av denne protokollen vil tillate andre å bruke SEM for å visualisere prøver ved å bruke disse teknikkene på deres system.

Introduction

En scanning elektron mikroskop (SEM) bruker en fokusert stråle av kraftkrevende elektroner generere et bilde fra videregående elektroner som viser morfologi og topografi eksempel1. SEM kan brukes til direkte bestemmer den fysiske størrelsen av en prøve, overflatestruktur, tredimensjonal form, og tilbyr større oppløsning og større dybdeskarphet sammenlignet * lys. En annen form for elektronmikroskop (EM), overføring elektronmikroskop (TEM) bruker fokusert elektroner som passerer gjennom utvalget, genererer bilder med fine detaljer av intern struktur. Mens TEM har høyere oppløsning enn lys eller SEM og kan brukes til å løse strukturer så liten som enkelt atomer, har tre store ulemper: omfattende utvalg forberedelse, en liten synsfelt og en grunne dybde på feltet2,3. Selv om andre visualisert protokoller eksisterer ved hjelp av SEM undersøke bestemte celler, organeller eller vev4,5,6,7,8,9, 10 , denne protokollen er unik i at vi beskriver metoder som grovt kan brukes på et stort utvalg av organismer morfologiske vurdering.

SEM har funnet bred programmer for å undersøke uorganisk materiale inkludert nanopartikler11,12, polymerer13og mange programmer i geologiske, industrielle og materielle vitenskap14, 15,16. I biologi, har SEM lenge vært brukt for å undersøke biologiske prøver alt fra individuelle proteiner til hele organismer17,18. SEM er av spesiell verdi fordi morfologiske detaljer fra overflaten kan brukes til å informere vitenskapelige funn. SEM er en rask, billig og enkel metode for å få detaljert informasjon om strukturen, størrelse og overflate kjennetegner et bredt spekter av biologiske prøver.

Fordi en SEM normalt opererer under høyvakuum (10-6 Torr minimum) å støtte en sammenhengende stråle av høyhastighets elektroner, tillates ingen væske (vann, oljer, alkoholer) i eksemplet kammeret, som væsker hindre et vakuum dannes. Således, alle prøver undersøkt ved hjelp av SEM må bli dehydrert vanligvis bruke en gradert etanol serie etterfulgt av en tørkeprosessen fjerne etanol. Det finnes flere metoder for tørking biologisk vev for bruk i SEM, inkludert luft tørker, lyophilization, bruk av et kritisk punkt tørking (CPD) enhet eller kjemiske tørking t-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftest utvalg av tørking metode er empirisk siden hvert biologiske utvalg kan reagere forskjellig på hver tørking metode. For enhver gitt prøven, alle disse metodene vil være riktig så sammenligne fordeler og ulemper av hver er nyttig i å velge den riktige metoden.

Air tørking et utvalg ved romtemperatur eller i tørking ovn (60 ° C) er den enkleste metoden, de fleste biologiske prøver viser tørking-indusert skade som shriveling og kollaps, som resulterer i forvrengning av prøven. Prosessen med lyophilization også fjerner vann (eller is) fra en prøve, men krever å være flash-frosne og plassert under vakuum fjerne is via prosessen med sublimering, potensielt skadelige prøven. I tillegg må brukeren ha tilgang til en lyophilizer. Den vanligste metoden for dehydrating prøver for SEM er kritisk punkt tørking (CPD). CPD, er etanol i en prøve erstattet med flytende karbondioksid (CO2), og under bestemte temperatur og trykk forhold kjent som kritisk punkt (31,1 ° C og 1073 psi), CO2 fordamper uten å opprette overflatespenning, og dermed effektivt opprettholde de morfologiske og strukturelle funksjonene av utvalget. CPD er vanligvis standard metode, har den flere ulemper. Først krever prosessen tilgang til et kritisk punkt tørketrommel, som er ikke bare dyrt, men også nødvendiggjør bruk av flytende karbondioksid. Andre er størrelsen på prøven som kan tørkes begrenset til kammeret størrelsen på det kritiske punktet tørketrommel. Tredje, utveksling av væsker under CPD kan forårsake turbulens som kan skade prøven.

Kjemisk tørking gir mange fordeler over CPD og fungerer som et egnet alternativ som er blitt mye brukt i SEM eksempel forberedelse. Bruk av kjemiske dehydrants som TBA og HMDS tilbyr en rask, billig og enkelt alternativ til andre metoder, samtidig opprettholde den strukturelle integriteten til prøven. Vi har nylig viste at det var ingen forskjell i integriteten til vev eller kvaliteten på det endelige bildet tatt når du bruker CPD eller TBA som tørking metode i voksen Drosophila netthinnen vev23. I motsetning til CPD, TBA og HMDS krever ikke en tørking instrument eller flytende CO2 , og det er ingen begrensning på størrelsen på utvalget å. I tillegg til å skaffe kjemikalier, må et standard kjemiske avtrekksvifte og riktig personlig verneutstyr (hansker, laboratoriefrakk og vernebriller) fullføre tørkeprosessen. Mens både TBA og HMDS er brannfarlig, TBA er mindre giftig og billigere (ca 1/3 kostnaden for HMDS) enn HMDS.

I denne artikkelen beskriver vi hvordan å fikse, vask, tørke, tørr, montere, spraking pels og image tre typer organismer: Cyanobakterie (Toxifilum mysidocida Golenkina sp. og en ukjent sp.), to euglenoids fra slekten Monomorphina (M. aenigmatica og M. pseudopyrum), og frukt fly (Drosophila melanogaster). Disse organismene representerer et bredt spekter (0,5 µm 4 mm) og mobilnettet mangfold (encellede til flercellet), men alle er lett mottakelig for SEM analyse med kun små variasjoner nødvendig for prøven forberedelse. Denne protokollen beskriver metodene for å bruke kjemiske dehydrering og SEM analyse for å undersøke morfologiske detaljene av tre typer organismer og ville være bredt aktuelt å undersøke mange organismebiologi og vev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse og fiksering

  1. Forberede Cyanobakterie.
    1. Vokser unialgal kulturer i F/2 media24,25 ved en temperatur på 28 ° C på en 14:10 h lys mørke syklus. Overføre tilstrekkelig kultur til en 1,5 mL microcentrifuge rør slik at etter at 15 min å avgjøre, bakteriell pellets er omtrent 0,05 mL i størrelse. Fjerne media og erstatte med 1,5 mL bindemiddel (1,25% glutaraldehyde, 0.1 M fosfat buffer pH 7.0), forsiktig Inverter flere ganger og ruge over natten på 4 ° C.
    2. Overføre fast cellene med en glass pipette i en 10 mL filtrering rigg (figur 1) som inneholder et polykarbonat 25 mm filter med 0,8 eller 0,2 µm porene, avhengig av størrelsen på cellene. Seal side armen og trakt med gummi propper inneholder kulturen i trakten. Fjerne bindemiddel av mild vakuum på filtration flasken, etter at både stoppere.
      Merk: Hvis cellen tettheten på polykarbonat filteret ikke er optimal, justere mengden starter kultur brukes.
  2. Forberede enkeltcelle alger (euglenoids).
    1. Vokse unialgal kulturer i AF-6 media26 med 150 mL L-1 av kommersielt tilgjengelig jord-vann medium lagt til media, ved en temperatur på 22 ° C på en 14:10 h lys mørke syklus. Overføre 2 mL lav tetthet (OD600 < 0,5) kultur med et glass Pipetter i en 10 mL filtrering rigg (figur 1) som inneholder et polykarbonat 25 mm filter med 8 µm porene. Seal side armen og trakt med gummi propper inneholder kulturen i trakten.
      Merk: Hvis cellen tettheten på polykarbonat filteret ikke er optimal, justere mengden starter kultur brukes.
    2. Legg til tre dråper 4% osmium tetroxide (OsO4) direkte til kultur og la ruge for 30 min. fjerner bindemiddel av mild vakuum på filtration flasken, etter at både stoppere.
      Merk: OsO4 er en akutt gift (dermal, oral, og innånding ruter), skadelig for huden, skadelig for øynene, og en åndedretts sensitizer. OsO4 skal håndteres i kjemisk avtrekksvifte bruke riktig personlig verneutstyr inkludert hansker, laboratoriefrakk og vernebriller.
  3. Forberede Drosophila melanogaster (frukt fly)23.
    1. Bedøve voksen fluer bruke 100% karbondioksid. Sted anesthetized voksne (ca 10 til 30 fluer) i en liten plast skrukork hetteglass eller 1,5 mL sentrifuge rør.
    2. Fordype bedøvet fluer i 1 mL av bindemiddel (1,25% glutaraldehyde, 0.1 M fosfat buffer pH 7.2) for 2t (eller overnatting) på 4 ° C. Hvis fluene flyter på overflaten av bindemiddel, legge noen dråper 2,5% polyetylenglykol tert-octylphenyl Eter å svekke overflatespenning av bindemiddel gir totalt neddykking av vev. Fjerne bindemiddel med et glass pipetter.

2. vask og dehydrering

  1. Vask og tørke Cyanobakterie.
    1. Vask fast prøven tre ganger med 5 mL 0.1 M fosfat buffer pH 7.0 ved romtemperatur for 10 min. Holde flasken og trakt korket for å holde vask. Fjern hver vask av mild vakuum på filtration flasken, etter at både stoppere.
    2. Tørke prøven samtidig opprettholde kontinuerlig nedsenking i en gradert etanol serien, 10 min i et volum på 5 mL i trakten. Gradert etanol konsentrasjoner er: 25%, 50%, 75%, 95% og 2 endringer av 100% etanol. Holde flasken og trakt korket inneholder etanol i trakten, hindre tap både via fordampning og passiv flyt gjennom filteret.
    3. Fjerne etanol av mild vakuum på filtration flasken, etter fjerning av både stoppere. Overføre filter/prøven til en engangs aluminium veier tallerken med akkurat nok 100% etanol å dekke prøven før tørking.
  2. Vask og tørke enkeltcelle alger (euglenoids).
    1. Vask fast prøven tre ganger med 5 mL deionisert vann ved romtemperatur for 10 min. Holde flasken og trakt korket inneholder vask i trakten. Fjern hver vask av mild vakuum på filtration flasken, etter at både stoppere.
    2. Tørke prøven samtidig opprettholde kontinuerlig nedsenking ved hjelp av en gradert etanol serie for 10 min i et volum på 5 mL i trakten. Gradert etanol konsentrasjoner er: 25%, 50%, 75%, 95% og 2 endringer av 100% etanol. Holde flasken og trakt korket inneholder etanol i trakten, hindre tap både via fordampning og passiv flyt gjennom filteret.
    3. Fjerne etanol av mild vakuum på filtration flasken, etter fjerning av både stoppere. Overføre filter/prøven til en engangs aluminium veier tallerken med akkurat nok 100% etanol å dekke prøven før tørking.
  3. Vask og tørke Drosophila melanogaster (frukt fly).
    1. Vask fast prøven tre ganger med 1 mL av 0.1 M fosfat buffer pH 7.2 ved romtemperatur for 10 min i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Fjern hver vask med et glass pipette, være forsiktig med å fjerne fluene.
    2. Tørke prøven ved hjelp av en gradert etanol serie, for 10 min i et volum på 1 mL i et microfuge rør. Etanol konsentrasjoner er: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Fjerne etanol med et glass pipette, være forsiktig med å fjerne fluene.
    3. Beholde prøven i 1,5 mL microcentrifuge tube med akkurat nok 100% etanol å dekke prøven før tørking.

3. tørking

  1. Utføre kjemisk tørking ved hjelp av t-butyl alkohol (TBA)27.
    1. Erstatte 100% etanol løsningen med en 1:1 løsning av TBA og 100% etanol i 20 min. Erstatt 1:1-løsning med 100% TBA i 20 min. Gjenta to ganger. Hold i løsning på 37 ° C slik at TBA ikke fryser.
      Merk: 100% TBA har en frysepunktet 25,5 ° c; 1:1 løsningen fryser ikke ved romtemperatur. TBA er brannfarlig, forårsaker alvorlig øyeirritasjon, skadelig ved innånding og kan forårsake luftveier, døsighet og svimmelhet. TBA skal håndteres i kjemisk avtrekksvifte bruke riktig personlig verneutstyr inkludert hansker, laboratoriefrakk og vernebriller.
    2. Overføre eksemplet i TBA, hvis du er i en 1,5 mL microcentrifuge tube, inn et engangs aluminium veier parabolen. En gang i aluminium veiing fatet, fjerne TBA og erstatte med akkurat nok frisk 100% TBA å dekke prøven. Fryse TBA ved 4 ° C i 10 min.
    3. Overføre til et vakuum desiccator (bell jar) med frosne gel pakker å holde TBA frosset. Evakuere og vedlikeholde vakuum med roterende pumpe tillate prøve å tørke av vakuum sublimering av den frosne TBA for minst 3 timer eller over natten.
  2. Utføre kjemisk tørking ved hjelp av hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. Erstatte 100% etanol løsningen med en 1:2 løsning av HMDS og 100% etanol i 20 min. erstatte 1:2 løsningen med en 2:1 løsning av HMDS og 100% etanol i 20 min. erstatte 2:1 løsning med 100% HMDS i 20 min. gjentas én gang.
      Merk: HMDS er brannfarlig og en akutt gift (dermal rute). HMDS skal håndteres i kjemisk avtrekksvifte bruke riktig personlig verneutstyr inkludert hansker, laboratoriefrakk og vernebriller.
    2. Overføre eksemplet i HMDS, hvis du er i en 1,5 mL microcentrifuge tube, inn et engangs aluminium veier parabolen. En gang i aluminium veier parabol, erstatte 100% HMDS med akkurat nok frisk 100% HMDS å dekke prøven.
    3. Overføre prøven til en plast eller glass ikke-vakuum desiccator med ferske tørkemiddel (5-6 cm dyp) og Legg inn i kjemisk avtrekksvifte. Alternativt sted prøven direkte i kjemisk avtrekksvifte tørke med løs lokk, som en boks, å forhindre avfall faller på prøven. La prøven tørke 12 til 24 h.

4. montering

  1. Montere Cyanobakterie og euglenoids.
    1. Etiketten bunnen av enten en 12 eller 25 mm aluminium montering stub å indikere hva blir plassert på toppen. Skjær polykarbonat filteret med tørket celler i kvartaler med en ren barberblad eller skalpell hvis bruker mangelfull 12 mm, eller plass hele filteret hvis bruker mangelfull 25 mm.
    2. Plass hvert filter på lim eller en karbon lim kategorien festet til toppen av mangelfull.
  2. Montere Drosophila melanogaster (frukt fly).
    1. Etiketten bunnen av aluminium montering stubben å indikere hva blir plassert på toppen.
      Plass tørket fluene ønsket sted lim eller karbon lim kategorien festet til toppen av mangelfull under dissecting mikroskop med presisjon pinsett.
    2. Bruke en ledende lim, dvs. sølv maling, rundt ytterkantene av fødsler. Koble sølv maling til fluene med en tannpirker for å sikre ledningsevne. Ikke la malingen til å ta ønsket tenkelig område.
    3. Plasser fødsler i en spire holderen og sett boksen Åpne stub holderen i en desiccator. At sølv malingen tørke i minst 3 timer eller over natten for best resultat.

5. spraking belegg

  1. Forberede frese belegg apparatet ved å utføre fire til fem flush argon gass. Hvis luftfuktigheten er høy (dvs. romluften føles fuktig, vanligvis om 50% relativ fuktighet), utføre seks til syv flush. Spraking pels fødsler følge instruksjonene fra produsenten.
  2. Pelsen eksempler basert på prøven brukt:
    1. Angi timeren til spraking pels for 180 s rett på filtre med Cyanobakterie.
    2. Angi timeren til spraking pels for 120 s rett på, så 20 s på tre sider i 45 ° vinkel for filtre med eukaryotic alger, dvs. euglenoids.
    3. For store prøver sette dvs. fly hoder, stopuret å spraking pels for 60 s rett på og 30 s på hver side i en vinkel på 45 grader.
      Merk: Når belegg er fullført, stubber skal med lys grå farge.

6. imaging

  1. Bilde prøver ved en scanning elektron mikroskop inkluderer som en sekundær electron (SE) detektor.
    1. For Cyanobakterie, gjelder følgende innstillinger: 3-5 kV gasspedalen spenning (AC), 20-30 sonde gjeldende (PC) og 5 mm arbeidsavstand (WD). Euglenoids, bruke 3 kV vekselstrøm, 30 PC og 5 mm WD. Fluer, bruke 5 kV vekselstrøm, 30 PC og 5 til 10 mm WD.
  2. Justere forstørrelsen avhengig av størrelsen på detaljer eller objektet til visualiseres. Justere stigmators, åpninger og fokus til et klart bilde er produsert. Fange bildet med innstillinger for høy oppløsning i henhold til produsentens instruksjoner av SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cyanobakterie er en prokaryote organismer som er kritiske til globale karbon, oksygen og nitrogen sykluser28,29. Av anslått 6000 arter av Cyanobakterie30, de fleste har en Slim skjede som dekker og koble cellene sammen og andre strukturer31, som sammen med figuren, kan løses mikroskopisk32. Cellestørrelse, form og pigmenter finnes skille individuelle arter og i akvatisk habitat, kan visualiseres som cyanobacterial "blooms"28. Moderne cyanobacterial klassifisering kombinerer alle morfologiske funksjoner ved å bruke * lys, TEM, og SEM, samt molekylære data33. Ligner mucilage skjede av Cyanobakterie, pellicle strimler av euglenoid arter hjelp fylogeni besluttsomhet. Euglenoids er akvatiske ulike flagellater som har mye morfologiske og atferdsmessige mangfold, og SEM analyser har vist seg nyttig i klassifisere forskjellige arter. Spesielt ha euglenoids romanen strukturer under plasma membran som består av parallelle proteinaceous strimler og piskehale som henger, kalt pellicle34,35,36. Antall, plasseringen og størrelsen på pellicle strimler er kritisk morfologiske komparatorer, og sammen med molecular Fylogenetiske data, brukes til å konstruere fylogeni for Euglenozoa37.

Det første trinnet i forberedelsene både Cyanobakterie og euglenoids krever filtrering organismer fra deres vekst medium og oppnås ved å sette sammen en filtrering rigg (figur 1A). Aspirasjon brukes til å trekke mediet gjennom polykarbonat filter, forlater organismer på overflaten av filteret. Porestørrelse polykarbonat filter skal velges slik at intakt organismer ikke vil passere (sammenligne figur 1B og 1 C). Figur 2 viser representant resultatene av tre forskjellige arter av Cyanobakterie. To er ferskvann og er marine. Detaljer i cellen, inkludert form og tekstur av overflaten er synlig, samt en kappe av mucilage eller prognoser fra cellene. Figur 3 viser hvordan SEM brukes til å visualisere pellicle strimler av to forskjellige euglenoid. Spiralformede ordningen av pellicle strimler at flettingen på bakre slutten å danne en hale hjelpemiddel i fylogeni besluttsomhet når du sammenligner Monomorphina aenigmatica (figur 3A og 3B) med Monomorphina pseudopyrum ( Figur 3 c og 3D).

I tillegg til morfologiske kjennetegn som identifiserer arter, kan eksterne morfologi av modellen organismer som Drosophila melanogaster brukes til å identifisere genetiske modifikatorer bruker fotoreseptorer neurons som utgjør sammensatt Drosophila øye38. Siden øyet er en uvesentlig vev i fluer, er det mulig å uttrykke giftige proteiner i netthinnen celler og bruke SEM undersøke morfologiske endringene genmodifisering har på øyet. Normal fly øyne er preget av en bestilt rekke bust og linser (figur 4A), men uttrykk for proteiner forbundet med Alzheimers opprette det som kalles "grov øyet" fenotypen (figur 4B). Gener som hemmer (figur 4C) eller øke (Figur 4 d) grov øye fenotypen kan spille en fysiologisk rolle i sykdomsprogresjon og har potensial for narkotika målretting39. Også vist i Figur 4 er eksempler på potensielle fallgruvene å unngå inkludert et eksempel av skjulte øyet fra feil tørking teknikk (figur 4E) og elektron lading fra utilstrekkelige frese belegg som vises under Image Vinningen (figur 4F og 4 G).

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av filtrering riggen og SEM av filtere polykarbonat. (A) dette apparatet brukes til å skille små eller enkelt encellete organismer som Cyanobakterie og euglenoids fra deres vekst medium. Anvendelsen av et vakuum til side arm kolbe vil trekke innholdet i trakten gjennom polykarbonat filteret og i bunnen av filtration flasken, forlater organismer på overflaten av filteret. (B) SEM av en 0,8 µm pore filter med ingen prøve som prøven var tapt på grunn av mishandling. Skala bar = 20 µm. (C) SEM en 0,8 µm pore filter med Cyanobakterie finnes. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : SEM mikroskop-bilde av Cyanobakterie. (A, B) Toxifilum mysidocida, en trådformede ferskvannsarter fra Colorado med en synlig skjede av mucilage (M). Skalere barer = 5 µm. (C, D) A ferskvann Golenkina sp. fra Ohio. Individuelle cellene noen ganger skjemaet kolonier holdt sammen av et tynt lag av mucilage (M). Filament-lignende utstikkende deler (hvite piler) forlenge for de enkelte cellene. Skalere barer = 10 µm. (E, F) Ukjent trådformede arter fra en hřy salinitet elvemunning Texas kysten. Enkeltcelle (svart piler) og dele celler (hvit pilspisser) er synlige. Skala bar i panelet E = 2 µm. skala bar i panelet F = 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : SEM mikroskop-bilde av pellicle strimler fra to arter av euglenoids. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) lav forstørrelse bilder av hele cellen. Skala bar = 5 µm. (B) høy forstørrelsen av den bakre enden. Skala bar = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) lav forstørrelse bilder av hele cellen. Skala bar = 10 µm. (D) høy forstørrelsen av den bakre enden. Skala bar = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : SEM analyse av fenotypiske endringer i Drosophila øyet. Uttrykk for giftige protein tau i forhold til normal eksterne utseende bestilte rekke bust og linser på fly øyet (A), og fører til døden av photoreceptor neurons, genererer "grov øyet" fenotypen (B). Uttrykk for genetisk modifikatorer som undertrykker (C) eller øke (D) tau grov øyet gir bevis på gener som kan spille en rolle i tau nevrotoksisitet. Feil teknikk under tørking trinnene kan føre til en kollaps av øyet (E) mens utilstrekkelig belegg av prøven vil forårsake lading, som vises som en hvit (F) eller (G) sort under bildeopptak, som vist ved pilen. Skala bar = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskrev vi en protokoll som SEM for å få detaljert informasjon om eksterne morfologiske kjennetegn av tre typer organismer som andre kan bruke til å undersøke funksjonene i mange typer organismer eller vev. I hvert trinn av protokollen er det steder feil som kan oppstå og diskuteres i detalj nedenfor.

Mens volumene for bindemiddel og vasker gitt her er bestemt, skal generelt bindemiddel og vasker 5-10 x volumet av prøven. Fiksering, vask og dehydrering tidene er basert på vår erfaring, hvis problemer oppstår, f.eks shriveling av prøven, må du kanskje øke tiden på hvert trinn av dehydrating eller tørke. Avhengig av din enkeltcelle prøve må du både en glutaraldehyde fiksering og en post fiksering i osmium tetroxide. Hvis en duell fixation er nødvendig etter trinn 1.1.2 Cyanobakterie prosedyren dekk med en lik mengde 2% OsO4 i samme bufferen og fortsetter fra trinn 1.2.2 enkeltcelle prosedyren. Fra arbeid ikke vises her, har vi funnet at Drosophila kan enten plasseres direkte i etappe, den stabiliserende følgende anesthetization eller kan fryses på ubestemt tid på 20 ° C i et microfuge rør og plassert i bindemiddel senere med ingen forskjell i ferdig bildekvalitet.

Under vask og dehydrering trinnene er det viktig å gå gjennom de gradert etanol langsomt og uten å hoppe over en bemerket konsentrasjon. Hvis utvalgene er dehydrated for fort, det negativt påvirker de underliggende strukturelle komponentene i vevet og prøven vil skrumpe, visne, eller skjule. Et eksempel på vev kollaps er vist i figur 4E. I tillegg vil hindre innføring av gjenstander som klumper og sammenslåing av morfologiske funksjoner, er det kritisk å forlate bare nok etanol å dekke prøven mellom trinn under dehydrering og tørking.

Når du bruker filtrering riggen, holder en dråpe vann på basen filteret på plass ved montering. Også filteret skal plasseres med den blanke siden opp og alle væsker burde være addert forsiktig, være forsiktig å håndtere filteret med forsiktighet for å hindre vaske vekk prøven. Selv om vi har funnet resultatene av tørking bruke HMDS eller TBA for å være av samme kvalitet, anbefaler vi å bruke TBA: mens både HMDS og TBA er brannfarlig, TBA er omtrent en tredjedel av kostnader og mindre giftige enn HMDS.

Under montering når bruker sølv ledende lim (også kalt sølv maling), være forsiktig når du bruker som din prøve kan lett bli dekket (begravet) i maling, skjule og dermed fine detaljer i morfologi. Frese belegg ganger kan variere basert på din prøve, og verdiene gitt her er basert på vår erfaring. Én potensielle negative resultatet av utilstrekkelige frese belegg er et fenomen som kalles lading, som ofte vises som en hvit eller svart linje (noen ganger en flash) i det endelige bildet (se figur 4F og G eksempler). Hvis mengden lading observert er minimal, kan det være mulig å redusere effektene ved å justere ulike mikroskop parametere, for eksempel senke akselererende spenning eller stråle strøm, øke kondensatoren linsen styrke, og/eller bruker en mindre objektive blenderåpning. De fleste søkemotormarkedsførere brukes for biologiske prøver har videregående electron detektorer, men noen søkemotormarkedsførere kan også være utstyrt med backscatter detektorer eller miljømessige videregående electron detektorer, som kan justeres for å redusere eller eliminere effektene av minimal lading. Hvis lading effektene er mer uttalt, er det sannsynlig at det er dårlig jording av prøven eller for lite spraking belegg for å produsere de sekundære elektronene, forårsaker ladet elektronene å bygge opp i prøven og frigis spontant, produsere forstyrrelser i bildet i oppkjøpet. Uttales lading er ofte løst med en tykkere belegg eller bedre jording med sølv maling. Fordi både for mye og for lite frese belegg kan negativt påvirke kvaliteten på bildet, er det best å optimalisere mengden belegg påføres ved å justere variablene tid (10-180 s) og presset (70 til 150 mTorr) av frese coater å oppnå en optim Al belegg. Som belegget ikke kan fjernes en gang brukt til prøven, anbefales en prøvekjøring med en enkelt prøve før belegg alle prøvene.

SEM parametere som akselererende spenningen (i kV), undersøke gjeldende (PC), og arbeidsavstand (WD) må justeres for å få det beste bildet mulig som innstillingene gitt her foreslås starter parametere basert på vår erfaring. Kvaliteten på prøven er avhengig av omsorgen tatt i forberedelse, avhengig kvaliteten på det endelige bildet erfaring og ferdigheter SEM operatør. Derfor anbefaler vi arbeider med en SEM tekniker eller tilbringe tid på å utvikle dine egne SEM ferdigheter. Alle data (inkludert eksempel forberedelse og bildebehandling) vises i dette dokumentet ble generert av studenter i biologi mikroskopi programmet på CMU, med veiledning fra fakultetet og våre mikroskopi tekniker.

Protokollene beskrevet her inkluderer bruk av potensielt skadelige kjemikalier, og de riktige sikkerhetstiltakene bør alltid være observert for å beskytte brukernes, særlig studenter som kan håndtere disse kjemikaliene. Mens protokollene angir sikkerhet bekymringer knyttet til hver kjemisk ved første gangs bruk, brukere bør alltid: (1) bruke kjemiske avtrekksvifte, (2) har tilgang til en akutt øye vask og sikkerhet dusj, (3) bruke riktig personlig verneutstyr inkludert nitrilhansker, laboratoriefrakk og øye beskyttelse og (4) vet hvor du finner skriftlige prosedyrer inkludert håndtering prosedyrer, utpekt bruke områder, søle prosedyrer, dekontaminering prosedyrer, og avfall avhending prosedyrer.

I konklusjonen, illustrerer disse organismene hvordan informasjon om tredimensjonale topografien i de ytre flatene av hver er nyttig for Fylogenetiske gruppering eller modifikator analyse. For Cyanobakterie, bestemmes av SEM kan brukes i kombinasjon med flere data fra * lys, TEM, og molekylære studier å identifisere, karakterisere og navnet Cyanobakterie. For euglenoids, antall, bredde, arrangement (spiralformede eller rett) og ornamenter, hvis pellicle strimler kan brukes med andre morfologiske data, og hvis nødvendig molekylære data å identifisere, karakterisere og navnet euglenoids. Videre kan andre typer encellede alger og protozoans eller mikro-dyr være forberedt og undersøkt i en lignende måte å fastslå eksterne morfologiske funksjoner som flagella, fôring struktur, eksterne ornamenter eller detaljer om vedheng i mikro-dyr. Til slutt, SEM har bred programmer for å undersøke morfologiske detaljer, som av modell systemet Drosophila, å karakterisere genetisk modifikatorer for sykdom patologi. Protokollene beskrevet her utnytte organismer som varierer sterkt med hensyn til kompleksitet, men alle er mottakelig for SEM analyse for å samle inn nyttig morfologiske informasjon som er kritisk for vitenskapelige funn som spenner over mange ulike subdisciplines i biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av en bevilgning MLS og en sommer Scholar Award til MAK fra Office for forskning og høyere grads studier ved Central Michigan University. Cyanobakterie ble levert av den Zimba og plankton lab, del av Center for kyst studier, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids ble levert av Triemer lab, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Biologi problemet 143 skanning elektronmikroskop (SEM) Cyanobakterie euglenoid frukt fly Drosophila kritisk punkt tørking (CPD) hexamethyldisilazane (HMDS) t-butyl alkohol (TBA)
Utarbeidelse av Prokaryotic og Eukaryotic organismer med kjemiske tørking for morfologisk analyse skanning elektronmikroskop (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter