Summary
Análisis de SEM es un método eficaz para ayudar en la identificación de las especies o la discriminación fenotípica. Este protocolo describe los métodos para examinar los detalles morfológicos específicos de tres tipos representativos de organismos y sería ampliamente aplicable a examinar características de muchos organismos y tipos de tejidos.
Abstract
Microscopía electrónica de barrido (SEM) es una técnica ampliamente disponible que se ha aplicado para estudiar a especímenes biológicos que van desde proteínas individuales a las células, tejidos, organelos y organismos incluso todo. Este protocolo se centra en dos métodos de secado químicos, hexamethyldisilazane (HMDS) y el alcohol t-butílico (TBA) y su aplicación a la proyección de imagen de organismos procarióticos y eucarióticos con SEM. En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). El propósito de este protocolo es describir un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de las muestras que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para morfológico evaluación. Culminación exitosa de este protocolo permitirá a otros utilizar SEM para visualizar muestras aplicando estas técnicas a su sistema.
Introduction
Un microscopio electrónico de barrido (MEB) utiliza un haz enfocado de electrones de alta energía para generar una imagen de electrones secundarios que muestra la morfología y la topografía de una muestra de1. SEM puede utilizarse para determinar directamente el tamaño físico de una muestra, la estructura superficial y la forma tridimensional y ofrece una mayor resolución y mayor profundidad de campo en comparación con microscopia ligera. Otra forma de microscopia electrónica (EM), microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza electrones enfocados que pasan a través de la muestra, generando imágenes con los detalles finos de la estructura interna. Mientras que TEM tiene mayor resolución que la luz o SEM y puede utilizarse para resolver estructuras tan pequeñas como átomos individuales, tiene tres inconvenientes principales: preparación de la muestra amplia, un pequeño campo de visión y poca profundidad de campo2,3. Aunque otros visualizar protocolos existen uso de SEM para examinar determinados tejidos, células y organelos4,5,6,7,8,9, 10 , este protocolo es el único que se describen métodos que pueden aplicarse ampliamente a una amplia gama de organismos para la evaluación morfológica.
SEM ha encontrado aplicaciones amplios para examinar materiales inorgánicos incluyendo nanopartículas11,12, polímeros13y numerosas aplicaciones en ciencias geológicas, industrial y material14, 15,16. En biología, SEM ha sido utilizado como un método para examinar muestras biológicas que van desde proteínas individuales a todo organismos17,18. SEM es de valor especial porque detalles morfológicos superficiales pueden utilizarse para informar el descubrimiento científico. Análisis de SEM es un método rápido, barato y simple para obtener información detallada sobre la estructura, tamaño y características de la superficie de una amplia gama de muestras biológicas.
Porque un SEM opera normalmente bajo alto vacío (10-6 Torr mínimo) para apoyar un haz coherente de electrones de alta velocidad, no líquidos (agua, aceites, alcoholes) son permitidos en la cámara de muestras, como líquidos evitar un vacío de formación. Así, todas las muestras examinadas usando SEM deben estar deshidratadas, por lo general mediante una serie gradual de etanol seguida de un proceso de secado para eliminar el etanol. Existen varios métodos de secado de tejidos biológicos para su uso en el SEM, incluyendo el secado, liofilización, uso de un dispositivo de (CPD) secado de punto crítico, o producto químico de secado utilizando el alcohol t-butílico (TBA) o hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. con mucha frecuencia, selección de un método de secado es empírica, ya que cada muestra biológica puede reaccionar diferentemente a cada método de secado. Cualquier muestra dada, todos estos métodos pueden estar apropiados, comparar las ventajas y desventajas de cada uno es útil seleccionar el método apropiado.
Mientras que el aire de secado de una muestra a temperatura ambiente o en un horno de secado (60 ° C) es el método más simple, más muestras biológicas muestran daños de sequía-inducida como arrugamiento y colapsan, dando por resultado la distorsión de la muestra. El proceso de liofilización también quita el agua (o hielo) de una muestra, pero requiere muestras ser flash-congeladas y colocado bajo vacío para quitar el hielo mediante el proceso de sublimación, potencialmente dañar la muestra. Además, el usuario debe tener acceso a un liofilizador. El método más comúnmente utilizado para deshidratar muestras para SEM es punto crítico de secado (CPD). En CPD, se sustituye el etanol en una muestra de líquido dióxido de carbono (CO2) y, bajo condiciones de presión conocidas como el punto crítico (31,1 º C y psi 1.073), CO2 se vaporiza sin crear tensión superficial, de tal modo y temperatura específica efectivamente manteniendo las características morfológicas y estructurales de la muestra. Mientras que el CPD es generalmente el método estándar, tiene varios inconvenientes. En primer lugar, el proceso requiere el acceso a un secador de punto crítico que no sólo es caro, pero también requiere el uso de dióxido de carbono líquido. En segundo lugar, el tamaño de la muestra que puede ser secado se limita al tamaño de la cámara del secador de punto crítico. En tercer lugar, el intercambio de líquidos en CPD puede causar turbulencia que puede dañar la muestra.
Secado químico ofrece muchas ventajas sobre CPD y sirve como una alternativa conveniente que es ser ampliamente utilizada en la preparación de muestras SEM. El uso de químicos dehydrants TBA como HMDS ofrece una alternativa rápida, barata y sencilla que otros métodos, mientras que mantiene la integridad estructural de la muestra. Recientemente demostró que no hubo diferencias en la integridad de los tejidos o la calidad de la imagen final cuando utilizando CPD o TBA como el método de secado en el adulto Drosophila tejido retiniano23. A diferencia de CPD, TBA y HMDS no requieren de un secado de la instrumento o líquido CO2 y no hay ninguna limitación en el tamaño de la muestra a secar. Además de los productos químicos, sólo una campana química estándar y equipos de protección personal (guantes, bata y gafas de seguridad) deben completar el proceso de secado. Mientras tanto TBA como HMDS son inflamables, TBA es menos tóxicos y menos costosos (aproximadamente 1/3 el costo de HMDS) de HMDS.
En este artículo describimos cómo fijar, lavar, deshidratar, secar, montar, sputter coat y imagen tres tipos de organismos: cianobacterias (Toxifilum mysidocida, Golenkina SP. y un desconocido SP.), dos euglenoides del género Monomorphina (M. Enigmonia y M. pseudopyrum) y la mosca de la fruta (Drosophila melanogaster). Estos organismos representan una amplia gama en tamaño (0,5 μm a 4 mm) y la diversidad celular (unicelular a multicelular), sin embargo, todos son fácilmente susceptibles de análisis SEM con sólo pequeñas variaciones es necesarias para la preparación de las muestras. Este protocolo describe los métodos para el uso de deshidratación química y el análisis de SEM para examinar detalles morfológicos de tres tipos de organismos y sería ampliamente aplicable al examen de muchos organismos y tipos de tejidos.
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Protocol
1. preparación y fijación
- Preparación de cianobacterias.
- Crecen cultivos axénicos en F/2 medios24,25 a una temperatura de 28 ° C en un 14:10 h luz ciclo oscuro. Transferencia de cultura suficiente a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que después de permitir que 15 min resolver, el pellet bacteriano es aproximadamente 0,05 mL en tamaño. Quitar los medios de comunicación y reemplazar con 1,5 mL de fijador (glutaraldehído 1.25%, tampón de fosfato 0,1 M pH 7.0), suavemente invertir varias veces e incubar durante una noche a 4 ° C.
- La transferencia de las células fijas con una pipeta de vidrio en una plataforma de filtración de 10 mL (figura 1) que contiene un filtro de 25 mm de policarbonato 0,8 o 0,2 μm de poro, dependiendo del tamaño de las células. El brazo lateral del sello y embudo con tapones de goma para contener la cultura en el embudo. Retirar el fijador suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
Nota: Si la densidad celular en el filtro de policarbonato no es óptima, ajuste la cantidad de a partir de cultivo utilizado.
- Preparar las algas unicelulares (euglenoides).
- Crecen cultivos axénicos en AF-6 medios de comunicación26 con 150 mL L-1 de medio agua del suelo disponible a los medios de comunicación, a una temperatura de 22 ° C en un 14:10 h luz ciclo oscuro. Transferir 2 mL de baja densidad (OD600 < 0.5) cultura con una pipeta de vidrio en una plataforma de filtración de 10 mL (figura 1) que contiene un filtro de 25 mm de policarbonato con poros μm 8. El brazo lateral del sello y embudo con tapones de goma para contener la cultura en el embudo.
Nota: Si la densidad celular en el filtro de policarbonato no es óptima, ajuste la cantidad de a partir de cultivo utilizado. - Añadir tres gotas 4% de tetróxido de osmio (OsO4) directamente a la cultura y dejar para incubar por 30 minutos retirar el fijador suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
Nota: OsO4 es una toxina aguda (dérmica, oral e inhalación rutas), corrosivo a la piel, daño a los ojos y un sensibilizador respiratorio. OsO4 debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal como guantes, bata y protección ocular.
- Crecen cultivos axénicos en AF-6 medios de comunicación26 con 150 mL L-1 de medio agua del suelo disponible a los medios de comunicación, a una temperatura de 22 ° C en un 14:10 h luz ciclo oscuro. Transferir 2 mL de baja densidad (OD600 < 0.5) cultura con una pipeta de vidrio en una plataforma de filtración de 10 mL (figura 1) que contiene un filtro de 25 mm de policarbonato con poros μm 8. El brazo lateral del sello y embudo con tapones de goma para contener la cultura en el embudo.
- Preparación de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta)23.
- Anestesiar a moscas adultas usando dióxido de carbono 100%. Lugar anestesiado adultos (10 a 30 moscas) en un tubo de centrífuga tapón plástico pequeño frasco o 1,5 mL.
- Sumerja moscas anestesiados en 1 mL de fijador (glutaraldehído 1.25%, tampón de fosfato 0,1 M pH 7.2) para 2 h (o noche) a 4 ° C. Si las moscas flotan hacia la superficie de este fijador, añadir unas gotas de éter de tert-Octylpheny 2.5% polietilenglicol para debilitar la tensión superficial del fijador que permite la inmersión total del tejido. Eliminar el fijador mediante una pipeta de vidrio.
2. lavado y deshidratación
- Lavar y deshidratar cianobacterias.
- Lavar la muestra fija tres veces con 5 mL de tampón de fosfato 0,1 M pH 7.0 a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el lavado. Quitar cada colada por vacío suave en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
- Deshidratar la muestra manteniendo la inmersión continua mediante una serie gradual de etanol, durante 10 minutos en un volumen de 5 mL en el embudo. Las concentraciones de etanol graduado son: 25%, 50%, 75%, 95% y 2 cambios de etanol 100%. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el etanol en el embudo, evitando así pérdidas de ambos a través de evaporación y el flujo de pasivo a través del filtro.
- Retire el etanol por suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones. Transferir la muestra de filtro a un desechable de aluminio peso plato que contiene suficiente etanol 100% para cubrir la muestra antes del secado.
- Lavar y deshidratar algas unicelulares (euglenoides).
- Lavar la muestra fija tres veces con 5 mL de agua desionizada a temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el lavado en el embudo. Quitar cada colada por vacío suave en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones.
- Deshidratar la muestra manteniendo la inmersión continua mediante una serie gradual de etanol durante 10 minutos en un volumen de 5 mL en el embudo. Las concentraciones de etanol graduado son: 25%, 50%, 75%, 95% y 2 cambios de etanol 100%. Mantener el matraz y embudo de cierre hermético para contener el etanol en el embudo, evitando así pérdidas de ambos a través de evaporación y el flujo de pasivo a través del filtro.
- Eliminar el etanol por suave vacío en el matraz de filtración, después de quitar ambos tapones. Transferir la muestra de filtro a un desechable de aluminio peso plato que contiene suficiente etanol 100% para cubrir la muestra antes del secado.
- Limpiar y deshidratar la Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
- Lavar la muestra fija tres veces con 1 mL de tampón de fosfato 0,1 M pH 7.2 a temperatura ambiente durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Quitar cada colada con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no eliminar las moscas.
- Deshidratar la muestra mediante una serie gradual de etanol, durante 10 minutos en un volumen de 1 mL en un tubo de microcentrífuga. Las concentraciones de etanol son: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Eliminar el etanol con una pipeta de vidrio, teniendo cuidado de no eliminar las moscas.
- Retener la muestra en el tubo de microcentrífuga de 1,5 mL con suficiente etanol 100% para cubrir la muestra antes del secado.
3. secado
- Realizar secado químico usando t-butil alcohol (TBA)27.
- Reemplazar la solución de etanol 100% con una solución de 1:1 de TBA y el 100% de etanol para reemplazar la solución de 1:1 con 100% de TBA durante 20 min repetir dos veces de 20 minutos. Mantener la solución a 37 ° C para que TBA no se congela.
Nota: 100% TBA tiene un punto de congelación de 25,5 ° C; la solución 1:1 no se congele a temperatura ambiente. TBA es inflamable, causa irritación grave en los ojos, es dañino si se inhala y puede causar irritación respiratoria, somnolencia o mareos. TBA debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal como guantes, bata y protección ocular. - Transferir la muestra en TBA, en caso de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, en un plato de pesaje de aluminio desechable. Una vez en el plato pesada de aluminio, quitar TBA y reemplace con suficiente TBA 100% fresca para cubrir la muestra. Congelar la TBA a 4 ° C durante 10 minutos.
- Transferir a un desecador de vacío (campana) con paquetes de gel congelado para mantener congelado de TBA. Evacuar y mantener el vacío con una bomba rotatoria de la muestra seca por vacío de la sublimación de la TBA congeladora durante al menos 3 horas o toda la noche.
- Reemplazar la solución de etanol 100% con una solución de 1:1 de TBA y el 100% de etanol para reemplazar la solución de 1:1 con 100% de TBA durante 20 min repetir dos veces de 20 minutos. Mantener la solución a 37 ° C para que TBA no se congela.
- Realizar secado químico utilizando hexamethyldisilazane (HMDS)20.
- Reemplazar la solución de etanol 100% con una solución de 1:2 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min reemplazar la solución de 1:2 con una solución de 2:1 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min reemplazar el 2:1 solución con 100% HMDS durante 20 min repetir una vez.
Nota: HMDS es inflamable y una toxina aguda (vía dérmica). HMDS debe manejarse en una campana de vapores químicos con equipos de protección personal como guantes, bata y protección ocular. - Transferir la muestra en HMDS, si en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, en un plato de pesaje de aluminio desechable. Una vez en el aluminio pesa el plato, reemplazar el 100% HMDS con suficiente fresco 100% HMDS para cubrir la muestra.
- Transferir la muestra en un desecador de vacío no de plástico o vidrio con desecante fresco (5-6 cm de profundidad) y coloque en una campana de humos químicos. Como alternativa, colocar la muestra directamente en una campana de vapores químicos para secar con una tapa suelta, como una caja, para evitar que los residuos caigan en la muestra. Permita que la muestra a secar durante 12 a 24 h.
- Reemplazar la solución de etanol 100% con una solución de 1:2 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min reemplazar la solución de 1:2 con una solución de 2:1 de HMDS y etanol al 100% durante 20 min reemplazar el 2:1 solución con 100% HMDS durante 20 min repetir una vez.
4. montaje
- Montaje de cianobacterias y euglenoides.
- La parte inferior de cualquiera de los dos un aluminio de 12 o 25 mm montaje trozo para indicar lo que se ha puesto en la parte superior de la etiqueta. Corte el filtro de policarbonato con celdas secas en cuartos con una limpia hoja de afeitar o bisturí si usando un trozo de 12 mm, o colocar el filtro entero si se utiliza un trozo de 25 mm.
- Coloque cada filtro adhesivo o una ficha adhesivo de carbono fijado a la parte superior de un trozo.
- Montaje de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
- La parte inferior del trozo de montaje de aluminio para indicar lo que se ha puesto en la parte superior de la etiqueta.
Colocar las moscas secas en la posición deseada en la ficha adhesivo adhesivo o carbono fijado a la parte superior de un trozo con un microscopio de disección con pinzas de precisión. - Aplique plata adhesivo conductivo, es decir, plata pintura, alrededor de los bordes de los talones. Conecte la pintura plata a las moscas con un palillo de dientes para asegurar la conductividad. No permita que toque el área deseada de la imagen de la pintura.
- Coloque los talones en una caja de soporte de talón y colocar el trozo abierto titular en un desecador. Deje que la pintura plata secar al menos 3 horas o toda la noche para obtener mejores resultados.
- La parte inferior del trozo de montaje de aluminio para indicar lo que se ha puesto en la parte superior de la etiqueta.
5. Farfullar revestimiento
- Preparar el aparato de recubrimiento sputter realizando cuatro o cinco brotes de gas argón. Si la humedad es alta (es decir, el aire se siente húmedo, generalmente cerca de 50% de humedad relativa), realizar descargas de seis a siete. Farfulle la capa los talones siguiendo las instrucciones del fabricante.
- Muestras de la capa basadas en espécimen utilizan:
- Para los filtros con cianobacterias, ajuste el temporizador a farfulle la capa para el recta s 180 en.
- Para los filtros con las algas eucariotas, es decir, euglenoides, ajustar el temporizador para sputter coat para 120 s s recta en, y luego 20 por tres lados en un ángulo de 45 °.
- Para muestras grandes, es decir, cabezas de mosca, ajustar el temporizador para sputter coat para 60 s s recta en, y luego 30 en cada lado en un ángulo de 45 °.
Nota: Después de la capa es completa, talones deben ser color gris claro en color.
6. proyección de imagen de
- Muestras de la imagen usando un microscopio electrónico de barrido incluye un detector de electrones secundarios (SE).
- Para cianobacterias, aplique los siguientes valores: tensión de acelerador de 3-5 kV (AC), sonda de corriente (PC) de 20-30 y 5 mm la distancia de trabajo (WD). Euglenoides, utilice 3 kV en corriente alterna, 30 PC y 5 mm WD. Para moscas, use 5 kV en corriente alterna, 30 PC y 5 a 10 mm WD.
- Ajustar magnificación dependiendo del tamaño del detalle o del objeto a visualizar. Ajustar el enfoque, stigmators y aperturas hasta que se produce una imagen clara. Capturar la imagen con alta resolución ajustes según las instrucciones del fabricante de la SEM.
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Representative Results
Cianobacterias son un grupo de procariota de organismos que son críticos para el carbono, el oxígeno y el nitrógeno ciclos28,29. De las aproximadamente 6000 especies de cianobacterias30, más tienen una envoltura mucilaginosa que recorren y conectan las células entre sí y a otras estructuras31, que junto con la forma, puede ser resuelto microscópico32. Tamaño de la célula, la forma y pigmentos presentes distinguen especies individuales y en hábitats acuáticos, pueden visualizarse como cianobacterias "floraciones"28. La moderna clasificación de cianobacterias combina todas las características morfológicas posibles usando microscopia ligera, TEM, SEM, así como datos moleculares33. Similar a la vaina del mucílago de las cianobacterias, tiras de película de euglenoid especie ayuda en la determinación de la filogenia. Euglenoides son flagelados acuáticos que poseen una gran diversidad morfológica y de comportamiento y análisis SEM ha demostrado ser útil en la clasificación de especies distintas. Específicamente, euglenoides poseen estructuras novela debajo de la membrana plasmática que se componen de tiras paralelas de proteínico y microtúbulos, llamados el pellicle34,35,36. Número, disposición y tamaño de las tiras de película son críticas comparación morfológica y junto con los datos filogenéticos moleculares, se utilizan para construir la filogenia de Euglenozoa37.
El primer paso en la preparación de cianobacterias y euglenoides requiere filtrado de los organismos de su medio de crecimiento y se logra armar un equipo de filtración (figura 1A). La aspiración se utiliza para tirar el medio a través de un filtro de policarbonato, dejando a los organismos en la superficie del filtro. Debe seleccionarse el tamaño del poro del filtro de policarbonato que los organismos intactos no pasará a través de (Comparar figura 1B y 1C). La figura 2 muestra resultados representativos de tres diferentes géneros de cianobacterias. Dos son agua dulce y una es Marina. Detalles de la célula, incluyendo la forma y la textura de la superficie son visibles, así como una envoltura del mucílago o proyecciones de las células. La figura 3 ilustra cómo SEM se utiliza para visualizar las tiras de película de dos especies diferentes euglenoid. La disposición helicoidal de la película las tiras combinar en la parte posterior para formar una cola ayuda en la determinación de la filogenia al comparar Monomorphina Enigmonia (Figura 3A y 3B) con Monomorphina pseudopyrum ( Figura 3 y 3D).
Además de las características morfológicas que identifican especies, la morfología externa de organismos modelo como Drosophila melanogaster puede utilizarse para identificar los modificadores genéticos usando las neuronas fotorreceptores que forman el compuesto Drosophila ojo38. Puesto que el ojo es un tejido no esencial en moscas, es posible expresar proteínas tóxicas en las células retinianas y SEM para examinar los cambios morfológicos que la modificación genética tiene en el ojo. Ojos de mosca normales se caracterizan por una matriz ordenada de las cerdas y las lentes (Figura 4A), sin embargo la expresión de proteínas asociadas con la enfermedad de Alzheimer crea lo que se denomina el fenotipo del 'ojo bruto' (Figura 4B). Genes que suprimen (figura 4) o aumentar (figura 4) el fenotipo de ojos áspero pueden jugar un papel fisiológico en la progresión de la enfermedad y tienen potencial para drogas dirigidos a39. También se muestra en la figura 4 son ejemplos de peligros potenciales para evitar incluyendo un ejemplo de la estructura colapsada del ojo de la inadecuada técnica de secado (figura 4E) y el electrón carga de recubrimiento sputter insuficiente que aparece durante adquisición de la imagen (figura 4F y 4 G).
Figura 1 : Representación esquemática de la plataforma de filtración y SEM de un filtro de policarbonato de. (A) este aparato se utiliza para separar pequeños o solo celled organismos tales como cianobacterias y euglenoides lejos de su medio de crecimiento. Aplicación de un vacío en el brazo lateral del matraz tire el contenido del embudo a través del filtro de policarbonato y en la base del matraz de filtración, dejando a los organismos en la superficie del filtro. (B) SEM de un poro de 0.8 μm filtro con ninguna muestra que la muestra se perdió debido a mal manejo. Barra de escala = 20 μm. (C) SEM de un filtro de poro de 0.8 μm con cianobacterias presentes. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Micrografía de SEM de la cianobacterias. (A, B) Mysidocida de Toxifilum, una especie de agua dulce filamentosa de Colorado con una envoltura visible de mucílago (M). Barras de la escala = 5 μm. (C, D) A agua dulce Golenkina SP. de Ohio. Individual de las células a veces colonias de forma por una fina capa de mucílago (M). Filamento-como salientes (flechas blancas) se extienden de las células individuales. Barras de la escala = 10 μm. (E, F) filamentosos especies desconocidas de un estuario de alta salinidad en aguas costeras de Texas. Célula individual (flechas negras) y división de las células (flecha blanca) son accesibles. Barra de escala en el panel E = 2 μm. escala bar en panel F = 1 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Micrografía de SEM de la película las tiras de dos especies de euglenoides. (A, B) Monomorphina Enigmonia. (A) imágenes de ampliación baja de toda la célula. Barra de escala = 5 μm. (B) aumento alta del extremo posterior. Barra de escala = 3 μm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) imágenes de ampliación baja de toda la célula. Barra de escala = 10 μm. (D) aumento alta del extremo posterior. Barra de escala = 5 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Análisis de SEM de la modificación fenotípica de los ojos de Drosophila . En comparación con la apariencia externa normal de la matriz ordenada de las cerdas y las lentes del ojo mosca (A), expresión de la proteína tóxica tau causa la muerte de las neuronas fotorreceptoras, generar el fenotipo de 'ojo bruto' (B). Expresión de modificadores genéticos que suprimir (C) o mejorar (D) el ojo áspero tau proporciona evidencia de genes que pueden desempeñar un papel en la neurotoxicidad de la tau. Técnica inadecuada durante el secado pasos puede llevar a un colapso de la estructura del ojo (E) mientras que la capa insuficiente de la muestra hará que la carga, que aparece como una banda negra (G) o blanco (F) durante la adquisición de la imagen, como indica la flecha. Barra de escala = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí hemos descrito un protocolo de uso de SEM para obtener información detallada sobre las características morfológicas externas de los tres tipos de organismos que otros pueden aplicar para examinar características de muchos tipos de organismos o tejidos. Dentro de cada paso del Protocolo, hay posibles puntos de error que pueden surgir y se discuten en detalle más adelante.
Mientras que los volúmenes de fijador y lavado dado aquí son específicos, en general el fijador y lavado debe ser 5-10 veces el volumen de la muestra. Todos los tiempos de fijación, lavado y deshidratación se basan en nuestra experiencia, si surgen problemas, por ejemplo, arrugamiento de la muestra, puede que necesite aumentar los tiempos en cada paso de deshidratación o secado. Dependiendo de su muestra de célula única, puede que necesite hacer una fijación en glutaraldehido y una fijación posterior en tetróxido de osmio. Si la fijación de un duelo es necesario después de paso 1.1.2 del procedimiento cianobacterias cubierta con una cantidad igual 2% OsO4 en el mismo buffer y proceden de paso 1.2.2 del procedimiento unicelular. De trabajo que no se muestra aquí, hemos encontrado que Drosophila puede ser colocado directamente en fijador siguiente anestesia o puede ser indefinidamente congelado a-20 ° C en un tubo de microcentrífuga y colocado en fijador en un momento posterior con ninguna diferencia en el acabado calidad de imagen.
Durante los pasos de lavado y deshidratación, es imprescindible para moverse a través de la serie gradual de etanol lentamente y sin saltarse una concentración conocida. Si las muestras se deshidratan muy rápido, afecta negativamente los componentes estructurales subyacentes en el tejido y muestras se marchitará, se marchita o colapso. Un ejemplo de colapso de tejido se muestra en la figura 4E. Además, para evitar la introducción de artefactos tales como agrupar y aplanamiento de las características morfológicas, es fundamental para dejar sólo suficiente etanol para cubrir la muestra entre pasos durante la deshidratación y secado.
Cuando se utiliza el equipo de filtración, una gota de agua en la base sostenga el filtro en su lugar durante el montaje. Además, el filtro debe colocarse con el lado brillante hacia arriba y todos los líquidos se deben agregar suavemente, teniendo cuidado de manejar el filtro con cuidado para evitar lavando la muestra. Aunque hemos encontrado los resultados de secado usando HMDS o TBA de igual calidad, recomendamos el uso de TBA: HMDS y TBA son inflamables, TBA es un tercio del costo y menos tóxicos de HMDS.
Durante el montaje cuando usando plata adhesivo conductivo (también llamada pintura de plata), tenga cuidado cuando aplique la muestra puede ser cubierta fácilmente (enterrada) en la pintura, tal modo oscurecer detalles finos en morfología. Tiempos de recubrimiento Sputter pueden variar basado en su muestra, y los valores dados aquí se basan en nuestra experiencia. Un resultado negativo potencial de recubrimiento sputter insuficiente es un fenómeno llamado carga, que a menudo aparece como una línea blanca o negra (a veces un flash) en la imagen final (ver figura 4F y G por ejemplo). Si la cantidad de carga observada es mínima, es posible mitigar los efectos ajustando diversos parámetros de microscopio, como bajar el voltaje de aceleración o viga actual, aumentando la fuerza de la lente del condensador, o usando un más pequeño abertura del objetivo. SEMs más utilizados para las muestras biológicas tienen detectores de electrones secundarios, sin embargo algunos SEMs también pueden estar equipados con detectores de rayos o detectores electrónica secundaria ambiental, que puede ajustarse para disminuir o eliminar los efectos de un mínimo de carga. Si los efectos de carga son más pronunciados, es probable que exista una pobre puesta a tierra de la muestra o poco Farfullar revestimiento para producir los electrones secundarios, haciendo que los electrones de carga acumular en el espécimen y saldrá espontáneamente, produciendo distorsión de la imagen durante la adquisición. Carga pronunciada más a menudo se resuelve con una capa más gruesa o mejor conexión a tierra con pintura de plata. Porque tanto demasiado y demasiado poco recubrimiento sputter puede afectar negativamente la calidad de la imagen, es mejor optimizar la cantidad de recubrimiento aplicado mediante el ajuste de las variables de tiempo (10 a 180 s) y presión (70 a 150 mTorr) de un recubridor sputter para lograr un optim al recubrimiento. Como la capa no puede quitarse una vez aplicado a la muestra, se recomienda una prueba de funcionamiento con una sola muestra antes de todas las muestras de la capa.
Parámetros de SEM como aceleración de tensión (kV), sonda de corriente (PC), y distancia de trabajo (WD) debe ajustarse para obtener la mejor imagen posible, como la configuración que aquí se sugiere a partir de parámetros basados en nuestra experiencia. Mientras que la calidad de la muestra depende del cuidado en la preparación, la calidad de la imagen final se basa en la experiencia y habilidad del operador del SEM. Por lo tanto, recomendamos trabajar con un técnico de la SEM o pasar tiempo desarrollando sus propias habilidades de SEM. Todos los datos (incluyendo la preparación de la muestra y proyección de imagen) se muestra en este trabajo fueron generados por estudiantes de pregrado en el programa de Biología microscopia en CMU, con orientación de profesores y nuestro técnico microscopia.
Los protocolos descritos aquí incluyen el uso de sustancias químicas potencialmente peligrosas, y siempre se deben observar las medidas de seguridad apropiadas para proteger a los usuarios, particularmente los estudiantes que pueden ser estos productos químicos. Mientras que los protocolos especifican problemas de seguridad asociados con cada producto químico al primer uso, los usuarios deben siempre: (1) utilizar una campana de humos químicos, (2) tener acceso a una ducha de seguridad y lavado de emergencia ojo, (3) utilizar equipo de protección personal incluyendo guantes de nitrilo, bata de laboratorio y ojo, protección y (4) sabe dónde encontrar los procedimientos de seguridad escritos incluye tramitación señalado áreas, procedimientos, procedimientos de descontaminación, de derrames y procedimientos de disposición de residuos.
En conclusión, estos organismos ilustran cómo información sobre la topografía tridimensional de la superficie externa de cada uno es útil para el análisis filogenético de la agrupación o el modificador. Cianobacterias, características determinadas el SEM se pueden utilizar en combinación con datos adicionales de microscopía de luz, TEM, y estudios moleculares para identificar, caracterizar y nombre de la cianobacteria. Para euglenoides, número, ancho, arreglo (recto o helicoidal) y ornamentación, si está presente, de la película las tiras pueden utilizarse con otros datos morfológicos, y si es necesarios datos moleculares, identificar, caracterizan y nombre euglenoides. Además, otros tipos de algas unicelulares y protozoos o micro invertebrados pueden ser elaborados y examinados de una manera similar para determinar las características morfológicas externas tales como flagelos, estructura, ornamentación externa o detalles de la alimentación apéndices en el caso de micro invertebrados. Finalmente, SEM tiene amplias aplicaciones para examinar los detalles morfológicos, tales como el ojo del sistema modelo Drosophila, para caracterizar los modificadores genéticos de la patología de la enfermedad. Los protocolos descritos aquí utilizan organismos que varían grandemente con respecto a la complejidad, pero todos son susceptibles de análisis de SEM para reunir información morfológica que es fundamental para el descubrimiento científico que abarca muchos diversos subdisciplines de Biología.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una subvención a la MLS y un verano Scholar Award a MAK de la oficina de investigación y estudios de posgrado en la Universidad de Michigan Central. Cianobacterias fueron suministradas por la Zimba y laboratorio de plancton, parte del centro para estudios costeros, Texas A & M University en Corpus Christi. Euglenoides fueron suministrados por el laboratorio Triemer, Universidad Estatal de Michigan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given - see link |
| AF6 media | Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given - see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given - see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE |
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