Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Beredning av prokaryota och eukaryota organismer använder kemisk torkning för Morfologisk analys i svepelektronmikroskopi (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM analys är en effektiv metod till stöd i artbestämning eller fenotypiska diskriminering. Detta protokoll beskriver metoder för att undersöka specifika morfologiska Detaljer av tre representativa typer av organismer och skulle vara allmänt tillämpliga på att undersöka funktioner i många organismer och vävnadstyper.

Abstract

Svepelektronmikroskopi (SEM) är en allmänt tillgänglig teknik som har använts för att studera biologiska prover alltifrån enskilda proteiner till celler, vävnader, organeller och även hela organismer. Detta protokoll fokuserar på två kemiska torkningsmetoder, hexamethyldisilazane (HMDS) och t-butyl alkohol (TBA) och deras tillämpning på imaging både prokaryota och eukaryota organismer med SEM. I den här artikeln beskrivs hur man fixa, tvätta, torka, torka, montera, sputter kappa och bild tre typer av organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. och en okänd sp.), två euglenoids från släktet Monomorphina (M. aenigmatica och M. pseudopyrum), och bananflugan (Drosophila melanogaster). Syftet med detta protokoll är att beskriva en snabb, billig och enkel metod för att få detaljerad information om struktur, storlek och ytegenskaper av exemplar som i stort sett kan tillämpas på ett stort antal organismer för morfologisk bedömning. Framgångsrika slutförandet av detta protokoll kommer att tillåta andra att använda SEM för att visualisera prover genom att tillämpa dessa tekniker på deras system.

Introduction

Ett svepelektronmikroskop (SEM) använder en fokuserade strålen av high-energy elektroner för att generera en bild från sekundära elektroner som visar morfologi och topografin av en prov1. SEM kan användas för att direkt avgöra den fysiska storleken på ett prov, ytstrukturen, och tredimensionell form, och erbjuder högre upplösning och större skärpedjup jämfört med ljusmikroskop. En annan form av elektronmikroskopi (EM), transmissionselektronmikroskopi (TEM) använder fokuserad elektroner som passerar genom provet, generera bilder med fina detaljer av inre struktur. Medan TEM har högre upplösning än ljus eller SEM och kan användas för att lösa strukturer så liten som enda atomer, den har tre stora nackdelar: omfattande provberedning, ett litet synfält och ett grunt djup av fält2,3. Även om andra visualiseras protokoll finns använda SEM för att undersöka specifika celler, organeller eller vävnader4,5,6,7,8,9, 10 , detta protokoll är unikt genom att vi beskriver metoder som kan tillämpas i huvudsak på ett stort antal organismer för morfologisk bedömning.

SEM har funnit bred applikationer för prövningen av oorganiska material inklusive nanopartiklar11,12, polymerer13och talrika applikationer i geologiska, industriella och material sciences14, 15,16. I biologi, har SEM länge använts som en metod för att undersöka biologiska prover alltifrån enskilda proteiner till hela organismer17,18. SEM är särskilt värdefulla eftersom morfologiska yta detaljer kan användas för att informera vetenskapliga upptäckter. SEM analys är en snabb, billig och enkel metod att få detaljerad information om struktur, storlek och ytegenskaper av ett brett spektrum av biologiska prover.

Eftersom en SEM fungerar normalt under hög vakuum (10-6 Torr minsta) att stödja en sammanhängande stråle av snabba elektroner, tillåts inga vätskor (vatten, oljor, alkoholer) i provkammaren, som vätskor att förhindra att vakuum bildas. Alltså, alla prover granskas med hjälp av SEM måste vara uttorkad, vanligtvis med hjälp av en graderad etanol serie därefter en torkningsprocess för att avlägsna etanolen. Det finns flera metoder för torkning av biologiska vävnader för användning i SEM, inklusive lufttorkning, frystorka den, användning av en kritisk punkt torkning (CPD) enhet eller kemisk torkning med hjälp av t-butyl alkohol (TBA) eller hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. oftast, val av en torkning metod är empiriska eftersom varje biologiska prov kan reagera annorlunda på varje torkning metod. För varje givet prov, kan alla dessa metoder vara lämpligt, så att jämföra fördelar och nackdelar av varje är användbar i att välja lämplig metod.

Lufttorkning prov i rumstemperatur eller i torkugn (60 ° C) är den enklaste metoden, de flesta biologiska prover visar torkning-inducerad skada såsom shriveling och kollaps, vilket leder till snedvridning av preparatet. Processen att frystorka den också tar bort vatten (eller is) från ett prov, men kräver prover vara flash-fryst och placeras under vakuum för att ta bort is via processen för sublimering, potentiellt skadliga provet. Dessutom måste användaren ha tillgång till en lyophilizer. Den vanligaste metoden för uttorkande prover för SEM är kritisk punkt torkning (CPD). CPD, ska etanolen i ett prov ersättas med flytande koldioxid (CO2) och, under särskilda temperaturen och trycket villkor kallas den kritiska punkt (31,1 ° C och 1 073 psi), CO2 förångar utan att skapa ytspänning, därmed att effektivt upprätthålla de morfologiska och strukturella funktionerna av provet. Fortbildning är generellt standardmetoden, har men flera nackdelar. Första kräver processen åtkomst till en kritisk punkt torktumlare, vilket är inte bara dyrt, men kräver också användningen av flytande koldioxid. För det andra är storleken på provet som kan torkas begränsad till kammaren storleken på den kritiska punkten torktumlare. För det tredje, utbyte av vätskor under CPD kan orsaka turbulens som kan skada provet.

Kemisk torkning erbjuder många fördelar jämfört med CPD och fungerar som ett lämpligt alternativ som blir allmänt används i SEM provberedning. Användning av kemiska dehydrants såsom TBA och HMDS erbjuder ett snabbt, Billigt och enkelt alternativ till andra metoder, samtidigt bibehålla den strukturella integriteten av provet. Vi visade nyligen att det var ingen skillnad i vävnaden eller kvaliteten på den slutliga bilden som fångas när du använder CPD eller TBA som metoden torkning i vuxen Drosophila näthinnevävnad23. Till skillnad från CPD, TBA och HMDS kräver inte ett snabbtorkande instrument eller flytande CO2 och det finns ingen begränsning på storleken av provet torkas. Förutom att få kemikalier, krävs endast en standard kemiska spiskåpa och lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, laboratorierock och skyddsglasögon) för att slutföra torkningen. Medan både TBA och HMDS är brandfarliga, TBA är mindre giftiga och billigare (ca 1/3 kostnaden för HMDS) än HMDS.

I den här artikeln beskrivs hur man fixa, tvätta, torka, torka, montera, sputter kappa och bild tre typer av organismer: cyanobakterier (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. och en okänd sp.), två euglenoids från släktet Monomorphina (M. aenigmatica och M. pseudopyrum), och bananflugan (Drosophila melanogaster). Dessa organismer utgör ett brett utbud i storlek (0,5 µm till 4 mm) och cellulära mångfald (encelliga till flercelliga), men alla är enkelt mottagliga för SEM analys med endast små variationer behövs för prov förberedelse. Detta protokoll beskriver metoder för att använda kemiska uttorkning och SEM analys för att undersöka morfologiska Detaljer för tre typer av organismer och skulle vara allmänt tillämpliga på att undersöka många organismer och vävnadstyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning och fixering

  1. Förbereda cyanobakterier.
    1. Växa unialgal kulturer i f/2 media24,25 vid en temperatur på 28 ° C på en 14:10 h ljus mörka cykel. Överföra tillräckliga kultur till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör så att efter att 15 min sedimentera, bakteriell pelleten är cirka 0,05 mL i storlek. Ta bort materialet och ersätta med 1,5 mL fixativ (1,25% glutaraldehyd, 0.1 M fosfatbuffert pH 7,0) försiktigt vänd flera gånger och inkubera över natten vid 4 ° C.
    2. Överföra de fasta celler med ett glas i en 10 mL filtrering rigg (figur 1) med pipett som innehåller en polykarbonat 25 mm filter med 0.8 eller 0,2 µm porer, beroende på storleken på cellerna. Försegla sidoarm och tratt med gummipropp att innehålla kulturen i tratten. Ta bort fixeringsvätskan av skonsamt vakuum på filtrerkolv, efter att ta bort båda proppar.
      Obs: Om cell densiteten på polykarbonat filtret inte är optimal, justera mängden start kultur används.
  2. Förbereda encelliga alger (euglenoids).
    1. Växa unialgal kulturer i AF-6 media26 med 150 mL L-1 kommersiellt tillgängliga jord-vatten medium tillsätts media, vid en temperatur av 22 ° C på en 14:10 h ljus mörka cykel. 2 ml av låg densitet (OD600 < 0.5) kultur med ett glas i en 10 mL filtrering rigg (figur 1) med pipett som innehåller ett polykarbonat 25 mm filter med 8 µm porer. Försegla sidoarm och tratt med gummipropp att innehålla kulturen i tratten.
      Obs: Om cell densiteten på polykarbonat filtret inte är optimal, justera mängden start kultur används.
    2. Tillsätt tre droppar 4% osmium vanligtvis (OsO4) direkt till kulturen och låt Inkubera för 30 min. ta bort fixeringsvätskan av skonsamt vakuum på filtrerkolv, efter bort båda proppar.
      Obs: OsO4 är en akut toxin (dermal, oral, och inandning rutter), frätande för huden, skadliga för ögonen, och en respiratoriska sensibiliserare. OsO4 ska hanteras i kemiska dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning inklusive handskar, laboratorierock och skyddsglasögon.
  3. Förbereda Drosophila melanogaster (bananflugan)23.
    1. Söva vuxna flugor med 100% koldioxid. Plats bedövas vuxna (ungefär 10 till 30 flugor) i en liten plast skruvlock injektionsflaska eller 1,5 mL centrifugrör.
    2. Fördjupa sövda flugor i 1 mL fixativ (1,25% glutaraldehyd, 0.1 M fosfatbuffert pH 7,2) för 2 h (eller över natten) vid 4 ° C. Om flugorna flyta till ytan av fixeringsvätskan, tillsätt några droppar av 2,5% polyetylenglykol tert-octylphenyl eter att försvaga ytspänningen i den fixativ som möjliggör total nedsänkning av vävnad. Ta bort fixeringsvätskan använder ett glas Pipettera.

2. tvättning och uttorkning

  1. Tvätta och torka cyanobakterier.
    1. Tvätta fast provet tre gånger med 5 mL 0,1 M fosfatbuffert pH 7.0 i rumstemperatur i 10 min varje. Hålla kolven och tratt försluten för att hålla tvätten. Ta bort varje tvätt av skonsamt vakuum på filtrerkolv, efter att ta bort båda proppar.
    2. Torkar ut provet bibehållen kontinuerlig nedsänkning med en graderad etanol-serien, för 10 min i en volym på 5 mL i tratten. De graderade etanol koncentrationerna är: 25%, 50%, 75%, 95% och 2 ändringar av 100% etanol. Hålla kolven och tratt försluten innehåller etanol i tratten, förhindrar förlust både via avdunstning och passiv flöde genom filtret.
    3. Ta bort etanol av skonsamt vakuum på filtrerkolv, efter att ta bort båda proppar. Överföra filter/provet till en engångs aluminium väger maträtt som innehåller precis tillräckligt 100% etanol för att täcka provet före torkning.
  2. Tvätta och torka encelliga alger (euglenoids).
    1. Tvätta tre gånger med 5 mL avjoniserat vatten fast provet i rumstemperatur i 10 min varje. Hålla kolven och tratt försluten för att innehålla tvätten i tratten. Ta bort varje tvätt av skonsamt vakuum på filtrerkolv, efter att ta bort båda proppar.
    2. Torkar ut provet bibehållen kontinuerlig nedsänkning med hjälp av en graderad etanol-serie i 10 min i en volym på 5 mL i tratten. De graderade etanol koncentrationerna är: 25%, 50%, 75%, 95% och 2 ändringar av 100% etanol. Hålla kolven och tratt försluten innehåller etanol i tratten, förhindrar förlust både via avdunstning och passiv flöde genom filtret.
    3. Ta bort etanol av skonsamt vakuum på filtrerkolv, efter att ta bort båda proppar. Överföra filter/provet till en engångs aluminium väger maträtt som innehåller precis tillräckligt 100% etanol för att täcka provet före torkning.
  3. Tvätta och torka Drosophila melanogaster (bananflugan).
    1. Tvätta fast provet tre gånger med 1 mL 0,1 M fosfatbuffert pH 7,2 i rumstemperatur i 10 min i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Ta bort varje tvätt med glas pipett, vara noga med att inte ta bort flugor.
    2. Torkar ut provet med en graderad etanol-serien, för 10 min i en volym om 1 mL i ett mikrofugrör. Etanol är: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Ta bort etanol med glas pipett, vara noga med att inte ta bort flugor.
    3. Behålla provet i 1,5 mL mikrocentrifug röret med lagom 100% etanol att täcka provet före torkning.

3. torkning

  1. Utför kemisk torkning med hjälp av t-butyl alkohol (TBA)27.
    1. Ersätta 100% etanol lösningen med en 1:1 lösning TBA och 100% etanol för 20 min. Ersätt 1:1 lösningen med 100% TBA för 20 min. Upprepa två gånger. Förvara lösningen vid 37 ° C så att TBA inte fryser.
      Obs: 100% TBA har en fryspunkt 25,5 ° c; 1:1 lösningen fryser inte vid rumstemperatur. TBA är brandfarligt, orsakar allvarlig ögonirritation, är skadliga vid inandning och kan orsaka irritation i luftvägarna, dåsighet eller yrsel. TBA ska hanteras i kemiska dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning inklusive handskar, laboratorierock och skyddsglasögon.
    2. Över provet i TBA, om i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, till en engångs aluminium väger maträtt. En gång i aluminium vågskålen, ta bort TBA och Ersätt med lagom fräsch 100% TBA att täcka provet. Frysa TBA vid 4 ° C i 10 min.
    3. Överföra till ett vakuum exsickator (bell jar) med frysta gel förpackningar att hålla TBA fryst. Evakuera och upprätthålla vakuum med en roterande pump att låta provet till torrt genom vakuum sublimering av den frysta TBA för minst 3 tim eller över natten.
  2. Utför kemisk torkning med hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. Ersätta 100% etanol lösningen med en 1:2 lösning av HMDS och 100% etanol för 20 min. Ersätt 1:2 lösningen med en 2:1 lösning av HMDS och 100% etanol för 20 min. Ersätt 2:1 lösning med 100% HMDS för 20 min. Upprepa en gång.
      Obs: HMDS är brandfarliga och en akut toxin (dermal exponering). HMDS ska hanteras i kemiska dragskåp med lämplig personlig skyddsutrustning inklusive handskar, laboratorierock och skyddsglasögon.
    2. Över provet i HMDS, om i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, till en engångs aluminium väger maträtt. En gång i aluminium väger maträtt, ersätta 100% HMDS med lagom fräsch 100% HMDS att täcka provet.
    3. Överför provet till en plast eller glas icke-vakuum Exsickator med färska torkmedel (5-6 cm djupa) och placera in i kemiska dragskåp. Alternativt placera provet direkt i dragskåp kemiska torka med löst lock, såsom en låda, att förhindra att skräp faller på provet. Låt den torka i 12 till 24 h.

4. montering

  1. Montera cyanobakterier och euglenoids.
    1. Etikett längst ned på antingen en 12 - eller 25-mm aluminium montering påbörjad att indikera vad läggs på toppen. Skär filtret polykarbonat med torkade celler i kvartal med en ren rakblad eller skalpell om använder väsentlig 12 mm eller placera hela filtret använder väsentlig 25 mm.
    2. Placera varje filter på lim eller en kol självhäftande flik säkrade till toppen av väsentlig.
  2. Montera Drosophila melanogaster (bananflugan).
    1. Etikett längst ned på den aluminium montering påbörjad att indikera vad läggs på toppen.
      Placera de torkade flugorna i önskad position på lim eller kol självhäftande flik säkrade till toppen av väsentlig i dissekera Mikroskop med precision pincett.
    2. Gäller silver ledande lim, dvs, silver färg, runt ytterkanterna av stubbar. Anslut den silver färgen till flugorna med hjälp av en tandpetare för att säkerställa ledningsförmåga. Låt inte färgen att tryck på önskad imaging området.
    3. Placera stubbar i en påbörjad innehavaren låda och placera rutan Öppna påbörjad hållare i en exsickator. Tillåta att silver färgen torka minst 3 tim eller över natten för bästa resultat.

5. sputter beläggning

  1. Förbereda fräsande beläggning apparaten genom att utföra fyra till fem spolar av argongas. Om luftfuktigheten är hög (dvs, luften känns fuktig, vanligtvis cirka 50% relativ fuktighet), utföra sex till sju färger. Sputter coat de stubbar efter tillverkarens anvisningar.
  2. Coat prover baserat på preparatet används:
    1. För filter med cyanobakterier, ställa in timern till sputter kappa för 180 s rakt på.
    2. För filter med eukaryota alger, dvs euglenoids, ställa in timern till sputter kappa för 120 s rakt på, sedan 20 s på tre sidor i en 45 ° vinkel.
    3. Ställa in timern till sputter coat för 60 s rakt på, sedan 30 s på varje sida i en 45 ° vinkel för stora prover, dvs flyga huvuden.
      Obs: Efter beläggning är komplett, stubbar ska vara ljusgrå färg.

6. imaging

  1. Bild exempel med ett svepelektronmikroskop som innehåller en sekundär elektron (SE) detektor.
    1. För cyanobakterier, gäller följande inställningar: 3-5 kV accelerator spänning (AC), 20-30 sond aktuell (PC) och 5 mm arbetsavstånd (WD). För euglenoids, använda 3 kV AC, 30 St, och 5 mm WD. Använd 5 kV AC, 30 för flugor, PC och 5 till 10 mm WD.
  2. Justera förstoringen beroende på storleken av detalj eller objektet att visualiseras. Justera stigmators, bländare och fokus tills en tydlig bild produceras. Fånga bilden med Högupplösningsinställningar enligt tillverkarens anvisningar av SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cyanobakterier är en prokaryota organismer som är kritiska till de globala kol, syre och kväve cykler28,29. Av de uppskattningsvis 6000 arterna av cyanobakterier30, de flesta har en slemmig slida som täcker och ansluta cellerna tillsammans och till andra strukturer31, som tillsammans med formen, kan vara löst mikroskopiskt32. Cellstorlek, form och pigment närvarande urskilja enskilda arter och i akvatiska livsmiljöer, kan visualiseras som Cyanobakterie ”blommar”28. Den moderna Cyanobakterie klassificeringen kombinerar alla morfologiska egenskaper som möjligt använder ljusmikroskop, TEM, SEM, samt och molekylära data33. Liknar den Mucilago slidan av cyanobakterier, tunna remsor av euglenoid arter stöd i fylogeni bestämning. Euglenoids är vattenlevande flagellater som besitter en hel del av morfologiska och beteendemässiga mångfald och SEM analys har visat sig användbart klassificera skilda arter. Specifikt, äger euglenoids romanen strukturer under deras plasma membran som består av parallella proteinhaltiga remsor och mikrotubuli, kallas den tunna hinnan34,35,36. Antal, arrangemang och storlek av tunna remsor är kritiska morfologiska komparatorer och tillsammans med molekylära fylogenetiska data, används för att konstruera fylogenin för Euglenozoa37.

Det första steget i förberedelserna både cyanobakterier och euglenoids kräver filtrering organismerna från deras odlingsmedium och åstadkoms genom att montera en filtrering rigg (figur 1A). Aspiration används för att dra mediet genom en polykarbonat filter, lämnar organismerna på ytan av filtret. Porstorlek av filtret polykarbonat bör väljas så att intakt organismerna inte passerar genom (jämför figur 1B och 1 C). Figur 2 visar representativa resultat av tre olika släkten av cyanobakterier. Två är sötvatten och en Marina. Detaljer av cellen, inklusive form och konsistens av ytan är synlig, liksom en slida av Mucilago eller prognoser från cellerna. Figur 3 illustrerar hur SEM används för att visualisera den tunna remsor av två olika euglenoid arter. Det spiralformade arrangemanget av tunna remsor att sammanfoga i bakre slutet att bilda en svans stöd i fylogeni beslutsamhet när man jämför Monomorphina aenigmatica (figur 3A och 3B) med Monomorphina pseudopyrum ( Figur 3 c och 3D).

Förutom morfologiska egenskaper som identifierar arter, kan yttre morfologi av modellorganismer som Drosophila melanogaster användas för att identifiera genetiska modifierare använda fotoreceptorer nervceller som utgör sammansatt Drosophila öga38. Eftersom ögat är en icke-väsentliga vävnad i flugor, är det möjligt att uttrycka giftiga proteiner i näthinnans celler och använda SEM för att undersöka de morfologiska förändringar som genetisk modifiering har på ögat. Normala flyga ögon kännetecknas av en ordnad rad borst och linser (figur 4A), men uttrycket av proteiner som är associerad med Alzheimers sjukdom skapar vad som kallas 'grov öga' fenotypen (figur 4B). Gener som hämmar (figur 4 c) eller öka (figur 4 d), grov ögat fenotypen kan en fysiologisk roll i sjukdomsprogression och har potential för drog inriktning39. Också visas i figur 4 är exempel på potentiella fallgropar att undvika inklusive ett exempel av den kollapsade strukturen i ögat från felaktig torkning teknik (figur 4E) och elektron laddning från otillräcklig fräsande beläggning som visas under Bild Förvärvandet (figur 4F och 4 G).

Figure 1
Figur 1 : Schematisk representation av filtrering rigg och SEM polykarbonat filter. (A) denna apparat används för att separera små eller enda encelliga organismer såsom cyanobakterier och euglenoids från deras odlingsmedium. Tillämpningen av ett vakuum på sidoarm kolvens kommer att dra innehållet i tratten genom filtret polykarbonat och in basen av filtrering kolven, lämnar organismerna på ytan av filtret. (B) SEM av en 0,8 µm porstorlek filter med inget prov som provet var förlorat på grund av misskötsel. Skalstapeln = 20 µm. (C) SEM 0,8 µm porstorlek filter med cyanobakterier närvarande. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : SEM Mikrograf av cyanobakterier. (A, B) Toxifilum mysidocida, en trådformiga sötvatten arter från Colorado med en synlig slida av Mucilago (M). Skala barer = 5 µm. (C, D) A sötvatten Golenkina sp. från Ohio. Enskilda cellerna ibland bildar kolonier hålls ihop av ett tunt lager av Mucilago (M). Glödlampa-liknande utbuktningar (vita pilar) förlänga de enskilda cellerna. Skala barer = 10 µm. (E, F) Okänd fintrådiga art från en hög salthalt mynning i Texas kustvatten. Enskild cell (svarta pilar) och delande celler (vit pilspetsar) syns. Skalstapeln i panelen E = 2 µm. skalstapeln i panelen F = 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : SEM Mikrograf av tunna remsor från två arter av euglenoids. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) låg förstoring bilder av hela cellen. Skalstapeln = 5 µm. (B) hög förstoring av bakre utgången. Skalstapeln = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) låg förstoring bilder av hela cellen. Skalstapeln = 10 µm. (D) hög förstoring av bakre utgången. Skalstapeln = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : SEM analys av fenotypiska modifiering av Drosophila ögat. Uttryck för den giftiga protein tau jämfört med normala utseende av de beställda utbudet av borst och linser av flyga ögat (A), och orsakar döden av ljusmätare nervceller, generera 'grov öga' fenotypen (B). Uttryck för genetiska modifierare som antingen hämmar (C) eller öka (D), tau grov ögat ger bevis på gener som kan spela en roll i tau neurotoxicitet. Felaktig teknik vid torkning steg kan leda till en kollaps av strukturen i ögat (E) medan otillräcklig beläggning av provet kommer att orsaka laddning, som visas som en vit (F) eller svart (G) bandet under bild förvärv, som visas av pilen. Skalstapeln = 400 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskrivs vi ett protokoll som använder SEM för att erhålla detaljerad information om externa morfologiska kännetecken av tre typer av organismer som andra kan använda för att undersöka funktioner av många typer av organismer eller vävnader. Inom varje steg av protokollet finns det potentiella punkter av fel som kan uppstå och diskuteras i detalj nedan.

Medan volymerna för fixativ och tvättar som ges här är specifika, bör i allmänhet den fixativ och tvättar vara 5-10 gånger volymen av preparatet. Fixering, tvättning och uttorkning alltid är baserat på vår erfarenhet, om problem uppstår, t.ex. shriveling av provet, kan du behöva öka gånger vid varje steg i uttorkande eller torkning. Beroende på ditt enda cell prov, kan du behöva göra både en glutaraldehyd fixering och en efter fixering i osmium vanligtvis. Om en duell fixering är behövs efter steg 1.1.2 cyanobakterier täcka med lika mycket 2% OsO4 i samma bufferten och fortsätt från steg 1.2.2 enda cell. Från arbetet som inte visas här, har vi funnit att Drosophila kan antingen placeras direkt i fixativ följande anesthetization eller kan vara fryst på obestämd tid vid-20 ° C i ett mikrofugrör och placeras i fixativ vid ett senare tillfälle med ingen skillnad i färdiga bildkvalitet.

Under tvätt och uttorkning stegen är det absolut nödvändigt att flytta genom graderade etanol serien långsamt och utan att hoppa över en känd koncentration. Om prover är uttorkad för snabbt, det påverkar negativt de underliggande strukturella komponenterna i vävnaden och preparatet kommer att skrumpna, vissna eller kollapsa. Ett exempel på vävnad kollaps visas i figur 4E. Dessutom för att förhindra införandet av artefakter såsom klumpar och tillplattning av morfologiska egenskaper, är det kritiskt att lämna bara tillräckligt etanol för att täcka provet mellan stegen under uttorkning och snabbtorkande.

När du använder filtrering riggen, kommer en droppe vatten på basen håller filtret på plats vid montering. Även filtret bör placeras med den blanka sidan upp och alla vätskor bör läggas försiktigt, försiktigt så att hantera filtret med varsamhet så att inte tvätta bort provet. Även om vi har hittat resultaten av torkning med antingen HMDS eller TBA för att vara av samma kvalitet, vi rekommenderar att du använder TBA: medan både HMDS och TBA är brandfarliga, TBA är ungefär en tredjedel av kostnad och mindre giftigt än HMDS.

Under montering när du använder silver ledande lim (även kallade silver färg), vara försiktig vid applicering som ditt prov kan enkelt täckas (begravd) i paint, skymmer därmed fina detaljer i morfologi. Fräsande beläggning gånger kan variera utifrån ditt prov, och värden som anges här är baserat på vår erfarenhet. Ett potentiella negativa resultat av otillräcklig fräsande beläggning är ett fenomen som kallas laddning, som ofta visas som en vit eller svart linje (ibland en flash) i den slutliga bilden (se figur 4F och G för exempel). Om mängden laddning observerade är minimal, kan det vara möjligt att mildra effekterna genom att justera olika Mikroskop parametrar, såsom sänka den accelererande spänningen eller helljus nuvarande, öka styrkan kondensorn lins, eller använda en mindre objektiva bländare. De flesta SEMs används för biologiska prover har sekundära electron detektorer, men vissa SEMs kan även utrustas med backscatter detektorer eller miljömässiga sekundär electron detektorer, som kan justeras för att minska eller eliminera effekterna av minimal laddning. Om laddning effekterna är mer uttalad, är det sannolikt att det är dålig jordning av provet eller för lite sputter beläggning för att producera de sekundära elektroner, orsakar de laddade elektronerna att bygga upp i preparatet och släppas spontant, producera förvrängning i bilden under förvärv. Uttalad laddning är oftast löst med en tjockare beläggning eller bättre jordning med silver färg. Eftersom både för mycket och för lite fräsande beläggning kan negativt påverka kvaliteten på bilden, är det bäst att optimera mängden beläggning tillämpas genom att justera variablerna tid (10-180 s) och tryck (70 till 150 mTorr) av den fräsande bestrykare att uppnå en optim Al beläggning. Eftersom beläggningen inte kan tas bort en gång tillämpas på provet, rekommenderas en provkörning med ett enda prov före beläggning alla prover.

SEM parametrar såsom accelererande spänning (i kV), sond aktuell (PC) och arbetsavstånd (WD) måste justeras för att få den bästa bilden möjligt som inställningarna ges här föreslås Startparametrar som baserat på vår erfarenhet. Även kvaliteten på provet är beroende av vården tas i förberedelse, bygger kvaliteten på den slutliga bilden på erfarenhet och skicklighet av operatorn SEM. Således rekommenderar vi arbetar med en SEM-tekniker eller spendera tid att utveckla din egen SEM färdigheter. Alla data (inklusive provpreparering och imaging) visas i dokumentet genererades av studenter i biologi mikroskopi program vid CMU, med vägledning från fakultet och vår mikroskopi tekniker.

De protokoll som beskrivs här inkluderar användning av potentiellt skadliga kemikalier och lämpliga säkerhetsåtgärder bör alltid följas för att skydda användare, särskilt studenter som kan hantering av dessa kemikalier. Medan protokoll ange säkerhetsrisker associerade med varje kemikalie vid första användningen, användare bör alltid: (1) använda kemiska spiskåpa, (2) har tillgång till en akut ögat tvätt och dusch, (3) Använd lämplig personlig skyddsutrustning inklusive nitrilhandskar, labbrock och ögat som skydd, och (4) veta var till finna skriftliga säkerhetsrutiner inklusive hantering, designerat använda områden, spill och sanering förfaranden, och förfaranden för bortskaffande av avfall.

Sammanfattningsvis visar dessa organismer hur information om tredimensionella topografin av utvändiga ytor av varje är användbart för fylogenianalys gruppering eller modifierare. Cyanobakterier, funktioner bestäms från SEM kan användas i kombination med ytterligare data från ljusmikroskop, TEM, och molekylära studier att identifiera, karakterisera och namnge cyanobakterier. För euglenoids, nummer, bredd, arrangemang (spiralformade eller rak) och ornamentik, i förekommande fall, av tunna remsor kan användas med andra morfologiska data, och om nödvändigt molekylära data, att identifiera, karakterisera och namnge euglenoids. Dessutom kan andra typer av encelliga alger och protozoer eller mikro-ryggradslösa djur förberedas och undersökt på ett liknande sätt att fastställa extern morfologiska egenskaper såsom flageller, utfodring struktur, yttre utsmyckning eller Detaljer för bihang vid mikro-ryggradslösa djur. Slutligen har SEM breda tillämpningar för att pröva morfologiska detaljer, såsom ögat av modell systemet Drosophila, att karakterisera genetiska modifierare av sjukdom patologi. De protokoll som beskrivs här utnyttja organismer som varierar kraftigt när det gäller komplexitet, men alla är mottagliga för SEM-analys att samla morfologisk information som är väsentlig för vetenskapliga upptäckter som spänner över många olika subdiscipliner av biologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades genom ett bidrag till MLS och en sommar Scholar Award till MAK från kontor för forskning och forskarutbildning vid Central Michigan University. Cyanobakterier levererades av Zimba och plankton lab, del av centrum för kustnära studier, Texas A & M University i Corpus Christi. Euglenoids levererades av Triemer lab, Michigan State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Biologi fråga 143 Scanning electron microscopy (SEM) cyanobakterier euglenoid bananflugan Drosophila kritisk punkt torkning (CPD) hexamethyldisilazane (HMDS) t-butyl alkohol (TBA)
Beredning av prokaryota och eukaryota organismer använder kemisk torkning för Morfologisk analys i svepelektronmikroskopi (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter