Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM analiz tür kimlik ya da fenotipik ayrımcılık yardım etmek için etkili bir yöntemdir. Bu iletişim kuralı organizmalar üç temsilcisi tür özel morfolojik detayları inceleyerek yöntemlerini açıklar ve birçok organizma özelliklerinin incelenmesi için genel olarak geçerli olacaktır ve doku türleri.

Abstract

Elektron mikroskobu (SEM) tarama biyolojik örnekler bireysel proteinler hücre, doku, organelleri ve hatta bütün organizmalar için arasında değişen çalışma uygulanan yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Bu protokol iki kimyasal kurutma yöntemi, hexamethyldisilazane (HMDS) ve t-butil alkol (TBA) ve görüntüleme için uygulama prokaryotik ve ökaryotik organizmaların SEM kullanarak odaklanmaktadır Bu makalede, biz tamir, yıkama, kurutmak, Kuru, mount, ceket şaplatın ve organizmalar üç tür görüntü açıklanmıştır: Siyanobakteriler (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ve bilinmeyen bir sp.), cins Monomorphina gelen iki euglenoids (M. aenigmatica ve M. pseudopyrum) ve meyve sineği (Drosophila melanogaster). Bu iletişim kuralının amacını yapısı, boyut ve geniş organizmalar için geniş bir ürün yelpazesi uygulanabilir örneklerin yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için hızlı, ucuz ve basit bir yöntem tarif etmektir morfolojik değerlendirme. Bu iletişim kuralı başarıyla tamamlanması diğerleri sistemlerine bu teknikleri uygulayarak örnekleri görselleştirmek için SEM kullanmak izin verir.

Introduction

Taramalı elektron mikroskobu (SEM) yüksek enerjili elektronların odaklanmış ışın demeti ikincil elektron Morfoloji ve örnek1topografya gösteren bir görüntü oluşturmak için kullanır. SEM doğrudan bir örnek, yüzey yapısı ve üç boyutlu şekil ve teklifler daha fazla çözünürlüğünü fiziksel boyutunu ve daha büyük ışık mikroskobu ile karşılaştırıldığında alan derinliğini belirlemek için kullanılabilir. Elektron mikroskobu (EM) başka bir formu, iç yapısının ince detayları ile görüntüleri oluşturma örneği üzerinden geçmek odaklı elektron transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanır. TEM ışık veya SEM daha daha yüksek çözünürlüğe sahip ve yapıları tek atomları küçük çözümlemek için kullanılan iken, üç önemli dezavantajları vardır: geniş numune hazırlama, küçük bir görüş alanı ve sığ derinliği alanı2,3. Diğer görüntülenir, ancak belirli hücreleri, organelleri veya doku4,5,6,7,8,9, incelemek için SEM kullanarak protokoller bulunmaktadır 10 , biz geniş organizmalar morfolojik değerlendirmesi için geniş bir ürün yelpazesi uygulanabilir yöntemleri tarif bu protokolü benzersizdir.

SEM nano tanecikleri11,12, polimerler13ve çok sayıda uygulama jeolojik, endüstriyel ve Malzeme Bilimleri14' te, gibi inorganik maddeler incelenmesi için geniş uygulamalar buldu 15,16. Biyolojide, SEM uzun bireysel proteinler bütün organizmalar17,-18arasında değişen biyolojik örnekleri inceleyerek bir yöntem olarak kullanılmıştır. Morfolojik yüzey detayları bilimsel keşif bilgilendirmek için kullanılabilir çünkü SEM belirli değeri var. SEM çözümleme yapısı, boyut ve biyolojik örnekleri geniş bir yüzey özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için hızlı, ucuz ve basit bir yöntemdir.

Bir SEM normalde tutarlı bir yüksek hızlı elektron huzmesi desteklemek için yüksek vakum altında (10-6 Torr en az) çalıştığından, hiçbir sıvı (su, yağlar, alkoller) gibi sıvılar bir vakum önleyebilirsiniz örnek odasında izin verilir. Böylece, tüm örnekleri SEM kullanarak muayene, genellikle etanol kaldırmak için bir kurutma işlemi tarafından izlenen bir kademeli etanol serisi kullanan susuz gerekir. Biyolojik dokuların kullanılmak üzere hava kurutma, lyophilization, kritik nokta kurutma (GBM) aygıt veya t-butil alkol (TBA) veya hexamethyldisilazane (HMDS)19, kullanarak kurutma kimyasal kullanımı da dahil olmak üzere SEM, kurutma birkaç yöntem vardır 20 , 21 , 22. biyolojik her örnek farklı kurutma her yönteme tepki bu yana çoğu zaman, bir kurutma yöntemi ampirik seçimdir. Avantajları ve dezavantajları karşılaştırarak uygun yöntem seçiminde yararlı bu yüzden herhangi bir verilen örnek için tüm bu yöntemlerin uygun olabilir.

Oda sıcaklığında veya kurutma fırın (60 ° C) bir örnek kurutma hava en basit yöntem olmakla birlikte, çoğu biyolojik örnekler kuruyup gibi kurutma-indüklenen zarar göster ve daraltmak, numune bozulma sonucu. Lyophilization süreci aynı zamanda su (veya buz) bir örnek kaldırır ama flaş dondurulmuş olmak örnekleri gerektirir ve vakum altında buz üzerinden kaldırmak için örnek zararlı süblimasyon, işlemi yerleştirilen. Buna ek olarak, Kullanıcı bir lyophilizer erişimi olmalıdır. Örnekleri SEM için dehydrating en sık kullanılan kritik noktası (GBM) kurutma yöntemidir. CPD içinde örnek bir etanol ile sıvı karbondioksit (CO2) ve belirli sıcaklık ve basınç koşulları kritik nokta (31,1 ° C ve 1,073 psi), CO2 yüzey gerilimi, böylece oluşturmadan buharlaştırır olarak bilinen altında değiştirilir etkili bir şekilde örnek morfolojik ve yapısal özelliklerini koruyarak. CPD genellikle standart yöntem olmakla birlikte, birçok sakıncaları vardır. İlk olarak, süreci önemli olan sadece pahalı değil ama aynı zamanda sıvı karbondioksit kullanımı gerektirir noktası kurutma makinesi, erişim gerektirir. İkinci olarak, kurutulmuş örnek boyutu kurutma makinesi kritik nokta Oda boyutu sınırlıdır. Üçüncü olarak, CPD sırasında sıvı alışverişi örnek zarar verebilir türbülans neden olabilir.

Kimyasal kurutma CPD birçok avantaj sunar ve yaygın SEM örnek hazırlanmasında kullanılır hale uygun bir alternatif olarak hizmet vermektedir. TBA ve HMDS gibi kimyasal dehydrants kullanımı hala örnek yapısal bütünlüğünü koruyarak diğer yöntemleri için hızlı, ucuz ve basit bir alternatif sunmaktadır. Biz son zamanlarda doku veya CPD veya TBA yetişkin Drosophila Retina doku23yılında kurutma yöntemi olarak kullanırken yakalanan son görüntü kalitesini bütünlüğünü hiçbir fark olduğunu gösterdi. CPD, aksine TBA ve HMDS kurutma bir enstrüman veya sıvı CO2 gerekmez ve kurutulmuş için örnek boyutu sınır yoktur. Kimyasallar alma ek olarak, yalnızca standart kimyasal duman hood ve uygun kişisel koruyucu ekipman (eldiven, önlük ve koruyucu gözlük) kurutma işlemi tamamlamak için gereklidir. TBA ve HMDS yanıcı olmakla birlikte, daha ucuz ve daha az toksik TBA (yaklaşık 1/3 HMDS maliyetini) HMDS daha.

Bu makalede, biz tamir, yıkama, kurutmak, Kuru, mount, ceket şaplatın ve organizmalar üç tür görüntü açıklanmıştır: Siyanobakteriler (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ve bilinmeyen bir sp.), cins Monomorphina gelen iki euglenoids (M. aenigmatica ve M. pseudopyrum) ve meyve sineği (Drosophila melanogaster). Bu organizmaların boyutu (4 mm için 0.5 µm) ve hücresel çeşitlilik (tek için çok hücreli hücreli) geniş bir temsil, henüz tüm numune hazırlama için gerekli sadece küçük farklılıklar nedeniyle kolayca SEM analiz için mükellef bulunmaktadır. Bu iletişim kuralı organizmalar üç tür morfolojik ayrıntıları incelemek için kimyasal su kaybı ve SEM çözümlemesi kullanarak yöntemlerini açıklar ve birçok organizma incelenmesi için genel olarak geçerli olacaktır ve doku türleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlık ve fiksasyon

  1. Siyanobakteriler hazırlayın.
    1. F/2 medya24,25 28 ° c sıcaklıkta kültürlerde unialgal 14:10 s büyümek ışık karanlık döngüsü. Yerleşmek 15 dk sonra izin, bakteriyel Pelet boyutu yaklaşık 0.05 mL öyle ki yeterli kültür 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Medyayı çıkarın ve sabitleştirici (%1.25 oxazolidin, 0.1 M fosfat tampon pH 7,0) 1,5 mL ile değiştirin, yavaşça birkaç kez ters çevir ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    2. Polikarbonat 25 mm Filtre hücreleri büyüklüğüne bağlı olarak 0.8 veya 0.2 µm gözenekli içeren sabit hücreleri bir 10 mL filtrasyon teçhizat (Şekil 1) içine cam pipet ile aktarın. Yan kol mühür ve huni kültüründe içerecek şekilde lastik stoper ile huni. Sabitleştirici filtrasyon flask, nazik vakum tarafından her iki stoper çıkardıktan sonra kaldırın.
      Not: Polikarbonat filtresinde hücre yoğunluğu en uygun değilse, kullanılan kültür başlangıç miktarını ayarlayın.
  2. Tek hücreli alg (euglenoids) hazırlayın.
    1. AF-6 medya26 14:10 s 22 ° c sıcaklıkta medyaya eklendi piyasada bulunan toprak-su ortamının 150 mL L-1 ile unialgal kültürlerde büyümek ışık karanlık döngüsü. Düşük yoğunluklu 2 mL transfer (600 < 0,5 OD) 8 µm gözenekleri olan bir polikarbonat 25 mm filtre içeren kültür ile Cam Pipet içine bir 10 mL filtrasyon teçhizat (Şekil 1). Yan kol mühür ve huni kültüründe içerecek şekilde lastik stoper ile huni.
      Not: Polikarbonat filtresinde hücre yoğunluğu en uygun değilse, kullanılan kültür başlangıç miktarını ayarlayın.
    2. Doğrudan kültür için % 4 osmiyum tetroxide (OsO4) üç damla ekleyin ve her iki stoper çıkardıktan sonra sabitleştirici filtrasyon flask, nazik vakum tarafından 30 dk. kaldırmak için kuluçkaya için.
      Not: OsO4 akut bir toksindir (dermal, oral, inhalasyon yönlendirir ve), gözleri ve solunum derhal zarar cilde aşındırıcı. OsO4 uygun kişisel koruyucu ekipman eldiven, önlük ve göz koruması gibi kullanarak bir kimyasal duman mahallede ele alınmalıdır.
  3. Drosophila melanogaster (meyve sineği)23hazırlayın.
    1. % 100 karbon dioksit kullanarak yetişkin sinekler anestezi. Yer yetişkin bir küçük plastik vidalı kapak şişe veya 1,5 mL santrifüj tüpü (yaklaşık 10-30 sinekler) anestezi.
    2. 4 ° C'de 2 h (veya gece) için sabitleştirici (%1.25 oxazolidin, 0.1 M fosfat tampon pH 7.2) 1 mL imzalat sinekli bırakın Sinekler sabitleştirici yüzeye float, % 2.5 Polietilen glikol tert-octylphenyl eter doku toplam batma için izin sabitleştirici yüzey gerilimi zayıflatmak için birkaç damla ekleyin. Bir cam damlalıklı kullanarak sabitleştirici kaldırın.

2. yıkama ve susuzlaştırma

  1. Yıkama ve Siyanobakteriler kurutmak.
    1. Üç kez ile 5 mL 0.1 M fosfat tampon pH 7,0 10 dakika oda sıcaklığında sabit örnek yıkayın. Şişesi ve huni yıkama tutmak için stoppered tutmak. Her yıkama filtrasyon flask, nazik vakum tarafından her iki stoper çıkardıktan sonra kaldırın.
    2. Örnek 5 mL huni hacmi 10 min için kademeli etanol serisi kullanarak sürekli daldırma koruyarak kurutmak. Kademeli etanol konsantrasyonları şunlardır: % 25, % 50, % 75, % 95 ve % 100 etanol 2 değişir. Her iki yolu ile şişesi ve etanol kaybını önleme huni içerecek şekilde stoppered huni tutmak buharlaşma ve filtre ile pasif akışı.
    3. Etanol filtrasyon flask, nazik vakum tarafından her iki stoper çıkardıktan sonra kaldırın. Filtre/örnek örnek kurutma önce karşılamak için yeterli % 100 etanol içeren çanak ağırlığında bir tek kullanımlık alüminyum aktarın.
  2. Yıkama ve tek hücreli alg (euglenoids) kurutmak.
    1. 10 dakika oda sıcaklığında sabit örnek 3 kez 5 mL deiyonize su ile yıkayın. Şişesi ve huni makinaya içerecek şekilde stoppered huni tutun. Her yıkama filtrasyon flask, nazik vakum tarafından her iki stoper çıkardıktan sonra kaldırın.
    2. Örnek 5 mL huni hacmi 10 min için kademeli etanol serisi kullanarak sürekli daldırma koruyarak kurutmak. Kademeli etanol konsantrasyonları şunlardır: % 25, % 50, % 75, % 95 ve % 100 etanol 2 değişir. Her iki yolu ile şişesi ve etanol kaybını önleme huni içerecek şekilde stoppered huni tutmak buharlaşma ve filtre ile pasif akışı.
    3. Etanol filtrasyon flask, nazik vakum tarafından her iki stoper çıkardıktan sonra kaldırın. Filtre/örnek örnek kurutma önce karşılamak için yeterli % 100 etanol içeren çanak ağırlığında bir tek kullanımlık alüminyum aktarın.
  3. Yıkama ve Drosophila melanogaster (meyve sineği) kurutmak.
    1. Üç kez ile 1 mL 0.1 M fosfat tampon pH 7.2 10 dakika oda sıcaklığında sabit örnek bir 1.5 mL microcentrifuge tüp içinde yıkayın. Her yıkama sinekler değil çıkarmak için dikkatli olmak bir cam pipet ile kaldırın.
    2. 1 mL microfuge tüp hacmi 10 min için kademeli etanol serisi kullanarak örnek kurutmak. Etanol konsantrasyonları şunlardır: % 25, % 50, % 75, %80, % 95, % 100. Sinekler değil çıkarmak için dikkatli olmak bir cam pipet ile etanol kaldırın.
    3. 1.5 mL microcentrifuge tüp kurutma önce örnek karşılamak için yeterli % 100 etanol ile örnekte korur.

3. kurutma

  1. Kimyasal kurutma t-butil alkol (TBA)27kullanarak gerçekleştirin.
    1. % 100 etanol çözüm 1:1 çözüm TBA ve % 100 etanol 20 dk. 20 dakika süreyle % 100 TBA ile 1:1 çözüm tekrar iki kez Değiştir yerine. Çözüm 37 ° C'de tutmak, TBA değil dondurma yok.
      Not: %100 TBA 25.5 ° C bir donma noktası vardır; 1:1 çözüm oda sıcaklığında dondurma değil. TBA yanıcı, ciddi göz tahrişine neden olur, Eğer inhale zararlıdır ve solunum tahriş, uyuşukluk veya baş dönmesi neden olabilir. TBA uygun kişisel koruyucu ekipman eldiven, önlük ve göz koruması gibi kullanarak bir kimyasal duman mahallede ele alınmalıdır.
    2. TBA, örnek bir 1.5 mL microcentrifuge tüp Eğer, bir tek kullanımlık alüminyum çanak ağırlığında aktarın. Bir kez alüminyum tartı çanak TBA kaldırın ve örnek karşılamak için yeterli taze % 100 TBA ile değiştirin. TBA 10 dk 4 ° C'de dondurmak.
    3. TBA donmuş tutmak için bir vakum desiccator için (bell jar) dondurulmuş jel paketleri ile aktarın. Tahliye ve en az 3 h için dondurulmuş TBA vakum süblimasyon tarafından kuru veya bir gece örnek izin vermek için döner bir pompa ile vakum korumak.
  2. Kimyasal hexamethyldisilazane (HMDS)20kullanarak kurutma gerçekleştirin.
    1. % 100 etanol çözüm HMDS 1:2 çözeltisi ile değiştirin ve % 100 etanol 20 dakika süreyle yerine HMDS 2:1 çözeltisi ile 1:2 çözüm ve % 100 etanol 20 dakika süreyle yerine 2:1 % 100 çözüm HMDS 20 dakika süreyle bir kez yineleyin.
      Not: Yanıcı ve akut bir toksin (dermal rota) HMDS değil. HMDS uygun kişisel koruyucu ekipman eldiven, önlük ve göz koruması gibi kullanarak bir kimyasal duman mahallede ele alınmalıdır.
    2. HMDS, örnek bir 1.5 mL microcentrifuge tüp Eğer, bir tek kullanımlık alüminyum çanak ağırlığında aktarın. % 100 alüminyum çanak, tartma yerine bir kez yeterli taze %100 ile HMDS örnek kapsayacak şekilde HMDS.
    3. Örnek bir plastik ya da cam elektrikli sigara desiccator taze kurutucu (5-6 cm derin) ile transfer ve kimyasal duman mahallede yerleştirin. Alternatif olarak, doğrudan bir kimyasal duman hood örnek üzerinde geçmesini enkaz önlemek için kutusu gibi gevşek bir kapak ile kuru için örnek yerleştirin. Örnek 12-24 saat kurumasını sağlar.

4. montaj

  1. Siyanobakteriler ve euglenoids monte.
    1. Ya bir 12 veya 25 mm alüminyum ne üstüne yerleştirilen belirtmek için saplama montaj alt etiket. Polikarbonat filtre kuru hücrelerle 12 mm saplama kullanıyorsanız bir temiz jilet veya neşter ile çeyrek kesilmiş veya 25 mm saplama kullanarak, tüm filtre koyun.
    2. Her filtre yapıştırıcı ya da bir saplama tepesine güvenli bir karbon yapışkanlı etiket yerleştirin.
  2. Mount Drosophila melanogaster (meyve sineği).
    1. Ne üstüne yerleştirilen belirtmek için alüminyum montaj saplama alt etiket.
      Kurutulmuş sinekler bir saplama diseksiyon mikroskop altında üst için hassas cımbız ile güvenli yapışkan ya da karbon yapışkanlı sekmesinde istediğiniz konuma yerleştirin.
    2. Gümüş iletken yapıştırıcı, Yani, gümüş boya, taslakları dış kenarlarında geçerlidir. Gümüş boya iletkenliği sağlamak için bir kürdan kullanarak sinekler bağlayın. Boya istediğiniz görüntüleme alanını dokunmak izin vermez.
    3. Taslakları bir saplama tutucu kutusuna yerleştirin ve yer belgili tanımlık açık saplama tutucu kutu içinde bir desiccator. Gümüş boya en az 3 h kuru veya bir en iyi sonuç için gece izin.

5. sputter kaplama

  1. 4-5 basması, argon gazı gerçekleştirerek sputter kaplama aparatı hazırlayın. Nem oranı yüksek ise (Oda hava nemli, genellikle hakkında hissediyorYani, % 50 bağıl nem), altı-yedi basması gerçekleştirmek. Kat üreticinin yönergeleri izleyerek taslakları şaplatın.
  2. Ceket örnekleri: örnek kullanılan temel
    1. Siyanobakteriler ile filtreler için 180 s düz için kat üzerinde şaplatın fırının saatini kurdu.
    2. Ökaryotik algler, Yani, euglenoids, sahip filtrelerini kat 120 s üzerinde düz, sonra 20 s 45 ° açıyla üç tarafı için şaplatın fırının saatini kurdu.
    3. Büyük örnekleri için Yani, sinek başlar, kat 60 s üzerinde düz, sonra 30 s 45 ° açıyla her tarafında şaplatın fırının saatini kurdu.
      Not: kaplama tamamlandıktan sonra taslakları açık gri renkte olmalıdır.

6. görüntüleme

  1. Bir ikincil elektron (SE) dedektörü içerir bir taramalı elektron mikroskobu kullanarak resim örnekleri.
    1. Siyanobakteriler için aşağıdaki ayarlar uygulanır: 3-5 kV Hızlandırıcı gerilim (AC), 20-30 sonda mevcut (PC) ve 5 mm çalışma mesafesi (WD). Euglenoids için 3 kV AC, 30 kullanmak PC ve 5 mm WD. Sinekler için 5 kV AC, 30 kullanmak PC ve 5-10 mm WD.
  2. Ayrıntı veya görüntülenmeyecektir için nesnenin boyutuna bağlı olarak büyütme ayarlayın. Net bir görüntü elde edilir kadar stigmators, diyafram ve odak ayarlayın. Sem, üreticinin yönergelerine göre yüksek çözünürlük ayarları kullanarak görüntü yakalama

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Siyanobakteriler küresel karbon, oksijen ve azot döngüsü28,29kritik organizmaların prokaryotik bir grubuz. Siyanobakteriler30yaklaşık 6000 tür, en kapak ve hücreleri birbirine bağlamak mukoza bir kılıf var ve diğer yapılar için olabilen şekliyle birlikte31, mikroskobik32çözüldü. Hücre boyutu, şekli ve pigmentler mevcut bireysel tür ayırt etmek ve su alanları, siyanobakteriyel "blooms"28görüntülenir. Modern siyanobakteriyel sınıflandırma morfolojik özellikleri ışık mikroskobu, TEM ve SEM yanı sıra moleküler veri33kullanarak olası tüm birleştirir. Benzer şekilde Siyanobakteriler zamk kılıf, film tabakası euglenoid tür yardım phylogeny belirlenmesi şeritler. Euglenoids morfolojik ve davranışsal çeşitlilik büyük miktarda sahip su flagellates vardır ve SEM analiz ayrı tür sınıflandırma yararlı olmuştur. Özellikle, euglenoids paralel proteinaceous şeritler ve mikrotübüller, film tabakası34,35,36denilen oluşan roman yapıları onların plazma zarı altında sahip. Sayısı, düzenleme ve film tabakası şeritler boyutunu kritik morfolojik Karşılaştırıcılar vardır ve moleküler filogenetik verilerle birlikte phylogeny Euglenozoa37için oluşturmak için kullanılır.

Siyanobakteriler ve euglenoids hazırlanması ilk adımı onların büyüme ortamdan organizmalar süzme gerektirir ve bir filtrasyon teçhizat (Şekil 1A) montaj tarafından gerçekleştirilir. Aspirasyon organizmalar filtre yüzeyine bırakarak bir polikarbonat filtre aracılığıyla orta çekmek için kullanılır. Öyle ki sağlam organizmalar aracılığıyla geçmek olmaz Polikarbonat filtrenin gözenek boyutu seçilmelidir ( Şekil 1B ve 1 Ckarşılaştırın). Şekil 2 Siyanobakteriler üç farklı cins temsilcisi sonuçlarını gösterir. İki tatlı su ve deniz biridir. Şekil ve doku yüzeyinin de dahil olmak üzere hücrenin ayrıntıları görünür, hem de bir kılıf zamk veya hücreleri projeksiyonları vardır. Şekil 3 film tabakası şeritler iki farklı euglenoid türlerin görselleştirmek için SEM nasıl kullanıldığı gösterilmektedir. Film tabakası helisel düzenlenmesi bir kuyruk Yardım Monomorphina aenigmatica , (Şekil 3A ve 3B) Monomorphina pseudopyrum ( ile karşılaştırırken phylogeny tayini oluşturmak için posterior sonundaki bu birleştirme şeritler Şekil 3 c ve 3D).

Türler tanımlamak morfolojik özelliklere ek olarak, Drosophila melanogaster gibi canlılar dış morfolojisi genetik değiştiriciler bileşik oluşturan photoreceptors nöronlar kullanarak tanımlamak için kullanılan Drosophila 38göz. Göz sinekler gerekli olmayan dokuda olduğundan, Retina hücrelerindeki toksik protein hızlı ve genetik değişiklik gözü morfolojik değişiklikleri incelemek için SEM kullanmak mümkündür. Alzheimer hastalığı ile ilişkili proteinlerin ifade oluşturmak ancak 'kaba göz' fenotip (Şekil 4B) adı ne normal sinek gözleri kıllar ve lensler (4A rakam), sipariş edilen dizesi ile karakterizedir. (Şekil 4 c) bastırmak veya (Şekil 4 d) kaba göz fenotip iyileştiren genlerin hastalık ilerlemesinde fizyolojik rolü ve uyuşturucu39hedefleme için potansiyele sahip. Ayrıca Şekil 4 ' te gösterilen göz daraltılmış yapısı örneği uygunsuz kurutma tekniği (Şekil 4E) ve elektron sırasında görünür yetersiz sputter kaplama şarj eklememek için olası tehlikelere örnekler resim alma (Şekil 4F ve 4 G).

Figure 1
Resim 1 : Filtrasyon teçhizat ve polikarbonat filtre SEM şematik gösterimi. (A) Bu cihaz Siyanobakteriler ve euglenoids onların büyüme orta uzak gibi küçük veya tek hücreli canlıların ayırmak için kullanılır. Bir vakum uygulama şişeye yan kol için huni içeriğini Polikarbonat filtre ve filtre yüzeyine organizmalar bırakarak filtrasyon şişeye Bankası içine çeker. (B) SEM 0.8 µm gözenek filtre yok örnek numune olarak ile ilgilenmedikleri nedeniyle kaybedildi. Ölçek çubuğu Siyanobakteriler mevcut 0.8 µm gözenek filtresiyle 20 µm. (C) SEM =. Ölçek çubuğu 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : SEM test, siyanobakteriler. (A, B) Toxifilum mysidocida, ipliksi tatlı su süsengiller Colorado gelen görünür bir kılıf ile zamk (M). Ölçek çubukları 5 µm. (C, D) A temiz su Golenkina sp. Ohio'dan =. Tek tek bazen birlikte zamk (M) ince bir tabaka tarafından düzenlenen form kolonileri hücrelere. Filaman benzeri çıkıntılar (beyaz ok) tek tek hücreler için genişletmek. Ölçek çubukları 10 µm. (E, F) bilinmeyen ipliksi türlerden yüksek tuzluluk Haliç Texas kıyı sularında =. Tek hücre (siyah oklar) ve sayesinde bunun bölünen hücreler (beyaz ok uçları) görülebilir. Ölçek çubuğu panelinde E 2 µm. ölçek çubuğu panelinde F = 1 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : SEM test film tabakası ile euglenoids iki tür şeritler. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A)düşük büyütme hücrenin tamamını görüntüler. Ölçek çubuğu 5 µm. (B) yüksek büyütme arka sonu =. Ölçek çubuğu 3 µm. (C, D) = Monomorphina pseudopyrum. (C) düşük büyütme hücrenin tamamını görüntüler. Ölçek çubuğu 10 µm. (D) yüksek büyütme arka sonu =. Ölçek çubuğu 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : SEM analiz Drosophila göz fenotipik değişiklik. Kıllar sıralı dizi ve lensler sinek göz(a)normal dış görünüm için karşılaştırıldığında, toksik protein tau ifade 'kaba göz' fenotip (B) üreten photoreceptor nöronlar ölüm nedenleri. Bu ya (C) bastırmak veya (D) tau kaba göz geliştirmek genetik değiştiriciler ifade tau nörotoksisite içinde bir rol oynayabilir genlerin kanıt sağlar. Örnek yetersiz kaplama şarj, beyaz (F) veya black (G) grubu olarak resim alma sırasında görünen neden olur iken adımları kurutma sırasında yanlış tekniği (E) gözün yapısı daraltmak için yol açabilir, okla gösterildiği gibi. Ölçek çubuğu 400 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada biz SEM diğer birçok türde organizmalar veya doku özelliklerini incelemek için uygulayabileceğiniz organizmalar üç tür dış morfolojik özellikleri hakkında ayrıntılı bilgi edinmek için bir iletişim kuralı'nı nitelendirdi. Her adımda Protokolü'nün, noktalarıdır potansiyel hata ortaya çıkabilir ve aşağıda ayrıntılarıyla ele alınmıştır.

Genel olarak bu birim için sabitleştirici ve burada verilen yıkar belirli olmakla birlikte, sabitleştirici ve yıkama 5-10 x numune hacmi olmalıdır. Sorun olursa, Örneğin, fiksasyon, yıkama ve susuzlaştırma sürekli deneyimlerimiz üzerinde temel alan örneği kuruyup, her adımda dehydrating veya kurutma kez arttırmanız gerekebilir. Tek hücre örneğinizi bağlı olarak, bir oxazolidin fiksasyon ve osmiyum tetroxide sonrası bir fiksasyonu yapmanız gerekebilir. Bir düello fiksasyon ise Siyanobakteriler prosedürünün adım sonra 1.1.2 bir eşit miktarda %2 ile aynı arabellek OsO4 kapak ve tek hücre yordamı 1.2.2 adımından devam edin. Burada gösterilmeyen işten Drosophila ya doğrudan sabitleştirici aşağıdaki anesthetization yerleştirilmesi veya süresiz olarak bir microfuge tüp-20 ° C'de dondurulmuş ve bitmiş hiçbir fark ile daha sonra bir anda sabitleştirici yerleştirilmiş olduğunu bulduk görüntü kalitesi.

Yıkama ve susuzlaştırma adımları sırasında yavaş yavaş ve ünlü bir konsantrasyon atlama olmadan kademeli etanol serisi ile taşımak için zorunludur. Örnekleri çok çabuk susuz, temel yapısal bileşenler doku olumsuz etkileri ve numune buruşmak kalmamak veya daraltın. Doku Daralt örneği Şekil 4Eiçinde gösterilir. Buna ek olarak, topaklanma ve morfolojik özellikleri düzleştirme gibi eserler getirilmesi önlemek için bu örnek arasındaki adımları dehydration sırasında karşılamak için yeterli etanol bırakmak için kritik ve kurutma olduğunu.

Filtrasyon teçhizat kullanırken, bir damla su temel filtre yerinde montaj zaman kalacak. Ayrıca, filtre parlak tarafı yukarı ile yer almalıdır ve tüm sıvılar yavaşça, süzgeç ile örnek temizlemekten önlemek için bakım için dikkatli olmak eklenmelidir. Her ne kadar biz eşit kalitede olması için HMDS veya TBA kullanarak kurutma sonuçlarını bulduk, TBA kullanmanızı öneririz: HMDS ve TBA yanıcı, TBA yaklaşık üçte maliyet ve daha az toksik HMDS daha iken.

Montaj sırasında zaman örneğinizi kolayca (gömülü) boya kaplı olabilir gibi uygularken dikkatli Gümüş iletken yapıştırıcı (Ayrıca denilen gümüş boya), kullanarak, böylece ince detaylar morfoloji engellemeyecek. Sputter kaplama kez örneğiniz göre değişebilir ve burada verilen değerler deneyimlerimiz üzerinde temel alır. Yetersiz sputter kaplama bir potansiyel negatif sonucu şarj, adı verilen bir olgu olduğunu sık sık son görüntüde beyaz ya da siyah çizgi (bazen bir flaş) olarak göründüğü (örnekler için bkz: Şekil 4F ve G ). Gözlenen şarj miktarı çok az ise, hızlanan voltaj düşürücü gibi çeşitli mikroskop parametreleri ayarlayarak etkilerini azaltmak veya kondenser mercek gücü artan ve/veya daha küçük bir kullanarak geçerli ışınlamak mümkün olabilir objektif diyafram. Bazı SEM'ler Ayrıca backscatter dedektörleri veya çevre ikincil elektron dedektörleri, tüm bunların azaltmak veya en az etkilerini ortadan kaldırmak için ayarlanabilir ile donatılmış olabilir ancak çoğu SEM biyolojik örnekler için kullanılan ikincil elektron dedektörleri, var şarj. Eğer şarj etkileri daha belirgin, zavallı topraklama örnek olduğunu büyük olasılıkla ya da çok az şaplatın ikincil elektronlar numune içinde oluşturmak ve kendiliğinden yayımlanması şarj edilmiş elektron neden, üretim üretmek için kaplama satın alma sırasında bozulma görüntü. Belirgin şarj en sık daha kalın bir kaplama ya da daha iyi gümüş boya ile topraklama ile giderilmiştir. Hem çok fazla ve çok az sputter kaplama görüntü kalitesini olumsuz etkileyebilir çünkü zaman değişkenlerini ayarlayarak uygulanan kaplama miktarı optimize etmek en iyisidir (10-180 s) ve bir optim ulaşmak için sputter coater (70-150 mTorr) baskısı Al kaplama. Kaplama için örnek bir kez uygulanan kaldırılamaz, bir test çalışması ile tek bir örnek tüm örnekleri kaplama önce önerilir.

SEM parametreleri (kV) gerilim hızlandırılması gibi mevcut (PC) araştırma ve çalışma mesafesi (WD) en iyi görüntü almak mümkün, burada verilen ayarları başlangıç parametreleri bizim deneyime dayalı önerilen olarak ayarlanması gerekir. Örnek kalitesini hazırlık aşamasında alınan bakım bağımlı olmakla birlikte, son görüntü kalitesini deneyim ve beceri SEM işleç dayanır. Böylece, biz tavsiye bir SEM teknisyen ile çalışma veya kendi SEM becerileri geliştirme zaman harcama. Tüm bu raporda gösterilen verileri (numune hazırlama ve görüntüleme dahil) de programda biyoloji mikroskobu CMU, rehberlik öğretim üyeleri ve bizim mikroskobu teknisyen lisans öğrencileri tarafından oluşturulan.

Burada açıklanan protokoller zararlı kimyasalların kullanımı dahil ve uygun güvenlik önlemleri her zaman kullanıcıları, özellikle bu kimyasalların işleme öğrencileri korumak için dikkat edilmelidir. İletişim kurallarını belirtmek her kimya üzerine ilk kullanımı ile ilişkili güvenlik endişeleri olsa da, kullanıcılar her zaman gerekir: (1) kimyasal duman başlığı kullan, (2) bir acil durum göz yıkama ve emanet duş erişiminiz, kullanın (3) uygun kişisel koruyucu ekipman dahil nitril eldiven, önlük ve koruma ve (4) yazılı güvenlik prosedürleri içine alan-in işlemleri, özel kullanım alanları, bulacağımı biliyorum göz yordamlar, dekontaminasyon yordamlar, dökülme ve elden çıkarma yordamları atık.

Sonuç olarak, bu organizmaların nasıl dış yüzeylerinin her üç boyutlu topografya hakkında bilgi gruplandırma veya değiştirici filogenetik analizi için yararlıdır göstermektedir. Siyanobakteriler, SEM belirlenen özellikleri ışık mikroskobu, TEM, ek verileri ile birlikte kullanılabilir ve Moleküler çalışmalar tanımlamak için karakterize ve Siyanobakteriler adı. Euglenoids, sayısı, genişlik, düzenleme (helisel ya da düz) ve süsleme için varsa, film tabakası şeritler diğer morfolojik verilerle kullanılabilir ve tanımlamak için gerekli moleküler veri karakterize ve isim euglenoids. Ayrıca, diğer türlü tek hücreli alg ve protozoa ya da mikro-omurgasızlar hazırlanmış olabilir ve benzer bir şekilde kamçı, yapısı, dış süsleme veya ayrıntılarını besleme gibi dış morfolojik özellikleri belirlemek için muayene ekleri mikro-omurgasızlar durumunda. Son olarak, SEM hastalığı patoloji genetik değiştiriciler karakterize etmek için geniş uygulamalar modeli sistemi Drosophila, göz gibi morfolojik ayrıntılarını incelemek için vardır. Burada açıklanan protokoller karmaşıklığı ile ilgili çok çeşitli organizmalar kullanmak, henüz tüm birçok farklı subdisciplines kapsayan bilimsel keşif için önemlidir yararlı morfolojik bilgi toplamak için SEM analiz için mükellef bulunmaktadır Biyoloji.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser MLS ve bir yaz bilim adamı Ödülü için bir hibe MAK için Office araştırma ve Central Michigan Üniversitesi'nde yüksek lisans çalışmaları finanse edildi. Siyanobakteriler kıyı çalışmaları, Texas A & M Üniversitesi'nde Corpus Christi için Zimba ve plankton lab, merkezi parçası tarafından temin edildi. Euglenoids Triemer lab, Michigan State University tarafından temin edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

Biyoloji sayı 143 Tarama elektron mikroskobu (SEM) Siyanobakteriler euglenoid meyve sineği Drosophila kritik noktası (GBM) kurutma hexamethyldisilazane (HMDS) t-butil alkol (TBA)
Elektron mikroskobu (SEM) tarama morfolojik analiz için kimyasal kurutma kullanarak prokaryotik ve ökaryotik organizmaların hazırlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter