Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

ניתוח SEM הוא שיטה יעילה כדי לסייע לזן או פנוטיפי אפליה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לבחינת המסוימות מורפולוגי של שלושה סוגי האורגניזמים נציג ויהיה בהרחבה החלים על בחינת תכונות של רבים organismal סוגי רקמות.

Abstract

סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) היא הנפוצה טכניקה שהוחלו ללמוד דגימות ביולוגיות ועד חלבונים בודדים תאים, רקמות, organelles, אורגניזם שלם אפילו. פרוטוקול זה מתמקד שתי שיטות הייבוש כימי, hexamethyldisilazane (HMDS) ו- t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך), ויישומם הדמיה של אורגניזמים הן prokaryotic והן האיקריוטים תוך שימוש ב- SEM. במאמר זה, אנו נתאר כיצד לתקן, מייבשים, יבש, הר, להתיז את המעיל, וקונטה תמונה שלושה סוגים של אורגניזמים: כחוליות (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ו sp. לא ידוע), euglenoids שני סוג Monomorphina (Aenigmatica מ' ומ pseudopyrum), ואת זבוב הפירות (דרוזופילה melanogaster). המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר שיטה פשוטה, זולה ומהירה כדי לקבל מידע מפורט על מבנה, גודל, שטח מאפייני דגימות יכול להחיל בהרחבה על מגוון רחב של אורגניזמים עבור מורפולוגי הערכה. סיומו המוצלח של פרוטוקול זה יאפשר לאחרים להשתמש SEM להמחיש דוגמאות על-ידי החלת טכניקות אלה במערכת שלהם.

Introduction

מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM) משתמשת ממוקדת קרן אלקטרונים אנרגיה גבוהה כדי ליצור תמונה של אלקטרונים משני המציג את הטופוגרפיה של מדגם1ומורפולוגיה. SEM יכול לשמש לקביעת ישירות מהגודל הפיזי של מדגם, מבנה השטח, ואת צורה תלת-ממדית, מציע רזולוציה גדולה יותר, גדול יותר עומק שדה לעומת מיקרוסקופ אור. צורה נוספת של מיקרוסקופ אלקטרונים (EM), במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משתמש ממוקד אלקטרונים שעוברים הדגימה, יצירת תמונות עם פרטים עדינים של המבנה הפנימי. בעוד TEM יש רזולוציה גבוהה יותר מאשר אור או SEM והוא יכול לשמש כדי לפתור מבנים קטן כמו אטומים בודדים, יש שלושה יתרונות: הכנת הדוגמא נרחב השדה מבט קטן, לעומק רדוד של שדה2,3. למרות השני דמיינו פרוטוקולים קיימים באמצעות SEM לבחון ספציפית תאים, organelles או רקמות4,5,6,7,8,9, 10 , פרוטוקול זה הוא ייחודי בכך אנו מתארים שיטות שבהן ניתן להחיל באופן כללי על מגוון רחב של אורגניזמים להערכת מורפולוגי.

SEM מצא יישומים נרחב לבחינת חומרים אנאורגניים כולל חלקיקים11,12, פולימרים13ויישומים רבים מדעי גיאולוגי, התעשייתי גשמי14, 15,16. בביולוגיה, SEM שימש זמן כשיטה לבדיקת דגימות ביולוגיות ועד חלבונים בודדים כל האורגניזמים17,18. SEM הוא בעל ערך מסוים כי מורפולוגי פרטים פני השטח יכול לשמש כדי ליידע את תגלית מדעית. ניתוח SEM הוא שיטה פשוטה, זולה ומהירה כדי לקבל מידע מפורט על מבנה, גודל, מאפייני השטח של מגוון רחב של דגימות ביולוגיות.

כי SEM בדרך כלל פועל תחת ואקום גבוה (10-6 טנדר של גוה של מינימום) כדי לתמוך קוהרנטי קרן אלקטרונים במהירות גבוהה, אין נוזלים (מים, שמנים, כהלים) מותר בבית הבליעה הדגימה, כמו נוזלים למנוע ואקום ויוצרים. לפיכך, כל הדגימות שנבדקו באמצעות SEM חייב להיות מיובש, בדרך כלל באמצעות סדרה מדורגת אתנול ואחריו תהליך הייבוש כדי להסיר האתנול. ישנן מספר שיטות של ייבוש רקמות ביולוגיות לשימוש ב- SEM, לרבות ייבוש האויר, lyophilization, שימוש של המכשיר (שיקגו) ייבוש נקודה קריטית או כימי ייבוש באמצעות t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך) או hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. לרוב, בחירה של שיטת הייבוש הוא אמפירי מאז כל דגימה ביולוגית עשוי להגיב באופן שונה על כל שיטת הייבוש. עבור כל דגימה נתון, כל שיטות אלו עשוי להיות מתאים, אז השוואה בין היתרונות והחסרונות של כל אחד הוא שימושי בחירת השיטה המתאימה.

בעוד אוויר ייבוש מדגם בטמפרטורת החדר או בתנור ייבוש (60 ° C) היא השיטה הפשוטה ביותר, רוב דגימות ביולוגיות הראה יבוש-induced נזק כגון מצמקים, לכווץ, והתוצאה היא עיוות של הדגימה. התהליך של lyophilization גם מסיר מים (או קרח) מדגם, אבל דורש דוגמאות להיות קפואה והניח תחת ואקום להסיר את הקרח באמצעות תהליך סובלימציה, ולהערך המדגם. בנוסף, המשתמש חייב להיות גישה איזה שהוא לופילייזר. השיטה הנפוצה ביותר עבור dehydrating דוגמאות עבור SEM הוא נקודה קריטית ייבוש (שיקגו). האתנול במדגם רופאות, מוחלף עם נוזלי דו תחמוצת הפחמן (CO2), ותחת טמפרטורה מסוימת ומצבי לחץ ידוע בתור נקודה קריטית (31.1 מעלות צלזיוס ו 1,073 psi), CO2 מאדה מבלי ליצור מתח, ובכך ביעילות שמירה על התכונות מבנים מורפולוגיים של המדגם. בעוד רופאות הוא בדרך כלל השיטה הרגילה, יש מספר חסרונות. ראשית, התהליך מחייב גישה נקודה קריטית מייבש, אשר הוא לא רק יקר, אבל גם מחייבת שימוש נוזלי פחמן דו-חמצני. שנית, גודל המדגם כי ניתן לייבש מוגבל לגודל החדר של הנקודה הקריטית מייבש. שלישית, חילופי נוזלים במהלך רופאות יכולות לגרום מערבולת אשר יכולים לגרום נזק המדגם.

ייבוש כימי יתרונות רבים על שיקגו ומשמש חלופה הופכת נפוצה בעוד SEM הכנת הדוגמא. שימוש dehydrants כימיים כגון יפורסם HMDS מציע אלטרנטיבה מהירה, זולה ופשוטה בשיטות אחרות, תוך שמירה על שלמות המבנה של המדגם. לאחרונה הראינו כי לא היה הבדל באינטגריטי של הרקמה או את איכות התמונה הסופית שנתפסו בעת שימוש רופאות או יפורסם כשיטת ייבוש דרוזופילה למבוגרים רקמת רשתית23. בניגוד רופאות, יפורסם בהמשך, HMDS אינם מצריכים מכשיר ייבוש או נוזלי CO2 , אין הגבלה על הגודל המדגם להיות מיובשים. בנוסף לקבלת הכימיקלים, נדרשים רק הוד fume כימי סטנדרטי, ציוד מגן אישי המתאים (כפפות, חלוק המעבדה ו בטיחות משקפי מגן) כדי להשלים את תהליך הייבוש. בעוד יפורסם והן HMDS דליק, יפורסם הוא פחות רעילים פחות יקר (כ- 1/3 העלות של HMDS) מאשר HMDS.

במאמר זה, אנו נתאר כיצד לתקן, מייבשים, יבש, הר, להתיז את המעיל, וקונטה תמונה שלושה סוגים של אורגניזמים: כחוליות (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp. ו sp. לא ידוע), euglenoids שני סוג Monomorphina (Aenigmatica מ' ומ pseudopyrum), ואת זבוב הפירות (דרוזופילה melanogaster). אורגניזמים אלה מייצגים מגוון רחב של גודל (0.5 מיקרומטר עד 4 מ מ) והמגוון הסלולר (חד-תא ל multicellular), אך כל נתונות בקלות ניתוח SEM עם וריאציות קטנות רק לצורך הכנה הדגימה. פרוטוקול זה מתאר את השיטות לשימוש התייבשות כימי וניתוח SEM לבחון פרטים מורפולוגי של שלושה סוגים של אורגניזמים ויהיה בהרחבה החלים על בחינת רבים organismal סוגי רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. קיבוע והכנה

  1. להכין כחוליות.
    1. גדלים unialgal תרבויות F/2 מדיה24,25 בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס על 14:10 h אור מחזור כהה. העברת תרבות מספיק צינור microcentrifuge 1.5 mL כזה לאחר המאפשר 15 דקות להתיישב, בגדר חיידקי הוא כ- 0.05 מ ל גודל. מסיר את המדיה ואת החלף 1.5 מיליליטר מקבע (1.25% גלוטראלדהיד, 0.1 M פוספט מאגר pH 7.0) היפוך מספר פעמים ובעדינות דגירה בין לילה ב 4 º C.
    2. העבר את התאים קבוע עם פיפטה מזכוכית לתוך מעטה סינון 10 מ"ל (איור 1) המכילים מסנן 25 מ מ פוליקרבונט עם נקבוביות מיקרומטר 0.8 או 0.2, בהתאם לגודל של התאים. לאטום את היד בצד, משפך עם stoppers גומי כדי להכיל את התרבות בתוך המשפך. הסר את מקבע על ידי ואקום עדין על הבקבוק סינון, לאחר הסרת שני פקקים.
      הערה: אם צפיפות תא מסנן פוליקרבונט אינה אופטימלית, להתאים את כמות החל תרבות בשימוש.
  2. להכין אצות תא בודד (euglenoids).
    1. לגדול unialgal תרבויות מדיה AF-626 עם 150 מ L-1 בינוני זמין מסחרית קרקע מים נוסף לתקשורת, בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס על 14:10 h אור מחזור כהה. העברת 2 מ של צפיפות נמוכה (כמנת600 < 0.5) תרבות עם פיפטה מזכוכית לתוך מעטה סינון 10 מ"ל (איור 1) המכיל מסנן 25 מ מ פוליקרבונט עם 8 מיקרומטר נקבוביות. לאטום את היד בצד, משפך עם stoppers גומי כדי להכיל את התרבות בתוך המשפך.
      הערה: אם צפיפות תא מסנן פוליקרבונט אינה אופטימלית, להתאים את כמות החל תרבות בשימוש.
    2. להוסיף 3 טיפות של 4% אוסמיום ארבע-חמצני (OsO4) ישירות אל התרבות, מאפשרים דגירה במשך 30 דקות להסיר את מקבע על ידי ואקום עדין על הבקבוק סינון, לאחר הסרת שני פקקים.
      הערה: OsO4 הוא הרעלן חריפה (עורי, אוראלי, שאיפת מנתבת), שמשחית העור, פגיעה בעיניים, sensitizer של מערכת הנשימה. צריך להיות מטופל OsO4 בשכונה fume כימי באמצעות ציוד מגן אישי המתאים כולל כפפות, חלוק המעבדה של הגנה העין.
  3. להכין דרוזופילה melanogaster (זבוב הפירות)23.
    1. עזים ומתנגד הזבוב הבוגר באמצעות 100% פחמן דו-חמצני. המקום ומורדמת מבוגרים (כ 10 עד 30 זבובים) פתיח בורג פלסטיק קטנה בקבוקון או 1.5 mL צנטריפוגה צינור.
    2. לטבול ומורדמת זבובים 1 מ"ל של מקבע (1.25% גלוטראלדהיד, 0.1 M פוספט מאגר pH 7.2) 2 h (או לילה) ב 4 º C. אם הזבובים לצוף אל פני השטח של מקבע, להוסיף כמה טיפות של 2.5% פוליאתילן טרט-octylphenyl גליקול להחליש את מתח הפנים של מקבע התרת ועלייתו של הרקמה. הסר את מקבע באמצעות pipet של זכוכית.

2. כביסה והתייבשות

  1. רוחצים את מייבשים כחוליות.
    1. רחץ המדגם קבוע 3 פעמים עם 5 מ של 0.1 M פוספט מאגר pH 7.0 בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשמור את הבקבוקון משפך הפסיקה להחזיק בכביסה. הסר כל כביסה על ידי ואקום עדין על הבקבוק סינון, לאחר הסרת שני פקקים.
    2. מייבשים את הדגימה תוך שמירה על טבילה רציף באמצעות סדרה מדורגת אתנול, 10 דקות באמצעי אחסון של 5 מ ל המשפך. ריכוזים אתנול מדורגת: 25%, 50%, 75%, 95% ו- 2 שינויים של 100% אתנול. לשמור הבקבוקון ואת משפך הפסיקה להכיל האתנול בתוך המשפך, מניעת אובדן שני באמצעות אידוי וזרימה פסיבי דרך המסנן.
    3. הסר אתנול על ידי ואקום עדין על הבקבוק סינון, לאחר הסרת שני פקקים. העברה המדגם/המסנן אלומיניום חד פעמיות שקילה מאכל המכיל אתנול 100% פשוט מספיק כדי לכסות את המדגם לפני ייבוש.
  2. רוחצים את מייבשים אצות תא בודד (euglenoids).
    1. לשטוף את הדגימה קבוע 3 פעמים עם 5 מ ל מים יונים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לשמור את הבקבוקון משפך הפסיקה כדי להכיל את לרחוץ המשפך. הסר כל כביסה על ידי ואקום עדין על הבקבוק סינון, לאחר הסרת שני פקקים.
    2. מייבשים את הדגימה תוך שמירה על טבילה רציף באמצעות סדרה אתנול מדורגת 10 דקות באמצעי אחסון של 5 מ ל המשפך. ריכוזים אתנול מדורגת: 25%, 50%, 75%, 95% ו- 2 שינויים של 100% אתנול. לשמור הבקבוקון ואת משפך הפסיקה להכיל האתנול בתוך המשפך, מניעת אובדן שני באמצעות אידוי וזרימה פסיבי דרך המסנן.
    3. הסר האתנול על ידי ואקום עדין על הבקבוק סינון, לאחר הסרת שני פקקים. העברה המדגם/המסנן אלומיניום חד פעמיות שקילה מאכל המכיל אתנול 100% פשוט מספיק כדי לכסות את המדגם לפני ייבוש.
  3. רוחצים את מייבשים דרוזופילה melanogaster (זבוב הפירות).
    1. לשטוף את הדגימה קבוע 3 פעמים עם 1 מ"ל של 0.1 M פוספט מאגר pH 7.2 בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות צינור microcentrifuge 1.5 mL. הסר כל כביסה עם פיפטה מזכוכית, נזהר שלא להסיר את הזבובים.
    2. מייבשים את הדגימה באמצעות סדרה מדורגת אתנול, 10 דקות בנפח של 1 מ"ל צינור microfuge. ריכוזי אתנול הם: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. הסר האתנול עם פיפטה מזכוכית, נזהר שלא להסיר את הזבובים.
    3. שומרים על המדגם בצינור microcentrifuge 1.5 mL עם אתנול 100% פשוט מספיק כדי לכסות את המדגם לפני ייבוש.

3. ייבוש

  1. לבצע כימי ייבוש באמצעות t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך)27.
    1. החלף את הפתרון אתנול 100% פתרון 1:1 של אתנול יפורסם בהמשך ל- 100% עבור 20 דקות להחליף פתרון 1:1 עם 100% יפורסם במשך 20 דקות חוזר פעמיים. שמור את הפתרון ב 37 ° C כך תפורסם לא להקפיא.
      הערה: יפורסם 100% יש נקודת קיפאון של 25.5 ° C; פתרון 1:1 לא יקפאו בטמפרטורת החדר. יפורסם הוא דליק, גורם לגירוי עיניים חמורות, הוא מזיק אם נשאף, עלול לגרום גירוי בדרכי הנשימה, נמנום או סחרחורת. צריך להיות מטופל יפורסם בשכונה fume כימי באמצעות ציוד מגן אישי המתאים כולל כפפות, חלוק המעבדה של הגנה העין.
    2. להעביר המדגם בתפורסם, במקרה של צינור microcentrifuge 1.5 mL, אלומיניום חד פעמיות במשקל של המנה. פעם בצלחת במשקל אלומיניום, להסיר יפורסם והחלף יפורסם 100% טריים מספיק כדי לכסות את הדגימה. להקפיא את יפורסם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. העברה desiccator ואקום (הצנצנת בל) עם ג'ל קפוא חבילות לשמור יפורסם קפוא. לפנות ולתחזק ואקום עם משאבה רוטרי כדי לאפשר את הדגימה כדי לייבש על ידי ואקום סובלימציה של יפורסם קפוא במשך לפחות 3 שעות או למשך הלילה.
  2. לבצע כימי ייבוש באמצעות hexamethyldisilazane (HMDS)20.
    1. להחליף את הפתרון אתנול 100% עם פתרון 1:2 של HMDS ו 100% אתנול במשך 20 דקות להחליף את פתרון 1:2 עם פתרון 2:1 של HMDS 100% אתנול במשך 20 דקות להחליף את ה-2:1 פתרון עם 100% HMDS עבור 20 דקות חוזר פעם אחת.
      הערה: HMDS הוא דליק, של הרעלן חריפה (כביש עורי). HMDS צריך להיות מטופל בשכונה fume כימי באמצעות ציוד מגן אישי המתאים כולל כפפות, חלוק המעבדה של הגנה העין.
    2. להעביר את מדגם HMDS, במקרה של צינור microcentrifuge 1.5 mL, לתוך אלומיניום חד פעמיות במשקל של המנה. ברגע האלומיניום שקילה צלחת, החלף את 100% HMDS עם 100% טריים מספיק HMDS כדי לכסות את הדגימה.
    3. להעביר את הדגימה desiccator-ואקום פלסטיק או זכוכית עם סופג לחות טריים (5-6 ס מ עמוקה) ולמקם לתוך בשכונה fume כימי. לחלופין, מקום המדגם ישירות ברדס fume כימית יבש עם מכסה רופף, כגון תיבת, כדי למנוע פסולת נופל על המדגם. לאפשר את הדגימה לייבוש על 12 עד 24 שעות.

4. הרכבה

  1. הר כחוליות, euglenoids.
    1. תווית בתחתית או 12 או 25-מ מ אלומיניום הרכבה stub כדי לציין מה הוא הושם על העליונה. לחתוך את המסנן פוליקרבונט עם התאים יבשים לרבעים עם גילוח נקי או אזמל אם באמצעות קצרמר 12 מ"מ, או למקם את המסנן, אם באמצעות קצרמר 25 מ מ.
    2. במקום כל מסנן על דבק או פחמן טאב דבק מאובטחת לחלק העליון של קצרמר.
  2. הר דרוזופילה melanogaster (זבוב הפירות).
    1. תווית בתחתית לספח הרכבה אלומיניום כדי לציין מה הוא הושם על העליונה.
      מקם את הזבובים מיובשים במיקום הרצוי בכרטיסיה דבק או פחמן דבק מאובטחת לחלק העליון של קצרמר תחת מיקרוסקופ ויבתר עם פינצטה דיוק.
    2. החל דבק מוליך כסף, קרי, כסף צבע, סביב הקצוות החיצוניים של הספחים. להתחבר לצבע כסף זבובים באמצעות קיסם כדי להבטיח מוליכות. אל תאפשר את הצבע לגעת באזור הדמיה הרצוי.
    3. למקם את הספחים בקופסה מחזיק stub ולמקם את ספח פתוח בעל תיבת desiccator. לאפשר לצבע כסף לייבש לפחות 3 שעות או למשך הלילה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

5. להתיז ציפוי

  1. הכן את המנגנון ציפוי לרעוד. להוציא על ידי ביצוע ארבעה או חמישה ריקונים של גז ארגון. אם הלחות גבוהה (קרי, האוויר חדר מרגיש לחות, בדר כ 50% לחות יחסית), לבצע ריקונים שש-שבע. להתיז את המעיל הספחים ההוראות של היצרן.
  2. דוגמאות המעיל בהתבסס על דגימות בשימוש:
    1. למסננים עם כחוליות, לכוון את הטיימר כדי להתיז את המעיל ישר s 180 על.
    2. למסננים עם אצה איקריוטית, קרי, euglenoids, לכוון את הטיימר כדי להתיז את המעיל 120 s ישר, ואז 20 s משלושה צדדים בזווית של 45 °.
    3. עבור מדגמים גדולים, קרי, לטוס ראשים, לכוון את הטיימר כדי להתיז את המעיל 60 s ישר ולאחר מכן 30 s בכל צד בזווית של 45 °.
      הערה: לאחר השלמת ציפוי, ספחי צריך להיות בצבע אפור בהיר.

6. הדמיה

  1. דגימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה הכוללת גלאי משני אלקטרונים (SE).
    1. עבור כחוליות, להחיל את ההגדרות הבאות: 3-5 kV מאיץ מתח (AC) 20-30 המכשיר הנוכחי (PC), ומרחק עבודה 5 מ מ (WD). לשימוש euglenoids, 3 kV AC, 30 PC, ו- 5 מ מ WD. לזבובים, השתמש 5 kV AC, 30 PC, ו- 5-10 מ מ WD.
  2. להתאים את ההגדלה בהתאם לגודל של פרט או של אובייקט כדי ניתן לאבחן. התאם את stigmators, פתחים, ולהתרכז עד תמונה ברורה מופק. ללכוד את התמונה באמצעות הגדרות של רזולוציה גבוהה על פי הוראות היצרן ב- SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כחוליות הם קבוצה prokaryotic של אורגניזמים החיים הם קריטיים אל פחמן גלובל, חמצן, חנקן מחזורים28,29. המינים 6000 המשוערת של כחוליות30, וברובם יש נדן mucilaginous לכסות, לחבר את התאים ותוקנו מבנים אחרים31, אשר יחד עם הצורה, יכול להיות ברמה המיקרוסקופית32. גודל תא, צורה, פיגמנטים נוכח להבחין בין מינים נפרדים, ניתן לאבחן בבתי גידול מימיים, כמו cyanobacterial "פורח"28. הסיווג cyanobacterial המודרני משלב תכונות מורפולוגיות כל אפשרי באמצעות מיקרוסקופ אור, TEM, SEM, כמו גם הנתונים המולקולריים33. בדומה נדן mucilage של כחוליות, קרומית רצועות euglenoid סיוע מין טקסונומי ונחישות. Euglenoids הימית flagellates שקיימים הרבה מאוד גיוון מורפולוגיים והתנהגותיים, ניתוח SEM הוכיח שימושי בסיווג מינים נפרדים. באופן ספציפי, euglenoids בעלי מבנים הרומן מתחת שלהם קרום פלזמה מורכבים במקביל רצועות proteinaceous ו- microtubules, שנקרא קרומית34,35,36. המספר, סידור וגודל של רצועות קרומית קריטי comparators מורפולוגי, יחד עם נתונים פילוגנטי מולקולרי, משמשים כדי לבנות את טקסונומי על Euglenozoa37.

השלב הראשון בהכנת כחוליות והן euglenoids דורש סינון של האורגניזמים מדיום הגידול שלהם, מושגת על ידי הרכבת מעטה סינון (איור 1 א'). השאיפה משמש יעבור את מסנן פוליקרבונט, עוזב את האורגניזמים על פני השטח של המסנן של המדיום. יש לבחור את גודל הנקבוביות של המסנן פוליקרבונט כך האורגניזמים שלם לא יעברו (להשוות איור 1B וג 1). איור 2 מציג תוצאות נציג שלושה סוגים שונים של כחוליות. שניים מים מתוקים, אחת היא ימית. פרטים של התא, לרבות צורה ומרקם פני השטח הם גלוי, כמו גם נדן mucilage או הקרנות את התאים. איור 3 מדגים איך SEM משמש כדי להמחיש את רצועות קרומית של שני מינים שונים euglenoid. הסידור הסליל של קרומית רצועות מיזוג זה בקצה האחורי כדי ליצור מכשיר הזנב האמיניות ונחישות בעת השוואה בין Monomorphina aenigmatica (איור 3A ו- 3B) עם Monomorphina pseudopyrum ( איור 3C ותלת מימד).

בנוסף מאפיינים מורפולוגיים לזהות מינים, המורפולוגיה החיצונית של מודל אורגניזמים כגון דרוזופילה melanogaster יכול לשמש לזיהוי גנטי מכפילי באמצעות הנוירונים photoreceptors המרכיבים את התרכובת דרוזופילה עין38. מאז העין היא רקמה שאינם חיוניים בזבובים, זה אפשרי לבטא חלבונים רעילים בתוך תאים ברשתית ולהשתמש SEM לבחון שינויים מורפולוגיים כי ההנדסה הגנטית יש על העין. עיניים רגיל לטוס מאופיינים על ידי מערך מסודר של זיפים, עדשות (איור 4A), אולם ביטוי של חלבונים הקשורים עם מחלת אלצהיימר ליצור מה שנקרא את 'עין קשה' פנוטיפ (איור 4B). הגנים לדכא (איור 4C) או לשפר (איור 4D) פנוטיפ עין קשה עשוי לשחק תפקיד פיזיולוגי התקדמות המחלה ויש פוטנציאל סמים מיקוד39. גם המוצג באיור 4 דוגמאות מוקשים פוטנציאליים להימנע כולל דוגמה של המבנה התמוטט של העין בין טכניקת ייבוש פסולים (איור 4E) אלקטרון טעינה של ציפוי לרעוד. לא מספיק להוציא המופיע במהלך ייבוא תמונות (איור 4F ו- 4g).

Figure 1
איור 1 : ייצוג סכמטי של האסדה סינון ו- SEM של מסנן פוליקרבונט. (א) מכשיר זה משמש כדי להפריד קטן או יחיד באורגניזמים כגון כחוליות euglenoids מן מדיום הגידול שלהם. יישום של שואב אבק על הזרוע בצד של הבקבוק ימשוך את התוכן של המשפך דרך המסנן פוליקרבונט, לתוך הבסיס של הבקבוק סינון, עוזב את האורגניזמים על פני השטח של המסנן. מסנן (B) SEM של נקבובית מיקרומטר 0.8 אין לדוגמה כדוגמה אבד בשל הנזק. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (ג) SEM של מסנן נקבובית 0.8 מיקרומטר עם כחוליות הנוכחי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : SEM micrograph של כחוליות. (A, B) Toxifilum mysidocida, filamentous מים מתוקים זן מקולורדו עם נדן גלוי של mucilage (ז). גודל ברים = 5 מיקרומטר. (C, D) של מים מתוקים Golenkina sp. מאוהיו. הפרט תאים לפעמים מושבות טופס מחוזק ע י שכבה דקה של mucilage (ז). הלהט כמו בליטות (החצים הלבנים) להאריך תאים נפרדים. גודל ברים = 10 מיקרומטר. (E, F) לא ידוע filamentous מינים של שפך נהר מליחות גבוהה במים לאורך החוף טקסס. תא בודד (חיצים שחורים) ותאים החלוקה (חץ לבן) גלויים. בר קנה המידה בחלונית E = 2 מיקרומטר. סולם בר בחלונית F = 1 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : SEM micrograph של קרומית רצועות של שני מינים של euglenoids. (A, B) Monomorphina aenigmatica. (א) תמונות הגדלה נמוכה של התא כולו. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. (B) בהגדלה של הסוף האחורי. סרגל קנה מידה = 3 מיקרומטר. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (ג) תמונות הגדלה נמוכה של התא כולו. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) בהגדלה של הסוף האחורי. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : SEM ניתוח של השינוי פנוטיפי של העין דרוזופילה . לעומת המראה חיצוני רגיל של המערך המסודרת של זיפים, עדשות של העין לעוף (A), ביטוי של טאו חלבון רעיל גרם למוות של הנוירונים קולט אור, יוצר את 'עין קשה' פנוטיפ (B). הביטוי ממגבילי גנטי לדכא (C) או לשפר (D) העין קשה טאו מספק ראיות של גנים אשר עשוי לשחק תפקיד neurotoxicity טאו. טכניקה לא תקין במהלך הייבוש צעדים יכול להוביל לקריסת המבנה של העין (E) בעוד ציפוי לא מספיקות המדגם יגרום טעינה, המופיע כלבן (F) או שחור (G) הלהקה במהלך ייבוא תמונות, כפי שמוצג על ידי החץ. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנחנו תיאר פרוטוקול באמצעות SEM כדי להשיג מידע מפורט אודות מאפיינים מורפולוגיים חיצוני של שלושה סוגים של אורגניזמים אחרים יכולים להחיל לבחון תכונות של סוגים רבים של אורגניזמים או רקמות. בתוך כל שלב של הפרוטוקול, יש נקודות פוטנציאליות של השגיאה שעלולים להתעורר, הם דנו בפירוט בהמשך.

בעוד אמצעי האחסון מקבע, שוטף הנקובים להלן הם ספציפיים, באופן כללי מקבע שוטף צריך להיות 5-10 x הנפח של הדגימה. כל הזמן קיבוע, כביסה, והתייבשות מבוססים על הניסיון שלנו, אם מתעוררות בעיות, למשל, מצמקים של המדגם, ייתכן שתצטרך להגדיל את הזמנים בכל שלב של dehydrating או ייבוש. בהתאם דגימת תא בודד, ייתכן שיהיה עליך לעשות אובססיה גלוטראלדהיד והן של קיבוע שאחרי אוסמיום ארבע-חמצני. אם אובססיה הדו-קרב הוא זקוק לאחר שלב 1.1.2 של ההליך כחוליות לכסות עם כמות שווה 2% OsO4 במאגר באותו והמשך משלב 1.2.2 של ההליך תא בודד. מהעבודה לא מוצג כאן, מצאנו כי דרוזופילה יכול או למקם ישירות לתוך ההרדמה הבאים לשבועיים או יכול להיות קפוא ללא הגבלת זמן ב-20 ° C צינור microfuge, ימוקם מקבע במועד מאוחר יותר עם אין הבדל סיים איכות התמונה.

במהלך השלבים כביסה והתייבשות, זה הכרחי כדי לעבור סדרת אתנול מדורגת באיטיות וללא דילוג על ריכוז ציין. אם הדגימות הן להתייבש מהר מדי, הוא משפיע לרעה את מרכיביה המבניים כבסיס ברקמה הדגימה יקבץ, לקמול, או לכווץ. דוגמה של רקמות קריסה מוצג באיור 4E. בנוסף, כדי למנוע את כניסתה של חפצים כגון clumping ושיטוח של תכונות מורפולוגיות, זה קריטי לעזוב רק אתנול מספיק כדי לכסות את הדגימה בין השלבים במהלך התייבשות וייבוש.

בעת שימוש המתקן סינון, טיפת מים על הבסיס תקיים את המסנן במקום בעת הרכבת. גם, יש להניח את המסנן הצד המבריק למעלה, כל הנוזלים להוסיף בעדינות, וישתדלו להתמודד עם המסנן עם טיפול למניעת ועקצה המדגם. אמנם מצאנו את התוצאות של ייבוש באמצעות HMDS או יפורסם להיות באיכות שווה, אנו ממליצים על שימוש יפורסם: בעוד HMDS והן יפורסם דליק, יפורסם היא כשליש עלות של פחות רעילים יותר HMDS.

במהלך הרכבה כאשר באמצעות דבק מוליך כסף (גם בשם כסף paint), היה זהיר בעת החלת כפי דגימת יכולה בקלות להיות מכוסה (קבור) הצבע, ובכך מסתיר פרטים עדינים במורפולוגיה. לרעוד. להוציא ציפוי פעמים עשויות להשתנות בהתבסס על דגימת ולאחר הערכים המופיעות כאן מבוססים על הניסיון שלנו. תוצאה אחת שלילית פוטנציאלי של ציפוי לרעוד. לא מספיק להוציא הוא תופעה שנקראת טעינה, אשר לעתים קרובות מופיע כקו לבן או שחור (לפעמים פלאש) בתמונה הסופית (ראה איור 4F ו- G דוגמאות). אם כמות טעינה שנצפה הוא מזערי, ייתכן ניתן לרכך את ההשפעות על-ידי התאמת מיקרוסקופ פרמטרים שונים, כגון הפחתת המתח מאיץ או לשגר הנוכחי, הגדלת כוח העדשה מעבה, ו/או שימוש קטן מיפתח צמצם אובייקטיבית. רוב SEMs המשמש עבור דגימות ביולוגיות יש גלאי משני אלקטרונים, אולם גם עשוי להיות מצויד SEMs קצת עם גלאי backscatter או גלאים סביבתיים משני אלקטרונים, אשר יכול להיות מותאם כדי להפחית או למנוע את השפעות מינימליות טעינה. אם ההשפעות טעינה הן יותר בולט, זה סביר שאין הארקה המסכן של המדגם או מעט מדי להתיז ציפוי כדי לייצר את האלקטרונים משנית, גורם האלקטרונים טעונה לבנות הדגימה, ישוחררו באופן ספונטני, הפקת עיוות בתמונה במהלך הרכישה. טעינה בולטת מזוהה לרוב עם ציפוי עבה יותר או יותר ההארקה בצבע כסף. בגלל ציפוי לרעוד. להוציא יותר מדי וגם מעט מדי עלולה להשפיע לרעה על איכות התמונה, מומלץ מטב את כמות ציפוי על ידי התאמת המשתנים של זמן (10-180 s) ואת הלחץ (70 עד 150 mTorr) coater לרעוד. להוציא כדי להשיג את optim ציפוי באל. כמו הציפוי לא ניתן להסיר לאחר החלתם על המדגם, מבצע בדיקה מומלצת עם דוגמה אחת לפני ציפוי כל הדגימות.

SEM פרמטרים כגון האצת מתח (ב kV), בדיקה הנוכחי (PC), ומרחק עבודה (WD) חייב להיות מותאם כדי לקבל את התמונה הטובה ביותר האפשרי, כמו ההגדרות ניתנות כאן הם הציעו החל פרמטרים בהתבסס על הניסיון שלנו. בזמן איכות המדגם היא תלויה מטופל בהכנה, איכות התמונה הסופית מתבססת הניסיון והמיומנות של המפעיל SEM. לכן, מומלץ לעבוד עם טכנאי SEM או לבלות זמן פיתוח מיומנויות SEM. כל הנתונים (כולל הכנת הדוגמא והדמיה) שמוצג במאמר זה נוצר על ידי סטודנטים לתואר ראשון בתכנית ביולוגיה מיקרוסקופיה-CMU, עם הדרכה ממרצים הטכנאי שלנו מיקרוסקופ.

הפרוטוקולים המתוארים כאן כוללים את השימוש של כימיקלים מזיקים, תמיד צריכה להיות העיר את אמצעי הבטיחות המתאימים כדי להגן על המשתמשים, במיוחד סטודנטים אשר עשוי להיות טיפול כימיקלים אלה. בעוד הפרוטוקולים לציין חששות בטיחות הקשורים לכל כימית בעת השימוש הראשון, המשתמשים צריכים תמיד: (1) השתמש ברדס fume כימי, (2) יש גישה מקלחת לשטוף ובטיחות העין חירום, (3) להשתמש כולל ציוד מגן אישי המתאים nitrile כפפות, חלוק המעבדה ואת העין הגנה, ו- (4) יודע איפה למצוא נהלי בטיחות בכתב כולל ניהול ההליכים, המיועד להשתמש באזורים, לשפוך נהלים, תהליכי טיהור, ופסולת סילוק הליכים.

לסיכום, אורגניזמים אלה ממחישים כיצד מידע על הטופוגרפיה תלת מימדי של משטחים חיצוניים של כל אחד הוא שימושי עבור ניתוח פילוגנטי קיבוץ או צירוף. עבור כחוליות, תכונות מחילופי SEM יכול לשמש בשילוב עם נתונים נוספים של מיקרוסקופ אור, TEM, במחקרים מולקולריים כדי לזהות, לאפיין, ותנו שם את כחוליות. עבור euglenoids, מספר, רוחב, סידור (הסליל או ישר), עיטור, אם קיימת, של קרומית רצועות ניתן להשתמש עם נתונים מורפולוגיים אחרים, ואם הנתונים המולקולריים הכרחי, כדי לזהות, לאפיין, ותנו שם euglenoids. יתר על כן, סוגים אחרים של אצות חד תאיות, protozoans או מיקרו-חסרי חוליות יכול להיות מוכן ובחן באופן דומה כדי לקבוע תכונות מורפולוגית חיצוני כגון שוטון, האכלה מבנה, קישוט חיצוני או בפרטי תוספות במקרה של מיקרו-חסרי חוליות. לבסוף, SEM יש יישומים רבים לבחינת פרטים מורפולוגי, כגון העין של מערכת מודל דרוזופילה, לאפיון גנטי מודיפיקטורי המחלה פתולוגיה. הפרוטוקולים המתוארים כאן לנצל את המיקרואורגניזמים להשתנות במידה רבה ביחס המורכבות, עדיין כל נתונות SEM ניתוח כדי לאסוף מידע מורפולוגי שימושי זה הוא קריטי עבור תגלית מדעית פורש subdisciplines שונים רבים של ביולוגיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו מומן על ידי מענק ה-MLS, פרס מלומד הקיץ יגיעו למשרד של מחקר, לימודים לתואר שני ושלישי באוניברסיטת מישיגן סנטרל. כחוליות סופקו על ידי Zimba, המעבדה פלנקטון, חלק ממרכז ה עבור מחקרים לאורך החוף, טקסס A & M באוניברסיטת קורפוס קריסטי. Euglenoids סופקו על ידי המעבדה Triemer, אוניברסיטת מדינת מישיגן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

ביולוגיה גיליון 143 סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) כחוליות euglenoid זבוב הפירות דרוזופילה נקודה קריטית ייבוש (שיקגו) hexamethyldisilazane (HMDS) t-בוטיל אלכוהול (יפורסם בהמשך)
הכנה של אורגניזמים Prokaryotic ו האיקריוטים באמצעות ייבוש כימיים עבור ניתוח מורפולוגי סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter