Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) में रूपात्मक विश्लेषण के लिए रासायनिक सुखाने का उपयोग Prokaryotic और Eukaryotic जीवों की तैयारी

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58761
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, Central Michigan University

Summary

SEM विश्लेषण प्रजातियों की पहचान या phenotypic भेदभाव में सहायता करने के लिए एक प्रभावी तरीका है । इस प्रोटोकॉल के तीन प्रतिनिधि प्रकार के जीवों के विशिष्ट रूपात्मक विवरण की जांच करने के लिए विधियों का वर्णन करता है और मोटे तौर पर कई जीवों और ऊतक प्रकार की सुविधाओं की जांच करने के लिए लागू किया जाएगा ।

Abstract

स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) एक व्यापक रूप से उपलब्ध तकनीक है कि व्यक्तिगत प्रोटीन से कोशिकाओं, ऊतकों, organelles, और यहां तक कि पूरे जीवों को लेकर जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है । इस प्रोटोकॉल दो रासायनिक सुखाने तरीकों पर केंद्रित है, hexamethyldisilazane (HMDS) और टी butyl शराब (टीबीए), और उनके आवेदन SEM का उपयोग कर दोनों prokaryotic और eukaryotic जीवों की इमेजिंग करने के लिए । इस अनुच्छेद में, हम कैसे तय करने के लिए, धोने, निर्जलीकरण, शुष्क, पर्वत, धूम कोट, और छवि जीवों के तीन प्रकार: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., और एक अज्ञात सपा.), जीनस euglenoids से दो Monomorphina (एम. aenigmatica और एम. pseudopyrum), और फल मक्खी (Drosophila melanogaster) । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक तेजी से, सस्ती, और सरल विधि का वर्णन करने के लिए संरचना, आकार, और नमूनों की सतह विशेषताओं है कि मोटे तौर पर रूपात्मक के लिए जीवों की एक बड़ी रेंज के लिए लागू किया जा सकता है के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त करने के लिए है मूल्यांकन. इस प्रोटोकॉल के सफल समापन दूसरों SEM उपयोग करने के लिए अपने सिस्टम के लिए इन तकनीकों को लागू करने से नमूनों कल्पना की अनुमति होगी ।

Introduction

एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) उच्च ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों की एक केंद्रित बीम का उपयोग करता है माध्यमिक इलेक्ट्रॉनों कि आकृति विज्ञान और एक नमूना1की स्थलाकृति से पता चलता है एक छवि उत्पंन करते हैं । SEM सीधे एक नमूने के भौतिक आकार, सतह संरचना, और तीन आयामी आकार निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और अधिक से अधिक संकल्प और प्रकाश माइक्रोस्कोपी की तुलना में क्षेत्र की बड़ी गहराई प्रदान करता है । इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) का एक और रूप, संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि) का उपयोग करता है ध्यान केंद्रित इलेक्ट्रॉनों कि नमूना के माध्यम से पारित, आंतरिक संरचना के ठीक विवरण के साथ छवियों पैदा. जबकि उनि प्रकाश या SEM की तुलना में उच्च संकल्प किया है और एकल परमाणुओं के रूप में छोटे संरचनाओं को हल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह तीन प्रमुख नुकसान है: व्यापक नमूना तैयारी, देखने का एक छोटा सा क्षेत्र, और2क्षेत्र के एक उथले गहराई,3. हालांकि अंय visualized प्रोटोकॉल मौजूद SEM का उपयोग करने के लिए विशिष्ट कोशिकाओं, organelles, या ऊतकों की जांच4,5,6,7,8,9, 10 , इस प्रोटोकॉल में अद्वितीय है कि हम विधियों का वर्णन है कि मोटे तौर पर रूपात्मक आकलन के लिए जीवों की एक बड़ी रेंज के लिए लागू किया जा सकता है ।

SEM नैनोकणों11,12, पॉलिमर13सहित अकार्बनिक पदार्थों की जांच के लिए व्यापक अनुप्रयोगों पाया गया है, और भूवैज्ञानिक में कई आवेदन, औद्योगिक, और सामग्री विज्ञान14, 15,16. जीव विज्ञान में, SEM लंबे समय से पूरे जीवों17,18के लिए व्यक्तिगत प्रोटीन से लेकर जैविक नमूनों की जांच के लिए एक विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है । SEM विशेष मूल्य का है क्योंकि रूपात्मक सतह विवरण वैज्ञानिक खोज को सूचित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । SEM विश्लेषण एक तेज, सस्ता, और सरल संरचना, आकार, और जैविक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला की सतह विशेषताओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त करने के लिए विधि है ।

क्योंकि एक SEM सामांय रूप से उच्च वैक्यूम (10-6 Torr ंयूनतम के तहत संचालित) के लिए उच्च गति इलेक्ट्रॉनों के एक सुसंगत बीम का समर्थन, कोई तरल पदार्थ (पानी, तेल, शराब) नमूना कक्ष में अनुमति दी जाती है, के रूप में तरल पदार्थ बनाने से एक निर्वात को रोकने के । इस प्रकार, SEM का उपयोग कर जांच की सभी नमूनों निर्जलित होना चाहिए, आमतौर पर एक ग्रेडेड इथेनॉल एक सुखाने की प्रक्रिया के बाद इथेनॉल को दूर करने के लिए श्रृंखला का उपयोग कर । SEM में उपयोग के लिए जैविक ऊतकों सुखाने के कई तरीके हैं, हवा सुखाने सहित, lyophilization, एक महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) डिवाइस का उपयोग, या रासायनिक टी का उपयोग सुखाने-butyl शराब (टीबीए) या hexamethyldisilazane (HMDS)19, 20 , 21 , 22. सबसे अधिक बार, एक सुखाने विधि के चयन अनुभवजंय है के बाद से प्रत्येक जैविक नमूना अलग तरह से प्रत्येक सुखाने विधि प्रतिक्रिया हो सकती है । किसी भी दिए गए नमूने के लिए, इन विधियों के सभी उपयुक्त हो सकता है, इसलिए लाभ और प्रत्येक के नुकसान की तुलना उपयुक्त विधि का चयन करने में उपयोगी है ।

जबकि हवा कमरे के तापमान पर एक नमूना सुखाने या एक सुखाने ओवन (६० डिग्री सेल्सियस) में सरल तरीका है, सबसे जैविक नमूने ऐसे shriveling और पतन के रूप में सुखाने प्रेरित नुकसान दिखाने के लिए, नमूना की विकृति में जिसके परिणामस्वरूप । lyophilization की प्रक्रिया भी एक नमूना से पानी (या बर्फ) निकालता है, लेकिन नमूने की आवश्यकता है फ्लैश-जमे हुए और निर्वात के तहत रखा उत्सादन की प्रक्रिया के माध्यम से बर्फ को दूर करने के लिए, संभावित नमूना हानिकारक. इसके अलावा, उपयोगकर्ता किसी lyophilizer के लिए पहुँच होना आवश्यक है । SEM के लिए निर्जलीकरण के नमूनों के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि महत्वपूर्ण बिंदु सुखाने (सीपीडी) है । सीपीडी में, एक नमूने में इथेनॉल तरल कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है और, विशिष्ट तापमान और दबाव की स्थिति महत्वपूर्ण बिंदु (३१.१ डिग्री सेल्सियस और १,०७३ साई) के रूप में जाना के तहत, सतह तनाव पैदा करने के बिना सह2 वाष्पीकृत, जिससे प्रभावी ढंग से नमूना के रूपात्मक और संरचनात्मक सुविधाओं को बनाए रखने. जबकि सीपीडी आम तौर पर मानक विधि है, यह कई कमियां है । सबसे पहले, इस प्रक्रिया को एक महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर, जो न केवल महंगा है, लेकिन यह भी तरल कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग आवश्यक के लिए पहुंच की आवश्यकता है । दूसरा, नमूना है कि सूख जा सकता है के आकार महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर के चैंबर आकार तक ही सीमित है । तीसरा, सीपीडी के दौरान तरल पदार्थ के आदान-प्रदान अशांति है कि नमूने को नुकसान पहुंचा सकता है पैदा कर सकता है ।

रासायनिक सुखाने सीपीडी पर कई लाभ प्रदान करता है और एक उपयुक्त विकल्प है कि व्यापक रूप से SEM नमूना तैयारी में इस्तेमाल किया जा रहा है के रूप में कार्य करती है । टीबीए और HMDS जैसे रासायनिक dehydrants का उपयोग एक तेजी से, सस्ती और अंय तरीकों के लिए आसान विकल्प प्रदान करता है, जबकि अभी भी नमूने की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने । हम हाल ही में पता चला है कि वहां ऊतक या अंतिम छवि की गुणवत्ता की अखंडता में कोई फर्क नहीं था पर कब्जा कर लिया जब वयस्क Drosophila रेटिना ऊतक23में सुखाने विधि के रूप में सीपीडी या टीबीए का उपयोग कर । सीपीडी के विपरीत, टीबीए और HMDS एक सुखाने उपकरण या तरल सह2 की आवश्यकता नहीं है और वहां नमूने के आकार पर कोई सीमा नहीं है सूख सकता है । रसायनों को प्राप्त करने के अलावा, केवल एक मानक रासायनिक धुएं हूड और उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (दस्ताने, लैब कोट, और सुरक्षा चश्मे) सुखाने की प्रक्रिया को पूरा करने के लिए आवश्यक हैं । जबकि दोनों टीबीए और HMDS ज्वलनशील हैं, टीबीए कम विषाक्त और कम खर्चीला है (लगभग 1/3 HMDS की लागत) HMDS से ।

इस अनुच्छेद में, हम कैसे तय करने के लिए, धोने, निर्जलीकरण, शुष्क, पर्वत, धूम कोट, और छवि जीवों के तीन प्रकार: cyanobacteria (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., और एक अज्ञात सपा.), जीनस euglenoids से दो Monomorphina (एम. aenigmatica और एम. pseudopyrum), और फल मक्खी (Drosophila melanogaster) । इन जीवों के आकार में एक विस्तृत श्रृंखला का प्रतिनिधित्व (०.५ µm को 4 मिमी) और सेलुलर विविधता (एकल कोशिकीय के लिए प्रकोष्ठ), अभी तक सभी आसानी से केवल छोटे नमूना तैयारी के लिए आवश्यक बदलाव के साथ SEM विश्लेषण के लिए उत्तरदाई हैं । इस प्रोटोकॉल रासायनिक निर्जलीकरण और SEM विश्लेषण का उपयोग करने के लिए जीवों के तीन प्रकार के रूपात्मक विवरण की जांच करने के लिए तरीकों का वर्णन है और मोटे तौर पर कई जीवों और ऊतक प्रकार की जांच करने के लिए लागू होगा ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. तैयारी और निर्धारण

  1. तैयार cyanobacteria ।
    1. F/2 मीडिया24,25 में एक 14:10 ज प्रकाश अंधेरे चक्र पर 28 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर unialgal संस्कृतियों हो जाना । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए पर्याप्त संस्कृति हस्तांतरण ऐसे है कि 15 मिनट बसने के लिए अनुमति देने के बाद, बैक्टीरियल गोली लगभग ०.०५ मिलीलीटर आकार में है । मीडिया निकालें और निर्धारण (१.२५% glutaraldehyde, ०.१ एम फास्फेट बफर पीएच ७.०) के १.५ मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित, धीरे से कई बार पलटना, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
    2. कोशिकाओं के आकार पर निर्भर करता है, ०.८ या ०.२ µm pores के साथ एक पाली कार्बोनेट 25 मिमी फिल्टर युक्त एक 10 मिलीलीटर निस्पंदन रिग (चित्रा 1) में एक गिलास पिपेट के साथ फिक्स्ड कोशिकाओं हस्तांतरण । कीप में संस्कृति को समाहित करने के लिए रबर डाट के साथ साइड आर्म और फ़नल को सील करें. छानने की कुप्पी पर कोमल निर्वात द्वारा, दोनों डाट को हटाने के बाद निर्धारण को हटा दें ।
      नोट: यदि पाली कार्बोनेट फ़िल्टर पर सेल घनत्व इष्टतम नहीं है, का उपयोग शुरू संस्कृति की मात्रा समायोजित करें ।
  2. एकल सेल शैवाल (euglenoids) तैयार करें ।
    1. वायु सेना में बढ़ती unialgal संस्कृतियों-6 मीडिया26 १५० मिलीलीटर के साथ-1 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिट्टी पानी के माध्यम से मीडिया को जोड़ा, 22 ° c के तापमान पर एक 14:10 ज प्रकाश अंधेरे चक्र पर । एक 10 मिलीलीटर निस्पंदन रिग में एक गिलास पिपेट के साथ कम घनत्व के 2 मिलीलीटर (आयुध डिपो६०० < ०.५) संस्कृति स्थानांतरण (चित्रा 1) 8 µm pores के साथ एक पाली कार्बोनेट 25 mm फिल्टर युक्त । कीप में संस्कृति को समाहित करने के लिए रबर डाट के साथ साइड आर्म और फ़नल को सील करें.
      नोट: यदि पाली कार्बोनेट फ़िल्टर पर सेल घनत्व इष्टतम नहीं है, का उपयोग शुरू संस्कृति की मात्रा समायोजित करें ।
    2. 4% आज़मियम tetroxide (OsO4) के तीन बूंदें सीधे संस्कृति को जोड़ने और 30 मिनट के लिए मशीन की अनुमति देते हैं । छानने का कुप्पी पर कोमल वैक्यूम द्वारा निर्धारण को हटाने, दोनों डाट हटाने के बाद ।
      नोट: OsO4 एक तीव्र विष है (चमड़े का, मौखिक, और साँस लेना मार्गों), त्वचा के लिए संक्षारक, आंखों के लिए हानिकारक है, और एक श्वसन संवेदीकरण. 4 OsO एक रासायनिक धुएं दस्ताने, लैब कोट, और नेत्र सुरक्षा सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
  3. तैयार Drosophila melanogaster (फ्रूट फ्लाई)23.
    1. Anesthetize वयस्क १००% कार्बन डाइऑक्साइड का उपयोग मक्खियों । प्लेस anesthetized वयस्कों (के बारे में 10 से 30 मक्खियों) एक छोटे से प्लास्टिक पेंच टोपी की शीशी या १.५ मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में ।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे (या रात भर) के लिए निर्धारण (१.२५% glutaraldehyde, ०.१ एम फास्फेट बफर पीएच ७.२) के 1 मिलीलीटर में विसर्जित anesthetized मक्खियों । यदि मक्खियों को निर्धारण की सतह के लिए नाव, २.५% पॉलीथीन ग्लाइकोल tert-octylphenyl ईथर की कुछ बूंदें जोड़ने के लिए निर्धारण की सतह तनाव को कमजोर ऊतक के कुल डुबकी के लिए अनुमति देता है । एक गिलास प्लास्टिक का उपयोग कर निर्धारण को हटा दें ।

2. धुलाई और निर्जलीकरण

  1. धो और निर्जलीकरण cyanobacteria ।
    1. 10 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर ०.१ मीटर फास्फेट बफर पीएच ७.० के 5 मिलीलीटर के साथ निश्चित नमूना तीन बार धो लें । कुप्पी और कीप stoppered को धोकर पकड़ रखें । छानने का कुप्पी पर कोमल निर्वात द्वारा प्रत्येक धोने निकालें, दोनों डाट हटाने के बाद ।
    2. एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला का उपयोग सतत विसर्जन को बनाए रखने जबकि नमूना निर्जलीकरण, कीप में 5 मिलीलीटर की एक मात्रा में 10 मिनट के लिए । वर्गीकृत इथेनॉल सांद्रता हैं: 25%, ५०%, ७५%, ९५%, और १००% इथेनॉल के 2 परिवर्तन । कीप में इथेनॉल शामिल करने के लिए कुप्पी और कीप stoppered रखें, दोनों वाष्पीकरण और निष्क्रिय प्रवाह के माध्यम से नुकसान को रोकने के माध्यम से फिल्टर.
    3. छानने का कुप्पी पर कोमल निर्वात द्वारा इथेनॉल निकालें, दोनों डाट हटाने के बाद । एक डिस्पोजेबल एल्यूमीनियम वजन बस पर्याप्त १००% इथेनॉल युक्त पकवान सुखाने से पहले नमूने को कवर करने के लिए फ़िल्टर/
  2. धो और निर्जलीकरण एकल सेल शैवाल (euglenoids) ।
    1. निश्चित नमूना 10 मिनट प्रत्येक के लिए कमरे के तापमान पर पानी की 5 मिलीलीटर के साथ तीन बार धो लें । फ़नल में धोने को शामिल करने के लिए कुप्पी और फ़नल stoppered रखें. छानने का कुप्पी पर कोमल निर्वात द्वारा प्रत्येक धोने निकालें, दोनों डाट हटाने के बाद ।
    2. इस नमूने को बनाए रखते हुए लगातार विसर्जन के लिए एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला का उपयोग कर 10 मिनट में 5 मिलीलीटर की एक मात्रा में कीप । वर्गीकृत इथेनॉल सांद्रता हैं: 25%, ५०%, ७५%, ९५%, और १००% इथेनॉल के 2 परिवर्तन । कीप में इथेनॉल शामिल करने के लिए कुप्पी और कीप stoppered रखें, दोनों वाष्पीकरण और निष्क्रिय प्रवाह के माध्यम से नुकसान को रोकने के माध्यम से फिल्टर.
    3. छानने का कुप्पी पर कोमल निर्वात द्वारा इथेनॉल निकालें, दोनों डाट हटाने के बाद । एक डिस्पोजेबल एल्यूमीनियम वजन बस पर्याप्त १००% इथेनॉल युक्त पकवान सुखाने से पहले नमूने को कवर करने के लिए फ़िल्टर/
  3. धो और निर्जलीकरण Drosophila melanogaster (फल मक्खी) ।
    1. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ०.१ मीटर फॉस्फेट बफर पीएच ७.२ की 1 मिलीलीटर के साथ फिक्स्ड नमूना तीन बार धो लें । एक गिलास पिपेट के साथ एक धोने निकालें, मक्खियों को दूर करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा.
    2. एक microfuge ट्यूब में 1 मिलीलीटर की मात्रा में 10 मिनट के लिए, एक वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला का उपयोग कर नमूना निर्जलीकरण । इथेनॉल सांद्रता हैं: 25%, ५०%, ७५%, ८०%, ९५%, १००% । एक गिलास पिपेट के साथ इथेनॉल निकालें, मक्खियों को दूर करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा.
    3. सिर्फ पर्याप्त १००% इथेनॉल सुखाने से पहले नमूने को कवर के साथ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में नमूना बनाए रखें ।

3. सुखाने

  1. टी-butyl अल्कोहल (टीबीए)27का उपयोग करके रासायनिक सुखाने का कार्य करें ।
    1. टीबीए और १००% इथेनॉल के 20 मिनट के लिए 1:1 समाधान के साथ १००% इथेनॉल समाधान बदलें 20 min. दोहराने के लिए १००% टीबीए के साथ 1:1 समाधान बदलें दो बार । ३७ डिग्री सेल्सियस पर समाधान रखें ताकि टीबीए फ्रीज नहीं है ।
      नोट: १००% टीबीए २५.५ ° c के एक फ्रीज बिंदु है; 1:1 समाधान कमरे के तापमान पर स्थिर नहीं होगा । टीबीए ज्वलनशील है, गंभीर आंख जलन का कारण बनता है, अगर साँस हानिकारक है, और सांस की जलन, तंद्रा, या चक्कर आना कारण हो सकता है । टीबीए एक रासायनिक धुएं दस्ताने, लैब कोट, और नेत्र सुरक्षा सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    2. टीबीए में नमूना स्थानांतरण, अगर एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक डिस्पोजेबल एल्यूमीनियम वजन पकवान में । एल्यूमीनियम वजन पकवान में एक बार, टीबीए को हटाने और बस पर्याप्त ताजा १००% टीबीए नमूना कवर के साथ की जगह । 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर टीबीए फ्रीज ।
    3. जमे हुए जेल पैक के साथ एक वैक्यूम desiccator (बेल जार) के लिए स्थानांतरण टीबीए जमे हुए रखने के लिए । खाली और बनाए रखने के एक रोटरी पंप के साथ वैक्यूम करने के लिए नमूने के लिए जमे हुए टीबीए के निर्वात उत्सादन द्वारा शुष्क करने के लिए अनुमति देने के लिए ंयूनतम 3 ज या रातोंरात ।
  2. hexamethyldisilazane (HMDS)20का उपयोग कर रासायनिक सुखाने प्रदर्शन ।
    1. 20 मिनट के लिए HMDS और १००% इथेनॉल के 1:2 समाधान के साथ १००% इथेनॉल समाधान बदलें । HMDS के 2:1 समाधान और 20 मिनट के लिए १००% इथेनॉल के साथ 1:2 समाधान बदलें । 2:1 के साथ १०० समाधान बदलें 20 min. दोहराएँ के लिए% HMDS एक बार.
      नोट: HMDS ज्वलनशील और एक तीव्र विष (चमड़े का मार्ग) है । HMDS एक रासायनिक धुएं दस्ताने, लैब कोट, और नेत्र सुरक्षा सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग कर हुड में नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    2. HMDS में नमूना स्थानांतरण, अगर एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, एक डिस्पोजेबल एल्यूमीनियम वजन पकवान में । एल्यूमीनियम वजन पकवान में एक बार, बस पर्याप्त ताजा १००% HMDS के साथ १००% HMDS की जगह के लिए नमूना कवर ।
    3. ताजा जलशुष्कक (5-6 सेमी गहरी) के साथ एक प्लास्टिक या ग्लास गैर वैक्यूम desiccator के लिए नमूना हस्तांतरण और एक रासायनिक धुएं हुड में जगह है । वैकल्पिक रूप से, नमूना जगह एक रासायनिक धुएं डाकू में सीधे एक ढीला ढक्कन, जैसे एक बॉक्स के साथ सूखी करने के लिए, नमूने पर गिरने से मलबे को रोकने के लिए । 12 से 24 एच के लिए सूखे के लिए नमूना की अनुमति दें ।

4. बढ़ते

  1. इत cyanobacteria आणि euglenoids.
    1. लेबल के नीचे या तो एक 12-या 25 मिमी एल्यूमीनियम बढ़ते ठूंठ को इंगित करने के लिए क्या शीर्ष पर रखा जा रहा है. एक साफ उस्तरा ब्लेड या स्केलपेल अगर एक 12 मिमी ठूंठ का उपयोग कर, या पूरे फिल्टर जगह अगर एक 25 मिमी ठूंठ का उपयोग कर के साथ क्वार्टर में सूख कोशिकाओं के साथ पाली कार्बोनेट फिल्टर ।
    2. चिपकने पर प्रत्येक फिल्टर प्लेस या एक कार्बन चिपकने वाला टैब एक ठूंठ के शीर्ष करने के लिए सुरक्षित ।
  2. इत Drosophila melanogaster (फ्रूट फ्लाई).
    1. लेबल एल्यूमीनियम बढ़ते ठूंठ के नीचे से संकेत मिलता है कि क्या शीर्ष पर रखा जा रहा है ।
      सटीक चिमटी के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक ठूंठ के शीर्ष करने के लिए सुरक्षित चिपकने वाला या कार्बन चिपकने वाला टैब पर वांछित स्थिति में सूखे मक्खियों प्लेस ।
    2. डिटेल के बाहरी किनारों के आसपास चांदी के प्रवाहकीय चिपकने वाला है, यानी, चांदी के रंग लागू करें । एक दंर्तखोदनी का उपयोग कर मक्खियों के लिए चांदी के रंग से कनेक्ट चालकता सुनिश्चित करने के लिए । रंग इच्छित इमेजिंग क्षेत्र को छूने के लिए अनुमति नहीं है ।
    3. डिटेल को एक डिटेल होल्डर बॉक्स में रखें और एक desiccator में ओपन डिटेल होल्डर बॉक्स लगाएं । चांदी के रंग की अनुमति दें सबसे अच्छा परिणाम के लिए 3 घंटे या रात भर शुष्क करने के लिए ।

5. धूम कोटिंग

  1. आर्गन गैस के चार से पांच फ्लश प्रदर्शन करके धूम कोटिंग उपकरण तैयार करें । यदि आर्द्रता उच्च है (यानी, कमरे में हवा नम लगता है, आमतौर पर के बारे में ५०% सापेक्षिक आर्द्रता), छह करने के लिए सात फ्लश करते हैं । धूम कोट डिटेल निर्माता के निर्देशों का पालन ।
  2. कोट नमूने के आधार पर इस्तेमाल किया नमूना:
    1. cyanobacteria के साथ फिल्टर के लिए, धूम कोट के लिए टाइमर सेट पर सीधे १८० एस ।
    2. eukaryotic शैवाल, यानी, euglenoids के साथ फिल्टर के लिए, १२० एस के लिए धूम कोट करने के लिए टाइमर सेट पर सीधे, तो एक ४५ डिग्री के कोण पर तीन पक्षों पर 20 एस ।
    3. बड़े नमूनों के लिए, यानी, सिर उड़, ६० एस के लिए सीधे पर धूम कोट के लिए टाइमर सेट, तो एक ४५ ° कोण पर प्रत्येक पक्ष पर 30 एस ।
      नोट: कोटिंग पूर्ण होने के बाद, डिटेल रंग में हल्का धूसर होना चाहिए ।

6. इमेजिंग

  1. एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि नमूने है कि एक माध्यमिक इलेक्ट्रॉन (एसई) डिटेक्टर शामिल हैं ।
    1. cyanobacteria के लिए, निंन सेटिंग्स लागू करें: 3-5 केवी त्वरक वोल्टेज (एसी), 20-30 जांच वर्तमान (पीसी), और 5 मिमी काम दूरी (WD) । euglenoids के लिए, 3 केवी एसी, 30 पीसी, और 5 मिमी WD का उपयोग करें । मक्खियों के लिए, 5 केवी एसी, 30 पीसी, और 5 से 10 मिमी WD का उपयोग करें ।
  2. visualized किया जा करने के लिए विवरण या ऑब्जेक्ट के आकार के आधार पर आवर्धन समायोजित करें । समायोजित stigmators, एपर्चर, और ध्यान केंद्रित जब तक एक स्पष्ट छवि का उत्पादन किया है । SEM के निर्माता के निर्देशों के अनुसार उच्च-रिज़ॉल्यूशन सेटिंग्स का उपयोग कर छवि कैप्चर करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Cyanobacteria जीवों के एक prokaryotic समूह है कि वैश्विक कार्बन, ऑक्सीजन, और नाइट्रोजन चक्र28,29के लिए महत्वपूर्ण हैं । cyanobacteria30की अनुमानित ६००० प्रजातियों में से, सबसे एक लसदार म्यान है कि कवर और कोशिकाओं को एक साथ जोड़ने और अन्य संरचनाओं के लिए31, जो आकार के साथ, microscopically३२हल किया जा सकता है. सेल आकार, आकार, और pigments वर्तमान व्यक्तिगत प्रजातियों और जलीय निवास में भेद, cyanobacterial "खिलता"28के रूप में visualized किया जा सकता है । आधुनिक cyanobacterial वर्गीकरण सभी रूपात्मक संभव प्रकाश माइक्रोस्कोपी, उनि, और SEM, साथ ही आणविक डेटा३३का उपयोग कर सुविधाओं को जोड़ती है । cyanobacteria के कफ म्यान के समान, फाइलोजेनी निर्धारण में euglenoid प्रजातियों के सहायता के पतली झिल्ली स्ट्रिप्स । Euglenoids जलीय flagellates है कि रूपात्मक और व्यवहार विविधता का एक बड़ा सौदा अधिकारी हैं, और SEM विश्लेषण अलग प्रजातियों वर्गीकृत करने में उपयोगी साबित किया है । विशेष रूप से, euglenoids उनके प्लाज्मा झिल्ली कि समानांतर proteinaceous स्ट्रिप्स और microtubules से बना रहे हैं के नीचे उपंयास संरचनाओं के अधिकारी, पतली झिल्ली३४,३५,३६कहा जाता है । संख्या, व्यवस्था, और पतली झिल्ली स्ट्रिप्स के आकार महत्वपूर्ण रूपात्मक comparators हैं, और एक साथ आणविक वंशावली डेटा के साथ, फाइलोजेनी३७के लिए Euglenozoa का निर्माण करने के लिए उपयोग किया जाता है.

दोनों cyanobacteria और euglenoids तैयार करने में पहला कदम अपने विकास के माध्यम से जीवों को छानने की आवश्यकता है और एक निस्पंदन रिग (आंकड़ा 1a) कोडांतरण द्वारा पूरा किया है । आकांक्षा को एक पाली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से मध्यम खींचने के लिए प्रयोग किया जाता है, फिल्टर की सतह पर जीवों को छोड़ । पाली कार्बोनेट फ़िल्टर का आकार ताकना का चयन किया जाना चाहिए ऐसी है कि बरकरार जीवों के माध्यम से पारित नहीं होगा ( चित्रा 1b और 1Cतुलना) । चित्रा 2 cyanobacteria के तीन अलग पीढ़ी के प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है । दो मीठे पानी हैं और एक समुद्री है । कोशिका का विवरण, जिसमें सतह की आकृति और बनावट दिखाई देती है, साथ ही कोशिकाओं से कफ या अनुमानों का एक म्यान भी होता है. चित्रा 3 कैसे SEM दो अलग euglenoid प्रजातियों के पतली झिल्ली स्ट्रिप्स कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है दिखाता है । पतली झिल्ली स्ट्रिप्स के पेचदार व्यवस्था है कि पीछे अंत में विलय के लिए फाइलोजेनी निर्धारण में एक पूंछ सहायता फार्म जब Monomorphina aenigmatica की तुलना (आंकड़ा 3 बीऔर) Monomorphina pseudopyrum के साथ ( चित्रा 3 सी और 3d) ।

प्रजातियों की पहचान है कि रूपात्मक विशेषताओं के अलावा, Drosophila melanogaster जैसे मॉडल जीवों की बाहरी आकृति विज्ञान यौगिक शामिल है कि photoreceptors न्यूरॉन्स का उपयोग कर आनुवंशिक संशोधक की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता Drosophila नजर३८. के बाद से आंख एक गैर मक्खियों में आवश्यक ऊतक है, यह रेटिना कोशिकाओं में विषाक्त प्रोटीन व्यक्त करने के लिए संभव है और SEM का उपयोग करने के लिए रूपात्मक परिवर्तन है कि आनुवंशिक संशोधन आंख पर है की जांच करें । सामांय मक्खी आंखें bristles और लेंस (चित्रा 4a) के एक अर्दली सरणी की विशेषता है, लेकिन अल्जाइमर रोग के साथ जुड़े प्रोटीन की अभिव्यक्ति बना क्या ' रफ आई ' phenotype (चित्रा 4B) कहा जाता है । जीन है कि (चित्रा 4c) को दबाने या बढ़ाने (चित्रा 4d) किसी न किसी आंख phenotype रोग प्रगति में एक शारीरिक भूमिका निभा सकते है और दवा३९लक्ष्यीकरण के लिए संभावित है । इसके अलावा चित्रा 4 में दिखाया संभावित नुकसान के उदाहरण है अनुचित सुखाने तकनीक से आंख के ढह संरचना का एक उदाहरण सहित से बचने के लिए (चित्रा 4E) और अपर्याप्त धूम कोटिंग है कि के दौरान प्रकट होता है से इलेक्ट्रॉन चार्ज इमेज अर्जन (फिगर 4F आणि 4g).

Figure 1
चित्रा 1 : निस्पंदन रिग और एक पाली कार्बोनेट फिल्टर के SEM के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (क) इस तंत्र का प्रयोग छोटे या एकल प्रकोष्ठीय जीवों जैसे cyanobacteria और euglenoids को अपने विकास माध्यम से दूर करने के लिए किया जाता है. कुप्पी की ओर हाथ करने के लिए एक वैक्यूम के आवेदन पाली कार्बोनेट फिल्टर के माध्यम से और निस्पंदन कुप्पी के आधार में, फिल्टर की सतह पर जीवों को छोड़ने के माध्यम से कीप की सामग्री खींच जाएगा । (ख) नमूना के रूप में कोई नमूना के साथ एक ०.८ µm ताकना फिल्टर की SEM क्योंकि से निपटने के खो गया था । स्केल बार = 20 µm. (ग) cyanobacteria वर्तमान के साथ एक ०.८ µm ताकना फिल्टर की SEM । स्केल बार = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : SEM micrograph of cyanobacteria. (A, B) Toxifilum mysidocida, कफ (एम) के एक दृश्य म्यान के साथ कोलोराडो से एक रेशा मीठे पानी की प्रजातियों । स्केल पट्टियां = 5 µm. (C, D) एक मीठे पानी Golenkina सपा । ओहियो से । कफ (एम) की एक पतली परत के द्वारा एक साथ आयोजित की गई एकल कोशिकाओं को कभी-कभार बनाते हैं । रेशा की तरह दखलंदाजी (सफेद तीर) व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए विस्तार । स्केल बार्स = 10 µm. (E, F) टेक्सास तटीय जल में एक उच्च लवणता मुहाना से अज्ञात रेशा प्रजातियों । व्यक्तिगत कोशिका (काले तीर) और विभाजन कोशिकाओं (सफेद ऐरोहेड) दिखाई दे रहे हैं । पैनल में स्केल बार E = 2 µm. स्केल बार पैनल में F = 1 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : euglenoids की दो प्रजातियों से पतली झिल्ली स्ट्रिप्स के SEM micrograph । (A, B) Monomorphina aenigmatica. (A) संपूर्ण कक्ष की कम आवर्धन छवियां । स्केल बार = 5 µm. (ख) पीछे अंत के उच्च आवर्धन । स्केल बार = 3 µm. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. (C) संपूर्ण कक्ष की कम आवर्धन छवियां । स्केल बार = 10 µm. (घ) पीछे अंत के उच्च आवर्धन । स्केल बार = 5 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : Drosophila नेत्र के phenotypic संशोधन के SEM विश्लेषण । bristles और मक्खी आँख के लेंस के आदेश दिया सरणी के सामान्य बाहरी उपस्थिति की तुलना में (क), विषाक्त प्रोटीन की अभिव्यक्ति ताऊ photoreceptor न्यूरॉन्स की मौत का कारण बनता है, ' रफ आई ' phenotype (बी) का सृजन. आनुवंशिक संशोधक की अभिव्यक्ति है कि या तो दमन (ग) या बढ़ाने के (घ) ताऊ रफ आइ जीन के सबूत प्रदान करता है जो ताऊ neurotoxicity में भूमिका निभा सकता है । सुखाने कदम के दौरान अनुचित तकनीक आंख की संरचना का एक संक्षिप्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं (ई), जबकि नमूने की अपर्याप्त कोटिंग चार्ज है, जो या तो एक सफेद (F) या काले (जी) छवि अधिग्रहण के दौरान बैंड के रूप में प्रकट होता है के कारण होगा, जैसा कि तीर से दिखाया गया है । स्केल बार = ४०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां हम एक SEM का उपयोग करने के लिए तीन प्रकार के जीवों कि दूसरों के जीवों या ऊतकों के कई प्रकार की सुविधाओं की जांच करने के लिए आवेदन कर सकते है के बाह्य रूपात्मक विशेषताओं के बारे में विस्तृत जानकारी प्राप्त प्रोटोकॉल का वर्णन किया । प्रोटोकॉल के हर कदम के भीतर, वहां त्रुटि है कि उत्पंन हो सकती है और नीचे विस्तार से चर्चा कर रहे है की क्षमता अंक हैं ।

जबकि निर्धारण और यहां दिए गए धोने के लिए खंड विशिष्ट हैं, सामांय में निर्धारण और बहाकर 5-10x नमूना की मात्रा होना चाहिए । सभी निर्धारण, धुलाई, और निर्जलीकरण बार हमारे अनुभव के आधार पर कर रहे हैं, समस्याओं उठता है, जैसे, नमूना के shriveling, आप निर्जलीकरण या सुखाने के हर कदम पर समय बढ़ाने की आवश्यकता हो सकती है । अपने एकल सेल नमूने के आधार पर, आप एक glutaraldehyde निर्धारण और आज़मियम tetroxide में एक पद निर्धारण दोनों करने की आवश्यकता हो सकती है । यदि एक द्वंद्वयुद्ध निर्धारण के बाद cyanobacteria प्रक्रिया के साथ एक ही बफर में एक बराबर राशि 2% OsO4 के साथ कवर की जरूरत है और एक सेल प्रक्रिया के चरण 1.2.2 से आगे बढ़ना । काम से यहां नहीं दिखाया गया है, हमने पाया है कि Drosophila या तो सीधे anesthetization निंनलिखित निर्धारण में रखा जा सकता है या एक microfuge ट्यूब में अनिश्चित काल के-20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है और समाप्त में कोई अंतर के साथ एक बाद में समय पर निर्धारण में रखा छवि गुणवत्ता ।

धोने और निर्जलीकरण कदम के दौरान, यह वर्गीकृत इथेनॉल श्रृंखला के माध्यम से धीरे और एक विख्यात एकाग्रता लंघन के बिना स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक है । यदि नमूने भी जल्दी से निर्जलित हैं, यह नकारात्मक प्रभावों ऊतक और नमूना में अंतर्निहित संरचनात्मक घटकों सूखना, सूख जाएगा, या पतन । ऊतक ढहने का एक उदाहरण चित्रा 4Eमें दिखाया गया है । इसके अलावा, इस तरह के झुरमुट और रूपात्मक सुविधाओं के समतल के रूप में कलाकृतियों का परिचय रोकने के लिए, यह निर्जलीकरण और सुखाने के दौरान कदम के बीच नमूना कवर करने के लिए बस पर्याप्त इथेनॉल छोड़ने के लिए महत्वपूर्ण है ।

जब निस्पंदन रिग का उपयोग कर, आधार पर पानी की एक बूंद जगह में फिल्टर पकड़ जब कोडांतरण जाएगा । इसके अलावा, फिल्टर चमकदार पक्ष के साथ रखा जाना चाहिए और सभी तरल पदार्थ धीरे जोड़ा जाना चाहिए, ध्यान के साथ फिल्टर संभाल सावधान करने के लिए दूर नमूना धुलाई को रोकने के लिए किया जा रहा । हालांकि हम या तो HMDS या टीबीए का उपयोग कर समान गुणवत्ता का हो सुखाने के परिणाम मिल गया है, हम टीबीए का उपयोग करने की सिफारिश: जबकि दोनों HMDS और टीबीए ज्वलनशील हैं, टीबीए के बारे में एक तिहाई लागत और कम HMDS से विषाक्त है ।

जब चांदी प्रवाहकीय चिपकने का उपयोग कर के दौरान बढ़ते (भी सिल्वर पेंट कहा जाता है), सावधान जब अपने नमूने के रूप में आवेदन आसानी से रंग में (दफन) कवर किया जा सकता है, जिससे आकृति विज्ञान में ठीक विवरण अस्पष्ट । धूम कोटिंग बार अपने नमूने के आधार पर भिंन हो सकते हैं, और यहां दिए गए मूल्यों हमारे अनुभव के आधार पर कर रहे हैं । एक अपर्याप्त धूम कोटिंग की संभावित नकारात्मक परिणाम एक घटना है, जो अक्सर एक सफेद या काली रेखा के रूप में प्रकट होता है (एक फ्लैश) अंतिम छवि में (देखें चित्रा 4F और उदाहरण के लिए जी ) । अगर मनाया चार्ज की राशि कम है, यह इस तरह के तेजी वोल्टेज या बीम वर्तमान को कम करने के रूप में विभिन्न माइक्रोस्कोप मापदंडों, समायोजन द्वारा प्रभाव को कम करने के लिए संभव हो सकता है, संघनित्र लेंस शक्ति में वृद्धि, और/ उद्देश्य एपर्चर । अधिकांश जैविक नमूनों के लिए इस्तेमाल SEMs माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों है, लेकिन कुछ SEMs भी backscatter डिटेक्टरों या पर्यावरण माध्यमिक इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों से सुसज्जित किया जा सकता है, जिनमें से सभी कम या कम के प्रभाव को खत्म करने के लिए समायोजित किया जा सकता चार्ज. यदि चार्ज प्रभाव अधिक स्पष्ट कर रहे हैं, यह संभावना है कि वहां नमूना या बहुत कम धूम कोटिंग माध्यमिक इलेक्ट्रॉनों का उत्पादन करने के लिए गरीब जमीन है, का आरोप लगाया इलेक्ट्रॉनों के लिए नमूना में निर्माण और सहज रूप से जारी, उत्पादन के कारण अधिग्रहण के दौरान छवि में विकृति । स्पष्ट चार्ज सबसे अधिक बार एक मोटा कोटिंग या चांदी के रंग के साथ बेहतर जमीन के साथ हल हो गई है । क्योंकि दोनों बहुत ज्यादा है और बहुत कम धूम कोटिंग नकारात्मक छवि की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, यह सबसे अच्छा है के लिए समय के चर का समायोजन द्वारा लागू कोटिंग की राशि का अनुकूलन (10 १८० s) और दबाव (७० धूम कोट के १५० mTorr) को प्राप्त करने के लिए एक optim अल कोटिंग । के रूप में कोटिंग एक बार नमूने के लिए लागू नहीं हटाया जा सकता है, एक परीक्षण चलाने के नमूने के सभी कोटिंग से पहले एक नमूना के साथ सिफारिश की है ।

ऐसे त्वरित वोल्टेज के रूप में SEM मापदंडों (केवी में), जांच वर्तमान (पीसी), और काम दूरी (WD) के लिए सबसे अच्छा संभव छवि पाने के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, के रूप में यहां दी सेटिंग्स हमारे अनुभव के आधार पर शुरू करने का सुझाव दिया है मापदंडों । जबकि नमूना की गुणवत्ता की तैयारी में लिया देखभाल पर निर्भर है, अंतिम छवि की गुणवत्ता के अनुभव और SEM ऑपरेटर के कौशल पर निर्भर करता है । इस प्रकार, हम एक sem तकनीशियन या खर्च समय अपने sem कौशल विकसित करने के साथ काम करने की सलाह देते हैं । डेटा के सभी (नमूना तैयारी और इमेजिंग सहित) इस पत्र में दिखाया सीएमयू में जीव विज्ञान माइक्रोस्कोपी कार्यक्रम में स्नातक छात्रों द्वारा उत्पंन किया गया, संकाय और हमारे माइक्रोस्कोपी तकनीशियन से मार्गदर्शन के साथ ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल संभावित हानिकारक रसायनों के उपयोग में शामिल हैं, और उचित सुरक्षा उपायों हमेशा उपयोगकर्ताओं को, विशेष रूप से छात्रों को जो इन रसायनों हैंडलिंग हो सकता है की रक्षा के लिए मनाया जाना चाहिए । जबकि प्रोटोकॉल पहले प्रयोग पर प्रत्येक रासायनिक के साथ जुड़े सुरक्षा चिंताओं को निर्दिष्ट करें, उपयोगकर्ताओं को हमेशा चाहिए: (1) एक रासायनिक धुएं हुड का उपयोग करें, (2) एक आपातकालीन आंख धोने और सुरक्षा स्नान करने के लिए उपयोग किया है, (3) सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग nitrile दस्ताने, लैब कोट, और नेत्र संरक्षण, और (4) पता है, जहां लिखित सुरक्षा प्रक्रियाओं, निर्दिष्ट उपयोग क्षेत्रों, फैल प्रक्रियाओं, संदूषण प्रक्रियाओं, और अपशिष्ट निपटान प्रक्रियाओं के समावेशी प्रक्रियाओं को खोजने के लिए ।

अंत में, इन जीवों वर्णन कैसे प्रत्येक की बाह्य सतहों के तीन आयामी स्थलाकृति के बारे में जानकारी वंशावली समूह या संशोधक विश्लेषण के लिए उपयोगी है । cyanobacteria के लिए, SEM से निर्धारित सुविधाओं प्रकाश माइक्रोस्कोपी, उनि से अतिरिक्त डेटा के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है, और आणविक अध्ययन की पहचान करने के लिए, विशेषताएं, और cyanobacteria नाम । euglenoids के लिए, संख्या, चौड़ाई, व्यवस्था (पेचदार या सीधे), और अलंकरण, यदि वर्तमान, पतली झिल्ली स्ट्रिप्स के अंय रूपात्मक डेटा के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है, और यदि आवश्यक आणविक डेटा, की पहचान करने के लिए, विशेषताएं, और नाम euglenoids । इसके अलावा, एकल प्रकोष्ठित शैवाल और protozoans या सूक्ष्म अकशेरूकीय के अंय प्रकारों को तैयार किया जा सकता है और एक समान तरीके से जांच की कशाभिका, खिला संरचना, बाहरी अलंकरण, या के विवरण के रूप में बाहरी रूपात्मक सुविधाओं का निर्धारण करने के लिए माइक्रो-अकशेरूकीय के मामले में उपांग । अंत में, SEM इस तरह के मॉडल प्रणाली Drosophilaकी आंख के रूप में रूपात्मक विवरण की जांच के लिए व्यापक अनुप्रयोगों, रोग विकृति के आनुवंशिक संशोधक की विशेषताएं है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित जीवों का उपयोग कि जटिलता के संबंध में बहुत भिंनता है, अभी तक सभी SEM विश्लेषण के लिए उत्तरदाई है उपयोगी रूपात्मक जानकारी है कि वैज्ञानिक खोज के लिए महत्वपूर्ण है इकट्ठा कई विभिंन उपविषयों में फैले जीवविज्ञान.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम MLS को अनुदान और केंद्रीय मिशिगन विश्वविद्यालय में अनुसंधान और स्नातक अध्ययन के कार्यालय से पहुंच के लिए एक ग्रीष्मकालीन विद्वान पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया । Cyanobacteria Zimba और प्लवक लैब, तटीय अध्ययन के लिए केंद्र के भाग के द्वारा आपूर्ति की गई थी, टेक्सास एक & एम कोष में विश्वविद्यालय Christi । Euglenoids को Triemer लैब, मिशिगन स्टेट यूनिवर्सिटी द्वारा सप्लाई किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
gold–palladium Ted Pella, Inc. 91212
Silver conductive adhesive 503 Electron Microscopy Sciences 12686-15
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate Sigma WHA110614
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black Sigma WHA110659
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate Sigma WHA110606
aluminum weighing dish  Fisher Scientific 08-732-100
aluminum mounting stubs (12 mm) Electron Microscopy Sciences 75210
aluminum mounting stubs (25 mm) Electron Microscopy Sciences 75186
Adhesive tabs  Electron Microscopy Sciences 76760
conductive carbon adhesive tabs Electron Microscopy Sciences 77825
F/2 media Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin https://utex.org/products/f_2-medium No Catalog number given - see link 
AF6 media Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf No Catalog number given - see link 
Soil water medium Carolina Biological Supply Company 153785
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) VWR 97062-208
Hummer 6.2 Sputter Coater Anatech USA http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 No Catalog number given - see link 
Hitachi 3400N-II SEM  Hitachi https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1
-2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A
IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA
nfD_BwE		 The company doesn't appear to sell this model any longer 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bozzola, J. J., Russell, L. D. Electron microscopy, principles and techniques for biologists. , 2nd ed, Jones and Bartlett Learning. Boston. (1999).
  2. Goldstein, J., et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis. , Springer. New York. (2003).
  3. Egerton, R. F. Physical principles of electron microscopy: an introduction to TEM, SEM, and AEM. , Springer. New York. (2005).
  4. Mukherjee, K., et al. Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (113), (2016).
  5. Bello, M. A., Ruiz-Leon, Y., Sandoval-Sierra, J. V., Rezinciuc, S., Dieguez-Uribeondo, J. Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  6. Ramirez-Esquivel, F., Ribi, W. A., Narendra, A. Techniques for Investigating the Anatomy of the Ant Visual System. Journal of visualized experiments. (129), (2017).
  7. Endres, B., et al. A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  8. Chan, V. B., et al. Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm. Journal of visualized experiments. (120), (2017).
  9. Miquel Guennoc,, C,, et al. A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy. Journal of visualized experiments. (119), (2017).
  10. Bucher, T., Kartvelishvily, E., Kolodkin-Gal, I. Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors. Journal of visualized experiments. (116), (2016).
  11. Thompson, Z. S., Rijal, N. P., Jarvis, D., Edwards, A., Bhattarai, N. Synthesis of Keratin-based Nanofiber for Biomedical Engineering. Journal of visualized experiments. (108), e53381 (2016).
  12. Ponce, A., Mejia-Rosales, S., Jose-Yacaman, M. Scanning transmission electron microscopy methods for the analysis of nanoparticles. Methods in Molecular Biology. , 453-471 (2012).
  13. Wang, X. S., Tang, H. P., Li, X. D., Hua, X. Investigations on the mechanical properties of conducting polymer coating-substrate structures and their influencing factors. International Journal of Molecular Sciences. 10 (12), 5257-5284 (2009).
  14. Hortola, P. SEM examination of human erythrocytes in uncoated bloodstains on stone: use of conventional as environmental-like SEM in a soft biological tissue (and hard inorganic material). Journal of Microscopy. 218 (Pt 2), 94-103 (2005).
  15. Joy, D. C. Scanning electron microscopy for materials characterization. Current Opinion in Solid State and Materials Science. 2 (4), 465-468 (1997).
  16. Tsikouras, B., Pe-Piper, G., Piper, D. J. W., Schaffer, M. Varietal heavy mineral analysis of sediment provenance, Lower Cretaceous Scotian Basin, eastern Canada. Sedimentary Geology. 237 (3-4), 150-165 (2011).
  17. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold Labeling for Scanning Electron Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1474, 309-325 (2016).
  18. Hall, D. H., Hartwieg, E., Nguyen, K. C. Modern electron microscopy methods for C. elegans. Methods in Cell Biology. 107, 93-149 (2012).
  19. Heegaard, S., Jensen, O. A., Prause, J. U. Hexamethyldisilazane in preparation of retinal tissue for scanning electron microscopy. Ophthalmic Research. 18 (4), 203-208 (1986).
  20. Nation, J. L. A new method using hexamethyldisilazane for preparation of soft insect tissues for scanning electron microscopy. Stain Technology. 58 (6), 347-351 (1983).
  21. Wolff, T. Preparation of Drosophila eye specimens for scanning electron microscopy. 2011 (11), Cold Spring Harbor. 1383-1385 (2011).
  22. Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 2 Unit 2B 2 (2012).
  23. Trotter, M. B., Stephens, T. D., McGrath, J. P., Steinhilb, M. L. The Drosophila model system to study tau action. Methods in Cell Biology. 141, 259-286 (2017).
  24. Guillard, R. R., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Canadian Journal of Microbiology. 8, 229-239 (1962).
  25. Guillard, R. R. L. Culture of Marine Invertebrate Animals. , Plenum Press. New York. (1975).
  26. Watanabe, M. M., Kawachi, M., Hiroki, M., Kasai, F. National Institute for Environmental Studies. , Tsukuba, Japan. 159 (1997).
  27. Inoue, T., Osatake, H. A new drying method of biological specimens for scanning electron microscopy: the t-butyl alcohol freeze-drying method. Archives of Histology and Cytology. 51 (1), 53-59 (1988).
  28. Zurawell, R. W., Chen, H., Burke, J. M., Prepas, E. E. Hepatotoxic cyanobacteria: a review of the biological importance of microcystins in freshwater environments. Journal of Toxicology and Environmental Health. Part B, Critical Reviews. 8 (1), 1-37 (2005).
  29. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  30. Silva Rocha, B., Carneiro, F. M. How many species of Cyanobacteria are there? Using a discovery curve to predict the species number. Biodiversity and Conservation. (22), 2907-2918 (2013).
  31. Robins, R. J., Hall, D. O., Shi, D. J., Turner, R. J., Rhodes, M. J. C. Mucilage acts to adhere cyanobacteria and cultured plant cells to biological and inert surfaces. FEMS Microbiology Letters. (34), 155-160 (1986).
  32. Diestra, E., et al. Characterization of an oil-degrading Microcoleus consortium by means of confocal scanning microscopy, scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. Scanning. 27 (4), 176-180 (2005).
  33. Komárek, J. Modern taxonomic revision of planktic nostocacean cyanobacteria: a short review of genera. Hydrobiologia. 639 (639), 231-243 (2010).
  34. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. I. Patterns of strips and pores. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (5), 469-479 (2000).
  35. Leander, B. S., Farmer, M. A. Comparative morphology of the euglenid pellicle. II. Diversity of strip substructure. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 48 (2), 202-217 (2001).
  36. Leander, B. S., Witek, R. P., Farmer, M. A. Trends in the evolution of the euglenid pellicle. Evolution. 55 (11), 2215-2235 (2001).
  37. Leander, B. S. Euglenida. euglenids or euglenoids. , Available from: http://tolweb.org/Euglenida/97461/2012.11.10 (2012).
  38. Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Genetics. 165 (3), 1233-1242 (2003).
  39. Reinecke, J. B., et al. Implicating calpain in tau-mediated toxicity in vivo. PLoS One. 6 (8), e23865 (2011).

Tags

जीव विज्ञान अंक १४३ स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) cyanobacteria euglenoid फ्रूट फ्लाई Drosophila क्रिटिकल पॉइंट सुखाने (सीपीडी) hexamethyldisilazane (HMDS) टी-butyl अल्कोहल (टीबीए)
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) में रूपात्मक विश्लेषण के लिए रासायनिक सुखाने का उपयोग Prokaryotic और Eukaryotic जीवों की तैयारी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Koon, M. A., Almohammed Ali, K.,… More

Koon, M. A., Almohammed Ali, K., Speaker, R. M., McGrath, J. P., Linton, E. W., Steinhilb, M. L. Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM). J. Vis. Exp. (143), e58761, doi:10.3791/58761 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter