Summary
SEM 분석 또는 phenotypic 종 식별에 원조 하는 효과적인 방법입니다. 이 세 가지 대표적인 유형의 생물의 특정 형태학 정보를 검사 하는 방법을 설명 합니다 프로토콜과 organismal 많은 기능 검사에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.
Abstract
스캐닝 전자 현미경 (SEM) 개별 단백질에서 세포, 조직, 세포, 및 전체 유기 체에 이르기까지 생물 표본 연구에 적용 된 널리 사용할 수 있는 기술 이다. 이 프로토콜은 두 개의 화학 건조 방법, hexamethyldisilazane (HMDS) 및 t-부 틸 알코올 (미정), 및 SEM.를 사용 하 여 간결한과 진 핵 생물의 이미지를 그들의 응용 프로그램에 초점을 맞추고합니다 이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이 프로토콜의 목적은 구조, 크기, 표면 특성에 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 표본에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법을 설명 하는 형태소 평가입니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 그들의 시스템에이 기법을 적용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 SEM을 사용 하는 다른 수 있게 됩니다.
Introduction
스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이차 전자 형태 및 샘플1의 지형에서에서 이미지를 생성 하 고 에너지 전자의 집중된 광선을 사용 합니다. SEM는 직접 샘플, 표면 구조 및 3 차원 모양 제공 큰 해상도의 실제 크기와 가벼운 현미경 검사 법에 비해 피사계 큰 깊이 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 전자 현미경 (EM)의 또 다른 형태, 전송 전자 현미경 (TEM) 내부 구조의 정밀한 세부 사항 가진 이미지를 생성 하는 샘플을 통해 전달 하는 집중 된 전자를 사용 합니다. 가장 빛 또는 SEM 보다 더 높은 해상도 작은 단일 원자 구조를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다, 그것은 세 가지 주요 단점: 광범위 한 샘플 준비, 보기의 작은 필드와 필드2,3의 얕은 깊이. 비록 다른 시각 프로토콜 특정 세포, 세포, 또는 조직4,5,6,7,,89, 검사를 SEM을 사용 하 여 존재 10 ,이 프로토콜은 독특한 형태학 평가 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 방법 설명.
Sem의 지질, 산업, 및 소재 과학14, 나노 입자11,12, 폴리머13및 수많은 응용 프로그램을 포함 하는 무기 재료를 조사 하기 위한 광범위 한 응용 프로그램을 발견 했다 15,16. 생물학, SEM 오래 개별 단백질에서 전체 유기 체17,18에 이르기까지 생물 학적 샘플을 조사 하기 위한 방법으로 사용 되었습니다. Sem의 과학적 발견을 알리기 위하여 형태학 표면 세부 정보를 사용할 수 있으므로 특정 값입니다. SEM 분석은 구조, 크기, 그리고 다양 한 생물 학적 샘플의 표면 특성에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법입니다.
일반적으로 SEM 고속 전자의 일관 된 빔을 지원 하기 위해 높은 진공 (10-6 Torr 최소) 밑에 운영 한다, 때문에 액체는 진공을 형성 하지 아니 액체 (물, 기름, 알콜) 샘플 챔버에 허용 됩니다. 따라서, 모든 샘플 SEM을 사용 하 여 검사 해야 합니다 탈수 일반적으로 건조 과정 뒤 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 에탄올을 제거. 공기 건조, 동결은, 임계점 건조 (일일) 장치, 또는 t-부 틸 알코올 (미정) 또는 hexamethyldisilazane (HMDS)19, 를 사용 하 여 건조 하는 화학 물질의 사용을 포함 하 여 SEM에서 사용 하기 위해 생물 학적 조직의 건조의 여러 방법이 있다 20 , 21 , 22. 가장 자주, 건조 방법의 선택은 경험적 이후 각 생물 학적 샘플 각 건조 방법에 다르게 반응할 수 있습니다. 각각의 장단점을 비교 하는 것은 적절 한 방법을 선택 하는 데 유용 하므로 어떤 주어진된 샘플에 대 한 모든 이러한 방법의 적절 한, 있을 수 있습니다.
실내 온도에 또는 건조 오븐 (60 ° C)에서 샘플을 건조 공기는 가장 간단한 방법은, 대부분의 생물 학적 샘플 건조-손상 shriveling 등을 표시 하 고 축소, 왜곡은 견본에서 결과. 동결은 과정 또한 제거 물 (또는 얼음) 샘플, 하지만 플래시-냉동 수 샘플을 필요로 하 고 승화, 잠재적으로 샘플 손상의 과정을 통해 얼음 제거 진공에서 배치. 또한, 사용자는 lyophilizer에 액세스할 수 있어야 합니다. SEM에 대 한 샘플을 탈수에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 (일일)을 건조 하는 중요 한 포인트입니다. 일일 비용, 액체 이산화탄소 (CO2)와, 특정 온도 압력 조건 함으로써 표면 장력을 만들지 않고 증발 임계점 (31.1 ° C와 1,073 psi), CO2 로 알려진에서 샘플에 에탄올이 대체 됩니다. 샘플의 형태 및 구조 기능을 효과적으로 유지. 일일은 일반적으로 표준 방법, 그것은 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 과정 뿐만 아니라, 하지만 또한 액체 이산화탄소의 사용을 필요로 하는 중요 한 포인트, 건조 기에 대 한 액세스를 필요 합니다. 둘째, 건조 수 있는 샘플의 크기의 임계점 건조 기 챔버 크기 제한 됩니다. 셋째, 일일 동안 액체의 교류는 샘플을 손상 시킬 수 있는 난 기류를 발생할 수 있습니다.
화학 건조 일일 비용 이상의 많은 장점을 제공 하 고 SEM 샘플 준비에서 널리 이용 되는 적당 한 대안 역할. 미정 및 HMDS와 같은 화학 dehydrants 사용 하 여 샘플의 구조적 무결성 유지 하면서 다른 방법에, 저렴 한, 빠르고 간단한 대안을 제공 합니다. 우리는 최근에 조직 또는 일일 비용 또는 미정 성인 초파리 망막 조직을23건조 방법으로 사용 하는 경우 캡처한 최종 이미지의 품질의 무결성에 차이가 있었다는 것을 보여주었다. 일일, 달리 미정 HMDS 필요 하지 않습니다는 건조 또는 액체 CO2 하 고 건조 하는 샘플의 크기에 제한이 없습니다. 화학 물질을 얻는 이외에 표준 화학 증기 두건 및 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 외 투, 및 안전 고글) 건조 과정을 완료 하는 데 필요 합니다. 미정 및 HMDS는 가연성, 미정은 적은 독성과 더 저렴 (약 1/3의 HMDS 비용) HMDS 보다.
이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이러한 생물 대표 다양 한 크기 (4 m m 0.5 µ m)과 세포 다양성 (단 세포 다세포에), 아직 모든 SEM 분석을 쉽게 순종 견본 준비에 필요한 작은 변화만. 이 프로토콜 화학 탈수 및 SEM 분석을 사용 하 여 생물의 세 종류의 형태학 세부 사항을 검사 하는 방법을 설명 합니다 및 많은 organismal 검토에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.
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Protocol
1. 준비 및 고정
- 박테리아를 준비 합니다.
- 14:10 h에 28 ° C의 온도에 F/2 미디어24,25 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 해결 하기 위해 15 분을 허용, 후 세균 펠 릿 크기에 약 0.05 mL 충분 한 문화 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 미디어를 제거 (1.25%도, 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.0) 정착 액의 1.5 mL를 바꿉니다, 그리고 부드럽게 여러 번 반전 및 4 ° c.에서 밤새 품 어
- 고정된 셀 10 mL 여과 장비 (그림 1)으로 유리 피 펫을 포함 하는 셀의 크기에 따라 0.8 또는 0.2 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 25 m m 필터를 전송 합니다. 쪽 팔을 봉인 하 고 깔때기에 문화를 포함 하는 고무 마 개와 퍼 널. 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 정착 액을 제거 합니다.
참고: 셀 밀도 폴 리 카보 네이트 필터를 최적화 하지 않으면 문화 사용 시작의 양을 조정 합니다.
- 단 세포 조류 (euglenoids)를 준비 합니다.
- AF-6 미디어26 14:10 h에 22 ° C의 온도에서 미디어에 추가 하는 상용 토양 물 매체의 150 mL L-1 에서 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 낮은 밀도의 2 개 mL를 전송 (600 < 0.5 세) 8 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 25 m m 필터를 포함 하 여과 장비 (그림 1)를 10 mL에 유리 피 펫과 문화. 쪽 팔을 봉인 하 고 깔때기에 문화를 포함 하는 고무 마 개와 퍼 널.
참고: 셀 밀도 폴 리 카보 네이트 필터를 최적화 하지 않으면 문화 사용 시작의 양을 조정 합니다. - 문화에 직접 4% 오스뮴 tetroxide (OsO4) 3 방울을 추가 하 고 30 분 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 정착 액을 제거 하는 동안 알을 품을 수 있도록.
참고: OsO4 는 급성 독 소 (피부, 구강, 그리고 흡입 노선), 부식, 눈과 호흡기 감광 손상 피부. OsO4 장갑, 눈 보호, 실험실 코트 등 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하 여 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.
- AF-6 미디어26 14:10 h에 22 ° C의 온도에서 미디어에 추가 하는 상용 토양 물 매체의 150 mL L-1 에서 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 낮은 밀도의 2 개 mL를 전송 (600 < 0.5 세) 8 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 25 m m 필터를 포함 하 여과 장비 (그림 1)를 10 mL에 유리 피 펫과 문화. 쪽 팔을 봉인 하 고 깔때기에 문화를 포함 하는 고무 마 개와 퍼 널.
- 초파리 melanogaster (과일 파리)23를 준비 합니다.
- 100%의 이산화탄소를 사용 하 여 성인 파리 anesthetize 장소는 작은 플라스틱 마 개 유리병 또는 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 성인 (약 10 ~ 30 파리) 취.
- 4 ° c.에 정착 액 (1.25%도, 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.2) 2 시간 (또는 숙박) 1 mL에 마 취 파리를 담가 파리는 정착 액의 표면에 플 로트, 경우 조직의 총 침수에 대 한 허용 정착 액의 표면장력을 약하게 2.5% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르의 몇 방울을 추가 합니다. 정착 액 유리 피펫으로 사용 하 여 제거 합니다.
2. 세척 및 탈수
- 워시와 남조류를 탈수.
- 3 시간 10 분 동안 실 온에서 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.0의 5 mL와 함께 고정된 샘플을 씻으십시오. 플라스 크와 퍼 널 세척을 막히고 유지. 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 각 세척을 제거 합니다.
- 깔때기에 5 mL의 볼륨에서 10 분 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 지속적인 집중을 유지 하면서 샘플을 탈수. 등급된 에탄올 농도: 25%, 50%, 75%, 95%, 및 100% 에탄올의 2 변화. 플라스 크 및 퍼 널 손실 방지 퍼 널에서 에탄올을 포함 하도록 막히고 두 통해 계속 증발 및 필터를 통해 수동 흐름.
- 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 에탄올을 제거 합니다. 일회용 알루미늄 접시 건조 하기 전에 샘플을 충당 하기 위해 충분히 100% 에탄올을 포함 된 무게를 필터/샘플을 전송 합니다.
- 세척 하 고 단 세포 조류 (euglenoids)를 탈수.
- 10 분 동안 실내 온도에 3 번 이온된 수의 5 mL와 고정된 샘플을 씻으십시오. 플라스 크와 깔때기를 깔때기에서 세척 포함 막히고 유지. 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 각 세척을 제거 합니다.
- 깔때기에 5 mL의 볼륨에서 10 분 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 지속적인 집중을 유지 하면서 샘플을 탈수. 등급된 에탄올 농도: 25%, 50%, 75%, 95%, 및 100% 에탄올의 2 변화. 플라스 크 및 퍼 널 손실 방지 퍼 널에서 에탄올을 포함 하도록 막히고 두 통해 계속 증발 및 필터를 통해 수동 흐름.
- 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 에탄올을 제거 합니다. 일회용 알루미늄 접시 건조 하기 전에 샘플을 충당 하기 위해 충분히 100% 에탄올을 포함 된 무게를 필터/샘플을 전송 합니다.
- 세척 하 고 탈수 초파리 melanogaster (과일 파리).
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세 번 1 mL의 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.2 10 분 동안 실내 온도에 고정된 샘플을 씻으십시오. 유리 피 펫, 파리를 제거 하지 않도록 주의 되 고 각 세척을 제거 합니다.
- 탈수 microfuge 관에 1 mL의 볼륨에서 10 분 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 샘플. 에탄올 농도: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. 파리를 제거 하지 않도록 주의 되는 유리 피 펫과 에탄올을 제거 합니다.
- 건조 하기 전에 샘플을 충당 하기 위해 충분히 100% 에탄올 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 샘플을 유지 합니다.
3. 건조
- 화학 건조 t-부 틸 알코올 (미정)27을 사용 하 여 수행 합니다.
- 20 분 20 분에 대 한 100 %TBA 1:1 솔루션 두 번 반복 하는 대체에 대 한 미정과 100% 에탄올의 1:1 솔루션으로 100% 에탄올 솔루션을 교체 합니다. 37 ° C에서 유지 솔루션 미정을 동결 하지 않습니다 있도록.
참고: 100 %TBA 25.5 ° C;의 어는 점 1:1 솔루션 실내 온도에서 동결 하지 것입니다. 미정 가연성, 눈 자극, 흡입, 유해한 이며 호흡기 자극, 졸음, 또는 현기증을 일으킬 수 있습니다. 미정은 적절 한 개인 보호 장비 장갑, 눈 보호, 실험실 코트 등을 사용 하 여 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. - 일회용 알루미늄 접시 무게에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 경우 미정에 샘플을 전송. 일단 알루미늄 무게 접시에 미정을 제거 하 고 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 신선한 100% 미정 대체 키를 누릅니다. 10 분 동안 4 ° C에서 TBA를 고정 합니다.
- 진공 desiccator (bell jar) 냉동된 젤 팩 미정 동결을 유지 하 게 전송 합니다. 철수 하 고 3 시간 이상 냉동된 미정의 진공 승화 하 여 건조 또는 하룻밤 샘플 수 있도록 로타리 펌프와 진공을 유지.
- 20 분 20 분에 대 한 100 %TBA 1:1 솔루션 두 번 반복 하는 대체에 대 한 미정과 100% 에탄올의 1:1 솔루션으로 100% 에탄올 솔루션을 교체 합니다. 37 ° C에서 유지 솔루션 미정을 동결 하지 않습니다 있도록.
- 화학 건조 hexamethyldisilazane (HMDS)20를 사용 하 여 수행 합니다.
- HMDS의 1:2 솔루션으로 100% 에탄올 솔루션 대체 및 100% 에탄올 20 분에 대 한 대체 HMDS의 2:1 솔루션으로 1:2 솔루션 및 20 분에 대 한 100% 에탄올 대체 2:1 100% 솔루션 20 분 대 한 HMDS 반복 한 번.
참고: HMDS는 가연성 및 급성 독 소 (피부 경로). HMDS는 장갑, 눈 보호, 실험실 코트 등 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하 여 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다. - 일회용 알루미늄 접시 무게에 경우 1.5 mL microcentrifuge 튜브에에서 HMDS에 샘플을 전송. 알루미늄 접시, 무게 100% 대체 되 면 충분 한 신선한 100% HMDS HMDS 샘플을 커버.
- 신선한 방 습 제로 (5-6 cm 깊은) 플라스틱이 나 유리 비 진공 desiccator 샘플 전송 고 화학 증기 두건에서 합니다. 또는 샘플에 떨어지는에서 파편을 방지 하기 위해, 상자와 같은 느슨한 뚜껑, 건조 화학 증기 두건에서 직접 샘플을 놓습니다. 12에서 24 h 동안 건조를 샘플을 수 있습니다.
- HMDS의 1:2 솔루션으로 100% 에탄올 솔루션 대체 및 100% 에탄올 20 분에 대 한 대체 HMDS의 2:1 솔루션으로 1:2 솔루션 및 20 분에 대 한 100% 에탄올 대체 2:1 100% 솔루션 20 분 대 한 HMDS 반복 한 번.
4입니다. 장착
- 남조류와 euglenoids를 탑재 합니다.
- 레이블을 나타냅니다 무엇 상단에 배치 되는 스텁 장착 중 12 또는 25 m m 알루미늄의 하단. 12 m m stub을 사용 하는 경우 분기를 깨끗 한 면도날 또는 메스로 말린 셀 폴 리 카보 네이트 필터를 잘라 또는 전체 필터 25 mm stub을 사용 하는 경우.
- 접착제 또는 stub의 상단에 보안 탄소 접착제 탭에서 각 필터를 배치 합니다.
- 마운트 초파리 melanogaster (과일 파리).
- 상단에 배치 되는 무엇을 나타내는 알루미늄 장착 스텁 하단의 라벨.
말린된 파리 접착제 또는 탄소 정밀 핀셋으로 해 현미경 스텁의 상단에 확보 된 접착제 탭에서 원하는 위치에 놓습니다. - 실버 전도성 접착제, 즉, 실버 페인트는 명세서의 외부 가장자리 주위에 적용 됩니다. 이쑤시개를 사용 하 여 전도성을 보장 하기 위해 파리에 은색 페인트를 연결 합니다. 원하는 영상 영역을 터치 페인트를 허용 하지 않습니다.
- 스텁 홀더 상자에는 명세서를 놓고는 desiccator에서 오픈 스텁 홀더 상자를 배치 합니다. 적어도 3 h 건조 또는 최상의 결과 위해 하룻밤 사이에 은색 페인트를 수 있습니다.
- 상단에 배치 되는 무엇을 나타내는 알루미늄 장착 스텁 하단의 라벨.
5. 스퍼터 코팅
- 아르곤 가스의 4 ~ 5 플러시를 수행 하 여 스퍼터 코팅 장치를 준비 합니다. 습도가 높은 경우 (즉, 방 공기에 대 한 일반적으로 촉촉한 느낌이 50% 상대 습도), 6 ~ 7 플러시를 수행. 스퍼터는 제조업체의 지침에 따라 명세서 코트.
- 표본에 따라 코트 샘플 사용:
- 남조류와 필터, 타이머 180 s 스트레이트 코트에 스퍼터를 설정 합니다.
- 진 핵 조류와 필터, 즉, euglenoids, 타이머 120 s에, 똑 바른 다음 20 s 45 ° 각도로 3 개의 측에 대 한 코트 스퍼터를 설정 합니다.
- 즉, 비행 머리 큰 샘플에 대 한 타이머 60 s에, 똑 바른 다음 30 s 45 ° 각도에서 양쪽에 대 한 코트 스퍼터를 설정 합니다.
참고: 코팅 완료 후 명세서 컬러로 밝은 회색 이어야 한다.
6입니다. 영상
- 이차 전자 (SE) 검출기를 포함 하는 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 이미지 샘플.
- 박테리아에 대 한 다음 설정을 적용: 3-5 kV 가속 전압 (AC), 20-30 프로브 전류 (PC), 그리고 5 m m 작동 거리 (WD). Euglenoids, 사용 3 k v AC, 30 PC 및 5mm WD. 파리, 5 k v AC, 30 사용 PC, 그리고 5 ~ 10 mm WD.
- 세부 사항 또는 수 개체의 크기에 따라 확대를 조정 합니다. 깨끗 한 이미지를 생산까지 stigmators, 가늠 구멍, 및 초점을 조정 합니다. SEM.의 제조업체의 지침에 따라 고해상도 설정을 사용 하 여 이미지 캡처
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Representative Results
남조류는 글로벌 탄소, 산소, 그리고 질소 사이클28,29에 중요 한 생물의 간결한 그룹. 박테리아30의 예상 6000 종의 가장 커버와 함께 셀을 연결 하는 mucilaginous 칼 집 있고 다른 구조에31, 될 수 있는 모양, 함께 해결 미세32. 셀 크기, 모양, 및 안료 현재 개별 종 구별 그리고 수 중 서식 지에서 cyanobacterial "꽃"28으로 구상 될 수 있다. 현대 cyanobacterial 분류 가능한 가벼운 현미경, TEM, SEM을, 뿐만 아니라 분자 데이터33를 사용 하 여 모든 형태학 상 특징을 결합 합니다. 남조류의 점액 칼 집에와 마찬가지로, 박막 euglenoid 종 보조 계통 결정에서의 스트립. Euglenoids 형태학과 행동 다양성의 큰 거래를가지고 수생 flagellates 고 SEM 분석 별개 종 분류에 유용한 입증 했다. 특히, euglenoids 병렬 배치할 스트립 및 박막34,,3536라는 microtubules의 구성 된 그들의 원형질 막 아래 소설 구조를가지고 있습니다. 번호, 배열, 및 박막 스트립의 크기 중요 한 형태학 비교 기, 있으며 분자 계통 발생 데이터를 함께 Euglenozoa37계통을 구성 하는 데 사용 됩니다.
남조류와 euglenoids를 준비 하는 첫 번째 단계는 그들의 성장 매체에서 유기 체를 필터링 요구 하 고 여과 장비 (그림 1A)를 조립 하 여 수행 됩니다. 포부 필터의 표면에 유기 체를 떠나는 폴 리 카보 네이트 필터를 통해 매체를 당겨 하는 데 사용 됩니다. 폴 리 카보 네이트 필터의 기 공 크기 그대로 유기 체를 통과 하지 것입니다를 선택 해야 합니다 ( 그림 1B 및 1 C비교). 그림 2 는 남조류의 3 개의 다른 속의 대표적인 결과 보여 줍니다. 2 개는 민물 고 하나는 해양. 모양과 표면 질감을 포함 하 여 셀의 내용을 표시, 뿐만 아니라 점액 또는 셀에서 예측의 칼 집에 있습니다. 그림 3 SEM를 사용 하 여 두 개의 서로 다른 euglenoid 종의 박막 스트립을 시각화 하는 방법을 보여 줍니다. 박막의 나선형 배열 Monomorphina aenigmatica (그림 3A 와 3B) Monomorphina pseudopyrum ( 와 비교할 때 계통 결정에 꼬리 원조를 후부 끝 그 병합 스트립 그림 3C 및 3D).
종 식별 하는 특성에 대 한 형태학, 이외에 모형 유기 체 초파리 melanogaster 등의 외부 형태는 화합물을 구성 하는 대뇌 신경 세포를 사용 하 여 유전 한정자를 식별 하 사용할 수 있습니다. 초파리 38눈. 눈 때문에 파리에 중요 하지 않은 조직, 망막 세포에 독성 단백질을 표현 하 여 눈에 유전 수정 형태학 상 변화를 SEM을 사용 하 여 가능 하다. 그러나 정상적인 비행 눈 Alzheimer의 질병과 관련 된 단백질의 표정을 만드는 '거친 눈' 표현 형 (그림 4B) 라는 bristles와 렌즈 (그림 4A), 정렬 된 배열에 의해 특징 이다. (그림 4C)을 억제 또는 강화 (그림 4D) 거친 눈 표현 형 유전자 질병의 진행에 생리 적인 역할을 하 고39를 대상으로 하는 약물에 대 한 잠재력을가지고 수 있습니다. 또한 그림 4 에 표시 하는 것은 잠재적인 함정을 피하기 위해 부적 절 한 건조 (그림 4E) 기술과 전자 중에 나타나는 부족 스퍼터 코팅에서 충전에서 눈의 축소 된 구조의 예를 포함 하 여의 예입니다. 이미지 수집 (그림 4 층 및 4 G)
그림 1 : 여과 장비와 폴 리 카보 네이트 필터의 SEM의 도식 대표. (A)이이 기구 작은 또는 단일 박테리아 및 그들의 성장 매체에서 euglenoids와 같은 단 세포 생물을 분리 하는. 폴 리 카보 네이트 필터를 통해 및 필터의 표면에 유기 체를 떠나 여과 플라스 크의 베이스에 플라스 크의 측면 팔에 진공의 응용 깔때기의 내용을 끌어 것입니다. (B) SEM는 0.8 µ m의 필터 없는 샘플 샘플으로 실패 때문에 분실 되었다. 눈금 막대 20 µ m. (C) 현재 남조류와 0.8 µ m 기 공 필터의 SEM을 =. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 남조류의 SEM 현미경 사진. (A, B) Toxifilum mysidocida, filamentous 민물 종 콜로라도에서 보이는 칼 집과 점액 (M)의. 스케일 바 = 5 µ m. (C, D) A 민물 Golenkina sp. 오하이오에서. 개별 세포 때때로 점액 (M)의 얇은 층에 의해 함께 개최 식민지를 형성. 필 라 멘 트 처럼 돌출 (흰색 화살표) 개별 셀에 대 한 확장. 스케일 바 = 10 µ m. (E, F) 알 수 없는 filamentous 종 텍사스 해안 바다에서 높은 염 분 강어귀에서. 개별 셀 (검은 화살표)과 나누어 셀 (흰색 화살표) 볼 수 있습니다. 눈금 막대에 패널 E 2 µ m. 눈금 막대에서 패널 F = = 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Euglenoids의 2 개의 종에서는 박막의 SEM 현미경 사진 스트립. (A, B) Monomorphina aenigmatica. 전체 셀의 (A) 낮은 확대 이미지. 눈금 막대 = 5 µ m. (B) 높은 확대 후부 끝의. 눈금 막대 = 3 µ m. (C, D) Monomorphina pseudopyrum. 전체 셀의 (C) 낮은 확대 이미지. 눈금 막대 = 10 µ m. (D) 높은 확대 후부 끝의. 눈금 막대 = 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 초파리 눈의 phenotypic 변경의 SEM 분석. Bristles의 주문한 배열 및 비행 눈 (A)의 렌즈의 일반적인 외관에 비해는 독성 단백질의 식이 '거친 눈' 표현 형 (B)를 생성 하는 포토 리셉터 신경의 죽음을 발생 합니다. 식 억제 (C) 또는 (D) 타우 거친 눈을 향상 하는 유전 한정자의 타우 neurotoxicity에 역할을 할 수 있는 유전자의 증거를 제공 합니다. 샘플의 부족 한 코팅 하면, 충전 중 이미지, 화이트 (F) 또는 (G) 밴드 검정으로 표시 되는 동안 단계를 건조 하는 동안 부적 절 한 기술 (E) 눈의 구조 붕괴 이어질 수 있습니다. 보이는 것 처럼 화살표에 의해. 눈금 막대 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리는 세 가지 유형의 다른 사람 유기 체 또는 직물의 많은 종류의 기능을 검사에 적용할 수 있는 생물의 외부 형태학 상 특성에 대 한 자세한 정보를 SEM을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 각 단계에서 발생할 수 있습니다 아래에 자세히 설명 되어 있는 오류의 잠재적인 포인트가 있다.
정착 액 및 세척 여기에서 주어진 볼륨 특정 있지만, 일반적으로 정착 액 및 세척 이어야 한다 5-10 배 볼륨의 표본. 문제가 발생할 경우, 예를 들어, 모든 정착, 세척, 탈수 시간, 우리의 경험에 기반으로 샘플의 shriveling 해야 할 수 있습니다 탈수 또는 건조의 각 단계에서 시간을 증가. 단일 셀 샘플에 따라도 고정 및 오스뮴 tetroxide에서 후 고정을 할 수 할 수 있습니다. 경우 결투 정착 필요 단계 1.1.2 박테리아 후 OsO4 같은 버퍼에 동일한 금액의 2%를 커버 하 고 단계 1.2.2 단일 셀에서에서 진행. 직장에서 여기에 표시 되지, 우리는 초파리 수 중 수 직접 통 다음 anesthetization에 또는 수 수 microfuge 관에서-20 ° C에서 무기한 동결 되 고 정착 액에 완료에 차이가 나중에 발견 이미지 품질입니다.
세척 및 탈수 단계 동안 천천히 그리고 지적된 농도 건너뛰는 없이 등급된 에탄올 시리즈를 통해 이동 하는 것이 필수적입니다. 샘플 너무 빨리 탈수, 그것은 조직에서 기본 구조 구성 요소에 부정적인 영향을 표본 주름 것 죽는다, 또는 축소. 조직 붕괴의 예는 그림 4E에 표시 됩니다. 또한, 아티팩트 응집 및 형태학 상 특징의 병합 등의 소개를 방지 하기 위해, 그것은 탈수 동안 단계 사이 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 에탄올을 두고 중요 하 고 건조입니다.
때 여과 장비를 사용 하 여 어셈블할 때 기지에 물 한 방울에에서 필터를 개최 한다. 또한, 필터 빛나는 쪽으로 배치 해야 하 고 모든 액체 추가 해야 부드럽게, 주의 주의 샘플을 멀리 세척 하는 방지 하기 위해 필터를 처리 하. 우리가 동등한 품질의 HMDS 또는 미정 중 하나를 사용 하 여 건조의 결과 찾았지만, TBA를 사용 하 여 것이 좋습니다: HMDS와 미정 가연성, 미정은 1/3 정도 비용과 적은 독성 HMDS 보다.
장착 하는 동안 때로 샘플 쉽게 커버 될 수 있다 (매장) 페인트에서를 적용할 때 조심은 전도성 접착제 (또한 불리 운된 실버 페인트)를 사용 하 여, 그로 인하여 형태학에 세밀 왜곡. 스퍼터 코팅 시간 당신의 견본에 따라 다를 수 있습니다 그리고 여기에서 주어진 가치는 우리의 경험을 바탕. 부족 한 스퍼터 코팅에의 한 잠재적인 부정적인 결과 충전, 라는 현상이 자주 나타나는 흰색 또는 검은색 선 (때로는 플래시)으로 최종 이미지에 (예를 들어 그림 4 층 및 G 참조). 관찰 된 충전 금액 최소 경우에, 그것은 수 있습니다 가속 전압을 낮추는 등 다양 한 현미경 매개 변수를 조정 하 여 효과 완화 하거나 현재 콘덴서 렌즈 강도 증가 및/또는 사용 하 여 작은 빔 객관적인 조리개입니다. 그러나 대부분 SEMs 생물 학적 샘플에 사용 되는 2 차 전자 검출기, 일부 SEMs 후방 산란 검출기와 환경 2 차 전자 검출기, 모두의 조정할 수 있다 감소 하거나 최소한의 영향을 제거 또한 장착할 수 있습니다. 충전. 경우 충전 효과 더 발음, 그것은 샘플의 가난한 접지는 또는 너무 작은 표본에 구축 하 여 저절로 나올 충전된 전자를 일으키는, 생산 보조 전자 생산 코팅 스퍼터 왜곡 중 현상 이미지 발음 충전는 가장 자주 더 두꺼운 코팅 또는 은색 페인트로 더 나은 접지입니다. 너무 많이 너무 적은 스퍼터 코팅을 이미지의 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다, 때문에 그것은 시간 변수를 조정 하 여 적용 하는 코팅의 양을 최적화 하는 가장 좋은 (10 ~ 180 s) 및 스퍼터 coater optim 달성 하기의 압력 (70 ~ 150 mTorr) 알 코팅입니다. 으로 한번 샘플에 적용 되는 코팅을 제거할 수 없습니다, 실행 하는 테스트 샘플의 모든 코팅 하기 전에 단일 샘플 좋습니다.
Sem의 매개 변수 가속 전압 (kV)을에서, 같은 프로브 전류 (PC), 그리고 작동 거리 (WD) 최고의 이미지 가능 하려면, 여기에서 주어진 설정 제안 우리의 경험에 따라 매개 변수를 시작으로 조정 해야 합니다. 샘플의 품질 관리 준비에 의존 하는 동안 최종 이미지의 품질 SEM 연산자의 기술과 경험에 의존 합니다. 따라서, sem의 기술자와 협력 또는 sem의 기술을 개발 하는 시간을 지출 하는 것이 좋습니다. 이 문서에 표시 된 데이터 (샘플 준비 및 이미징 등)의 모든 학부 학생 지도 교수와 우리의 현미경 기술자와 함께 CMU, 생물학 현미경 프로그램에 의해 생성 되었다.
여기에 설명 된 프로토콜 잠재적으로 유해 화학 물질의 사용을 포함 하 고 사용자, 특히 학생 들이 화학 물질을 취급 수 있습니다 보호 하기 위해 항상 적절 한 안전 조치를 관찰 해야 합니다. 프로토콜은 처음 사용 시 각 화학 물질과 관련 된 안전 문제를 지정 하는 동안 사용자가 항상 해야 한다: (1) 화학 연기 후드를 사용 하 여, (2)에 액세스할 수 긴급 눈 세척 및 안전 샤워, (3) 사용 하 여 적절 한 개인 보호 장비 등 니트 릴 장갑, 실험실 외 투 및 눈 보호, 그리고 (4) 서 면된 안전 절차 처리 절차, 지정 포함 사용 지역, 찾을 수 있는지 알고 절차, 오염 제거 절차를 유출 하 고 폐기물 처리 절차.
결론적으로, 이러한 생물 어떻게 각각의 외부 표면의 3 차원 지형에 대 한 정보는 계통 발생 그룹 또는 한정자 분석을 위한 유용한 설명 합니다. 박테리아, SEM에서 결정 하는 기능에서 가벼운 현미경 검사 법, 가장, 추가 데이터와 함께에서 사용할 수 있습니다 및 식별, 분자 연구 특성화, 하 고는 박테리아 이름을. Euglenoids, 수, 너비, 정렬 (헬리컬 또는 직선), 및 장식에 대 한 경우는 박막의 스트립 함께 사용할 수 있습니다 다른 형태학 상 데이터, 그리고 필요한 분자 데이터를, 특성, 그리고 euglenoids의 이름을 하는 경우. 단 세포 조류와 protozoans 또는 마이크로-무척 추 동물의 다른 종류를 준비 하 고 flagella, 구조, 외부 장식, 또는의 내용을 먹이 같은 외부 형태학 상 특징을 결정 하는 비슷한 방식에서으로 검사할 수 있습니다 또한, 마이크로-무척 추 동물의 경우 표시 됩니다. 마지막으로, SEM는 질병 병 리의 유전 한정자 특성 형태학 세부 모델 시스템 초파리의 눈 등을 조사 하기 위한 광범위 한 응용 프로그램 있다. 여기에 설명 된 프로토콜 활용 복잡성에 관하여 중대 하 게 변화 하는 유기 체 아직 모든 의무가 SEM 분석은 과학적 발견의 많은 다른 subdisciplines 스패닝에 대 한 중요 한 유용한 형태학 정보를 수집 하는 생물학입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 연구의 사무실 및 중앙 미시간 대학에서 대학원에서 MAK로 MLS와 여름 학술 상 교부 금에 의해 투자 되었다. 남조류는 해안 연구, 텍사스 A & M 대학교 코 퍼스 크리스티에 대 한 Zimba 및 플랑크톤 연구소, 센터의 부분에 의해 공급 되었다. Euglenoids는 Triemer 연구소, 미시간 주립 대학에 의해 공급 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| gold–palladium | Ted Pella, Inc. | 91212 | |
| Silver conductive adhesive 503 | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110614 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.8 μm, polycarbonate, black | Sigma | WHA110659 | |
| Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 μm, polycarbonate | Sigma | WHA110606 | |
| aluminum weighing dish | Fisher Scientific | 08-732-100 | |
| aluminum mounting stubs (12 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75210 | |
| aluminum mounting stubs (25 mm) | Electron Microscopy Sciences | 75186 | |
| Adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 76760 | |
| conductive carbon adhesive tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | |
| F/2 media | Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin | https://utex.org/products/f_2-medium | No Catalog number given - see link |
| AF6 media | Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota | https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf | No Catalog number given - see link |
| Soil water medium | Carolina Biological Supply Company | 153785 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100) | VWR | 97062-208 | |
| Hummer 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4 | No Catalog number given - see link |
| Hitachi 3400N-II SEM | Hitachi | https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE |
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References
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