Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

doi: 10.3791/58763 Published: February 7, 2019

Summary

هنا نقدم طريقة جديدة لتحديد الانتماءات الملزمة في التوازن وفي الحل مع حساسية عالية على نطاق واسع. وهذا يحسن التحليل الكمي لربط الحمض النووي عامل النسخ. الأسلوب الذي يستند إلى الأسفار الآلي تباين القياسات في نظام التسليم المراقب.

Abstract

القياس الكمي الدقيق لعامل النسخ (TF)-التفاعلات الحمض النووي ضروري لفهم تنظيم التعبير الجيني. نظراً للنهج القائمة تعاني من قيود كبيرة، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتحديد الحمض النووي TF ملزم الانتماءات مع حساسية عالية على نطاق واسع. يعتمد على مبدأ تباين (اتحاد كرة القدم) الأسفار المنشأة المقايسة لكن يدخل تحسينات فنية هامة. أولاً، نحن قياس منحنى معايرة تنافسية كاملة اتحاد كرة القدم في بئر واحدة بإدراج TF ومرجع مسمى فلوريسسينتلي الحمض النووي في مصفوفة مسامية [اغروس] هلام. غير مسمى الحمض النووي أوليجومير يتم تحميلها على أعلى كمنافس، ومن خلال نشرها، يشكل تدرج الزمانية. التدرج فا الناتج هو ثم تلا استخدام إعداد مجهر ابيفلوريسسينسي مخصصة. هذا الإعداد محسنة يزيد كثيرا من حساسية الكشف عن إشارة اتحاد كرة القدم، السماح بربط الضعفاء والأقوياء على حد سواء كمياً موثوق بها، حتى بالنسبة لجزيئات أوزان الجزيئية مماثلة. بهذه الطريقة، يمكننا قياس واحد منحنى معايرة كل من لوحة متعددة جيدا جيدا، ومن خلال إجراءات مناسبة، يمكن استخراج تفارق المطلق ثابت (كد) وتركيز البروتين النشط. عن طريق اختبار كافة المتغيرات طفرة نقطة واحدة من توافق معين ملزم التسلسل، يمكننا استطلاع في المشهد خصوصية أسرة ملزم TF، عادة على لوحة واحدة. مصفوفات الوزن الموقف الناجم عن ذلك (PWMs) تتفوق تلك المستمدة من الأساليب الأخرى في التنبؤ في فيفو شغل TF. نقدم هنا، دليلاً تفصيليا لتنفيذ الورك فا في مجهر فلوري إليه تقليدية وخط أنابيب تحليل البيانات.

Introduction

ونظرا للدور المركزي لعوامل النسخ (TFs) في تنظيم الجينات، تحديد تفضيلاتهم ملزم بطريقة كمية أمر بالغ الأهمية. الدراسات المنوي قبل فون هيبل عرض فكرة أن TFs تنظيمية تعترف بسرعة الحمض النووي، مثل أن تجليدها يصفها توازن دينامي حراري، بينما يسيطر عليها أحداث المصب تجنيد بوليميريز الحمض النووي الريبي للمروج حركية أبطأ1. في فيفو ملزمة الدراسات التي أجريت مؤخرا تشير إلى أن هذه الصورة يحتمل أكثر تعقيداً2،3؛ ومع ذلك، هذه الافتراضات العامة بمثابة تقديرات تقريبية جيدة، ودعمت العديد من النهج الحسابية العثور على العناصر التنظيمية المستقلة، والتنبؤ بالتعبير عن تسلسل4،،من56. بينما الربط التوازن وبالتالي يعمل بنجاح كمفهوم، الأساليب الحالية لتحديد التفاعلات الحمض النووي TF تركز على ربط خصوصية وعادة لا مباشرة تدبير الانتماءات الملزمة في التوازن. القياس المنتظم لربط TF-الحمض النووي يمثل تحديا تقنيا كبيرا، والأساليب القائمة على عدة قيود مختلفة.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين متبوعاً بعمق التسلسل (الرقائق-seq)7، التقنية في فيفو الأكثر انتشارا، لا تسمح بقياس الانتماءات الملزمة أو التعريب الدقيق لمواقع داخل أجزاء الجينوم الربط. عدة في المختبر الأساليب، بما في ذلك الدناز footprinting8التنقل الغرواني الكهربي العالي (أمسا)9, السطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)10وعبارة ثيرموفوريسيس11 قادرة على قياس الانتماءات الملزمة، ولكن هم الإنتاجية منخفضة نسبيا. وفي المقابل، تقنيات إنتاجية عالية منها البروتين ملزمة [ميكروارس]12وتقنية HT-سيليكس13،14والبكتيرية المختلطة واحدة (B1H)15 ليست قادرة على قياس الانتماءات الملزمة، وعادة ما تسفر عن الإفراط محددة ملزمة متواليات، الذي يرجع أساسا إلى انتقاء صارمة أو الغسيل الخطوات اللازمة. التطورات الأخيرة تشمل الوجه يضرب تسلسل العميق على أساس16، seq سيليكس17، والمستندة إلى ميكروفلويديكس MITOMI18 أو ابتسامة Seq19، التي تسمح لاستخراج الانتماءات الملزمة المطلقة؛ ومع ذلك، أنها تعتمد على قياس كثافة الأسفار المسماة TF والحمض النووي. الأسفار إشارات، ولذلك يصبح الحد من تركيزات منخفضة البروتين وفي تحديد قيم كد منخفضة (< ~ 10 نانومتر). وعلاوة على ذلك، الربط TF-الحمض النووي في هذه الأساليب يأخذ مكان على سطوح رقيقة، رفع القضايا مع الربط غير محدد و/أو صف السيارات الخلفية، مما يجعل من الصعب على دقة قياس ضعف الربط.

لمعالجة أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير أسلوب جديد لتحديد الحمض النووي TF تقارب المناظر الطبيعية في التوازن وفي الحل الذي طالبنا عالية الأداء fluorescence تباين (HiP فا)20. التقنية استناداً إلى فحص تباين (اتحاد كرة القدم) الأسفار المقررة21 ولكن تعديل لقياس ثوابت ملزمة مع حساسية عالية وواسعة النطاق باستخدام المجهر الآلي مخصص وإعداد التحليل.

وترصد المقايسة فا التفاعل بين الأنواع المسماة فلوريسسينتلي (مثل أوليجومير الحمض النووي) لشريك ملزم، في هذه الحالة TF، بقياس الدوران الجزيئية للجزيء المسمى. عند الربط إلى TF، يتناقص سرعة دوران سبب radius هيدرودينامية أعلى والوزن الجزيئي للمجمع ملزمة، مما يؤدي إلى زيادة اتحاد كرة القدم. القياس الدقيق لربط قوي جداً (كد < ~ 1 نانومتر) يتطلب استخدام تركيزات منخفضة من مرجع مسماة، الحمض النووي (ج < ~ 1 نانومتر). وهذا يصعب تحقيقه مع أداة تجارية مثل قارئ ميكروسكوبية قياسية. وباﻹضافة إلى ذلك، فرق كبيرة حجم (10 100 إضعاف) بين المجمعات المنضمة وغير المنضمة ضروري عادة، الذي يحظر القياس للتفاعلات بين المجالات الملزمة TF وقصيرة ليغومرات الحمض النووي، التي عادة ما تكون من الأوزان الجزيئية مماثلة تقريبا . وأخيراً، منحنى معايرة كامل يتطلب عادة إعداد وقياس آبار متعددة تحتوي على سلسلة تركيز للأنواع تيتراتينج.

لمعالجة هذه القضايا، نحن نستخدم إعداد مجهرية ويديفيلد، تعديل لتحقيق كشف عالية الحساسية وتسمح قياسات اتحاد كرة القدم في مختلف المواقف ض من بئر واحدة. وهذا تمكننا من رصد التفاعلات الربط بين أنواع مماثلة من الوزن الجزيئي، ومع ارتفاع الانتماءات. ويتحقق أعلى من الناتج عن طريق قياس اتحاد كرة القدم في لوحة جيدا متعدد الأشكال والاضطلاع سلسلة معايرة أسرة واحدة جيدا باستخدام إيصال نظام الخاضعة للرقابة (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، عن طريق استخدام مقايسة ملزمة تنافسية، نحن استخراج ثوابت ملزمة ليس فقط، بل أيضا تركيز البروتين النشط. هذا سمة هامة للمقايسة، نظراً لجزء فقط من جزيئات TF أعرب نشطة بسبب ميسفولدينج البروتين أو تدهور. ويستند الإعداد التجريبية مجهر ابيفلوريسسينسي تجارية مجهزة بمراحل بيزو XY و Z. نحن ترقية النظام مع الإثارة الليزر الخارجي، ثم الكشف عن الاثنين تنبعث مكونات الاستقطاب الخطي على رقاقة الكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر مع الكم عالية الكفاءة للكشف عن الضوء (الشكل 1ب وج 1). النظام يستخدم هدفا فتحه عددية عالية (غ) بالإضافة إلى جهاز استشعار حساسة جداً، ومما يتيح حساسة للغاية فا القياسات. عن طريق تسجيل الأسفار z-المكدسات، ملزمة التفاعلات يمكن أن يقاس على طول محور ع الضوئية عند استخدام مصفوفة متجانسة كواشف مختبر. جميع هذه التعديلات يمكن تنفيذها على نظام موجود لسهولة وفعالية من حيث التكلفة.

نحن نوظف مقايسة تنافسية ملزمة التي تقارب ملزم من أوليجومير الحمض النووي غير مسمى يقاس بالمقارنة مع الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، الذي يخدم كمرجع. وأدرجت TF ومرجع الحمض النووي في تركيزات ثابتة في مصفوفة جل مسامية [اغروس] (المسام حجم ~ 1 ميكرومتر) يشكل بيئة غير التفاعل للربط. المرجع هو المسمى الحمض النووي مع Cy5. هذه الصبغة أثبتت أنها مناسبة تماما للقياسات اتحاد كرة القدم بسبب بقائه fluorescence طويلة نسبيا (~ 1ns) وانبعاث fluorescence في استعملنا الطيف المرئي (خلفية صف السيارات منخفضة). تركيز TF في فائض المولى على مرجع Cy5 الحمض النووي، وضمان أن جميع المراجع الحمض النووي مرتبط بالبروتين. حلاً منافس غير مسمى الحمض النووي ثم تودع على سطح هلام وينشر داخل المصفوفة المسامية، إنشاء الانحدار تركيز ج (z, t) أن التغييرات على z-موقف البؤري والزمن t (الشكل 1أ من الشكل 2أ-2 ج). TF ملزمة للحمض النووي Cy5-المرجع وهكذا يتعرض محلياً بتركيزات مختلفة للمنافس الحمض النووي التي تتنافس للتوثيق، مما يؤدي إلى FA متغيرة بشكل حيوي من الحمض النووي إشارة Cy5 FAREF(z, t) (الشكل 2ب و 2 (ج)).

لتحديد c(z,t) تركيز المنافس، نقيس في آبار منفصلة (معايرة الآبار) اتحاد كرة القدم بشكل حيوي تغيير إشارة "النيل الأزرق" (ملحوظة) فاNB(z, t) (الشكل 2و 3). هذه الصبغة إينتيركالاتيس في الحمض النووي وذلك بمثابة جهاز استشعار الحمض النووي للمنافس الحمض النووي. مع هذا النظام التسليم المراقب، يمكن قياس عشرات ومئات من مختلف الانتماءات الملزمة البروتين الحمض النووي داخل لوحة متعددة جيدا واحدة (96-384 جيدا أو لوحة تنسيق). ثم يتم قياس تسلسلياً حتى تشريد المرجع المسمى الحمض النووي من فريق العمل كاملة. علينا تحديد خصوصية ملزم لعامل معين حسب قياس الانتماءات جميع الطفرات قاعدة واحدة 3 ن من تسلسل توافق طول ن. الهيب فا يتطلب كميات قليلة من البروتين (~ بمولس كل منحنى المعايرة) ويظهر انخفاض تقلب في تحديد ك قد[معامل الاختلاف (CV) < 20%]، بينما تسمح القياسات على نطاق واسع نسبيا. ويمكن إجراء الأسلوب الآلي يدوياً أو بالكامل باستخدام نظام روبوتية، أسفر عن السير الذاتية حتى أقل (الشكل 4، اللوحة العلوية). الانفصال من الثوابت يتم قياسها بدقة عالية وصولاً إلى 0.5 نانومتر. للانتماءات مرتفعة للغاية (كد < 500 م)، يمكننا استخدام معايرة تنافسية معيار (الشكل 5) بسبب عدم الدقة في قياس تركيزات الحمض النووي المنافس عند مستويات منخفضة (< 100 nM).

يمكن أن تكون نفذت على ما يقرب من أي معيار الورك فا، مقلوب، مجهر فلوري ابيفلوريسسينسي، قدمت توافر مرحلة XY الآلي ومرحلة محور ع بيزو. المكونات البصرية بنيت حولها إعداد ويديفيلد الآلي مجهزة من الأهداف البعيدة المدى. في الممارسة العملية، يمكن تكييفها للأهداف مع الخصائص الأخرى (في عمل معين، والمسافة والفتحة العددية) المقايسة. ومع ذلك، يتطلب هذا تحسين المعلمات (المسافات بين z-شرائح، المسامية والارتفاع [اغروس] هلام، إلخ.). من الممكن أيضا استخدام أنواع أخرى من الليزر أو الكاميرا. ويرد أدناه وصف مفصل للإجراءات التجريبية بأكملها وتحليل البيانات في المقطع بروتوكول.

Protocol

1-الاستقطاب مجهرية

  1. لإنارة ليزر ويديفيلد، تركز خط شمال البحر الأبيض المتوسط 638 ليزر صمام ثنائي المستمر (40 ميغاواط) في فتحه الألياف الضوئية المتعدد لتنظيف شعاع. جبل المستقطب خطي في إخراج الألياف لتعيين استقطاب ضوء الليزر.
  2. كتلة عنصر الإثارة في ضوء المنبعثة مع مرآة مزدوج اللون (640 nm وقف إنتاج المواد الانشطارية)، وممر الموجه مرشح (ممر الموجه 700/75).
  3. واسمحوا إشارة fluorescence تمر من خلال تقسيم شعاع استقطاب، الذي يقسم الضوء المنبعثة إلى مكوناته الاستقطاب عمودي ومتوازية. ثم، تركيز الشعاع غير تنعكس (العنصر الموازي) وشعاع ينعكس (عنصر عمودي) مع عدسة أتشروماتيك من البعد البؤري 200 ملم على رقاقة الكاميرا CCD م مضيئة في الظهر (الشكل 1ب وج 1). استخدم مرآة لضبط اتجاه شعاع عمودي نحو العدسة.

2-تصميم واختبار مرجع المسمى الفلورسنت الحمض النووي أوليجومير

  1. تحديد تسلسل الحمض النووي الإشارة الأساسية: ويستند الأسلوب مقايسة تنافسية أن التدابير ثابت التفكك (كD2) بين عامل النسخ ومنافس غير مسمى أوليجومير الحمض النووي التي تتنافس للربط مع فلوريسسينتلي المسمى الحمض النووي التي تقارب لفريق العمل يعمل كمراجع (كD1). التسلسل توافق الآراء التي تم الحصول عليها من مصادر أخرى مثل footprinting الدناز أو البكتيرية 1-هجين يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق5،15.
    ملاحظة: كقاعدة عامة، إشارة مناسبة الحمض النووي له 3 إلى انخفاض 7-fold في تقارب ملزمة ل TF مقارنة بالتسلسل إلى توافق في الآراء.
  2. قياس الورك فا KD1s 2-3 الطفرات واحد مؤقت لتسلسل الآراء المستمدة في الخطوة السابقة. حاول أن تغير المواقف في تسلسل الآراء ليست محددة للغاية لتجنب خسارة كاملة للربط.
    ملاحظة: من المهم أن التسلسل المرجعي هو الالتزام بعامل النسخ للفائدة (استخدمنا في هذا البروتوكول العملاق جي تي)، ولكن ليس قويا جداً، حيث أن المنافسين الأضعف يمكن أن أووتكومبيتي عليه بتركيزات عالية.
  3. توسيع فكرة أساسية (8-12 قاعدة أزواج عموما) بطول 16 قاعدة أزواج أو أكثر عن طريق إضافة شكل متناظر المرافقة التسلسل في كلا الجانبين (إضافة سلاسل جانبية للربط السليم). إذا لزم الأمر (لفترة أطول المتعهدة المجالات، على سبيل المثال)، استخدم تسلسل أطول (حتى ~ 50 قاعدة أزواج في طول تم اختباره مع المقايسة الورك فا).
    تنبيه: كن حذراً لا لإضافة القواعد التي من المتوقع لإنشاء مواقع الربط حمل خارج الرحم. استخدام الأدوات الحاسوبية التي تنبئ بمواقع الربط من PWMs المتاحة لتسهيل هذه العملية (مثلاً بيسيت22).
  4. كمرجع المسمى الحمض النووي، ليغومرات النظام المسماة فلوريسسينتلي في أما إلى الأمام أو عكس حبلا في نهاية 3 أو 5 '. باستخدام، على سبيل المثال Cy5 أو بوديبي-650 أو أي صبغة مناسبة أخرى بتركيز 10 ميكرون (100 ميكرومتر 10 x الأوراق المالية) في المياه، وتمييع تدريجي كما هو موضح في الخطوة 3.1.
  5. إعداد 500 مل 1 × المخزن المؤقت ملزم بإضافة 33 ملم العازلة فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني = 7.0)، 90 مم كلوريد الصوديوم، والمنظفات غير الأيونية 0.01 ٪ في الماء المقطر. كما تعد 3 × المخزن المؤقت الملزم، الذي يحتوي على نفس المكونات، ما عدا في تركيزات ثلاثي. في حالة استخدام 3 × المخزن المؤقت ملزم كحل الأسهم ل 1 × المخزن المؤقت ملزم، إعداد وحدات التخزين > 500 مل؛ وبخلاف ذلك، تعد 250 مل.
    ملاحظة: هذا التكوين الأمثل للنسخ عامل الاستقرار ومنع الجلوتاثيون S-ترانسفيراز (GST) ثنائي.
  6. التدبير في إعداد الفحص المجهري هو موضح في الخطوة 1 اتحاد كرة القدم من 200 ميليلتر من ربط المخزن المؤقت الذي يحتوي على 0.8 nM المسماة مرجع الحمض النووي حضور عدد مختلف من TF في زجاج أسفل الميكروسكوب 96-كذلك لوحة (5-6 آبار بتركيزات مختلفة TF) إلى تحديد تركيز فريق العمل استخدام. تنفيذ سلسلة معايرة مع مقادير متزايدة من TF واختر للمقايسة تركيز الذي يصل المنحنى هضبة، مشيراً إلى ملزمة كاملة من أوليجومير مرجع الحمض النووي.
    ملاحظة: تركيز TF الأمثل يعتمد على قيم ثوابت تفكك الحمض النووي TF. وبصفة عامة، تتطلب أقل كس تركيزات أقل.

3-أوليجومير الصلب

  1. أن يصلب ليغومرات الحمض النووي للمرجع المسمى الحمض النووي (تسلسل تحديد في الخطوة السابقة)، مزيج 7 الحل الحمض النووي ميليلتر 10 مم المسمى صبغ قدما واحدة-الذين تقطعت بهم السبل وميليلتر 7 تركيز 10 ملم من مجموعتها عكس غير المسماة في 186 ميليلتر من الماء.
  2. لتسلسل الحمض النووي المنافس، مزيج 20 ميليلتر من حلول 100 ملم (في المياه وتوفيرها من قبل الشركة المصنعة) دنا واحد-الذين تقطعت بهم السبل إلى الأمام مع 20 ميليلتر من 100 ملم المقابلة عكس واحد تقطعت الحمض النووي لكل تسلسل منافس الفردية التي يمكن قياسها.
  3. أداء الصلب بشكل منفصل في cycler بكر قياسية بتسخين الحلول إلى 70 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وانخفاض درجة الحرارة إلى RT بمعدل 0.1 K/s. إذا لم يعتمد جهاز PCR تستخدم التدرجات درجات الحرارة بهذا المعدل، قم ببساطة إينكوبيشنز التدريجي مع انخفاض درجات الحرارة (اختبار كانت دورات 99 3 ق مع ك-0.40 في كل دورة).

4-جل إعداد

ملاحظة: المقطع التالي يوضح إعداد اثنين من نوع مختلف من المواد الهلامية: 1) معايرة الآبار تحتوي على المواد الهلامية مع البروتين ويتم استخدامها لتحديد ك قدلتسلسل الحمض النووي كل منافس، وآبار المعايرة 2) الاستفادة من ملاحظة أن تحديد تركيز الحمض النووي في كل وقت من الأوقات نقطة واكتساب الارتفاع. يتم التركيز على التحضير لتجربة صفيحة 96-جيدا، ولكن يشار إليها أيضا وحدات التخزين المطابقة لشكل لوحة 384-جيدا.

  1. حل 0.5% w/v نقطة انصهار منخفضة [اغروس] في المخزن المؤقت ملزم بغلي ذلك في فرن ميكروويف مختبر. وبعد انحلال كاملة، ضبط مستوى الصوت مرة أخرى مع ddH2س لتعويض التبخر الممكنة.
    ملاحظة: لمزيد من الراحة، إعداد مخزون من 10-20 مل 10 مختبرين للمواد الهلامية وتذوب لهم عند 75 درجة مئوية عندما تكون هناك حاجة إليها. ويمكن تخزين مخزونات جل في الرايت
    تنبيه: كن حذراً لتجنب محمص لحل جل في فرن ميكروويف. اختصار الوقت تدفئة فترات مع المصافحة بين الأفضل.
  2. إعداد الآبار معايرة، والمعايرة، أولاً تذوب اثنين 10 مل جل مختبرين الأسهم عند 75 درجة مئوية تحت تهتز.
    1. استخدام ميليلتر 240 (بما في ذلك النفقات 20%) لكل منافس (n = عدد تسلسل المنافس).
    2. استخدم نفس الحجم من جل للبئر المعايرة ملحوظة لضمان تساوي درجة الحرارة واللزوجة لكل المواد الهلامية.
    3. تعيين درجة الحرارة إلى 35 درجة مئوية ثم الانتظار لدرجة الحرارة إلى حجته.
  3. لمعايرة الآبار، إضافة مرجع نانومتر (تركيز النهائي) المهجنة 1.4 الحمض النووي (التي تم الحصول عليها في الخطوة 3)، البروتين TF (تركيز نهائي جTF = 20-60 نانومتر، كما حددت في الخطوة 2، 6)، DTT (0.2 مم)، وربط المخزن المؤقت في إجمالي حجم ميليلتر ن x 200 أو ميليلتر ن x 13 في 96 -أو لوحة 384-جيد التنسيق، على التوالي (بالإضافة إلى النفقات العامة). مزيج دقيق بعكس تهز (لا دوامة).
  4. ببطء بإضافة 200 ميليلتر الواحدة وكذلك في شكل لوحة 96-جيدا (13 ميليلتر/جيدا لآبار 386) لحل جل إعداد في الخطوة السابقة إلى الآبار المعايرة لوحة جيدا.
  5. لمعايرة الآبار، أولاً بإضافة 5 نانومتر ملحوظة لجل ذاب خارج الآبار (إجمالي حجم اعتماداً على تنسيق لوحة جيدا المستخدمة، والعدد من معايرة الآبار؛ وعادة ما تكون 5-6 كل لوح جيدا ما يكفي).
  6. "الماصة؛" 200 ميليلتر (13 ميليلتر لتنسيق لوحة 384-جيدا) لملاحظة تحتوي على جل ببطء داخل الآبار المعايرة للوحة جيدا وتأكد من تجنب فقاعات الهواء.
    ملاحظة: استخدام بيبيتس الإلكترونية أو الروبوتات يزيد بشكل ملحوظ إمكانية تكرار نتائج.
  7. السماح للهلام يصلب 10 دقيقة في RT، وآخر 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية (إزالة التكثيف من الزجاج بعد ذلك إذا لزم الأمر). تأكد من القيام بجميع هذه الخطوات على سطح أفقي تماما لتجنب السطوح جل متنافرة.
    ملاحظة: يتم عادة مستقرة المواد الهلامية التي تحتوي على البروتين لساعات عدة على الأقل في 4 درجات مئوية.

5-إضافة الحل الحمض النووي المنافس

ملاحظة: الحلول التالية التي ينبغي أن تعد قبل بدء المعايرة وتضاف علاوة على الآبار والمعايرة والمعايرة في وقت واحد.

  1. إضافة ملدن المسمى مرجع الحمض النووي والبروتين في 3 × المخزن المؤقت ملزم في الأوقات 3 تركيزات أعلى من مختبرين الأسهم جل.
    1. تعتيق ميليلتر 20 مزيج من الحل التي تم الحصول عليها مع 40 ميليلتر لكل منافس حل الحمض النووي التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.
    2. لكل بئر المعايرة، مزيج 20 ميليلتر من 3 × ملزمة مخزن يحتوي على 15 ملم NB الحل مع 40 ميليلتر من منافس ملدنة الحمض النووي (أي تسلسل من نفس الطول مناسبة).
      ملاحظة: لوحات 384، حسنا، استخدم ميليلتر 21 بدلاً من 60 ميليلتر في المجموع.
  2. بشكل اختياري، تحقق تجانس مستويات الارتفاع جل في آبار مختلفة من اللوحة سبيكتروسكوبيكالي عن طريق قياس امتصاص في 380 نانومتر، باستخدام قارئ لوحة متعددة جيدا (تكون القيم امتصاص تتناسب مع مرتفعات جل).
  3. إضافة 50 ميليلتر (7 ميليلتر لتنسيق لوحة 384-جيدا) الحلول الحمض النووي المنافس مختلطة (تعتيق في الخطوة 3) على رأس المواد الهلامية. في محاولة لإضافة كافة الحلول المنافس في الوقت نفسه قدر الإمكان باستخدام بيبيتس متعدد القنوات الإلكترونية أو رأس بيبيتينج 96-القناة، إذا كانت متوفرة. بعد إضافة حلول المنافس، ضع اللوحة في مرحلة مجهر وبدء القياسات فورا (الخطوة 7).

6. الحصول على الصور

  1. الحصول على التتابع مرات سلسلة z-مداخن (مثلاً، استخدام طائرات 12 و ms 100-300 من وقت الإضاءة). تجنب أخذ الصور قريبة جداً إلى السطح جيدا (< مكم ~1.4 مع لوحات المستخدمة هنا) لاستبعاد أي تحيز الاستقطاب.
  2. إجراء دورات 10-25 من القياسات حتى كائنة كاملة من الحمض النووي المسمى الإشارة من TF. عادة ما يتم التوصل إلى نقطة النهاية بعد ح 1-2، تبعاً لحركية ملزمة والانتشارية للمنافس الحمض النووي.

7-استخراج FA(z,t) من البيانات الخام

  1. بمجرد قد تم تصويرها صفيحة جيدا، تحسب من الصور الفلورية الخام قيم بكسل متوسط كثافة المناطق ذات الاهتمام للموازي (ط=) وعمودياً (ط+) استقطاب مكونات (الشكل 1ج). وهذا يمكن أن يتم تلقائياً باستخدام البرمجيات الورك فا23.
    ملاحظة: البرنامج الهيب فا، دليل إرشادي، ومجموعة بيانات اختبار يمكن تحميلها23. بدلاً من ذلك، استخدام أي برامج أخرى مكتوبة بمخصص لاستخراج أنا+ وأنا= والقيام بتحليل المتلقين للمعلومات للمنحنيات المعايرة، كما هو موضح بالتفصيل أدناه.
  2. حساب اتحاد كرة القدم لكل بئر. لكل بئر، يحسب البرنامج النصي FA(z,t) في كل z-موقف ووقت نقطة تي استناداً إلى:
    المعادلة 1:Equation 1
    حيث G هي صك ز-معامل تقوم بتصحيح أي انحياز القناة عمودي.
  3. تحديد ز-عامل إعداد الفحص المجهري عن طريق قياس اتحاد كرة القدم أي الحلول التي تحتوي على صبغة فلورسنت من تباين المعروفة. استخراج عناصر الاستقطاب اثنين للإشارة ومن ثم استخدام المعادلة 1 الحصول على ز، معرفة اتحاد كرة القدم الحل (G = 1.15 في هذا الإعداد).

8-معايرة المنحنى لتحديد تركيز الحمض النووي المنافس من اتحاد كرة القدمملحوظة:

  1. يصلب ميليلتر 120 لكل مرجع إلى الأمام وعكس oligomer (تركيز الأسهم 100 مم؛ أي تسلسل عشوائي مع نفس الطول كمنافس تسلسل يمكن استخدامها) وتخلط مع ميليلتر 120 3 × المخزن المؤقت ملزم يتضمن NB (15 نانومتر).
  2. إعداد سلسلة تمييع مع تخفيف 1:2 في 1 × المخزن المؤقت للربط مع تخفيف 6 في المجموع. ميكس 50 ميليلتر لتخفيف هذه مع 200 ميليلتر من نقطة انصهار منخفضة 0.5% [اغروس] (T > 35 درجة مئوية) جل في 1 × ربط المخزن المؤقت الذي يحتوي على 5 نانومتر ملحوظة في تريبليكاتيس.
  3. إضافة 200 ميليلتر لكل حل من الحلول 6 إعداد في الخطوة السابقة في صفيحة 96-جيدا وتخزين لوحة ح 1 عند 4 درجة مئوية لضمان كامل جيليشن، ثم 1 ح في تدبير الرايت اتحاد كرة القدمملحوظة من الحلول باستخدام الإعداد الورك فا.
  4. استخراج فاNB (z, t) وفقا للخطوة السابقة وتناسب البيانات باستخدام معادلة بتلة:
    المعادلة 2:Equation 2
    حيث Cالحمض النووي هو تركيز oligomer الحمض النووي؛ ك تشغل تركيز ليغومرات الحمض النووي في نصفها مواقع الربط؛ اتحاد كرة القدمكحد أقصى تطبيع ثابت؛ و n هو معامل هيل. يتم تعيين كو اتحاد كرة القدمكحد أقصى، و نون كمعلمات الحرة أثناء الإجراء المناسب.
  5. أدخل المعلمات الثلاث التي تم الحصول عليها من الإجراء المناسب في البرنامج فا الورك (في اللوحة اليسرى السفلي).
  6. كرر تحديد منحنى المعايرة كل بضعة أشهر، أو بعد إجراء التغييرات في إعداد الفحص المجهري.

9-تحديد تركيزات الحمض النووي المنافس

  1. استخدام البرمجيات الورك فا لاستخراج ج (z, t) من القياسات فاNB(z, t) (الشكل 3). أولاً الحصول على منحنى المعايرة كما هو موضح في المقطع السابق وإدخال المعلمات المناسب للبرنامج (انظر دليل للحصول على التفاصيل).
  2. استخدم البرنامج لاستقراء تلقائياً c(z,t) ج < 100 نانومتر (انظر دليل للحصول على تفاصيل) استخدام المعادلة 3 (الشكل 3ب)، الذي يصف نشر المنافس الحمض النووي داخل [اغروس] هلام المصفوفة أحادية البعد، على افتراض نشر مجاناً.
    المعادلة 3:Equation 3
    حيث ج0 هو تركيز الأولية للمنافس الحمض النووي؛ erf هي دالة الخطأ؛ z هو الموقف؛ D هو معامل نشر المنافس الحمض النووي؛ ور0 هو وقت البدء للقياسات. المعلمات الحرة المستخدمة هي ج0 و z/Equation 4.

10-التقليدية المعايرة التنافسية مع الورك فا لربط الحمض النووي قوي جداً

  1. متسلسل تمييع ليغومرات الحمض النووي المنافس مختلفة في الصفوف من لوحة 96-جيدا (أو لوحة 384-جيدا) في التركيزات: 0، 1.25، 3.5، 9، 19، 45، 90، 190، 425، 900، 1900، وشمال البحر الأبيض المتوسط 4000. إضافة المرجع المسمى Cy5 الحمض النووي (1 نانومتر) وفريق العمل (20-50 نانومتر) بتركيز مستمر، مع إجمالي حجم 200 ميليلتر الواحدة وكذلك في ربط المخزن المؤقت (الشكل 5). انتظر 40 دقيقة حتى يتم تحقيق توازن دينامي حراري واكتساب (مع الإعداد فا الورك) z-مداخن لكل بئر (الحصول على عدة صور للبئر الواحد يقلل تقلب بحساب متوسط FA القيم المحسوبة).
  2. بناء منحنيات المعايرة الربط التوازن ويصلح لهم مع المعادلة 4 (الشكل 5ب). ق دكمصممة بالمعايرة التنافسية التقليدية مماثلة لتلك ناتجة عن الورك فا استخدام مصفوفة هلام [اغروس]20.

11-من المناسب إجراء منحنيات المعايرة اتحاد كرة القدم

  1. عرض في برنامج الورك فا منحنيات المعايرة أعيد بناؤها للتسلسل الفرد المنافس FA(z,t) = f[c(z,t)] وبصريا التحقق من جودة البيانات (انظر دليل للحصول على التفاصيل). إذا لزم الأمر، صقل المعايير المستخدمة لتحديد تركيزات الحمض النووي المنافس في الخطوة 10.
  2. تناسب كل منحنى المعايرة الفردية تلقائياً باستخدام المعادلة 4، الذي يعطي حلاً تحليلية لمعايرة تنافسية فحوصات24.
    المعادلة 4:Equation 5
    مع:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    حيث RT هو تركيز البروتين؛ LT غير مسمى و لش هو تركيز الحمض النووي المسمى؛ كD2 هو ثابت التفكك التي سيجري تحديدها؛ آرتي هو تركيز البروتين النشط؛ و A و B معلمات التطبيع.

    أولاً تحديد كD1، الذي يخدم كمرجع لتحديد القيم كD2 المختلفة. كD1 يمكن تحديد سهولة مع الفحص عن طريق اختيار تسلسل الحمض النووي صبغ-مرجع كتسلسل المنافس غير مسمى الحمض النووي (انظر الدليل).
  3. قم بإدخال القيمة التي تم الحصول عليها من كD1 في البرنامج وحساب القيم كD2 لكل منافس الحمض النووي على اللوحة.
    ملاحظة: المعلمات مجاناً للإجراء المناسب هي كD2، آرتي، ألف وباء
  4. تصدير ثابت تفكك كD2 وتركيز البروتين النشط آرتي لجميع الآبار المعايرة الفردية اللوحة عن طريق النقر فوق الزر "تصدير" في البرنامج.

12-بوم البناء، خصوصية التفاعل البروتين-الحمض النووي، والتهم الزائفة

إنشاء تسلسل الشعارات PWMs مختلفة باستخدام أداة على الإنترنت ويبلوجو 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi) كما هو موضح سابقا20.

Representative Results

ونحن تطبيق HiP فا TFs تجزئة الجينات شبكة25،26، الذي يولد نمط الجسم الأمامي الخلفي للأجنة المورفولوجية، إلى حد كبير من خلال تنظيم النسخي. من هذه الشبكة، اخترنا "bzip" المجال TF العملاقة (Gt) لتحليل مفصل (الشكل 4). نظراً لعوامل النسخ كاملة الطول من الصعب التعبير عن وتسفر عن معظمها نفس التفضيلات ملزمة كتلك المجالات (DBD) ملزمة الحمض النووي13، استخدمنا دبد تنصهر فيها ضريبة السلع والخدمات وأعربت في القولونية GST الانصهار البروتينات لبناء تحقيق النتائج نفسها ك وحدة دبدس20.

التسلسل توافق Gt (تاكجتاج) يمثل تسلسل الملزمة الأقوى التي عقدنا العزم كما هو موضح أعلاه. ثم أننا التحقيق في تأثير على الطاقة ملزمة لجميع الطفرات نقطة واحدة ممكنة ضمن تسلسل توافق Gt 10-مير (ما مجموعة 30)، الذي كان واقفاً إلى جانب قواعد إضافية في نهايات 5 'و 3'. قمنا بقياس replicates اثنين عينات هلام التي أنتجت باستخدام التنفيذ التلقائي، ونسخ إضافية واحدة تنتج يدوياً للمقارنة. ك قدتراوحت بين 0.6 إلى > 2000 نانومتر لمتواليات تحور منفردة، وأكدنا أيضا انعدام تام للربط إلى تسلسل "غير ملزمة" (البيانات لا تظهر).

عادة على غرار TF-الحمض النووي ملزم خصوصيات هي استخدام مصفوفة وزن موقف (بوم)، التي يتم تعيين نقاط لكل النوكليوتيدات الممكنة في كل موضع في عزر ملزمة. بوم يفترض أن كل موقف يسهم في ربط القوة بشكل مستقل، وفي معظم الحالات تشكل نموذجا كافياً ل TF ملزمة تفضيلات27. نحن ولدت PWMs المنقحة على أساس القياسات لدينا تقارب عقب إنشاء إجراءات28،29 ومقارنة لهم PWMs اثنين سبق الإبلاغ عنها في الأدب. الأول هو استناداً إلى التهم التردد النوكليوتيدات من مواقع حددتها الحمض النووي footprinting4،5الربط، وتم الحصول على بوم الثاني بالتحديد (B1H) واحد-الهجين البكتيرية. 15

عالية تشابه PWMs ل replicates الثلاثة (الشكل 4، اللوحة العلوية)، بما في ذلك للحصول على نموذج أعد يدوياً (تكرار 3)، ويدل إمكانية تكرار نتائج عالية لأسلوب الهيب فا. حين PWMs التي حصل عليها الورك فا عموما مماثلة إلى PWMs التي تم الحصول عليها بالأساليب الأخرى (الشكل 4، الفريق أقل)، هناك انحرافات: في الموضع 2 (السهم الأسود)، بداية فكرة "bzip" الأساسية، الطفرات T > (ز, C, A) يؤدي إلى إكمال فقدان الربط في عزر التي حصل عليها الورك-اتحاد كرة القدم، وما يتسق مع فكرة B1H ولكن ليس مع الذي حصل مع footprinting الدناز، الذي ما زال الربط القوى نسبيا للقواعد (G، A). على العكس من ذلك، في وضع 7 (السهم الرمادي)، أن الطفرة T > ج يؤدي إلى ربط أقوى كثيرا عما هو متوقع استناداً إلى PWMs المقاسة سابقا.

انحرافات أخرى أكثر دهاء ولكن ليس أقل أهمية. إجمالاً، "بوم" الورك فا أقل تحديداً من الأخريين، مما يعكس حقيقة أن العديد من الطفرات من توافق الآراء لا يزال ينتج معتدل القوة الملزمة. وهذا يمكن قياسها كمياً باستخدام محتوى المعلومات (IC). جيم بت 11.5 الورك فا المصفوفة (متوسط replicates الثلاثة)، بالمقارنة مع IC = بتات 13.4 وبتات 16.8 الدناز footprinting ومصفوفات B1H، على التوالي. عموما (ولكن ليس عالمياً)، فإن PWMs التي حصلت عليها الورك فا أقل تحديداً من تلك التي تم الحصول عليها بطرق أخرى، استناداً إلى 26 TFs التحقيق20.

Figure 1
الشكل 1:تصوير التخطيطي الورك فا المقايسة والإعداد التجريبية. (أ) جل نظام التسليم للمعايرة منافس الحمض النووي في بئر واحدة. (ب) إعداد الفحص المجهري فا الورك. تخصيص مجهر ويديفيلد الآلي مع الكشف عن الضوء الفلورية الاستقطاب على كاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر. (ج) الخام fluorescence الصورة مع هاتين المنطقتين من الفائدة المستخدمة لتحديد خط (أحمر) وعمودياً (الأخضر) استقطاب مكونات. (د) نموذجي تخطيط لوحة 96-جيدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : البيانات "الخام اتحاد كرة القدم" ومنحنيات المعايرة أعيد بناؤها. (أ) مسار FA(z,t) نموذجي لمعايرة التي تحتوي على NB. (ب، ج) FA(z,t) الوقت مسارات لبئرين معايرة قياس ملزمة قوية (ب) والمنافس ربط الحمض النووي (ج) أكثر اعتدالا. (د، ه) المقابلة أعيد بناء اتحاد كرة القدم قياسات المعايرة وتركيبها منحنيات قوية (د) ومتوسطة (ه) ملزمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : تحديد تركيز ج الحمض النووي المنافس (z, t) استخدام "النيل الأزرق" (NB). (أ) اتحاد كرة القدم-التركيز منحنى المعايرة ل 16 أزواج قاعدة الحمض النووي ليغومرات. ملحوظة: في سلسلة معايرة تقليدية، مضمن في [اغروس] هلام جنبا إلى جنب مع تركيزات مختلفة من منافس الحمض النووي. تقارب ملاحظة أن الحمض النووي هو20من تسلسل مستقل؛ ولذلك، يمكن استخدام منحنيات المعايرة ذاتها لتحديد ج (z، t) لتسلسل الحمض النووي مختلفة من نفس الطول. (ب) منافس الحمض النووي وقت نشر الشخصية في ارتفاع تعسفي z تحديد استخدام خمسة آبار المعايرة. لكل دورة من دورات القياس، يتم عرض فاس متوسط أربعة آبار المحتوية على ملاحظة كنقط بيضاء. المنحنيات مزودة باستخدام المعادلة 3 (خط أبيض، والآبار الفردية في اللون) وجيم (z، t) بتركيزات منخفضة (ج < ~ 100 nM) يتحدد المنحنى المناسب المستنتجة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : ملزمة خصوصيات الأسرة المجال "bzip" العملاقة TF (Gt). PWMs الورك فا من replicates ثلاثة: اثنان المعدة باستخدام التنفيذ التلقائي، وواحد أعد يدوياً (اللوحة العلوية) يتم مقارنة مع PWMs الناتجة عن الدناز footprinting وعن أسلوب الاختيار (B1H) واحد-الهجين البكتيرية (أسفل اللوحة). إجمالاً، زخارف ملزمة الورك فا تتفق مع البيانات السابقة، لكن كما تظهر اختلافات كبيرة، كما أبرز مع الأسهم السوداء والرمادية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : المعايرة التنافسية التقليدية مع الورك فا. (أ) ويظهر تصميم لوحة 8 منافس مختلفة الحمض المخفف متسلسل في المخزن المؤقت ملزم في صف واحد من لوحة 96-جيدا. يظهر مخطط حرارة فا للقوة الملزمة التعسفي مختلفة. (ب) التنافسية معايرة المنافسين الثلاثة المعينة ملزمة ل TF Bcd مع مختلف الانتماءات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

الهيب فا أسلوب جديد شامل لتحديد المناظر الطبيعية تفضيل ملزمة للتفاعلات TF-الحمض النووي. ومن التدابير الانتماءات الملزمة من حيث الحمض النووي عزر المتغيرات مباشرة، تجنب أي الافتراض أن أفضليات ملزمة تنعكس في تواتر حدوث النوكليوتيدات في مجموعة من موثقات فوق العتبة. القياس يجري في الحل دون التثبيت وتدخل الميكانيكية أو الكيميائية برد فعل ملزم، تقارب شروط التوازن قدر الإمكان. نظام التسليم المراقب يسمح قياس منحنى المعايرة الكامل داخل واحدة جيدا ويزيد الإنتاجية والموثوقية في الوقت نفسه توفير البروتين. يسمح استخدام هدفا مع ارتفاع الفتحة العددية والكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر مع جمع خفيفة عالية كفاءة للكشف عن الضوء الفلورسنت حساسة للغاية. ومن ثم مع هذا الإعداد، فا الصغيرة يتغير منخفضة كما يمكن كشف النائب 10-15 بدقة؛ في الممارسة العملية، وهذا يعني أن أي رد فعل ملزم هو سهولة الكشف عن الزيادة الجماعية بعد ملزم الحد الأدنى (منخفضة كنسبة شامل 2) التي. عادة هذا ليس الحال بالنسبة للنظم التجارية مثل القراء الميكروسكوبية. بسبب حساسية عالية، الورك فا يوسع نطاق ثوابت التفكك التي يمكن قياس موثوق بها في مجموعة بيكومولار. مصممون الطاقات ملزم بدقة على عدة أوامر من ضخامة.

لتقييم نوعية PWMs المنقحة، أجرينا نوعين من التحليل20. نحن اختبار، لخمسة عوامل تجزئة شبكة الجينات، وجيدا كيف يمكن التنبؤ PWMs مختلفة الملامح seq رقاقة تجريبية في مناطق الجينوم 21 تجزئة الجينات. كاختبار ثاني، قمنا باستخدام نموذج التسلسل للتعبير4 أن تتنبأ أنماط التعبير من القدرة على الانقسام على أساس تركيز البروتين وتفضيل ملزمة TFs المشاركة. في كلتا العمليتين، وجدنا أن PWMs الورك فا أقل محددة تؤدي إلى حد كبير أفضل من footprinting أكثر تحديداً و B1H PWMs20.

خلافا لأساليب حيثياته ، الورك فا يتطلب بعض المعرفة المسبقة بالأفضلية المعطاة لفريق العمل ملزم. ومع ذلك، تسلسل توافق معروفة TFs العديد من، والعديد من الأساليب القائمة يمكن توريد منهم13،،من1415. إذا لزم الأمر، تسلسل صحيح الربط الأمثل ويمكن الاطلاع على شكل تكراري.

قمنا باستخدام الحمض النووي إشارة ليغومرات المسمى فلوريسسينتلي مع Cy5 وبوديبي--650. أثبتت هذه الأصباغ أداء جيدا لكرة القدم قياسات نظراً لتباين المنضمة وغير المنضمة المرجع المسمى الحمض النووي الأكبر بين الأصباغ اختبار مختلفة. وهذا ما يضمن طائفة ديناميكية الحد أقصى لقيم كرة القدم. وبصفة عامة، أي صبغة الفلورسنت مع الأسفار عمر ≥ 1 ns يرجح أن يكون مناسباً لكنه يحتاج إلى أن تختبر أولاً. إذا كان ذلك ممكناً، فإنه ينصح باستخدام الأصباغ الاستشعاع في نطاق الأشعة تحت الحمراء القريبة للتقليل من البروتين أوتوفلوريسسينسي.

أن الخطوة الأكثر أهمية من الإجراءات التجريبية هي بيبيتينج الهلام في لوحات جيدا. إمكانية تكرار نتائج جيدة يتطلب أحجام جل أن تكون موحدة قدر الإمكان. التغيرات في الارتفاع جل تترجم إلى تغييرات الانتشارية oligomer الحمض النووي تنافسية، وبالتالي تغييرات واضحة في تقارب عند تقييم البيانات. وهذا هو المصدر الرئيسي للفرق في تكرار تقنية. ويحسن استخدام تقنيات بيبيت أو الأتمتة الإلكترونية إمكانية تكرار نتائج. ويمكن تجنب فقاعات الهواء داخل الجل ببطء وعناية بيبيتينج. من المهم أيضا لإضافة جميع الحلول المنافس على رأس الآبار المعايرة مع تأخير صغيرة قدر الإمكان. لإمكانية تكرار نتائج أفضل، يمكن أن يكون آليا العملية برمتها باستخدام روبوت بيبيتينج مع حاضنات الحرارة. هو جزء هام لنقل البروتوكول لأتمتة التحسين اللازمة لدرجة حرارة الحاضنة وأوقات الاحتضان. تأكد لإيجاد توازن أمثل بين لزوجة الهلام (أي. ولا باردة جداً) والاستقرار للبروتينات (أي، لا حار جداً). وهذا يتوقف على حد سواء على سرعة الاستغناء عن المواد الهلامية في الآبار والاستقرار من البروتين المستخدمة.

الهيب فا يجعل استخدام نظام التسليم المراقب ليغومرات الحمض النووي المنافس. لإنشاء منحنيات المعايرة، من الضروري تحديد تركيز الحمض النووي المنافس c(z,t) لكل معطى z-ضع داخل المصفوفة جل والوقت نقطة t. هذا خطوة حاسمة أخرى، نظراً لعزم كس يعتمد مباشرة على c(z,t). وتستخدم لهذا الغرض (الشكل 1د، الشكل 2) معايرة الآبار التي تحتوي على صبغ ملحوظة كجهاز استشعار لتركيز الحمض النووي. عادة، وتكفي 3-5 معايرة الآبار التي تحتوي على ملاحظة للوحة الواحدة. قبل أن يقيم أي الورك فا التجربة، ينبغي إنشاء منحنى معايرة ملحوظة للإنشاء قبل تنفيذ سلسلة معايرة تقليدية من NB حله في [اغروس] هلام مع منافس الحمض النووي لأي تسلسل بتركيزات مختلفة (الرقم 3 )، كما هو موضح بالتفصيل في الخطوة 8. في حالة ربط قوي جداً (كد < 500 م)، يصبح استقراء المستخدمة لتحديد تركيزات منخفضة من منافس الحمض النووي تحد، نظراً لأنها أقل دقة من قياس مباشر. ومع ذلك، ل TFs مع هذه منخفضة ك قد، يمكن استخدام الإعداد الورك فا القيام معايرة تنافسية تقليدية في المخزن المؤقت ملزم دون استخدام مصفوفة [اغروس] هلام (الشكل 5). على سبيل المثال، يمكن إجراء المعايرة كامل واحد بتركيزات مختلفة 12 من الدنا المنافس في صف واحد من لوحة 96-جيدا.

نظام التسليم المراقب أيضا يتطلب سرعة حركية ملزمة TF-الحمض النووي والبروتينات مستقرة، منذ نشر على الرغم من [اغروس] هلام الديناميكية (على الرغم من بطء). يمكن اختبار كل الخصائص مباشرة مع الإعداد الورك فا بالتالي، مع مرور الوقت، اتحاد كرة القدم TFs للفائدة عندما تلتزم منهما المسمى فلوريسسينتلي مرجع الحمض النووي. قياس معدلات كعلى كOFF لعوامل التحقيق، وتبين لهم أن يكون بناء على أمر من ميلي ثانية إلى ثانية20، وفقا لآخر الدراسات30. هذا سريع بما فيه الكفاية لضمان أن تجري القياسات في التوازن. وفي حالة أخرى ردود فعل ملزم بحركية أبطأ، يمكن ضبطها الانتشارية للمنافس بخفض تركيزه أو تقليل حجم المسام هلام. في حالة اختبار TFs، كلها قد ر سريعقبالة (~ ثانية)، وقت قياس إجمالي حوالي 1-2 ساعة كافية لضمان توازن دينامي حراري في كل قياس.

مشكلة محتملة أخرى تتصل بالبروتين هو تشكيل المجاميع البروتين التي قد تغير من قياسات اتحاد كرة القدم. استخدام شروط المخزن المؤقت الأخرى التي تحتوي على إضافات مختلفة (مثل تينسيديس) يمكن أن يمنع تشكيل التجميعية، إذا لزم الأمر.

وقد عملنا على افتراض الخطي لبوم؛ ومع ذلك، يمكن تحجيم الورك فا لتشمل جميع الطفرات النوكليوتيدات دي ممكن في التسلسل إلى توافق في الآراء. وأخيراً، يمكن تكييفها لقياس أنواع أخرى من التفاعلات ملزمة الورك فا. والشرط الأساسي أن يكون متاح جزيء إشارة مناسبة ملزمة بالبروتين الذي يمكن أن يكون المسمى فلوريسسينتلي. مع نظام التسليم المراقب، يمكن إنشاء تدرج لوني تركيز لأي نوع من [ليغند]؛ ولذلك، يمكن قياس تفاعلات البروتين البروتين والبروتين المخدرات مع المثل العالية الدقة والإنتاجية.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونحن نشكر ج. مولر لاستنساخ كدنا وأعضاء من مختبر فرنسي، وخاصة س. بيرجيلت، لمشورة قيمة ونقاش حماسي. وأيد هذا العمل SFB 646، شبكات تنظيمية في التعبير الجينوم والصيانة (كج, P.B.)، المركز للعلوم البروتين المتكامل (عنوان)، ومدرسة الدراسات العليا للعلوم الكمية ميونيخ (ماجستير). تسلم عنوان دعم الأوقيانوغرافية ألماني (SFB 646، SFB 1064، سيبسم، كبم)، أوند فيما für بونديسمينيستيريوم Forschung (الألمانية: أبيو-سيستيمبيولوجي إيننوفاتيونسويتبيويرب)، هومبولدت-المؤسسة (ألكسندر فون همبولدت، و الأستاذية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).
قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter