Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

doi: 10.3791/58763 Published: February 7, 2019

Summary

Her præsenterer vi en roman metode til fastsættelse af bindende tilhørsforhold ved ligevægt og i løsning med høj følsomhed på en stor skala. Dette forbedrer kvantitativ analyse af transskription faktor-DNA bindende. Metoden er baseret på automatiseret fluorescens anisotropy målinger i et kontrolleret levering system.

Abstract

Nøjagtig kvantificering af transskription faktor (TF)-DNA interaktioner er afgørende for at forstå reguleringen af genekspression. Da eksisterende tilgange lider af betydelige begrænsninger, har vi udviklet en ny metode til bestemmelse af TF-DNA bindende tilhørsforhold med høj følsomhed på en stor skala. Analysen bygger på princippet om, at etablerede fluorescens anisotropy (FA) men introducerer vigtige tekniske forbedringer. Først, vi måler en fuld FA konkurrencedygtige titreringskurven i et enkelt godt ved at indarbejde TF og fluorescently mærket reference DNA i en porøs Agarosen gel matrix. Umærkede DNA oligomer er indlæst på toppen som en konkurrent og gennem diffusion, danner en spatio-temporale gradient. Den resulterende FA gradient er derefter læse ved hjælp af en tilpasset epifluorescensmikroskop mikroskop setup. Denne forbedrede opsætning øger følsomheden af FA signal detection, så både svage og stærke binding til kvantificeres pålideligt, selv for molekyler af lignende Molekylær vægt. På denne måde, vi kan måle en titreringskurven pr. brønd af et multi godt plade, og gennem en passende procedure, vi kan udvinde både absolutte dissociationskonstant (KD) og aktive proteinkoncentration. Ved at teste alle enkelt mutation varianter af en given konsensus bindende sekvens, kan vi kortlægge hele bindende specificitet landskab af en TF, typisk på en enkelt plade. De resulterende holdning vægt matricer (PWMs) over de stammer fra andre metoder til at forudsige i vivo TF belægning. Her præsenterer vi en detaljeret vejledning for at gennemføre HiP-FA på en konventionelle automatisk fluorescerende mikroskop og data analyse pipeline.

Introduction

På grund af transkriptionsfaktorer (TFs) centrale rolle i genregulering, bestemme deres bindende præferencer i en kvantitativ måde er af afgørende betydning. Skelsættende undersøgelser af von Hippel introducerede tanken om, at lovgivningsmæssige TFs hurtigt genkende DNA, således at deres bindende er godt beskrevet af den termodynamisk ligevægt, mens de downstream begivenheder ved at rekruttere RNA polymerase til selskabet kontrolleres af langsommere kinetik1. Seneste i vivo bindende undersøgelser tyder på, at dette billede er sandsynligvis mere komplekse2,3; ikke desto mindre disse generelle antagelser tjene som gode approksimationer og har støttet mange beregningsmæssige metoder til at finde cis-regulerende elementer og forudsige udtryk fra sekvenser4,5,6. Mens ligevægt bindende er således blevet med held ansat som et koncept, nuværende metoder til bestemmelse af TF-DNA interaktioner fokusere på bindende specificitet og typisk ikke direkte foranstaltning bindende tilhørsforhold ved ligevægt. Systematisk måling af TF-DNA bindende repræsenterer en stor teknisk udfordring, og de eksisterende metoder har flere forskellige begrænsninger.

Kromatin immunoprecipitation efterfulgt af dyb sekventering (ChIP-seq)7, den mest udbredte i vivo teknik, tillader ikke måling af bindende tilhørsforhold eller den præcise lokalisering af bindende websteder inden for genomisk fragmenter. Flere in vitro- metoder, herunder DNase footprinting8, elektroforese mobilitet shift (EMSA)9, overflade plasmon resonans (SPR)10og individuel thermophoresis11 er i stand til at måle bindende tilhørsforhold, men de er relativt lav dataoverførselshastighed. Omvendt, høj overførselshastighed teknikker herunder protein bindende microarrays12, HT-SELEX13,14, og bakteriel one-hybrid (B1H)15 er ikke i stand til at måle bindende tilhørsforhold og typisk giver alt for specifikke bindende sekvenser, som hovedsagelig skyldes den strenge udvalg eller vask skridt nødvendigt. Nyere udvikling omfatter dyb sekventering baseret HiTS-FLIP16, SELEX-seq17, og mikrofluidik-baserede MITOMI18 eller smil-Seq19, som gør det muligt for udvinding af absolut bindende tilhørsforhold; de er dog afhængige måling fluorescens intensiteter af mærket TF og DNA. Fluorescens signaler, derfor bliver begrænsende på lavt proteinindhold koncentrationer og fastlæggelse af lav KD værdier (< ~ 10 nM). Derudover finder TF-DNA-binding i disse metoder sted på tynde flader, at rejse spørgsmål med uspecifik bindende og/eller auto-fluorescens baggrund, hvilket gør det vanskeligt at nøjagtigt kvantificere svage bindende.

For at løse disse begrænsninger, har vi udviklet en ny metode til at bestemme TF-DNA affinitet landskaber ved ligevægt og i løsning, som vi kaldte højtydende fluorescens anisotropy (hofte-FA)20. Teknikken er baseret på etableret fluorescens anisotropy (FA) assay21 men modificeret til at måle bindende konstanter med høj følsomhed og på store ved hjælp af et tilpasset elektronisk mikroskop og analysis setup.

FA assay overvåger samspillet mellem fluorescently mærket arter (som en DNA oligomer) til bindende partner, i dette tilfælde en TF, ved at måle den molekylære rotation af det mærkede molekyle. Ved binding til TF aftager dens rotationshastighed på grund af højere hydrodynamiske radius og Molekylær vægt af den bundne kompleks, hvilket resulterer i øget FA. Nøjagtig måling af det meget stærke binding (KD < ~ 1 nM) kræver brug af lave koncentrationer af mærket, reference DNA (c < ~ 1 nM). Det er vanskeligt at opnå med en kommerciel instrument som en standard mikrotiterplade læser. Derudover er en stor størrelse forskel (10-100 fold) mellem de bundne og ubundne komplekser normalt nødvendigt at forbyde maaling af interaktioner mellem TF bindende domæner og korte DNA oligomerer, som typisk er af nogenlunde samme Molekylær vægt . Endelig, en komplet titreringskurven normalt kræver forberedelse og måling af flere brønde, der indeholder en koncentration serie for at titrere arter.

For at løse disse problemer, bruger vi en widefield mikroskopi setup, modificeret til at opnå høj påvisning følsomhed og tillade FA målinger ved forskellige z-positioner af en enkelt brønd. Dette gør det muligt for os at overvåge bindende interaktioner mellem arter af lignende molekylvægt og med høje tilhørsforhold. Højere overførselshastighed er opnået ved at måle FA i multi godt plade formater og gennemføre en hele titrering serie i en enkelt brønd med en kontrolleret leverance system (figur 1en). Derudover ved at ansætte en konkurrencedygtig bindende assay, udtrækker vi ikke kun bindende konstanter, men også koncentrationen af aktive protein. Dette er et vigtigt element i analysen, da kun en del af de udtrykte TF molekyler er aktive på grund af protein misfoldning eller nedbrydning. Opsætningen af eksperimenterende er baseret på en kommerciel epifluorescensmikroskop udstyret med XY - og Z-piezo faser. Vi opgraderet system med eksterne laser excitation, så fundet to udsendte lineær polarisation komponenter på chip i en EM-CCD kamera med høj kvante effektivitet for lette påvisning (figur 1b og 1 c). Systemet bruger en høj numerisk blænde (NA) mål kombineret med en ultra-følsomme sensor og dermed giver meget følsomme FA målinger. Ved at optage fluorescens z-stakke, kan bindende interaktioner måles langs den optiske z-aksen ved hjælp af en heterogene matrix til reaktanter. Alle disse ændringer kan gennemføres umiddelbart på et eksisterende system og er omkostningseffektive.

Vi anvender en konkurrencedygtig bindende assay som bindende affinitet på en umærket DNA oligomer måles i forhold til den fluorescently mærket DNA, som fungerer som en reference. TF og reference DNA er indarbejdet i faste koncentrationer i en porøs Agarosen gel matrix (pore størrelse ~ 1 µm), der udgør en ikke-interagere miljø for bindingen. Referencen DNA er mærket med Cy5. Dette farvestof viste sig for at være velegnet til FA målinger på grund af dens forholdsvis lange fluorescens levetid (~ 1ns) og fluorescens emission i den far-red af det synlige spektrum (lav auto-fluorescens baggrund). TF koncentration er kindtand overskydende over Cy5-reference DNA, at sikre, at alle reference DNA er bundet til proteiner. En opløsning af umærket konkurrent DNA bliver så indsat på gel overflade og diffunderer inside de porøse matrix, oprettelse af en koncentration gradient c (z, t) , der ændrer sig over z-placeringen af fokusplanet og tiden t (figur 1a, fig. 2a-2 c). TF bundet til Cy5-reference-DNA er således lokalt udsat for forskellige koncentrationer af konkurrent DNA, der konkurrerer om bindende, fører til en dynamisk skiftende FA af Cy5-reference DNA FAREF(z, t) (figur 2b og 2 c).

For at bestemme konkurrent koncentration c(z,t), måler vi i separate brønde (kalibrering wells) dynamisk skiftende FA signal af Nile Blue (NB) FANB(z, t) (figur 2en og 3). Dette farvestof intercalates i DNA og fungerer dermed som en DNA sensor for konkurrent DNA. Med denne kontrolleret levering system, kan snesevis til hundredvis af forskellige DNA-protein bindende tilhørsforhold måles inden for en multi godt plade (96 - eller 384-godt plade format). Måling udføres derefter sekventielt indtil fuldstændig fordrivelse af mærket referencen DNA fra TF. Vi bestemmes bindende specificitet for en given faktor ved måling tilhørsforhold af alle 3 N enkelt-base mutationer af konsensus sekvens af længde N. HiP-FA kræver små mængder af protein (~ pmols per titreringskurven) og viser lav variabilitet i bestemmelse af KDs [koefficient for variation (CV) < 20%], samtidig med at målinger på en relativt stor skala. Metoden kan udføres manuelt eller fuldt automatiseret ved hjælp af en robot system, hvilket resulterer i endnu lavere CVs (figur 4, øverste panel). Dissociation konstanter er målt med høj præcision ned til 0,5 nM. For ekstremt høje tilhørsforhold (KD < 500 pM), vi bruger en standard konkurrencedygtige titrering (figur 5) på grund af unøjagtigheder i målingen af konkurrent DNA koncentrationer på et lavt niveau (< 100 nM).

HiP-FA kan gennemføres på næsten enhver standard, inverteret, fluorescerende epifluorescensmikroskop, forudsat tilgængelighed af en automatiseret XY-fase og en piezo z-aksen fase. Optiske komponenter blev bygget op omkring en automatiseret widefield setup udstyret med et langdistance mål. I praksis kan analysen tilpasses til målene med andre egenskaber (i en bestemt orden, afstand og numerisk blænde). Dette kræver imidlertid optimering af parametre (afstande mellem z-skiver, porøsitet og højden af agarosegel, osv.). Brug af andre typer af lasere eller kamera er også muligt. En detaljeret beskrivelse af hele forsøgsmetoden og analyse af data er angivet nedenfor i afsnittet protokol.

Protocol

1. polarisering mikroskopi

  1. For widefield laser belysningsstyrke, fokusere en 638 nm linjen af en kontinuerlig diodelaser (40 mW) på blænde af multimode optiske fibre til stråle oprydning. Montere en lineær polarisator på outputtet af fiber for at indstille polariseringen af laserlys.
  2. Blokere komponenten excitation af det udsendte lys med en dichroic spejl (640 nm cut-off) og en bandpass filter (bandpass 700/75).
  3. Lad fluorescens signalet passerer gennem en polariserende stråledeler, som opdeler det udsendte lys i sin vinkelret på og parallel polariseret komponenter. Derefter fokusere ikke afspejlet strålen (parallel komponent) og den reflekterede lysstråle (vinkelret komponent) med en achromatic linse af 200 mm brændvidde på chip af en back-belyste EM-CCD kamera, (figur 1b og 1 c). Brug et spejl til at justere retningen af den vinkelrette stråle mod linsen.

2. design og test af fluorescerende-mærket Reference DNA Oligomer

  1. Bestemme core rækkefølgen af reference DNA: metoden er baseret på en konkurrencedygtig assay, der måler dissociationskonstant (KD2) mellem en transkriptionsfaktor og umærkede konkurrent DNA oligomer, der konkurrerer om bindende med en fluorescently mærket DNA hvis affinitet til TF fungerer som en referencer (KD1). Konsensus sekvens fra andre kilder som DNase footprinting eller bakteriel 1-hybrid kan tjene som en start punkt5,15.
    Bemærk: som en tommelfingerregel, en passende henvisning DNA har en 3 til 7-fold fald i bindende affinitet til TF i forhold til konsensus sekvens.
  2. Måling af hofte-FA KD1s af 2-3 foreløbig enkelt mutationer af konsensus sekvensen stammer i det forrige trin. Prøv at mutere positioner i konsensus sekvens, ikke der er for specifikt at undgå fuldstændig tab af bindingen.
    Bemærk: Det er vigtigt, at reference-sekvensen er bundet af transkriptionsfaktor af interesse (vi brugte i denne protokol kæmpe Gt), men ikke for kraftigt, således at svageste konkurrenter kan outcompete det i høje koncentrationer.
  3. Udvide core motiv (8-12 base par generelt) til en længde af 16 basepar eller mere ved at tilføje symmetrisk flankerende sekvens på begge sider (tilføje sidekæder til ordentlig indbinding). Hvis det er nødvendigt (længere biding domæner, for eksempel), bruge længere sekvenser (op til ~ 50 base par i længde blev testet med hofte-FA analysen).
    Advarsel: Pas på ikke at tilføje baser, der forventes at skabe ektopisk bindingssteder. Bruge beregningsmæssige redskaber, som forudsiger bindingssteder fra tilgængelige PWMs til at lette denne proces (f.eks. PySite22).
  4. Som mærket reference DNA, ordre oligomerer, der navngives fluorescently på enten frem eller vende strand 3' eller 5' enden. Brug, for eksempel Cy5, Bodipy-650 eller enhver anden egnet farvestof i en koncentration på 10 µM (100 µM 10 x stock) i vand og fortyndes trinvis som beskrevet i trin 3.1.
  5. Forbered 500 mL 1 x binding buffer ved at tilføje 33 mM kalium fosfat buffer (pH = 7,0), 90 mM NaCl, og 0,01% nonionisk detergent i destilleret vand. Også forberede 3 x binding buffer, som indeholder de samme komponenter, undtagen på tre koncentrationer. Hvis du bruger 3 x binding buffer som lager løsning for 1 x binding buffer, forberede diskenheder > 500 mL; ellers, forberede 250 mL.
    Bemærk: Denne sammensætning var optimeret til transskription faktor stabilitet og til at forhindre glutathion S-transferase (GST) dimerization.
  6. Foranstaltning med opsætningen mikroskopi beskrevet i trin 1 FA af 200 µL af binding buffer indeholdende 0,8 nM mærket reference DNA i overværelse af forskellige beløb af TF i et glas bund mikroskopi 96-brønd plade (5-6 wells med forskellige TF koncentrationer) til bestemme TF koncentration at bruge. Udføre en titrering serie med stigende mængder af TF og vælge for analysen den koncentration, som kurven når et plateau, der angiver fuldført binding af DNA reference oligomer.
    Bemærk: Den optimale TF koncentration afhænger værdierne af TF-DNA dissociation konstanter. Generelt kræver lavere KDs lavere koncentrationer.

3. oligomer udglødning

  1. For at anneal DNA oligomerer af mærket henvisningen DNA (sekvens bestemmes i det foregående trin), mix 7 µL af en 10 mM dye-mærket frem enkeltstrenget DNA løsning og 7 µL af en 10 mM koncentration af umærket omvendt komplementet i 186 µL vand.
  2. For konkurrent DNA-sekvenser, bland 20 µL af 100 mM løsninger (i vand, leveret af fabrikanten) fremad enkeltstrenget DNA med 20 µL af 100 mM for den tilsvarende omvendte enkelt-strenget DNA for hver enkelt konkurrent sekvens skal måles.
  3. Udføre den udglødning separat i en standard PCR cycler ved opvarmning løsninger til 70 ° C i 3 min og faldende temperatur til RT med en sats på 0,1 K/s. Hvis PCR maskinen anvendes ikke understøtter temperatur forløb ved denne hastighed, simpelthen gøre trinvis inkubationer med faldende temperaturer (testet var 99 cyklusser af 3 s med-0.4 K per cyklus).

4. gel forberedelse

Bemærk: I følgende afsnit beskrives udarbejdelsen af to forskellige slags geler: 1) titrering brøndene indeholder geler med protein og bruges til at bestemme KDs for respektive konkurrent DNA-sekvenser, og 2) kalibrering brøndene gøre brug af NB til bestemme DNA-koncentrationen på ethvert givet tidspunkt punkt og erhvervelse højde. Er fokus på udarbejdelse af eksperimentet i en 96-brønd plade, men de tilsvarende mængder for en 384-godt plade format er også angivet.

  1. Opløs 0,5% w/v lavt smeltepunkt Agarosen i binding buffer ved kogning det i et laboratorium mikrobølgeovn. Efter fuldstændig opløsning, justere lydstyrken igen med ddH2O at kompensere for eventuelle fordampning.
    Bemærk: For bekvemmelighed, udarbejde en status over 10-20 10 mL alikvoter af geler og smelte dem ved 75° C, når de er nødvendige. Gel bestande kan gemmes på RT.
    Forsigtig: Være omhyggelig med at undgå overhedning af gelopløsning i mikrobølgeovnen. Kort opvarmningstid intervaller med ryster i mellem er at foretrække.
  2. For at forberede titrering og kalibrering brønde, smelte først to 10 mL gel stock alikvoter ved 75 ° C under omrystning.
    1. Bruge 240 µL (herunder 20% overhead) for hver enkelt konkurrent (n = antallet af konkurrent sekvenser).
    2. Brug den samme mængde af gel til NB kalibrering godt for at sikre en ens temperatur og viskositet af begge geler.
    3. Derefter indstille temperaturen til 35 ° C og vente til temperaturen til Reagensglasset.
  3. Til titreringen wells, tilføje 1,4 nM (endelig koncentration) hybridiseret reference DNA (opnåede i trin 3), TF protein (endelig koncentration CTF = 20-60 nM, som bestemt i trin 2.6), DTT (0,2 mM) og bindende buffer i en samlet maengde paa n x 200 µL eller n x 13 µL i en 96 - eller 384-godt plade format, henholdsvis (plus overhead). Blandes grundigt ved invertere/rysten (gør ikke vortex).
  4. Langsomt tilføje 200 µL pr. brønd i 96-brønd plade format (13 µL/brønd for 386 wells) af gelopløsning udarbejdet i det forrige trin til titrering wells godt pladen.
  5. For kalibrering wells, først tilføje 5 nM NB til den smeltede gel udenfor wells (samlede volumen afhængigt af formatet godt plade anvendes og antallet af kalibrering brønde, normalt 5-6 per godt plade er nok).
  6. Tilsæt 200 µL (13 µL til 384-godt plade format) af NB som indeholder gel langsomt inden titrering wells af godt pladen og sørg for at undgå luftbobler.
    Bemærk: Brugen af elektroniske pipets eller robotics øger reproducerbarhed.
  7. Lad gel størkne til 10 min på RT, og en anden 10 min. ved 4 ° C (fjerner kondens fra glasset bagefter hvis nødvendigt). Sørg for at gennemføre alle disse trin på en helt vandret overflade at undgå inhomogene gel overflader.
    Bemærk: Protein indeholder gels er normalt stabil i mindst flere timer på 4 ° C.

5. tilføjelse konkurrent DNA løsning

Bemærk: Følgende løsninger bør være forberedt før du starter titreringen og lægges oven på kalibrering og titrering brøndene samtidigt.

  1. Tilføj den udglødet mærket reference DNA og protein i 3 x binding buffer på 3 gange højere koncentrationer end gel stock delprøver.
    1. Mix 20 µL af den opnåede opløsning med 40 µL af hver udglødet konkurrent DNA løsning opnåede i trin 3.
    2. For hver kalibrering brønd, bland 20 µL af 3 x binding buffer indeholdende 15 mM NB løsning med 40 µL af udglødet konkurrent DNA (en sekvens af samme længde er passende).
      Bemærk: 384-godt plader, bruge 21 µL i stedet for 60 µL i alt.
  2. Valgfrit, kontrollere homogeniteten af gel højde niveauer i de forskellige brønde af pladen hjælp ved måling af absorbans ved 380 nm, ved hjælp af en multi godt Pladelæser (absorbans værdier er proportional med gel højder).
  3. Tilsæt 50 µL (7 µL til 384-godt plade format) af blandet konkurrent DNA løsninger (udglødet i trin 3) oven på geler. Prøv at tilføje alle konkurrent løsningerne som samtidig som muligt ved hjælp af elektroniske multikanals pipets eller en 96-kanal pipettering hoved, hvis den er tilgængelig. Efter tilsætning af konkurrent løsninger, pladen anbringes på stadiet mikroskop og start målinger umiddelbart (trin 7).

6. billede erhvervelse

  1. Sekventielt erhverve gange serie af z-stakke (f.eks. brug 12 fly og 100-300 ms belysning tid). Undgå at tage billeder for tæt til at nå overfladen (< ~1.4 µm med pladerne anvendes heri) til at udelukke enhver polarisering bias.
  2. Udføre 10-25 cyklusser af målinger indtil komplet adskillelsen af mærket reference-DNA fra TF. Slutpunkt nås typisk efter 1-2 timer, afhængigt af den bindende kinetik og diffusivity konkurrents DNA.

7. udsugning af FA(z,t) fra Raw-Data

  1. Når en godt plade har været afbildet, beregne fra rå fluorescens billeder de gennemsnitlige pixelværdier af regioner af interesse for parallellen (jeg=) og vinkelret (I+) polariseret intensitet komponenter (figur 1c). Dette kan ske automatisk ved hjælp af HiP-FA software23.
    Bemærk: HiP-FA software, en brugsanvisning og et test-datasæt kan være hentet23. Alternativt bruge andre brugerdefinerede-skrevet software til at udtrække jeg= og jeg+ og udføre den efterfølgende analyse af titrering kurver, som beskrevet i detaljer nedenfor.
  2. Beregne FA til hver brønd. Til hver brønd, scriptet beregner FA(z,t) ved hver z-position og tid punkt t i henhold til:
    Ligning 1:Equation 1
    Hvor G er instrument G-faktor, der korrigerer for enhver form for partiskhed mod den vinkelrette kanal.
  3. Bestemme G-faktor af mikroskopi setup ved at måle FA nogen løsninger, der indeholder et fluorescerende farvestof af kendte anisotropy. Udtrække to polarisering komponenter af signalet og så bruge ligningen 1 for at opnå G, vel vidende FA af løsningen (G = 1.15 i denne opsætning).

8. kalibreringskurven for bestemmelse af konkurrent DNA koncentration fra FANB

  1. Anneal 120 µL af hver frem og bak reference oligomer (100 mM stock koncentration; enhver tilfældig rækkefølge med samme længde som konkurrent sekvens kan bruges) og blandes med 120 µL af 3 x binding buffer indeholdende NB (15 nM).
  2. Forberede en fortyndingsrække med 1:2 fortyndinger i 1 x binding buffer med 6 fortyndinger i alt. Mix 50 µL af disse fortyndinger med 200 µL af 0,5% lavt smeltepunkt (T > 35 ° C) agarosegel i 1 x binding buffer indeholdende 5 nM af NB i tre.
  3. Tilføje 200 µL af hver af de 6 løsninger udarbejdet i det forrige trin i en 96-brønd plade og opbevar plade for 1 h på 4 ° C for at sikre fuldstændig gellation, derefter 1 h på RT. foranstaltning FANB af løsninger ved hjælp af HiP-Anlægsopsætning.
  4. Uddrag FANB (z, t) ifølge det foregående trin og passer til dataene ved hjælp af en Hill ligning:
    Ligning 2:Equation 2
    Hvor CDNA er koncentrationen af DNA oligomer; k koncentrationen af DNA oligomerer på hvor halvdelen af bindingsstederne er besat; FAmax er en normalisering konstant; og n er Hill-koefficient. Kristensen, FAmax, og n er angivet som frie parametre under montering procedure.
  5. Angiv de tre parametre opnås fra proceduren montering i hofte-FA software (i venstre nederste panel).
  6. Gentag bestemmelse af kalibreringskurven hver par måneder eller efter at foretage ændringer i opsætningen til mikroskopi.

9. bestemmelse af konkurrent DNA koncentrationer

  1. Bruge HiP-FA software til at udtrække c (z, t) fra FANB(z, t) målinger (figur 3). Først opnå en kalibreringskurve som beskrevet i forrige afsnit og angive parametrene montering til softwaren (Se vejledningen for detaljer).
  2. Bruge programmet til at automatisk ekstrapolere c(z,t) for c < 100 nM (Se vejledningen for detaljer) bruger ligning 3 (fig. 3b), som beskriver den endimensionale diffusion konkurrents DNA i matrixen Agarosen gel, forudsat at fri diffusion.
    Ligning 3:Equation 3
    Hvor C0 er den oprindelige koncentration af konkurrent DNA; ERF er fejlfunktionen; z er holdning; D er diffusion koefficient for konkurrent DNA; og t0 er starttidspunktet for målingerne. De anvendte frie parametre er C0 og z /Equation 4.

10. konventionelle konkurrencedygtige titrering med hofte-FA for meget stærk DNA bindende

  1. Seriefremstillede fortyndes forskellige konkurrent DNA oligomerer i rækker på en 96-brønd plade (eller 384-godt plade) i koncentrationer på: 0, 1,25, 3.5, 9, 19, 45, 90, 190, 425, 900, 1900, og 4000 nM. Tilføje referencen Cy5-mærket DNA (1 nM) og TF (20-50 nM) ved en konstant koncentration, med en samlet maengde paa 200 µL pr. brønd i binding buffer (figur 5en). Vente 40 minutter indtil termodynamisk ligevægt er opnået og erhverve (med hofte-Anlægsopsætning) z-stakke til hver brønd (erhverve flere billeder pr. brønd reducerer variation af de beregnede FA værdier i gennemsnit).
  2. Konstruere ligevægt bindende titrering kurver og passe dem med ligning 4 (figur 5b). KDs bestemmes af konventionelle konkurrencedygtige titrering er identiske med dem, fremstillet ved hofte-FA ved hjælp af en Agarosen gel matrix20.

11. montering Procedure af FA titrering kurver

  1. Vise i hofte-FA software rekonstruerede titrering kurverne for de individuelle konkurrent sekvenser FA(z,t) = f[c(z,t)] og visuelt kontrollere oplysningernes kvalitet (Se vejledningen for detaljer). Hvis det er nødvendigt, justere de parametre, der anvendes til bestemmelse af konkurrent DNA koncentrationer i trin 10.
  2. Passe hver enkelt titreringskurven automatisk ved hjælp af ligning 4, som giver en analytisk løsning for konkurrencedygtige titrering assays24.
    Ligning 4:Equation 5
    Med:Equation 6
    Equation 7
    Equation 8
    Equation 9
    Hvor RT er proteinkoncentration; LT er den umærkede og LST er den mærket DNA koncentration; KD2 er dissociationskonstant skal fastlægges; RT er koncentrationen af aktive protein; og A og B er normalisering parametre.

    Første bestemme KD1, der tjener som reference for fastlæggelse af de forskellige KD2 værdier. KD1 er kan bestemmes let med assayet ved at vælge sekvensen af dye-reference DNA sekvens af umærket konkurrenten DNA (Se manual).
  3. Angiv den opnåede værdi af KD1 i softwaren og beregne KD2 værdier for alle konkurrent DNA på pladen.
    Bemærk: De frie parametre af proceduren for montering er KD2, RT, A og B.
  4. Eksportere dissociationskonstant KD2 og koncentration af aktive protein RT for alle individuelle titrering wells af pladen ved at klikke på knappen "Eksport" i softwaren.

12. PWM konstruktion, specificitet af Protein-DNA interaktion, og Pseudo tæller

Opret sekvens logoer for de forskellige PWMs ved hjælp af online-værktøj WebLogo 3.0 (http://weblogo.threeplusone.com/create.cgi), som tidligere beskrevet20.

Representative Results

Vi anvendte HiP-FA til TFs af segmentering genet netværk25,26, som genererer anterior-posterior krop mønster af Drosophila embryoner, hovedsagelig gennem transkriptionel regulering. Fra dette netværk, valgte vi at bZIP domæne TF Giant (Gt) for en detaljeret analyse (figur 4). Da fuld længde transkriptionsfaktorer er vanskeligt at udtrykke og udbytte for det meste de samme bindende præferencer som deres DNA bindende domæner (Bel)13, vi brugte Bel smeltet til GST og udtrykt konstruktion i E.coli GST fusion proteiner til levere de samme resultater som DBDs alene20.

Gt konsensus sekvens (enTTACGTAAC) repræsenterer den stærkeste bindende sekvens, som vi bestemt som beskrevet ovenfor. Vi undersøgte derefter indflydelse på bindende energi af alle mulige mutationer, single-point inden for 10-mer Gt konsensus sekvens (ialt 30), flankeret af ekstra baser for 5' og 3' enden. Vi målte to replikater hvis gel prøver blev produceret ved hjælp af automatisering, og en yderligere replikat produceret manuelt for sammenligning. KDs varierede fra 0,6 til > 2000 nM for enkeltvis muterede sekvenser, og vi bekræftede også fuldstændig mangel på binding til en "ikke-bindende" sekvens (data ikke vist).

TF-DNA bindende særpræg er typisk modelleret ved hjælp af en position vægt matrix (PWM), som tildeles en score hver muligt nukleotid på hver position i bindende motiv. PWM antager, at hver position bidrager til bindende styrke uafhængigt og i de fleste tilfælde udgør en tilstrækkelig model for TF bindende præferencer27. Vi genereret reviderede PWMs baseret på vores affinitet målinger følgende etableret procedurer28,29 og sammenlignet dem med to PWMs tidligere rapporteret i litteraturen. Først er baseret på nukleotidsekvens frekvens tæller fra bindende websteder identificeret ved DNA footprinting4,5, og den anden PWM blev opnået ved bakteriel one-hybrid (B1H) udvalg. 15

Høj ligheden mellem PWMs for de tre flergangsbestemmelser (figur 4, øverste panel), herunder for den prøve, der tilberedes manuelt (replikat 3), viser en høj reproducerbarhed af metoden HiP-FA. PWMs fremstillet af HiP-FA er overordnede svarende til de PWMs, der er opnået med de andre metoder (figur 4, nederste panel), der er væsentlige afvigelser: på position 2 (sort pil), start af kerne bZIP motiv, mutationer T > (G, C, A) fører til komplet tab af bindende i motivet er fremstillet ved hofte-FA, som er i overensstemmelse med B1H motiv, men ikke med der opnås med DNase fodspor, hvor bindingen er stadig relativt stærke baser (G, A). Omvendt på position 7 (grå pil), mutation T > C fører til meget stærkere binding end hvad der var forventet baseret på de tidligere målte PWMs.

Andre afvigelser er subtile, men ikke mindre vigtige. Samlet, HiP-FA PWM er mindre specifikt end to andre, afspejler den kendsgerning, at mange mutationer fra konsensus stadig resultere i moderat stærke binding. Dette kan kvantificeres ved hjælp af informationsindhold (IC). IC er 11,5 bits for HiP-FA matrix (gennemsnittet af de tre gentagelser), i forhold til IC = 13,4 bits og 16,8 bits for DNase footprinting og B1H matricer, henholdsvis. Generelt (dog ikke universelt), den PWMs opnået ved hofte-FA er mindre specifikt end dem, der opnås ved hjælp af andre metoder, baseret på 26 TFs undersøgt20.

Figure 1
Figur 1:skematisk skildringer af HIP-FA assay og eksperimentel opsætning. (a) gel leveringssystem for titrere konkurrent DNA i enkelt brønde. (b) hofte-FA mikroskopi setup. Tilpasset automatiserede widefield mikroskop med polariserede fluorescens lys opdagelse på en EM-CCD kamera. (c) rå fluorescens billedet med de to regioner i rentesats, der anvendes til at bestemme parallellen (rød) og den vinkelret (grøn) polariseret komponenter. (d) typisk layout af en 96-brønd plade. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Rå FA data og rekonstruerede titrering kurver. a typiske FA(z,t) bane til en kalibrering godt indeholdende NB. (b, c) FA(z,t) tid baner for to titrering wells måling binding til en stærk (b) og mere moderat c DNA bindende konkurrent. (d, e) Tilsvarende rekonstrueret FA titrering målinger og monteret kurver for stærk (d) og moderat (e) bindende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Bestemmelse af koncentrationen af konkurrent DNA c (z, t) ved hjælp af Nile Blue (NB). a FA-koncentrationen kalibreringskurven for 16 basepar DNA oligomerer. I en konventionel titrering serie, er NB indlejret i agarosegel sammen med forskellige koncentrationer af konkurrent DNA. NB affinitet til DNA er sekvens-uafhængig20; Derfor, de samme kalibreringskurverne kan anvendes til bestemmelse af c (z, t) for forskellige DNA-sekvenser af samme længde. b konkurrent DNA tid diffusion profil på en vilkårlig z højde bestemmes ved hjælp af fem kalibrering brønde. For hver måling cyklus vises de gennemsnitlige FAs af fire NB-holdige brønde som hvide prikker. Kurverne er monteret ved hjælp af ligning 3 (hvid linje, individuelle brønde i farve) og c (z, t) ved lave koncentrationer (C < ~ 100 nM) bestemmes af ekstrapoleret montering kurve. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Bindende særegenheder af bZIP domæne familien TF Giant (Gt). HIP-FA PWMs af tre replikater: to udarbejdet ved hjælp af automatisering og en manuelt udarbejdet (øverste panel) sammenlignes med PWMs genereret af DNase footprinting og bakteriel one-hybrid (B1H)-udvælgelsesmetode (nederste panel). Alt i alt HIP-FA bindende motiver er enig med tidligere data men viser også betydelige forskelle, som markerede med sorte og grå pile. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Konventionel konkurrencedygtige titrering med hofte-FA. (a) plade design viser 8 forskellige konkurrent DNA seriefremstillede fortyndet i binding buffer i en enkelt række i en 96-brønd plade. En FA varmekort er vist for forskellige vilkårlige bindende styrker. b konkurrencedygtige titrering af tre konkurrent DNAs binding til Bcd TF med forskellige tilhørsforhold. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

HiP-FA er en omfattende ny metode til bestemmelse af de bindende præference landskaber af TF-DNA interaktioner. Den måler bindende tilhørsforhold af mutationsmønstre DNA motiv varianter direkte, at undgå eventuelle underliggende antagelse at bindende præferencer er afspejlet i frekvens af nukleotid forekomst i et sæt af ovennævnte tærskel bindemidler. Målingen foregår i løsning uden immobilisering og mekaniske eller kemiske indblanding med bindende reaktion, tilnærme ligevægtsforhold så tæt som muligt. Den kontrollerede levering system tillader måling af en fuld titreringskurven inden for et enkelt godt og øger både overførselshastighed og pålidelighed samtidig spare protein. Ved hjælp af et mål med en høj numerisk blænde og EM-CCD kamera med høj lys indsamling effektivitet giver mulighed for meget følsomme fluorescerende lys påvisning. Derfor, med denne opsætning, små FA ændres så lavt som 10-15 mP kan påvises præcist; i praksis betyder dette at nogen bindende reaktion som den massive stigning efter bindende er minimal (så lavt som en masse forholdet mellem 2) opdages let. Dette er normalt ikke tilfældet med kommercielle systemer som mikrotiterplade læsere. På grund af sin høje følsomhed udvider HiP-FA rækken af dissociation konstanter, der kan måles pålideligt i rækken picomolar. Bindende energier bestemmes nøjagtigt over flere størrelsesordener.

For at vurdere kvaliteten af de reviderede PWMs, udføres vi to typer af analyse20. Vi testet for fem faktorer af segmentering genet netværk, hvor godt forskellige PWMs kan forudsige eksperimentelle ChIP-seq profiler i regionerne genomisk i 21 segmentering gener. Som en anden test brugte vi et sekvensudtryk til model4 der forudsiger udtryk patterns af segmentering smagsforstærkere bindende præference og protein koncentration af deltagende TFs. I begge øvelser, fandt vi, at de mindre specifikke HiP-FA PWMs udføre markant bedre end de mere specifikke footprinting og B1H PWMs20.

I modsætning til de novo metoder kræver HiP-FA nogle forudgående kendskab til en given TF bindende præference. Imidlertid enighed sekvenser er kendt for mange TFs, og mange eksisterende metoder kan levere dem13,14,15. Hvis det er nødvendigt, kan den sande optimal bindende sekvens findes iterativt.

Vi brugte DNA reference oligomerer fluorescently mærket med Cy5 og Bodipy-650. Disse farvestoffer har vist sig for at udføre godt for FA målinger da anisotropy bundne og ubundne mærket reference dna var den største blandt de forskellige afprøvede farvestoffer. Dette sikrer den maksimale dynamiske rækkevidde for FA værdier. Generelt, enhver fluorescerende farvestof med en fluorescens levetid ≥ 1 ns er tilbøjelige til at være egnet men skal testes først. Hvis det er muligt, anbefales det at bruge farvestoffer fluorescerende i det nær-infrarøde område for at minimere protein autofluorescence.

Den mest kritiske trin af forsøgsmetoden er Pipettering af gel i godt pladerne. God reproducerbarhed kræver gel diskenheder skal være så ensartede som muligt. Ændringer i gel højde oversættes til ændringer af diffusivity for konkurrencedygtige DNA oligomer, og dermed synlige ændringer af affinitet, når de evaluerer data. Dette er den vigtigste kilde til varians i en teknisk replikeres. Anvendelse af en elektronisk pipette eller automation teknikker forbedrer reproducerbarhed. Luftbobler i gelen kan undgås ved langsom og forsigtig pipettering. Det er også vigtigt at tilføje de alle konkurrent løsninger oven på titrering brøndene med som lille forsinkelse som muligt. For bedste reproducerbarhed, kan hele processen automatiseres ved hjælp af en pipettering robot med varme væksthuse. En vigtig del for at overføre protokollen til automatisering er nødvendige for optimering af inkubator temperatur og inkuberingstider. Sørg for at finde en optimal balance mellem viskositet af gel (dvs., ikke for koldt) og stabilitet af proteiner (dvs. ikke for varmt). Dette afhænger både af dosisdispensering hastigheden på geler i brønde og stabilitet af protein anvendes.

HiP-FA gør brug af et kontrolleret levering system for konkurrent DNA oligomerer. For at konstruere titreringer kurver, er det nødvendigt at bestemme konkurrent DNA koncentrationen c(z,t) for hver given z-position inden for matrixen gel og tid punkt t. Dette er endnu et afgørende skridt, da bestemmelsen af KDs afhænger direkte af c(z,t). Kalibrering wells indeholdende NB farvestof som en sensor for DNA koncentration bruges til dette formål (figur 1d, figur 2en). Normalt er 3-5 kalibrering wells indeholdende NB pr. plade tilstrækkelig. Før evaluere ethvert HiP-FA eksperiment, en NB kalibreringskurve bør konstrueres til set-up ved at udføre en konventionel titrering række NB opløst i agarosegel med en konkurrent-DNA i en sekvens ved forskellige koncentrationer (figur 3 en), som forklaret i detaljer i trin 8. I tilfælde af meget stærke binding (KD < 500 pM), ekstrapolering anvendes til bestemmelse af lave koncentrationer af konkurrent DNA bliver begrænsende, da det er mindre præcis end en direkte måling. Til TFs med sådanne lave KDs, kan HiP-Anlægsopsætning bruges til at udføre en konventionel konkurrencedygtige titrering i binding buffer uden brug af en Agarosen gel matrix (figur 5). For eksempel, kan en fuldstændig titrering med 12 forskellige koncentrationer af konkurrent DNA udføres i en enkelt række i en 96-brønd plade.

Den kontrollerede levering system kræver også hurtig TF-DNA bindende kinetik, og stabile proteiner, siden udbredelsen, selvom agarosegel er dynamiske (selv om langsomme). Begge egenskaber kan testes direkte med hofte-Anlægsopsætning ved følgende, over tid, FA af TFs af interesse når bundet til deres respektive fluorescently mærket reference DNA. Vi målte KON og KOFF satser for de undersøgte faktorer og fundet dem at være størrelsesordenen millisekunder til sekunder20, i overensstemmelse med andre undersøgelser30. Dette er tilstrækkeligt hurtigt til at sikre, at målingerne foregår ved ligevægt. For andre bindende reaktioner med langsommere kinetik, kan diffusivity konkurrentens indstilles ved at sænke sin koncentration eller reducere gel porestørrelse. I tilfælde af de testede TFs, som alle har hurtig TOFF (~ sekunder), en total måleperioden på omkring 1-2 h er tilstrækkelig til at sikre termodynamisk ligevægt på hver måling.

En anden potentiel spørgsmål relateret til protein er dannelsen af protein aggregater, der kan ændre FA målinger. Brugen af andre buffer betingelser forskellige tilsaetningsstoffer (ligesom sukkertensider) kan forhindre samlede dannelse, hvis nødvendigt.

Vi har arbejdet under linearitet antagelse af PWM; men HIP-FA kan skaleres til at omfatte alle mulige di-nukleotid mutationer af konsensus sekvens. Endelig kan HiP-FA tilpasses måle andre typer af bindende interaktioner. Forudsætningen er at have rådighed en passende molekyle bundet af det protein, som kan mærkes fluorescently. Med den kontrollerede levering system, kan en koncentration forløb oprettes for enhver form for ligand; Derfor, protein-protein og stof-protein interaktioner kan måles med tilsvarende high fidelity og overførselshastighed.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker J. Müller for cDNA kloner og medlemmer af Gallien lab, især S. Bergelt, værdifulde råd og livlig diskussion. Dette arbejde blev støttet af SFB 646, regulerende net i genom udtryk og vedligeholdelse (C.J., P.B.), Center for integreret Protein videnskab (U.G.) og forskerskole for kvantitative Biosciences München (M.S.). U.G. anerkender støtte af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM), yder støtten Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF: ebio - Innovationswettbewerb Systembiologie), og Humboldt-stiftelsen (Alexander von Humboldt, Professorat).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
16- / 18-bp DNA-oligomers Eurofins Custom synthesis
Nile Blue A Sigma N5632-25G
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS Greiner 655891 175 µm thick glass bottom
384 Well Sensoplate, black Greiner 788896
Agarose, low gelling temperature Sigma A9414-50G
Sodium Chloride Merck 1.06404.1000
Tween-20 Sigma P1379-1L
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate Merck 1.05099.1000
Potassium dihydrogen phosphate Merck 1.04873.1000
Q-POD Element Merck Millipore ZMQSP0DE1
Millipak 40 Gamma Gold Filter Merck Millipore MPGL04GK2
Milli-Q Integral 3 Water Purification System Merck Millipore ZRXQ003WW
Quantum TIX Merck Millipore QTUMOTIX1
DL-Dithiothreitol Sigma 43815-1G
Mastercycler gradient Eppendorf Z316083
SafeSeal tube 1.5 mL Sarstedt 72.706.200
Tube 15 mL Sarstedt 62.554.502
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP Sarstedt 72.737.002
MICROSCOPY SETUP:
Automated widefield microscope LEICA DMI6000
Long distance objective LEICA HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry
638 nm line continuous diode laser Omicron PHOxX 638-40, 40mW
Back-illuminated EM-CCD Camera Andor iXon DV897
Dichroic mirror AHF 640nm cut-off
Bandpass filter AHF ET bandpass 700/75
Linear polarizer Thorlabs LPVISC050-MP2
Polarizing beam splitter Thorlabs BS010
Achromatic lens Thorlabs 200 mm focal length
Multimode optical fiber Optronis FVP600660710
ROBOTIC SYSTEM:
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper Beckman Coulter Biomek NXP
SOFTWARE:
Programming language National Instruments Labview 9.0
Script for the HiP-FA software available at https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berg, O. G., von Hippel, P. H. Selection of DNA binding sites by regulatory proteins. Statistical-mechanical theory and application to operators and promoters. Journal of Molecular Biology. 193, 723-750 (1987).
  2. Hammar, P., et al. Direct measurement of transcription factor dissociation excludes a simple operator occupancy model for gene regulation. Nature Genetics. 46, 405-408 (2014).
  3. Chen, J., et al. Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells. Cell. 156, 1274-1285 (2014).
  4. Segal, E., Raveh-Sadka, T., Schroeder, M., Unnerstall, U., Gaul, U. Predicting expression patterns from regulatory sequence in Drosophila segmentation. Nature. 451, 535-540 (2008).
  5. Schroeder, M. D., et al. Transcriptional control in the segmentation gene network of Drosophila. PLoS Biology. 2, 271 (2004).
  6. He, X., Samee, M. A., Blatti, C., Sinha, S. Thermodynamics-based models of transcriptional regulation by enhancers: the roles of synergistic activation, cooperative binding and short-range repression. PLoS Computionnal Biology. 6, (2010).
  7. Wilson, M. D., et al. Species-Specific Transcription in Mice Carrying Human Chromosome 21. Science. 322, 434-438 (2008).
  8. Galas, D. J., Schmitz, A. Dnaase footprinting - simple method for detection of protein-DNA binding specificity. Nucleic Acids Research. 5, 3157-3170 (1978).
  9. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2, 1849-1861 (2007).
  10. Liedberg, B., Nylander, C., Lundstrom, I. Surface-plasmon resonance for gas-detection and biosensing. Sensors and Actuators. 4, 299-304 (1983).
  11. Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1, (2010).
  12. Berger, M. F., et al. Compact, universal DNA microarrays to comprehensively determine transcription-factor binding site specificities. Nature Biotechnology. 24, 1429-1435 (2006).
  13. Nitta, K. R., et al. Conservation of transcription factor binding specificities across 600 million years of bilateria evolution. eLife. 4, (2015).
  14. Jolma, A., et al. DNA-Binding Specificities of Human Transcription Factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
  15. Noyes, M. B., et al. A systematic characterization of factors that regulate Drosophila segmentation via a bacterial one-hybrid system. Nucleic Acids Research. 36, 2547-2560 (2008).
  16. Nutiu, R., et al. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology. 29, (2011).
  17. Riley, T. R., et al. SELEX.-seq: a method for characterizing the complete repertoire of binding site preferences for transcription factor complexes. Methods Molecular Biology. 1196, 255-278 (2014).
  18. Maerkl, S. J., Quake, S. R. A systems approach to measuring the binding energy landscapes of transcription factors. Science. 315, 233-237 (2007).
  19. Isakova, A., et al. SMiLE-seq identifies binding motifs of single and dimeric transcription factors. Nature Methods. 14, 316-322 (2017).
  20. Jung, C., et al. True equilibrium measurement of transcription factor-DNA binding affinities using automated polarization microscopy. Nature Communications. 9, 1605 (2018).
  21. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules: Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochemical Journal. 51, 155-168 (1952).
  22. Github. Available from: https://github.com/Reutern/PySite (2018).
  23. Github. Available from: https://githum.com/GeneCenterMunich/HiP-FA (2018).
  24. Roehrl, M. H., Wang, J. Y., Wagner, G. A general framework for development and data analysis of competitive high-throughput screens for small-molecule inhibitors of protein-protein interactions by fluorescence polarization. Biochemistry. 43, 16056-16066 (2004).
  25. St Johnston, D., Nuesslein-Volhard, C. The origin of pattern and polarity in the Drosophila embryo. Cell. 68, 201-220 (1992).
  26. Pankratz, M., Jäckle, H. The Development of Drosophila melanogaster, Vol. 1. Bate, M., Martinez Arias, A. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 467-516 (1993).
  27. Zhao, Y., Ruan, S. X., Pandey, M., Stormo, G. D. Improved Models for Transcription Factor Binding Site Identification Using Nonindependent Interactions. Genetics. 191, (2012).
  28. Noureddine, M. A., et al. Probing the functional impact of sequence variation on p53-DNA interactions using a novel microsphere assay for protein-DNA binding with human cell extracts. PLoS Genetics. 5, 1000462 (2009).
  29. Veprintsev, D. B., Fersht, A. R. Algorithm for prediction of tumour suppressor p53 affinity for binding sites in DNA. Nucleic Acids Research. 36, 1589-1598 (2008).
  30. Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 16540-16545 (2012).
Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).More

Jung, C., Schnepf, M., Bandilla, P., Unnerstall, U., Gaul, U. High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58763, doi:10.3791/58763 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter