Summary
Dargestellt ist ein Protokoll für einen Teller-Wettbewerb-Assay um festzustellen, ob ein bestimmter Kompost anfällig ist für Bakterien und Pilze, die Wachstum von Rhizoctonia Solaniunterdrücken.
Abstract
Ziel war es, zu entwickeln und eine einfache, kostengünstige und effektive Bioassay zur Erkennung der Krankheit unterdrückende Fähigkeit von einem bestimmten Kompost gegen bodenbürtigen Pilz Rhizoctonia Solanizu optimieren. R. Solani ist ein Erreger einer breiten Palette von Pflanze Gastgeber weltweit. Der Pilz im Boden als eine saprophytischen überlebt und wächst schnell auf einfache Wasser-Agar-Medien. Die Platte-Assay ist eine schnelle Methode, um Kompost für ihre Fähigkeit, das Wachstum von R. Solanilangsam zu vergleichen. Der Assay korreliert auch gut mit Unterdrückung der anderen bodenbürtigen Pilzerreger, die als Saprophytes in Böden wie Alternaria frühen Plagen, Fusarium Wilt, Wurzelfäule Phytophthora und Pythium-Wurzelfäule zu überleben.
Introduction
Rhizoctonia repräsentiert einen breiten Komplex von Pilzen, welche Thanatephorus Cucumeris (Frank) Donk (Anamorph = Rhizoctonia Solani Kühn) ist der Erreger der Wurzelfäule und Dämpfung-ab1. Rhizoctonia Solani ist eine aggressive Erreger und einem saprophytischen, die als Sklerotien unter widrigen Umgebungsbedingungen1überleben können. Infolgedessen, es hat eine globale Verteilung und kann dazu führen, dass Krankheit auf unterschiedlichsten Pflanze Gastgeber Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae, einschl. Brassicaceen, was zu schweren wirtschaftlichen Verlusten.
Kompost hat die Fähigkeit, Biocontrol Mittel für bestimmte Werk Erreger2Hafen. Aber nicht alle Komposte sind gleich, noch beeinflussen sie alle Krankheitserreger ebenso3. Holzwerkstoff-Kohlenstoff hat höhere Lignin, Zellulose-Verhältnisse als Heu oder Stroh-Kohlenstoff-Komposte basierte. R. Solani bevorzugt leicht zugänglich Kohlenstoff im Stroh gefunden. Im Gegensatz dazu sind Biokontrolle Pilze wie Trichoderma spp., effektiver, wenn Kohlenstoff weniger leicht zugänglich ist. Nützliche Pilze und Bakterien in Kompost können Pflanzenkrankheiten durch Wettbewerb, Antagonismus oder Regulierung der Pflanze Wachstum3unterdrücken. Der vorgeschlagene Test erkennt vor allem Antagonismus erstellt von Produktion von Antibiotika, Ecoenzymes oder Chelatoren, die schädlich für den Erreger sind.
Pflanze Bioassays sind ein Goldstandard ob Komposte begünstigen oder Pflanze Wachstum4abzuschrecken. Pflanze Bioassays sind jedoch zeitaufwendig (Wochen bis Monate) abgeschlossen, die möglicherweise länger als gewünscht und mehr Arbeit erfordert, Pflanzen mit Wurzeln, Schweregrad des Wurzelsystems zu quantifizieren zu extrahieren. Vergleichsweise robust, aber schneller (Tage) Assays wäre ideal für Qualitätskontrollprogramme. Das Ziel dieses Papiers ist es, einen relativ schnellen und genauen Test, um vorherzusagen, unterdrückende Potenzial von Kompost zu demonstrieren. Die Methode wurde nach Alfano Et Al. gemustert. 5 mit zwei Ausnahmen, Kompost-Extrakte wurden verdünnt und Wasser-Agar wurde anstelle von Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) verwendet. R. Solani wächst schnell auf einfache Wasser-Agar-Medien PDA gefördert Wachstum von Bakterien und andere Pilze, die die Kultur6kontaminiert.
Dieser Assay Platte dient als Indikator der Unterdrückung, die zu einer Reihe von Pflanzenpathogene gilt, die als Saprophytes einschließlich R. Solani7, Alternaria frühen Plagen, Fusarium Wilt, Wurzelfäule Phytophthora und Pythium-Wurzelfäule im Boden überleben. Die Platte Wettbewerb-Assay ist sinnvoll, Bildschirm eine Reihe von Kompostprodukte für mit Gemeinschaften von Mikroben, die als biologische Bekämpfungsmittel Boden Krankheitserreger dienen. Der Test war eines der beständigsten Anzeichen der Krankheit Unterdrückung im kommerziellen Kompost Produkte6,8. Produkte wurden für ihre Variation im Rezept, Reife und Produktionsprozess gewählt.
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Protocol
1. bereiten Sie im Voraus
- Master-Pilz-Kultur (Testorganismen)
- Bestellen Sie bei American Type Culture Collection, Mikrobiologie Sammlung9, durch seine Teleomorph Thanatephorus Cucumeris (Frank) (ATCC 10154) oder MYA 4031.
- Alternativ: Lokaler Isolate zu sammeln, wie von den Autoren gemacht. Sämlinge von Radieschen (Raphanus Sativus) funktionieren gut als Köder Pflanze; sammeln Sie Boden, von einem Ort bekannt, eine Geschichte der Dämpfung-off oder Wurzel Fäule durch R. Solaniverursacht haben. Saat in den Boden und von Wurzel Läsionen zu isolieren, wenn Sämlinge 3 bis 4 Wochen alt sind.
- Sämlinge aus dem Boden zu entfernen und mit Leitungswasser spülen. Suchen Sie nach braun Gewebe in der Keimachse Region zwischen die Blätter und die Wurzel (Abbildung 1).
- Verwenden Sie eine einzelne scharfe Rasierklinge um 1 cm Segmente der Keimachse oder Wurzel geschnitten, die eine braune Farbe haben. Verwenden Sie Flamme-sterilisierte Pinzette die Segmente in 10 % ige Lösung von Haushaltsbleiche für 1 min, gefolgt von einem 10 s-Spülen in sterilem Wasser eintauchen.
Hinweis: Oben und unten eine sterile Petrischale sind nützliche Container für diesen Schritt. - Verwendung Flamme sterilisiert Zange auf die Pflanze übertragen Stücke an der Innenseite von einem Papiertuch zu pat trocken und dann auf der Oberfläche einer Petrischale mit Wasser Agar (15 g auf 1 L).
- Legen Sie die Petrischale in einem Kunststoff-Behälter mit einem Deckel und Inkubation bei Raumtemperatur (ca. 20 ° C). Wischen Sie das Innere des Behälters mit 10 % Bleichmittel oder 75 % Ethanol und Luft trocknen vor dem Einsetzen der Schale.
- Halten Sie die Isolate im Langzeitspeicher auf einem minimalen Medium Maismehl Agar (17 g in 1 L) schrägen (bei 5 ° C).
Abbildung 1: Krankheitssymptome. Boden mit R. Solani führt zu lückenhaft Keimung und Etablierung (links). Symptome auf Rettich-Keimlinge als braune Läsionen an der Keimachse (rechts). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Verwenden Sie Kartoffel-Dextrose-Agarplatten (39 g in 1 L) für Inokulum für diese Platte Assay.
- Etablieren einer Tochter Kultur Rhizoctonia Kultur auf Kartoffel-Dextrose-Agar, eine oder zwei Tage vor der Assay zu versichern ist gut auf der Kultur-Platte vor dem Assay etabliert. Starten Sie die Tochter Kultur durch die Übertragung eines kleinen Stück (10 mm Durchmesser) von R. Solani aus der master-Kultur in der Mitte des einen frischen Teller mit Kartoffel-Dextrose-Agar (Abbildung 2).
Hinweis: Arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube oder wischen Sie einem Labortisch mit 10 % Bleichmittel oder 75 % Ethanol, Risiko einer Kontamination zu minimieren.
- Etablieren einer Tochter Kultur Rhizoctonia Kultur auf Kartoffel-Dextrose-Agar, eine oder zwei Tage vor der Assay zu versichern ist gut auf der Kultur-Platte vor dem Assay etabliert. Starten Sie die Tochter Kultur durch die Übertragung eines kleinen Stück (10 mm Durchmesser) von R. Solani aus der master-Kultur in der Mitte des einen frischen Teller mit Kartoffel-Dextrose-Agar (Abbildung 2).
- Autoklaven 25 mL Reagenzgläser mit 10 mL Aliquots von destilliertem Wasser (2 X Anzahl der Proben).
2. Vorbereitung der Proben auf Probe
- 10 mL autoklaviert Wasser in 25 mL Reagenzgläsern zwei unabhängige 0,5 g Proben von jeder Probe Kompost hinzufügen. Schütteln Sie das Reagenzglas über Nacht.
- Beschriften Sie die Reagenzgläser mit einzigartigen Probennummern und jedes Mitglied des Paares als (Referenz) oder B (Beispiel).
- Fügen Sie nach 24 h 1,5 g schlicht Agar 90 mL destilliertem Wasser in zwei 125 mLconical Flaschen hinzu.
- Autoklaven beide konische Flaschen mit Agar und der A-Probe eines jeden Paares für 20 min mit einer langsamen Auspuff-Einstellung.
- Legen Sie nach dem Autoklaven die konische Flaschen mit Agar in einem 45 ° C-Wasserbad, bis Gleichgewicht (ca. 30 min) zu erreichen. Legen Sie Probe Schlämme nicht im Wasserbad, bis es auf 45 ° c abgekühlt ist
Abbildung 2: Abbildung des Protokolls. Stecker der R. Solani befinden sich in Petrischalen mit Kompost-Wasser-Extrakt. Der Durchmesser des Myzel Wachstum bemisst sich nach 1-2 Tagen mit Hilfe eines Stereomikroskops, Auflösung und Kontrast zu verbessern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
- Gießen Sie A Probe (autoklaviert Referenz) Kompost Gülle in die geschmolzenen Agar A Agar Flasche. Wirbel, Kompost in den Agar zu zerstreuen.
- Gießen Sie B Probe (lebende Beispiel) Kompost Gülle in der geschmolzenen Agar B Agar Flasche. Wirbel, Kompost in den Agar zu zerstreuen.
- Gießen Sie die Mischung von jedem Kolben in fünf Kunststoff Petrischalen 100 mm im Durchmesser sind.
- Lassen Sie die Platten kühlen über Nacht, so dass der Agar härtet.
3. Fügen Sie die Rhizoctonia -Herausforderung
- Mit aseptischen gleichgroße Stücke von R. Solani , jedes Paar Probe Agarplatten übertragen (3 bis 5 mm Corkborer funktioniert gut, um gleich große Stücke zu etablieren). Nehmen Sie die Kolonie aus dem äußeren Rand der Kolonie um sicherzustellen, dass das Myzel wächst aktiv.
Hinweis: Arbeiten in einer Laminar-Flow-Haube oder wischen Sie einem Labortisch mit 10 % Bleichmittel oder 70 % Ethanol. - 1-2 Tage bis das Koloniewachstum etwa auf halbem Weg bis an den Rand der Platten A erreicht inkubieren Sie die Platten bei Raumtemperatur.
4. Messen Sie R. Solani Wachstum
- Messen Sie den Radius des Mycels in jeder Platte, die nächste 1 mm mit einem klaren flachen Lineal mit einem Stereo-Mikroskop mit übertragene Beleuchtung.
Hinweis: Schräge oder dunklen Bereich Beleuchtung erleichtert zu sehen, und Messen Sie die transparenten Hyphen. Zonen der Hemmung werden an dieser Stelle rund um Kompost Fragmente in der B-Platte sichtbar sein, wenn der Kompost suppressive ist. - Zeichnen Sie den Radius an drei Orten pro Platte und berechnen Sie einen Mittelwert der drei als eine repräsentative Maßnahme dienen.
- Subtrahieren Sie den Mittelwert der B Platten von den A-Platten. Wenn B < A dann gibt es Mikroben in die B-Platten, die unterdrückende R. Solani pathogen sind.
- Teilen Sie den mittleren Radius durch die Anzahl der Tage Herausforderung Einheiten der relativen Unterdrückung als Rate, mm Myzel pro Tag zum Ausdruck bringen.
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Representative Results
Fertige Kompost sollte stabil sein und Reifen, zwei Begriffe, die oft synonym, verwendet werden, so dass es sicher verpackt und transportiert werden kann und nicht Ursache Nebenwirkungen während der Endnutzung4. Stabilität ist eine Resistenz gegen Zersetzung und wird in der Regel mithilfe von Indizes der mikrobiellen Aktivität bestimmt. Allgemeine Maßnahmen der mikrobielle Atmung können Kompost Stabilität aber nicht zwangsläufig Krankheit Unterdrückung eines aggressiven Erreger und saprophytischen z. B. R. Solani7messen. Diese Studie konzentriert sich auf Reife , die leitet das Material ist bereit für einen bestimmten Zweck und für gärtnerische Zwecke richtet sich nach Anlage Keimung und Wachstum Assays.
Auszüge aus der lebendigen Komposte unterdrückt R. Solani Wachstum deutlich mehr als autoklaviert Proben (P ≤ 0,0001). Autoklavieren tötet mikrobielle Aktivität, Hinweis auf eine mikrobiell vermittelten Unterdrückung. Dies bestätigt, dass die Platte A in der Methode dient als Negativkontrolle für mikrobiell vermittelten Biokontrolle (Abbildung 3).
Abbildung 3: Beeinflussung der Autoklavieren R. Solani Wachstum in-vitro-, prozentuale Veränderung im Myzel Wachstum von Kontrolle gemessen. Ein Testmaterial ist "suppressive" den Pilz, wenn der Radius des Myzel Wachstum weniger als eine autoklaviert Kontrolle ist. Dargestellt sind Mittel ± 1 Standardfehler. Die Fehlerbalken für die autoklaviert Kontrolle ist zu klein, um zu sehen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Wachstum von R. Solani Myzel Kompost-Extrakt wirkte Kompost Methode und Rohstoff in das Rezept von Kompost, aber nicht die Dauer der Reifung oder Heilung von6,8. Wachstum verringerte sich um Vermicompost, Miete Prozesse und Rezepturen mit Hartholz Rinde (Abbildung 4). Suppressiveness stellt einen Rückgang des Wirtschaftswachstums von R. Solani.
Abbildung 4: Verwendung von Platte Wettbewerb Assay, der Suppressiveness von Kompostprodukten zu vergleichen. ± 1 Standardfehler der Änderung der R. Solani Wachstum auf eine autoklaviert Referenzplatte bedeutet. Sowohl die Bedienung als auch die Behandlung Vergleiche wurden mit virulenten R. Solanigeimpft. Werte unter Null stellen Suppressiveness dar. Suppressiveness von R. Solani war betroffen von Kompost (A) (B) die Dauer der Heilung oder Reifung und (C) Rezept-Methode. Im Vergleich waren belüftete statische Flor (ASP), Miete (W), Vermicompost (V) und die anaerobe Vergärung (AD). Rezept Zutaten im Vergleich waren Verschwendung von Lebensmitteln (F), Hühnermist (P), Speiseresten und Hühnermist (FP), Gülle (M) und Hartholz Rinde (H). Kontrastierende Buchstaben über Balken kennzeichnen Behandlungen, die sich deutlich unterscheiden. Diese Zahl wurde von Neher Et Al. modifiziert 8 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Aus früheren Untersuchungen wissen wir, dass bestimmte Komposte zu unterdrücken R. Solani wirksam sind und dass die unterdrückende Wirkung aufgrund der Mikroben leben im Kompost, nicht die abiotischen Eigenschaften von Kompost6,8. Die Verwendung von Autoklavieren als Mittel zur "Mikrobiota töten" ist kritisiert worden, weil es die Kohlenstoffverbindungen der Medien10beeinflusst. Wir verglichen die Verwendung von Autoklavieren zu Vakuumfiltration durch Papier Whatman Nr. 1. Behandlungen, die weder gefiltert noch autoklaviert waren zeigten die größte Unterdrückung von R. Solani Wachstum6. Filtration entfernt größere, festen Teilchen, die anscheinend wichtig, Krankheit Unterdrückung durch wahrscheinlich beherbergen Antibiotikum Mikroben produziert wurden.
Vorteile des Verfahrens sind die Einfachheit und Erschwinglichkeit. Ähnlich wie die Schlussfolgerungen und Empfehlungen der Alfano Et al. 2, ist die Platte Wettbewerb Assay eine schnelle vorläufige Beurteilung der Unterdrückung der Krankheit aber nicht zuverlässig als ein Standalone-Assay, weil nur der Erreger und nicht die Pflanze-Host vorhanden ist. Außerdem würde Krankheit nicht festzustellen, ob die Umwelt ungünstig war; R. Solani Krankheiten werden durch warme und Feuchte Bedingungen1begünstigt. Insgesamt gibt es mehr Komplexität im Boden und Kompost Ökosystem als vollständig von einem einzigen Labor Test4,8nachgeahmt werden könnte. Die Platte-Assay ist vergleichbar mit anderen Indikatoren wie Nematoden Index von Kompost Reife und drei mikrobiellen Ecoenzymes, Phosphatase, β-1,4-Glucosidase und β-1,4-N-Acetylglucosaminidase8. Die Ecoenzymes spiegelt den Zustand der Zersetzung und dem Kohlenstoff und Nährstoff Bedarf der mikrobiellen Gemeinschaft. Bestätigung der Suppressiveness Pflanze Tests erreicht werden, aber sie nehmen mehr Zeit in Anspruch. Isolieren und Aufrechterhaltung einer Reinkultur eines Pilzes kümmert sich um Verunreinigungen zu vermeiden. ATCC9 bietet Tipps und Techniken für die Kultivierung von Hefen und filamentöse Pilze.
Die Methode ist ein potenzieller Kandidat für kommerzielle Zertifizierung von Krankheit unterdrückende Eigenschaften. Das Ergebnis spiegelt Unterdrückung als Boden Funktion. Es gibt keine Mechanismen oder spezifische mikrobielle Spezies verantwortlich für Krankheit Unterdrückung an. Eine zukünftige Anwendung könnte sein, schneiden Sie einen Teil der Hemmung Zone zur Extraktion von DNA für die Sequenzierung und Identifizierung von Community-Mitgliedern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Vermont landwirtschaftliche Experiment-Station wettbewerbsfähige Luke Programm VT-HO1609 wurde die Forschung gefördert. Lynn Fang verwendet die Methode als Teil ihrer M.S.-Dissertation an der Universität von Vermont6.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclavable narrow-neck glass conical flask | Fisher Scientific | 10-040D | 125-mL |
| autoclavable glass testtubes | Fisher Scientific | 14-925J | 25-mL |
| dehydrated granulated agar | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | 500 g quantity |
| heat resistant gloves | Fisher Scientific | MEMGG1314WL | several brands available |
| Parafilm (strips of 2-3 cm wide) | Fisher Scientific | PM992 13-374-16 | 5 or 10 cm widths work |
| disposable polystyrene petri dishes | Fisher Scientific | R80116 | comes in sleeves of 20/ea or cases of 500 |
| dehydrated potato dextrose agar | Fisher Scientific | DF0013-15-8 | comes in quantities of 100, 500 and 2000 grams |
| benchtop reciprocal shaker | Thomas Scientific | 1227Y31 | other models will work |
| water bath | ThermoScientific | S37363 | 5L general purpose |
| clear ruler, flat, at least 10 cm | Any | use metric rule | |
| ATCC culture | American Type Culture Collection | ATCC 10154 | teleomorph Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) or MYA 4031; |
| lab tape | Fisher Scientific | 15935 | autoclavable and removable, 1" wide preferred |
| water resistant marker | office or scientific supply | Sharpie fine tip | write sample number on tape |
References
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- Wichuk, K. M., McCartney, D. Compost stability and maturity evaluation - a literature review. Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).
- Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness. Biological Control. 3, 199-207 (2011).
- Fang, L. Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).
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