Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Evaluering af virulens og patogenese af Aeromonas infektion i en Caenorhabditis elegans Model

Published: December 20, 2018 doi: 10.3791/58768

Summary

Her, vil vi præsentere tre forskellige eksperimenter for at studere Aeromonas infektion i C. elegans. Ved hjælp af disse praktiske metoder, er det let at vurdere toksicitet mellem og inden for Aeromonas arter.

Abstract

Den menneskelige patogen Aeromonas har været klinisk vist sig at forårsage gastroenteritis, sårinfektioner, sepsis og urinvejsinfektioner. De fleste menneskelige sygdomme er blevet rapporteret at være forbundet med fire arter af bakterier: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniiog Aeromonas caviae. Model organisme Caenorhabditis elegans er en bacterivore, der giver en fremragende infektion model til at studere den bakterielle patogenesen af Aeromonas. Her, vil vi præsentere tre forskellige eksperimenter for at studere Aeromonas infektion ved hjælp af en C. elegans model, herunder overlevelse, flydende toksicitet og muskel nekrose assays. Resultaterne af de tre metoder bestemmelse af virulens i Aeromonas var konsekvent. A. dhakensis viste sig at være de mest giftige blandt de 4 store Aeromonas arter forårsager kliniske infektioner. Disse metoder er vist sig at være en praktisk måde at vurdere toksicitet mellem og inden for Aeromonas arter og bidrage til forståelsen af patogenesen af Aeromonas infektion.

Introduction

Den menneskelige patogen, Aeromonas, har klinisk vist at forårsage gastroenteritis, sårinfektioner, sepsis og urinveje infektioner1,2. De fleste tilknyttede menneskelige sygdomme er blevet rapporteret at være forbundet med fire bakteriearter: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veroniiog Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. blandt Aeromonas infektionssygdomme, bløddelene infektioner kan forårsage svær sygelighed og dødelighed hos mennesker. Af note er muskel nekrose den mest alvorlige form af blødt væv infektion6. Observation af overlevelse og muskel nekrose af Caenorhabditis elegans efter infektion er en praktisk metode til at spekulere Aeromonastoksicitet.

Forskere har allerede udviklet mange modelorganismer til at studere bakterielle infektioner. I tidligere undersøgelser, blev mus, zebrafishes og nematoder brugt som dyremodeller til undersøgelse af patogenesen og virulens Aeromonas6,7,8. Hvert dyr model har sin ' fordele og applikationer. Model organisme, Caenorhabditis elegans, er en bacterivorous nematode hvilke indtag bakterier som foodnaturally. C. eleganshar udviklet et kompliceret medfødte immunforsvar mod bakteriel infektion i løbet af dets udvikling. Under stress af bakteriel infektion, har C. elegans vist sig for at være en fremragende infektion model til at studere den bakterielle patogenesen af Aeromonas6,7,9 og andre patogener ligesom svamp10 og entero Escherichia coli O157: H711. Men der er stadig ingen publikation, der fokuserer på metodologi i ved hjælp af C. elegans som en model til at studere virulens i Aeromonas.

Her introducerer vi tre forskellige eksperimenter for at studere Aeromonas infektion med C. elegans som en dyremodel: assays til overlevelse, flydende toksicitet og muskel nekrose. Disse metoder er en praktisk måde at vurdere toksicitet mellem og inden for Aeromonas arter og forbedre forståelsen af patogenesen af Aeromonas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af dyrkningsmediet

Bemærk: Se tabel 1 for løsning forberedelse.

  1. For at forberede M9 medium12, opløse 1,5 g KH2PO4, 5.66 g Na2HPO4og 2,5 g NaCl i 500 mL deioniseret vand. Autoklavering ved 121 ° C i 20 min. vente indtil afkøles til stuetemperatur og derefter tilsættes 0,5 mL 1 M MgSO4 før første brug.
  2. For at forberede ødelægge vækst medium (NGM)12, Opløs 3 g NaCl, 2,5 g bakteriel pepton og 20 g agar i 1 L i ionbyttet vand. Autoklavering ved 121 ° C i 20 min. vente indtil afkøles til 55 ° C i et vandbad og derefter tilsættes 1 mL af 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5% kolesterol i ethanol og 25 mL af fosfat buffer. Swirl at blande godt.
  3. Hæld ca. 5 mL NGM ind hver 6 cm petriskål. Undgå boble produktion på overfladen af pladen. Forlade plader ved stuetemperatur for 1 nat og pakke at spare ved 4 ° C. Bringe tilbage til stuetemperatur før anvendelse.
  4. For at forberede beriget NGM (ENGM), Opløs 3 g NaCl, 5 g bakteriel pepton, 1 g gærekstrakt og 30 g agar i 1 L i ionbyttet vand. Autoklavering ved 121 ° C i 20 min. vente indtil afkøles til 55 ° C i et vandbad og tilsættes 1 mL af 1 M CaCl2, 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 5% kolesterol i ethanol og 25 mL af fosfat buffer. Swirl at blande godt.
  5. Hæld ca. 10 mL ENGM til hver 9 cm petriskål. Undgå boble produktion på overfladen af pladen. Forlade plader ved stuetemperatur for 1 nat og pakke at spare ved 4 ° C. Bringe til stuetemperatur før anvendelse.
  6. At forberede S medium12, blande 40 mL S Basal, 0,4 mL 1 M kalium citrat, 0,4 mL trace metaller løsning, 0,12 mL 1 M CaCl2, 0,12 mL 1 M MgSO4, 40 µL af 5% kolesterol i ethanol og 1 mL af 8 mM FudR før brug.

2. synkronisering af C. elegans6,9,12

  1. Vask ca. 2.000 orme i fælderne-voksen scene med 10 mL sterilt deioniseret vand i en 15 mL tube. Vaske ud bakterier 3 x, at holde orme i bunden af røret.
  2. Der centrifugeres prøve for 1 min 500 x g ved at trække ned orme. Fjern supernatanten, og holde orme i 3,5 mL deioniseret vand.
  3. Tilsæt 1 mL NaOCl (10-15%) og 0,5 mL 5 M KOH ind i røret. Bland jævnt ved omrystning < 6 min at lyse orm organer.
  4. Når æggene er frigjort fra ormene, tilføje 10 mL deioniseret vand for at stoppe lysering. Der centrifugeres i 1 min på 1.200 x g til at trække ned æggene og Fjern supernatanten så meget som muligt. Vask med 15 mL M9 medium mindst 3 x.
    Bemærk: Se trin 1.1 for sammensætningen af M9 medium.
  5. Hold æg i 1 mL M9 medium. Transport æg til en 3,5 cm parabol til inkubation ved 20 ° C for en nat (ca 12 – 18 h).
    Bemærk: Efter inkubation, vil æggene klækkes for at ormen larve, der er indkaldt som første larve (L1) fase.
  6. Der afpipetteres ud 10 µL af L1 orme i M9 medium. Antal orm og beregne koncentrationen af L1 orme i M9 medium.
  7. Frø højst 10.000 inkuberes L1 fase orme med en pipette på en 9 cm ENGM plade spredes med Escherichia coli OP50.
    1. I dette trin kulturperler spredning 0,5 mL natten E. coli OP50 med Luria-Bertani (LB) bouillon på 9 cm ENGM plade. Inkuber plade ved 37 ° C i 16-18 h
      Bemærk: For at undgå kontaminering, det spreder sig skridt skal udføres i en laminar flow hætte.
    2. Afkøles til stuetemperatur før såning L1 orme. Frø højst 10.000 inkuberes L1 fase orme på ENGM pladen med E. coli OP50.
  8. Inkuber orme ved 20 ° C til 44 h, eller indtil de vokser til 4th larve (L4) fase.
    Bemærk: Se trin 1.3 for sammensætningen af ENGM medium. En orm er en hvid prik i halvmåne form på midten af kroppen side på stadiet L4.
  9. Bruge den synkroniserede L4 fase orme i de følgende assays. Brug vildtype N2 orme i C. elegans overlevelse assay med Aeromonas dhakensis og C. elegans flydende toksicitet assay med Aeromonas dhakensis. Bruge RW1596 orme (myo-3(st386); stEx30 [myo-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) i C. elegans muskel nekrose assay med Aeromonas dhakensis.

3. C. elegans overlevelse Assay med Aeromonas6,9

  1. På dagen for såning L1 orme på ENGM breder sig med E. coli OP50, vælge en enkelt koloni af hver af de fire Aeromonas stammer eller E. coli OP50 og kultur med 2 mL LB bouillon henholdsvis ved 37 ° C i 16 h.
    Bemærk: For at undgå kontaminering, skal dette trin udføres i en laminar flow hætte. Her, de følgende bakteriestammer blev brugt: E. coli OP50, normal mad kilde til C. elegans. A. dhakensis AAK1, den første fuldt sekventeret patogene kliniske A. dhakensis isolere. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 og A. caviae A2-9307121 er repræsentativ kliniske isolater fra National Cheng Kung University Hospital.
  2. Absorbansen OD600 bakteriel bouillon og justere den bakterielle bouillon til OD600 = 2.0 med LB bouillon.
  3. Spot og sprede 30 µL af bakteriel bouillon hver 6 cm NGM plade. Kultur plader ved rumtemperatur natten over.
    Bemærk: Se trin 1.2 for sammensætningen af NGM medium.
  4. Den dag L1 orme vokse til stadiet L4, tilfældigt vælge og overføre 50 orme til en NGM plade med hvert af de fire Aeromonas stammer eller E. coli OP50.
  5. Inkuber NGM plader ved 20 ° C, indtil analysen er afsluttet.
  6. Overføre alle de levende orme til en nypræparerede NGM plade med bakterier og tælle antallet af levende døde, og sensor orme hver dag, indtil den sidste orm er død.
    Bemærk: Overføre orme til en frisk tilberedt NGM plade dagligt til vedligeholdelse af infektion, selvom bruger sterile orme (fxglp-4, eller med FudR).
  7. Plot overlevelse kurverne baseret på beregningen af daglige data.

4. C. elegans flydende toksicitet Assay med Aeromonas7

Bemærk: For at undgå kontaminering, skal trin udføres i en laminar flow hætte.

  1. Dagen efter såning L1 orme på ENGM pladen spredes med E. coli OP50, vælge en enkelt koloni af hver af de fire Aeromonas stammer og E. coli OP50 og kultur med 5 mL LB bouillon hver ved 37 ° C i 16 h.
    Bemærk: I protokollen, de følgende bakterier stammer blev brugt: E. coli OP50, normal mad kilde til C. elegans. A. dhakensis AAK1, den første fuldt sekventeret patogene kliniske A. dhakensis isolere. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 og A. caviae A2-9307121 er repræsentativ kliniske isolater fra National Cheng Kung University Hospital.
  2. Absorbansen OD600 bakterier bouillon.
  3. Der centrifugeres den bakterielle bouillon på 3.500 x g i 15 min. at fjerne LB bouillon. Resuspend bakterier og justere den bakterielle bouillon til OD600 = 3,0 med S medium. Tilføje 195 µL af bakteriel bouillon i S medium til mindst 8 huller i en 96-brønd pladen.
    Bemærk: Se trin 1,6 for sammensætningen af S medium.
  4. Vaske L4 orme på ENGM plade med E. coli OP5 ved hjælp af M9 medium. Justere orm løsningen til en koncentration på 5 orme pr. µL og tilsæt 5 µL af opløsningen orm til hver brønd i 96-brønd-pladen. Sikre, at der er ca 25 orme pr. brønd.
  5. Inkuber 96-brønd plade på en shaker på 200 rpm ved 25 ° C.
  6. Tæl antallet af levende orme og døde orme efter 24, 48 og 72 h. beregne overlevelsesrater for hver brønd med følgende formel: (levende orme/Total orme) × 100%.
  7. Tegne en scatter plot grafen med de daglige data beregning.

5. C. elegans muskel nekrose Assay med Aeromonas6

Bemærk: For at undgå kontaminering, skal disse trin udføres i en laminar flow hætte.

  1. Vælge en enkelt koloni af hver af de fire Aeromonas stammer og E. coli OP50 og kultur med 2 mL LB bouillon hver ved 37 ° C i 16 h dag L1 orme udsås på ENGM spredes med E. coli OP50.
    Bemærk: Her, de følgende bakterier stammer blev brugt: E. coli OP50, normal mad kilde til C. elegans. A. dhakensis AAK1, den første fuldt sekventeret patogene kliniske A. dhakensis isolere. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 og A. caviae A2-9307121 er repræsentativ kliniske isolater fra National Cheng Kung University Hospital.
  2. Absorbansen OD600 bakterier bouillon og justere bakterier bouillon til OD600 = 2.0 med LB bouillon. Spot og sprede 30 µL af bakteriel bouillon på 6 cm NGM plader. Kultur plader ved rumtemperatur natten over.
  3. Dag vokse ormene L1 til L4 fase, overførsel 50 orme til hver NGM plade med hvert af de fire Aeromonas stammer eller E. coli OP50. Inkuber NGM plader ved 20 ° C. Overføre orme hver 24 h til nypræparerede NGM plader med bakterier.
  4. Tage muskel billeder ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
    1. Tilfældigt vælge 10 orme på en 2%-agarosegel i M9 medium på et dias. Lamme ormene ved hjælp af 2 µL af 1% natriumazid i M9 medium på Agarosen for mindre end 5 min før du tager billeder.
    2. Placer en cover slip og fange de muskel billeder ved hjælp af en grøn fluorescerende proteiner (NGL) filter på et fluorescerende mikroskop med charge - sammen enhedens kamera. Fange muskel billederne på 24, 48 og 72 h post L4 fase.
  5. Gennemføre billede analyse og figur forberedelse med en billedbehandling software.
    Bemærk: Definitionerne af scores og muskel skader niveauer er vist i figur 3, som kriterierne, der er opført som følger: 3 point for manglende muskelfibre; 2 point for bristet eller ødelagte muskelfibre; 1 point for bent muskelfibre; 0 point for sund muskelfibre.

6. den statistiske analyser

  1. Udføre alle eksperimenter minimum tre gange uafhængigt af hinanden.
  2. Brug metoden Kaplan-Meier for at vurdere C. elegans overlevelse assays, og brug log-rank test til at analysere overlevelse forskelle. Sæt statistiske signifikansniveau på 0,05.
  3. Bruge Student's t-test til at analysere de statistiske resultater af C. elegans flydende toksicitet assays til de to forskellige grupper. Brug en-vejs ANOVA test til at analysere forskelle mellem tre eller flere værdier for en uafhængig variabel. Sæt statistiske signifikansniveau på 0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved at følge de protokoller er beskrevet ovenfor, er det let at skelne mellem toksicitet fra de fire Aeromonas stammer. Overlevelse analysen af C. elegans er vist i figur 1. Overlevelsesrater for C. elegans inficeret med Aeromonas arter, vises i rækkefølge fra høje til lave var: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila og A. dhakensis. Selv om der er forskelle med hensyn til toksicitet mellem og inden for Aeromonas arter, viste overlevelsesrater for C. elegans, gennemsnitligt højeste dødelighed blandt ormene inficeret med A. dhakensis. Virulens i A. hydrophila var ringere end af A. dhakensis (p < 0,01). I modsætning til A. dhakensis og A. hydrophila,blev de svækkede virulences af A. veronii og A. caviae observeret i C. elegans overlevelse assay. Mangfoldighed af overlevelsesrater for C. elegans inficeret med forskellige Aeromonas arter er i overensstemmelse med kliniske observationer af Aeromonas infektion7.

Resultaterne af flydende toksicitet analysen af C. elegans er vist i figur 2. Med tid, infektion faldet antallet af orme, der overlevede betydeligt, når C. elegans var inficeret med enten A. dhakensis eller A. hydrophila. Overlevelsesraten for ormene inficeret med A. dhakensis var ringere end de smittede med A. hydrophila. Derimod havde de grupper, der er inficeret med A. veronii eller A. caviae højere overlevelsesrate på hvert tidspunkt i forhold til A. dhakensis og A. hydrophila. Tendenserne i overlevelsesprocenten af C. elegans i flydende toksicitet analysen repræsenterer virulens i forskellige Aeromonas arter er lig dem observeret i overlevelse assay.

I C. elegans muskel nekrose assay, vi først klassificeret niveauer af muskelskader og tildelt score ifølge de tilsvarende niveauer. Der er fastsat definitioner af scoren og muskel skader niveauer i figur 3. De scoring kriterier for hver muskel skader niveau er som følger: 0 point for sund muskelfibre; 1 point for bent muskelfibre; 2 point for bristet eller ødelagte muskelfibre; 3 point til tabet af muskelfibre. Resultaterne af C. elegans muskel nekrose assay i Aeromonas inficerede -C. elegans er vist i figur 4. Grader af muskelskader varieret blandt Aeromonas arter. Niveauer af muskel skade varierede i rækkefølge fra mild til svær som følger: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila og A. dhakensis på hvert tidspunkt. I modsætning til A. hydrophila og A. dhakensisvar muskel nekrose ikke indlysende i worms inficeret med A. caviae og A. veronii. De fleste af ormene inficeret med A. caviae og A. veronii var registreret som 0 point. C. elegans inficeret med A. hydrophila eller A. dhakensis udstillede alvorlig muskelskader. Af note, de fleste af ormene inficeret med A. dhakensis påvist muskel skader graded ≥2 point. Graden af muskel nekrose af C. elegans inficeret med A. dhakensis var mere alvorlig med hensyn til en højere procentdel af score ≥ 2 point i forhold til A. hydrophila. Sværhedsgraden af muskel nekrose i arternes 4 Aeromonas korreleret med resultaterne fra overlevelse og flydende toksicitet assays.

Metoderne beskrevet ovenfor tilbyder en nem måde at skelne virulens mangfoldighed blandt og inden for Aeromonas arter. Desuden er dette en pålidelig model til at studere samspillet mellem en patogen og vært.

Figure 1
Figur 1 : Overlevelse kurver af C. elegans. Overlevelse analysen viser de forskellige toksiciteter forskellige Aeromonas arter til C. elegans (**: P < 0,01; *: P < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Overlevelsesraten for C. elegans fra flydende toksicitet assay. Flydende toksicitet analysen viser de forskellige toksicitet af forskellige Aeromonas arter til C. elegans. På (A) 24 h, (B) 48 h, og (C) 72 h post Aeromonas infektion, C. elegans inficeret med A. dhakensis har de laveste overlevelsesrate. Resultatet tyder på, at A. dhakensis er den mest giftige Aeromonas arter til C. elegans (***: P < 0,001; **: P < 0,01, fejllinjer: standardafvigelsen, SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : De tilsvarende noder for muskel nekrose i C. elegans induceret af Aeromonas infektion. Kriterierne for muskel nekrose og tilsvarende scorer er som følger: 3 point for manglende muskelfibre; 2 point for bristet eller ødelagte muskelfibre; 1 point for bent muskelfibre; 0 point for sund muskelfibre. Bent muskelfibre (pile), bristet muskelfibre (pilespidser) og mangler muskelfibre (star) er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : C. elegans muskel nekrose scores. Muskel nekrose scorer viser de forskellige toksiciteter forskellige Aeromonas arter til C. elegans. På (A) 24 h, (B) 48 h, og (C) 72 h post Aeromonas infektion, C. elegans muskelskader er de hårdeste fra infektion med A. dhakensis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Løsning Forberedelse
Fosfat Buffer Opløses 119.35 g deioniseret KH2PO4 og 21.43 g K2HPO4, i 1 L vand.
Autoklavering ved 121 ° C i 20 min
Juster pH-værdien til pH = 6.0 med KOH.
Vent, indtil afkøles til stuetemperatur
S Basal Opløse 5.85 g NaCl, 6 g KH2PO4og 1 g K2HPO4 i 1 L i ionbyttet vand.
Autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
Vent, indtil afkøles til stuetemperatur.
1 M kalium citrat Opløses 4 g citronsyre acid•H2O og 58,7 g tri-kalium citrate•H2O i 0,2 mL deioniseret vand.
Juster pH-værdien til pH = 6.0.
Autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
Vent, indtil afkøles til stuetemperatur.
Trace metaller løsning Opløse 1.86 g dinatrium EDTA, 0.69 g FeSO4•7 H2O, 0,2 g frihedsbevægelse2•4 H2O, 0,29 g ZnSO4•7 H2O,
0,025 g CuSO4•5 H2O i 1 L deioniseret vand.
Autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
Vent, indtil afkøles til stuetemperatur
Holde løsningen i mørke.
LB bouillon 5 g gær opløses 10 g NaCl og 10 g trypton ekstrakt i 1 L deioniseret vand. Autoklavering ved 121 ° C i 20 min.
Vent, indtil afkøles til stuetemperatur.

Tabel 1: Løsning forberedelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C. elegans er en bacterivorous nematode det naturligt indtag bakterier som mad og har udviklet en kompliceret medfødt immunitet for bakterier under sin evolutionære proces. To af de store organer opretholde og støtte immunitet er overhuden og tarmen9,13. Epidermis og bands af muskel i C. elegans ligner bløddelene strukturer i pattedyr og mennesker6. På grund af disse karakteristika kan C. elegans anvendes som en model organisme for at studere patogenesen af Aeromonas infektion.

Her, vil vi præsentere tre metoder til at undersøge Aeromonas infektion i C. elegans , som er repræsentative for de forskellige toksicitet blandt 4 Aeromonas arter og er korreleret med klinisk observation7. Disse praktiske metoder skelne de forskellige grader af toksicitet blandt Aeromonas arter. Ved hjælp af disse metoder, kan forskere studere virulens i forskellige Aeromonas arter og den forsvarende mekanisme for værter ved Aeromonas infektion.

I disse tre metoder fungerer C. elegans ikke blot som et rovdyr, men også som et bytte af Aeromonas. Hvis ormene ikke i sund tilstand før test, vil resultaterne af vært-patogen interaktion være forskellige. Det er således vigtigt at være meget forsigtig, når manipulere C. elegans. For at undgå overdreven skader på æg af C. elegans i trinnet synkronisering, være sikker på at observere frigivelsen af æg kontinuerligt. Når æggene er beskadiget, formindskes i vid udstrækning rugeæg antallet af C. elegans æg. Selvom de beskadigede æggene klækkes med succes, er orme tilbøjelige til at have udviklingsmæssige problemer. Derfor er det afgørende for komplet trin 2.3 indenfor 6 min efter ormene udsættes for NaOCl og KOH.

De tre metoder, der beskrives ovenfor viser sammenhængende resultater på Aeromonas toksiciteter til C. elegans, herunder to forskellige eksperimenter måling overlevelsesprocenten af C. elegans under Aeromonas infektion og en observere den morfologiske forandringer af muskel. Virulens testen ved hjælp af forskellige konstrueret metoder kan give forskellige resultater. For eksempel, forskere har tidligere observeret forskellige udfald i C. elegans plade og væske-undersøgelser,14. I vores forskning fandt vi også der var uoverensstemmelse mellem disse to assays9. Det menes, at det eksterne miljø vil påvirke virulens af patogenet, og forskerne har brug at finde de optimale betingelser til at udforske virulens mekanisme. Fra et andet perspektiv er det værd at studere og forstå de underliggende mekanismer i særlige betingelser for infektion.

I dette arbejde etableret vi en infektion model i C. elegans at studere virulens Aeromonas og den tilsvarende host reaktion efter infektion. Disse tre metoder kunne anvendes til at studere de andre Aeromonas arter ud over de 4 arter behandles i den foreliggende undersøgelse. Desuden vil disse tilgange giver en platform til at studere de underliggende mekanisme ansvarlig for muskel nekrose induceret af bakteriel infektion og udvikle potentielle behandlinger for at forbedre de kliniske resultater af alvorlige bløddele infektioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for bistand fra C. elegans core facilitet i Taiwan og til de diagnostiske Mikrobiologi og antimikrobiel resistens laboratorium af nationale Cheng Kung University Hospital for at levere Aeromonas isolerer. Vi anerkender også Caenorhabditis genetik Center (CGC), og WormBase. Vi takker også Savana Moore for redigering håndskriftet.

Denne undersøgelse var delvist støttet af tilskud fra ministeriet for videnskab og teknologi i Taiwan (mest 105-2628-B-006-017-MY3) og National Cheng Kung University Hospital (NCKUH-10705001) til P.L. Chen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Shaker incubator YIH DER LM-570R Bacteria incubation
K2HPO4 J.T.Baker MP021519455 Culture medium preparation 
KH2PO4 J.T.Baker 3246-05 Culture medium preparation 
Na2HPO4 J.T.Baker MP021914405 Culture medium preparation 
NaCl SIGMA 31434 Culture medium preparation 
MgSO4 SIGMA M7506 Culture medium preparation 
agar Difco 214530 Culture medium preparation 
CaCl2 SIGMA C1016 Culture medium preparation 
cholesterol SIGMA C8503 Culture medium preparation 
ethanol SIGMA 32205 Culture medium preparation 
KOH SIGMA P5958 Culture medium preparation 
6 cm Petri plate ALPHA PLUS 46 agar plate preparation
96-well plate FALCON 353072 liquid assay
bacterial peptone Affymetrix/USB AAJ20048P2 Culture medium preparation 
yeast extract SIGMA 92144 Culture medium preparation 
citric acid•H2O SIGMA C1909 Culture medium preparation 
tri-potassium citrate•H2O SIGMA 104956 Culture medium preparation 
FudR  SIGMA 1271008 Culture medium preparation 
disodium EDTA SIGMA E1644 Culture medium preparation 
FeSO4•7 H2O SIGMA 215422 Culture medium preparation 
MnCl2•4 H2O SIGMA 221279 Culture medium preparation 
ZnSO4•7 H2O SIGMA 204986 Culture medium preparation 
CuSO4•5 H2O SIGMA C8027 Culture medium preparation 
tryptone SIGMA 16922 Culture medium preparation 
Microscope system Nikon  Eclipase Ti inverted  microscope imaging
Scientific CCD Camera QImaging  Retiga-2000R Fast 1394  microscope imaging

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parker, J. L., Shaw, J. G. Aeromonas spp. clinical microbiology and disease. Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).
  2. Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Skin and soft-tissue infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (4), 543-547 (2013).
  3. Chao, C. M., Lai, C. C., Tang, H. J., Ko, W. C., Hsueh, P. R. Biliary tract infections caused by Aeromonas species. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 32 (2), 245-251 (2013).
  4. Chuang, H. C., et al. Different clinical characteristics among Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii biovar sobria and Aeromonas caviae monomicrobial bacteremia. Journal of Korean Medical Science. 26 (11), 1415-1420 (2011).
  5. Chao, C. M., Lai, C. C., Gau, S. J., Hsueh, P. R. Skin and soft tissue infection caused by Aeromonas species in cancer patients. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 46 (2), 144-146 (2013).
  6. Chen, P. L., et al. A Disease Model of Muscle necrosis caused by Aeromonas dhakensis infection in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 7, 2058 (2016).
  7. Chen, P. L., et al. Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences. PLoS One. 9 (11), 111213 (2014).
  8. Saraceni, P. R., Romero, A., Figueras, A., Novoa, B. Establishment of infection models in zebrafish larvae (Danio rerio) to study the pathogenesis of Aeromonas hydrophila. Frontiers in Microbiology. 7, 1219 (2016).
  9. Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. RIOK-1 Is a Suppressor of the p38 MAPK Innate Immune Pathway in Caenorhabditis elegans. Frontiers in Immunology. 9, 774 (2018).
  10. Powell, J. R., Ausubel, F. M. Models of Caenorhabditis elegans infection by bacterial and fungal pathogens. Methods in Molecular Biology. 415, 403-427 (2008).
  11. Chou, T. C., et al. Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 Shiga-like toxin 1 is required for full pathogenicity and activation of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway in Caenorhabditis elegans. Cellular Microbiology. 15 (1), 82-97 (2013).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Engelmann, I., Pujol, N. Innate immunity in C. elegans. Advances in Experimental Medicine and Biology. 708, 105-121 (2010).
  14. Feinbaum, R. L., et al. Genome-wide identification of Pseudomonas aeruginosa virulence-related genes using a Caenorhabditis elegans infection model. PLoS Pathogens. 8 (7), 1002813 (2012).

Tags

Immunologi og infektion sag 142 Aeromonas dhakensis Aeromonas hydrophila Aeromonas veronii Aeromonas caviae Caenorhabditis elegans bakteriel infektion flydende toksicitet assay overlevelse analyse Muskel nekrose assay.
Evaluering af virulens og patogenese af <em>Aeromonas</em> infektion i en <em>Caenorhabditis elegans</em> Model
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., More

Chen, Y. W., Ko, W. C., Chen, C. S., Chen, P. L. Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model. J. Vis. Exp. (142), e58768, doi:10.3791/58768 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter