Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

العلاج الجيني وحي بوليكيشن طلاء لحماية النانو أوريغامي الحمض النووي

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

ويرد هنا، على بروتوكول لحماية النانو أوريغامي الحمض النووي في وسائط الإعلام المنضب ملغ والغنية نوكلاس استخدام الشيتوزان السكاريد الموجبة الطبيعية والاصطناعية بولييثيلينيميني الخطي (لبيي) الطلاء.

Abstract

عقد النانو أوريغامي الحمض النووي بإمكانيات هائلة لاستخدامها للتطبيقات الطبية والبيولوجية. ومع ذلك، الظروف منخفضة الملح ونوكلياسيس في السوائل الفيزيولوجية حمل تمسخ وتدهور الذاتي تجميعها النانو الحمض النووي. في إيصال الجينات غير الفيروسية، هو التغلب على تدهور الانزيمية للحمض النووي بالتغليف من الحمض النووي مشحونة سلبا في قذيفة الموجبة. هذه الوثيقة، مستوحاة من الجينات إنجاز التقدم، بسيطة، خطوة واحدة ومنهجية قوية هو تعرض لاستقرار النانو أوريغامي الحمض النووي طلاء لهم مع الشيتوزان والخطي بولييثيلينيميني. ويحمي الطلاء بوليكيشن كفاءة النانو أوريغامي الحمض النووي في وسائل الإعلام الغنية نوكلاس والمستنفد مغ. كما يحافظ هذا الأسلوب addressability كامل من الروغان المستندة إلى إنزيم وابتمر من النانو الحمض النووي.

Introduction

الحمض النووي لبنة تنوعاً لبرمجة التجميع الذاتي ل هياكل النانو1. أن الأسلوب الأكثر شعبية لإنشاء النانو الحمض النووي هو تقنية أوريغامي الحمض النووي، الذي يستند التجميع الذاتي الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل دائرية طويلة، واحد فروع سقالة بمساعدة مئات من أقصر تدبيس الاصطناعية تحديد الشكل2. اليوم، إنشاء النانو الحمض النووي في تقريبا أي الهندسة ومورفولوجيا سهولة ممكنة. يمكن أن يكون فونكتيوناليزيد سيتيسبيسيفيكالي مع عالية الدقة3،4 النانو الحمض النووي ويمكن برمجتها للخضوع للتغييرات كونفورماشونال اللوستيريك5،6. ومن ثم، باستخدام الحمض النووي كمادة بناء يوفر فرصة فريدة لخلق النانو للبرمجة واستجابة مصممة خصيصا للتطبيقات في بيوسينسينج والتشخيص وإيصال الأدوية. النانو الحمض النووي غير عرضه الهضم أكسو-و إندو-نوكليسيس، وعلى أساس شعرية 3D أوريغامي الحمض النووي النانو عموما تتطلب المخازن المؤقتة للملوحة العالية (مثلاً.، 5-20 مم Mg+ 2) للحفاظ على ما سلامة7،8.

التدهور السريع للحمض النووي من نوكليسيس الموجودة في الدم والمصفوفة خارج الخلية عقبة رئيسية أمام كفاءة في فيفو إيصال المنتجات الوراثية في خلايا9. للتغلب على هذا القيد، في إيصال الجينات غير الفيروسية، يختلط الحمض بوليمر الأيوني في نسبة (نسبة الأمينات في بوليكاتيون للفوسفات في الحمض النووي) مقابل10N/P محددة. يحمي الحمض النووي من تدهور نوكلاس بوساطة المعقدة من الحمض النووي مع بوليمر الموجبة، المعروفة باسم بوليبليكس، ويعزز الإقبال على الهاتف الخلوي11. مستوحاة من التقدم إيصال الجينات، أوليجوليسيني12، أوليجوليسيني--البولي إثيلين غليكول (شماعة) البوليمرات الإسهامية13، بولي (2-ديميثيلامينو-اثيلميثاكريلاتي) (بدمايما)-على أساس البوليمرات14و بروتينات قفيصه الفيروس15 وقد استخدمت لتحقيق استقرار النانو أوريغامي الحمض النووي.

في الآونة الأخيرة، أبلغنا بطريقة لحماية النانو أوريغامي الحمض النووي في النضوب ملغ والوسائط الغنية نوكلياسي باستخدام الشيتوزان السكاريد الموجبة الطبيعية وبولييثيلينيميني الخطي الاصطناعية (لبيي) تم الإبلاغ عن16. هذه المقالة هو تكييف أعمالنا السابقة ويصف البروتوكول مفصلاً لإعداد بوليبليكسيس، تكييفها، اختبار استقرار النانو عارية والمحمية في وسائط الإعلام الملح المنخفضة والغنية نوكلاس وبحث addressability للانزيم وابتمر فونكتيوناليزيد النانو أوريغامي الحمض النووي عند طلاء بوليكاتيون.

Protocol

1. إعداد حل الأسهم بوليكاتيون

  1. حل الأسهم لبيي
    1. إضافة 10 مغ لبيي في الكأس الزجاجية التي تتضمن < 10 مل ح2o.
    2. تماما حل لبيي، إضافة HCl (32 في المائة) حتى تصل إلى الرقم الهيدروجيني 2.0.
    3. قم بضبط درجة الحموضة 7.0 بإضافة هيدروكسيد الصوديوم (10 م).
    4. ضبط حجم الصوت بتركيز 1 ملغ/مل النهائي.
    5. فيلتراتي لبيي الحل الأسهم من خلال غشاء 0.22 ميكرومتر.
  2. الشيتوزان الحل الأسهم
    1. حل 16.6 ملغ من الشيتوزان oligosaccharide لاكتات (مث ~ 5 كاتشين، تكوين oligosaccharide 60%، ديسيتيلاتيد من كيتين بنسبة 90 في المائة) في 1 مل من حمض الخليك (10 ٪) وسائط الإعلام مائي لإعداد حل أسهم بتركيز من 10 ملغ/مل.

2-تنقية النانو أوريغامي الحمض النووي

  1. مزيج 100 ميكروليتر من عينة أوريغامي الحمض النووي (في 5 مم تريس، يدتا 1 مم، 5 ملم كلوريد الصوديوم العازلة (المعرفة كالسل) بما في ذلك 18 مم مجكل2) مع حجم ما يعادل 22 مم مجكل تكملة2 تيرابايت (100 ميليلتر) في أنبوب 1.5 مل.
  2. إضافة 200 ميليلتر لتنقية العازلة (15% (w/v) ربط 8,000، 5 ملم تريس، يدتا 1 و 505 ملم كلوريد الصوديوم). المزيج بلطف بانعكاس الأنبوبة.
  3. تدور العينة في ز × 16,000 في درجة حرارة الغرفة (شيركلوف) لمدة 25 دقيقة.
  4. تجاهل المادة طافية بعناية وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت 16 مم مجكل2 تكملة السل. المادة طافية وبيليه تحتوي على خيوط التيلة الزائدة وسرع أوريغامي الحمض النووي، على التوالي.
  5. احتضان العينة لمدة يوم واحد في شيركلوف 650 لفة في الدقيقة في ثيرموميكسير. هذه الخطوة لاستثارة كاملة أوريغامي الحمض النووي.

3-[اغروس] هلام التفريد (عمر)

  1. إضافة ز 1.6 من [اغروس] و 80 مل من 0.5 x TAE المخزن المؤقت (20 ملم تريس، 0.5 مم يدتا، حمض الخليك 10 ملم، درجة الحموضة 8) في كوب زجاج لإعداد 2% [اغروس] هلام. الميكروويف لدقيقة 5 عباب محتويات الكأس لمدة 1 دقيقة في حمام مائي. إضافة ميليلتر 352 مجكل2 (2.5 م) تحضير الهلام مع 11 مم مجكل2. قبل وصمة عار الهلام مع 10 ميليلتر من الحمض النووي جل وصمة عار.
  2. صب جل الحل في مربع هلام جافة وإدراج مشط التفريد هلام. واسمحوا أن الحل الذي ترسخ في شيركلوف لمدة 15-30 دقيقة.
  3. الملحق المخزن المؤقت قيد التشغيل مع 11 مم مجكل2(0.5 × تاي المخزن المؤقت).
  4. مزيج من 10-20 ميكروليتر من العينة مع 20% 6 × تحميل المخزن المؤقت (والغليسيرول 30% (v/v)، بروموفينول 0.25% (w/v) الأزرق، 0.25% (w/v) زيلين نفط زايلين فرنك فرنسي) وتحميله في الآبار [اغروس] هلام.
  5. تشغيل الهلام في 70 الخامس في شيركلوف عن 2.5-3 ح.
  6. تصور الهلام مع الماسح ضوئي الأشعة فوق البنفسجية.

4-السلبية وصمة عار مجهر إلكتروني (نستيم)

  1. تطبيق 5 ميليلتر nanostructure المخفف أو بوليبليكس على شبكة تيم Cu400 المغلفة بالكربون خرج توهج. وليكن الجسميات ل ca. 1 دقيقة.
  2. يصفي السائل الفائض من حافة الشبكة بقطعة من ورق الترشيح.
  3. تطبيق 5 ميليلتر من محلول مائي خلات اليورانيل 2% والانتظار لمدة 1 دقيقة.
  4. استخدام حافة الورقة عامل التصفية لاستنزاف السائل الفائض من حافة الشبكة تماما.
  5. واسمحوا الشبكة جاف تماما قبل الحقن إلى ال.

5-بوليبليكس تشكيل

ملاحظة: مثال توضيحي لإعداد بوليبليكس تضم أوريغامي الحمض النووي والشيتوزان في نسب N/P 0.01-8.

  1. حساب عدد الأمينات كل بوليكيشن باستخدام الصيغة-1 (الجدول 1).
  2. قياس تركيز المنقي أوريغامي الحمض النووي باستخدام جهاز المطياف الضوئي بنفسجي الترا في 260 نيوتن متر. استخدام 2 ميليلتر من المخزن المؤقت للسل الفارغة لمعايرة الجهاز. حساب "نمول للفوسفات" استخدام صيغة-2.
  3. إعداد 15 ميليلتر لهيكل أوريغامي الحمض النووي بما في ذلك 1 نمول من الفوسفات.
  4. استخدام 3 صيغة لحساب حجم الشيتوزان، الذي يعتبر ضروريا لإعداد بوليبليكس ن/ص 0.01 8. على سبيل المثال، إعداد بوليبليكس في 8 N/P، يلزم 1.8 ميليلتر من الشيتوزان (0.8 mg/mL) (N/P هو 8 ونمول الفوسفات هو 1، والوزن الجزيئي من الشيتوزان ز 5,000/مول، تركيز الشيتوزان الحل الأسهم 0.8 ملغ/مل وعدد الأمينات كل الشيتوزان هو 28). إضافة 13.2 ميليلتر من السل إلى 1.8 ميليلتر من الشيتوزان (0.8 mg/mL). إضافة 15 ميليلتر من الشيتوزان الحل (0.8 mg/mL) إلى 15 ميليلتر من أوريغامي الحمض النووي من الخطوة 5، 3 للحصول بوليبليكس الشيتوزان أوريغامي الحمض النووي مع NP 8. بوليبليكس تتشكل تلقائياً.
  5. كرر الخطوة 5.4 بإعداد بوليبليكسيس في نسب مختلفة N/P.
  6. تنفيذ عصر كما هو موضح في الخطوة 3 (الشكل 1A). وتشمل أوريغامي الحمض النووي عارية كعنصر التحكم.
  7. الصورة بوليبليكس كما هو موضح في الخطوة 4 (الشكل 2).

    صيغة-1) عدد من المجموعات أمين كل بوليكاتيون
    Equation 1

    صيغة-2) الخلد للفوسفات
    =Equation 2

    صيغة-3) حجم بوليكاتيونس (ميكروليتر)
    =Equation 3

6-إلغاء التغليف مع سلفات ديكستران

  1. حساب عدد المجموعات سلفات الواحدة سلفات ديكستران استخدام صيغة-4 (الجدول 2).
  2. حساب حجم سلفات ديكستران اللازمة ديكومبليكساتيون بوليبليكس في معرفة مسبقاً A/P نسبة استخدام صيغة-5. أ/ف الشحن نسبة هي نسبة بين مجموعات سلفات بوليانيون (A) لمجموعات الفوسفات (P) أوريغامي الحمض النووي. مبلغ فائض من كبريتات ديكستران الحاجة كفاءة ديكومبليكساتيون من بوليبليكسيس (مثلاً 500-1,000). على سبيل المثال، ديكومبليكس بوليبليكس أعدت في القسم 5 (بوليبليكس يحتوي على 1 نمول من الفوسفات) في A/مطلوب ف 1,000، 3.6 ميليلتر من ديكستران سلفات 40 كاتشين (50 ملغم/مل) (A/P هو 1000، ونمول الفوسفات 1، الوزن الجزيئي لسلفات ديكستران 40,000 غ/مول ، تركيز ديكستران سلفات الأسهم الحل 50 ملغم/مل وعدد من كبريتات 220). إضافة 3.6 ميليلتر من كبريتات ديكستران (50 ملغم/مل) بوليبليكس من الخطوة 5.4 ومزيج جيد.
  3. إذا كان يعمل مع بوليبليكس الشيتوزان، إضافة هيدروكسيد الصوديوم لتسهيل عملية ديكومبليكسيشن. إضافة هيدروكسيد الصوديوم بتركيز نهائي 10 ملم. تخطي هذه الخطوة لبيي بوليبليكسيس.
  4. تنفيذ عصر كما هو موضح في الخطوة 3 (الشكل 1B). وتشمل أوريغامي الحمض النووي عارية وبوليبليكس كعنصر التحكم.

    صيغة-4) عدد من المجموعات سلفات كل بوليانيون =
    Equation 4

    صيغة-5) حجم سلفات ديكستران (ميليلتر)
    =Equation 5

7-الاستقرار نحو استنفاد ملغ

  1. أغسل ميليلتر 20 أوريغامي الحمض النووي أو بوليبليكس المطابق (بما في ذلك الفوسفات نمول 2) مع ميليلتر 4 × 600 مغ من الصفر المخزن المؤقت (5 ملم تريس، يدتا 1 و 30 ملم كلوريد الصوديوم) استخدام العمود ultrafiltration (موكو ~ كاتشين 3). تدور كل غسل في ز × 14,000 في شيركلوف لمدة 3-5 دقائق.
  2. جمع الحل المتبقية (80 ميليلتر) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد 650 لفة في الدقيقة في ثيرموميكسير.
  3. إذا كان الاختبار بوليبليكس لبيي، إضافة 2.5 ميليلتر مجكل2 (500 ملم) لتركيز نهائي من 16 مم مجكل2. ثم قم بإضافة 7 ميليلتر من ديكستران 40 سلفات كاتشين (50 ملغم/مل) (أي ما يعادل A/1,000 ف) لكشف جوهر النانو الحمض النووي (إلغاء التغليف، راجع الخطوة 6).
    ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان يعمل مع بوليبليكس الشيتوزان أو عارية أوريغامي الحمض النووي.
  4. اتبع تصوير نستيم كما هو موضح في الخطوة 3 (الشكل 2).

8-الدناز أنا المعايرة بالانزيم من النانو أوريغامي الحمض النووي عارية

  1. 3 مزيج ميليلتر عارية أوريغامي الحمض النووي بما في ذلك الفوسفات نمول 1 مع 2 ميليلتر من 10 x أنابيب الدناز أنا المخزن المؤقت (100 ملم تريس-HCl، 25 مم مجكل2، 5 مم كاكل2، درجة الحموضة 7.6)، 1 ميليلتر مجكل2 (250 ملم)، 12 ميليلتر من الماء في 0.2 مل PCR. إضافة 2 ميليلتر من الدناز أنا (10 x). ضبط المخزون تركز الدناز أنا (س 10) للحصول على النهائي الدناز أنا تركيزات 0.25-2 يو/مليلتر.
  2. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 1-2 في ثيرموسيكلير.
  3. تزج العينات في الثلج وتنشيط النشاط نوكليوليتيك بإضافة 2 ميليلتر من 500 مم ديثيوثريتول (DTT) و 2.5 ميليلتر من عطا (33 ملم).
  4. تحليل العينات باستخدام سن كما هو موضح في الخطوة 3.

9-الاستقرار بوليبليكسيس نحو الدناز أنا

  1. ميليلتر 4 مزيج من بوليبليكس (بما في ذلك 1 نمول من الفوسفات، أعدت في نسب مختلفة N/P) مع 1.5 ميليلتر من الدناز أنا المخزن المؤقت (10 x)، ميليلتر 8 تيرابايت و 1.5 ميليلتر من الدناز أنا (100 U/mL) 0.2 مل PCR الأنبوبة.
  2. تبني نموذج ل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في ثيرموسيكلير.
  3. إضافة 2 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل) لهضم "احتضان أولاً الدناز" مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ثيرموسيكلير.
    ملاحظة: بدلاً من الهضم الأنزيمي، إبطال مفعول المواد الكيميائية الدناز أنا بإضافة ميليلتر 1.5 من القيمة (500 مم) و 2 ميليلتر من عطا (33 مم) يمكن أن يؤديها.
  4. إضافة 3.6 ميليلتر من ديكستران 40 سلفات كاتشين (50 ملغم/مل) (أي ما يعادل A/1,000 ف) لكشف جوهر النانو الحمض النووي.
  5. تنفيذ العمر كما هو موضح في الخطوة 3 (الشكل 3 ألف، الشكل 3). وتشمل أوريغامي الحمض النووي الطازجة كمراقبة لقياس ومقارنة كثافات الفرقة في الهلام.
  6. الرسوم الفرقة على العمر واستخراج أوريغامي الحمض النووي بضغط تجميد استخراج عمود استناداً إلى بروتوكول المقدمة من المورد.
  7. اتبع تصوير نستيم كما هو موضح في الخطوة 4 (الشكل 2).

10-الاستقرار نحو الجنين المصل البقري (FBS)

  1. أنابيب FBS في 0.2 مل بكر ميليلتر 4 ميكس أوريغامي الحمض النووي عارية أو بوليبليكس المقابلة لها (بما في ذلك 1 نمول من الفوسفات) مع 17 ميليلتر من السل + 10%. استخدام FBS طازجة المذابة.
  2. احتضان العينة في ˚C 37 في cycler حرارية ح 24.
  3. تزج العينة في حمام الثلج.
  4. إذا كان الاختبار في بوليبليكس، وإجراء عملية إلغاء التغليف عن طريق إضافة 3.6 ميليلتر من ديكستران 40 سلفات كاتشين (50 ملغم/مل). إضافة هيدروكسيد الصوديوم بالإضافة إلى ذلك، إذا كان يعمل مع بوليبليكسيس الشيتوزان (راجع الخطوة 6.3)
  5. تنفيذ عصر كما هو موضح في الخطوة 3. وتشمل أوريغامي الحمض النووي الطازجة كمراقبة لقياس ومقارنة كثافات الفرقة في الهلام.
  6. الرسوم الفرقة على السن واستخراج أوريغامي الحمض النووي بعمود استخراج تجميد ضغط.
  7. إضافة 2 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل) إلى حل أوريغامي الحمض النووي المستخرج (20 ميليلتر) في أنبوب بكر 0.2 مل. احتضان مدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في ثيرموسيكلير لهضم بروتينات المصل ملزمون النانو.
  8. تغسل العينة مع 5 × 500 ميليلتر من السل بما في ذلك 16 مم مجكل2 باستخدام العمود تنبيذ فائق (موكو ~ كاتشين 100) لغسل بروتيناز ك (MW ~ كاتشين 28.9) بعيداً. تدور كل غسل في ز × 14,000 في شيركلوف لمدة 3-5 دقائق.
  9. القيام بتصوير نستيم كما هو موضح في الخطوة 4 (الشكل 3).
    ملاحظة: جل العينة المستخرجة من الخطوة 10.6 قد تكون مباشرة المستخدمة لتصوير نستيم. ومع ذلك، يمكن أن يكون التصوير صعبة للغاية بسبب تمسك بروتينات المصل بالنانو أوريغامي الحمض النووي. ولذلك، يوصي بالعلاج بروتيناز ك (خطوات 10.7-10.9) لتسهيل عملية التصوير.

11-اختبار Addressability الفجل البيروكسيديز إنزيم (HRP)-فونكتيوناليزيد أوريغامي الحمض النووي عند الطلاء مع بوليكيشنز

  1. تنقية ذاتية المجمعة بيوتينيلاتيد-NR (البيوتين-NR) كما هو موضح في الخطوة 2.
  2. احتضان 200 ميليلتر لتنقية البيوتين-NR (36 شمال البحر الأبيض المتوسط، في 16 مم تستكمل العازلة السل) مع 200 ميليلتر من streptavidin HRP مترافق (540 نانومتر، في المخزن المؤقت للسل). إضافة ميليلتر 4.8 مجكل2 (500 ملم) بتركيز نهائي من 14 مم. احتضان في شيركلوف ح 12 650 لفة في الدقيقة في ثيرموميكسير
  3. تنقية فونكتيوناليزيد HRP NR (HRP-NR) بطريقة تنقية شماعة (كما هو موضح في الخطوة 2) لإزالة الإنزيمات HRP غير منضم. ريسوسبيند سرع برنامج الصحة الإنجابية-NR في السل بما في ذلك 16 مم مجكل2.
  4. ميليلتر 6.5 مزيج من NR HRP المنقي (36 nM) مع 6.5 ميليلتر من بوليكيشنز تركيزات البديل للإعداد بوليبليكس في نسب N/P من 1، 2، 4، 10 و 20 (باستخدام الصيغة 3).
  5. كرر الخطوات 11.2 11.4 NR غير بيوتينيلاتيد. كما يمكن ربط الإنزيم HRP غير تحديداً أوريغامي الحمض النووي، أوريغامي الحمض النووي غير بيوتينيلاتيد، الذي تعامل مع برنامج الصحة الإنجابية الإنزيمات وشماعة تنقيته (على غرار البيوتين-NR)، سيكون بمثابة عنصر التحكم في الفحص.
  6. 6.5 مزيج ميليلتر من الماء المقطر مع 6.5 ميليلتر من بوليكاتيونس تركيزات البديل المقابلة لنسب محددة N/P 1، 2، 4، 10 و 20. بمثابة عينات أطروحات مجموعة فارغة.
  7. إضافة حل المعدة في خطوات 11.4-11.6 (12.5 ميليلتر) إلى لوحة 96-جيدا بما في ذلك ميليلتر 72.5 حبيس المخزن المؤقت (25 مم حبيس، 20 مم بوكل، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.05% X-100 تريتون، 1% [دمس]، الرقم الهيدروجيني 7.4) وتخلط جيدا.
  8. إضافة 10 ميليلتر من 2، 2 '--أزينو-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (أبتس) (15 ملم).
  9. إضافة 5 ميليلتر من ح2س2 (12 ملم)، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ح2س2 يبدأ رد الفعل.
  10. قياس امتصاص في 421 شمال البحر الأبيض المتوسط ما يزيد على 4 ح مع قارئ لوحة المتعدد (الشكل 4 أ).

12-اختبار Addressability لهيمن ملزمة الابتامرات (HBA)-فونكتيوناليزيد أوريغامي الحمض النووي عند الطلاء مع بوليكيشنز

  1. تنقية HBA فونكتيوناليزيد-NR (HBA-NR) كما هو موضح في الخطوة 2. ريسوسبيند HBA-NR سرع في السل وتستكمل مع 6 مم مجكل2 (أعلى تركيز الملح يؤدي إلى تجميع HBA-NR).
  2. ميكس 10 ميليلتر من HBA-NR (40 نانومتر) مع 10 ميليلتر من بوليكيشنز في تركيز مختلفة لإعداد بوليبليكس محددة بنسب N/P 1، 2 و 10 و 20.
  3. ميكس 10 ميليلتر من عارية NR (40 نانومتر) أو الماء المقطر مع 10 ميليلتر من بوليكيشنز بتركيزات متفاوتة المقابلة لنسب N/P 1، 2، 10 و 20.
  4. إضافة حل 20 ميليلتر أعدت من الخطوات 12.2 و 12.3 إلى لوحة 96-جيدا بما في ذلك 60 ميليلتر من المخزن المؤقت هيبيس (25 مم هيبيس، 20 مم بوكل، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 0.05% X-100 تريتون، 1% [دمس]، الرقم الهيدروجيني 7.4) وتخلط جيدا. وتشمل عينة فارغة واحدة على الأقل الاستعاضة عن حل بوليبليكس أو بوليكيشن 20 ميليلتر (من الخطوات 12.2 و 12.3) مع الماء.
  5. إضافة 5 ميليلتر من هيمين (0.04 ملم) تليها 10 ميليلتر من ATBS (15 ملم). وضع اللوحة على شاكر مدارية لمدة 5 دقائق.
  6. إضافة 5 ميليلتر من ح2س2 (12 ملم)، ومزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  7. قياس امتصاص في 421 نموفير 30 دقيقة مع قارئ لوحة المتعدد (الشكل 4 باء).

Representative Results

وصممت النانو أوريغامي الحمض النووي ثلاثة تكوينات مختلفة، بما في ذلك نانورود (NR)، نانوبوتلي (ملحوظة) وأسلاك محيطة nanostructure (WN) (نماذج ثلاثية الأبعاد للنانو موضحة في الشكل 2). NR وفي ملحوظة تم تصميمه استناداً إلى شعرية ساحة والعسل، على التوالي، واستخدام كادنانو17 و WN تم إنشاؤه باستخدام برنامج ديدالوس18. بروتوكول شامل للتصميم والتجميع الذاتي للنانو الحمض النووي قد نشرت فعلا19،20،،من2122. الأساسية الخاصة بشكل خيوط كانت أمرت وتجميعها ذاتيا وكذلك تنقية استناداً إلى بروتوكول وصف ستال وآخرون. 23 (الخطوة 2).

تميزت بوليبليكسيس هلام التخلف العقلي المقايسة وتصوير نستيم. عند خلط أوريغامي الحمض النووي مع بوليكيشنز، لوحظ تحول في الفرقة نانوستروكتوري عارية نحو الكاثود (الشكل 1أ). ويمكن أن يعزى هذا إلى موازنة شحنة سالبة للفوسفات زيادة المجموعات عند الربط إلى بوليكيشنز والحجم الكلي للمجمع. إضافة مبلغ إضافي قدرة بوليانيونس مثل كبريتات ديكستران عكس تشكيل بوليبليكس. في هذا الصدد، سلفات ديكستران الوزن الجزيئي أعلى (مث ~ كاتشين 40) أظهرت أن تكون أكثر كفاءة في ديكومبليكساتيون مقارنة بانخفاض الوزن الجزيئي ديكستران سلفات (مث ~ كاتشين 4) (الشكل 1ب).

أثناء التصوير بوليبليكسيس لبيي من خلات اليورانيل السلبية وصمة عار TEM، كان من الصعب صورة أي جزيئات. وكان الافتراض بأنها قد تعرقل ذلك لبيي خلات اليورانيل من الربط للعمود الفقري الفوسفات بسبب ضيق التدريع أوريغامي الحمض النووي. ولذلك، قبل التصوير نستيم، تمت إضافة مبلغ فائض من كبريتات ديكستران إلى بوليبليكسيس ليبي. وأظهرت النانو أوريغامي الحمض النووي كشف أي علامة على عيب أو التحلل. بالعكس، تم تصويرها بوليبليكسيس الشيتوزان بنجاح مع عدم الحاجة إلى العلاج بوليانيون (الشكل 2).

وكانت جميع النانو الحمض النووي عارية (بغض النظر عن تكوينات مختلفة) التشويه والتحريف تماما بعد يوم واحد من الحضانة عند 37 درجة مئوية في المخزن المؤقت مغ من الصفر، كما أكد تصوير نستيم. وفي المقابل، النانو المغلفة مع لبيي أو الشيتوزان في N/P≥1 لا تزال سليمة. وبالمثل، الدناز أنا معايرة فحوصات أظهرت قابلية النانو غير المحمية نحو الهضم الأنزيمي. بينما كانت يهضم النانو عارية تماما حضور 1 الدناز يو/مليلتر بعد ح 2، ليبي أو الشيتوزان مغلفة أوريغامي الحمض النووي وبقيت سليمة في المخزن المؤقت مغ من الصفر تستكمل مع 10 يو/مليلتر الدناز أنا على الأقل ليوم واحد (الشكل 2). وكان تحقيق الاستقرار أعلى نحو الهضم نوكليوليتيك بزيادة نسبة N/P بوليبليكسيس. بالإضافة إلى ذلك، يحمي لبيي النانو الحمض النووي أكثر كفاءة بالمقارنة مع الشيتوزان (الشكل 3ألف، الرقم 3ج)، ربما بسبب كثافة أعلى رسوم ليبي، وبالتالي، أعلى النسب ملزمة تجاه الحمض النووي24 . لا يوجد فرق لوحظ أثناء استخدام لبيي الوزن الجزيئي مختلفة (الشكل3B).

Addressability المجموعات الوظيفية في النانو الحمض النووي بعد التغليف في قذيفة بوليمر سمة هامة. وعلاوة على ذلك، تم فحص توافق طلاء بوليكيشن مع الفجل البيروكسيديز إنزيم (HRP) وهيمن ملزمة الابتامرات (HBA) فونكتيوناليزيد أوريغامي الحمض النووي. بروز من سطح NR ثلاثة خيوط التيلة بيوتينيلاتيد وفونكتيوناليزيد ثم مع برنامج الصحة الإنجابية مترافق ستريبتافيدين (الإنزيمات الثلاثة الواحدة أوريغامي الحمض النووي). نشاط حفازة عالية (كد: 439 nM) ابتمر HBA PS2. M (5 '-جتججتاججكججتج-3') وقد اختيرت لهذه التجارب25. ما يصل إلى 24 خيوط التيلة بروز من السطح NR مع رابط طول 5-شمال البحر الأبيض المتوسط (5 '-آآآجاااجاااا-3') تليها PS2. التسلسل M (24 الابتامرات الواحدة أوريغامي الحمض النووي). لا عائقا ملحوظا من الانزيمية أو لوحظ نشاط ابتمر عند طلاء أوريغامي الحمض النووي برنامج الصحة الإنجابية أو HBA فونكتيوناليزيد لبيي والشيتوزان في المتغير N/P النسب (الشكل 4أ-ب)16. ومع ذلك، حركية إنزيم HRP هائلة تغيرت بعد الربط إلى أوريغامي الحمض النووي (الشكل 4ج).

Figure 1
الشكل 1 : صور العمر الممثل لتكوين بوليبليكس وإلغاء التغليف. (أ) المقايسة تحول التنقل الغرواني الكهربي لملاحظة مختلطة مع الشيتوزان في نسب N/P من 0.01-8. ويتضمن كل حارة نمول 1 NB. لين أول هو مرجع NB. (ب) إلغاء التغليف بوليبليكسيس بسلفات ديكستران بوليانيونيك (DS). لقد تم تعديل هذا الرقم من رقم منشورة سابقا16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : ميكروجرافس تيم وصمة سلبية أوريغامي الحمض النووي وبوليبليكسيس- 3D ميكروجرافس النموذجي ونستيم من عارية النانو أوريغامي الحمض النووي (العمودين 1 و 2). ميكروجرافس نستيم بوليبليكسيس لبيي (بعد إلغاء التغليف) وبوليبليكسيس الشيتوزان (العمودان 3 و 4). نستيم صور عارية والمحمية أوريغامي الحمض النووي (بوليبليكس) تتعرض لنضوب ملغ (أعمدة 5 و 6 و 7)، تدهور الانزيمية (الأعمدة 8 و 9)، الهضم المصل (أعمدة 10 و 11) لمدة يوم واحد في 37 درجة مئوية. واستخدمت في هذا التحليل كاتشين لبيي-5. عارية الحمض النووي النانو كانت تدهورت بعد الكشف في عصر حضور 1 يو/مليلتر الدناز أنا أو في السل + 10% FBS بعد ح 2 من الحضانة عند 37 درجة مئوية. تغيير حجم أشرطة: 100 نانومتر. لقد تم تعديل هذا الرقم من رقم منشورة سابقا16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : الممثل نتائج الدناز أنا فحوصات الحماية. (A) الدناز أنا المقايسة حماية بوليبليكسيس WN مع كاتشين لبيي-5، لبيي-10 كاتشين وكاتشين لبيي-25 أعدت في نسبة N/P 2، 4، 8 و 10. تعرض العينات ل 10 يو/مليلتر الدناز أنا 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. لين الأخير هو عنصر التحكم WN. بوليبليكسيس كانت ديكابسولاتيد قبل التحميل إلى الهلام. (ب) كثافة الفرقة يعني تطبيع بوليبليكسيس أوريجاميس الحمض النووي مع مختلف لبيي المستخرجة من العمر صورة-ألف. ويمثل المحور Y كثافة طبيعية يعني الفرقة. (ج) "الدناز" أنا أعدت الفحص الحماية من بوليبليكسيس WN الشيتوزان في N/P نسب من 1، 2، 4، 10 و 20. تعرض العينات ل 10 يو/مليلتر الدناز أنا 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. 6 لين هو بوليبليكس عنصر التحكم (20 N/P). لين الأخير هو عنصر التحكم WN. وكانت جميع الشيتوزان بوليبليكسيس ديكابسولاتيد التحميل المسبق إلى الهلام. لقد تم تعديل هذا الرقم من رقم منشورة سابقا16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: نتائج الممثل لقياس الألوان فونكتيوناليزيد الإنزيم وابتمر فحوصات أوريغامي الحمض النووي. (أ) مقايسة اللونية لأنزيم فونكتيوناليزيد النانو (HRP-NR) المغلفة مع الشيتوزان ح 3.7 بعد بدء رد الفعل. (ب) مقايسة اللونية من النانو فونكتيوناليزيد ابتمر (HBA-NR) مغطاة بطبقة الشيتوزان، 6 دقيقة بعد الشروع في رد الفعل. ويمثل المحور Y امتصاص تم تسويتها. (ج) رصد مقايسة اللونية لبرنامج الصحة الإنجابية، وبرنامج الصحة الإنجابية-NR على مر الزمن. لقد تم تعديل هذا الرقم من رقم منشورة سابقا16. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

البوليمرات الموجبة الشيتوزان كاتشين لبيي-5 كاتشين لبيي-10 كاتشين لبيي-25
الوزن الجزيئي للبوليمر (كاتشين) 5 5 10 25
الوزن موليكوالر من مونومر (g/mol) 161 43 43 43
عدد أمين كل مونومر 1 1 1 1
عدد أمين الواحد البوليمر 28 116 232 581

الجدول 1. حساب عدد المجموعات أمين كل بوليكيشن.

الوزن الجزيئي لسلفات ديكستران (كاتشين) 4 40
الوزن الجزيئي لمركب (g/mol) 366 366
عدد من كبريتات كل مونومر 2 2
عدد سلفات الواحد البوليمر 22 220

الجدول 2. حساب عدد المجموعات سلفات كل بوليانيون.

Discussion

في التجميع الذاتي أوريغامي الحمض النووي، خيوط التيلة عادة تضاف نسبة 5-10 الزائدة إلى السقالة. كما ربط خيوط التيلة الزائدة هذه بوليبليكسيس بوليكاتيون والنموذج في مجموعة مونوميتير التي يصعب كذلك يمكن فصله عن بوليبليكسيس أوريغامي الحمض النووي. ومن ثم فهو خطوة حاسمة في تشكيل بوليبليكس إزالة خيوط التيلة الزائدة واستخدام النانو أوريغامي الحمض النووي المنقي جيدا.

وقد وضعت أساليب أخرى لتحقيق استقرار النانو الحمض النووي مثل سيكليزيشن خيوط الحمض النووي عن طريق رد فعل فوق26. كما ألكاين وأزيد تعديل خيوط التيلة مطلوبة من أجل تشكيل متداخلة واحدة-الذين تقطعت بهم السبل خواتم، يقتصر هذا الأسلوب لتحقيق الاستقرار في النانو الصغيرة مثل كاتيناني الحمض النووي، وأنها ليست قابلة لسهولة لأكبر أوريغامي الحمض النووي هيكل مثل تلك المستخدمة في هذا البروتوكول. في الآونة الأخيرة، Gerling etل27 ذكرت طريقة لإنشاء سندات ديمر (وثيقة البرنامج القطري) بيريميدين سيكلوبوتيني التساهمية بين ثيميدينيس المجاورة داخل النانو الحمض النووي باستخدام الإشعاع فوق البنفسجي. على الرغم من أن هذا الأسلوب موقع انتقائية وقابلة للتطوير، فعاليتها في حماية أوريغامي الحمض النووي أقل بكثير من طلاء بوليكيشن. على سبيل المثال، تحمل كائنات أوريغامي الحمض النووي استقرت وثيقة البرنامج القطري فقط 0.4 يو/مليلتر الدناز أنا ح 1، بينما كانت بوليبليكسيس مستقرة حضور 10 يو/مليلتر الدناز أنا ليوم واحد على الأقل.

وباختصار، العلاج الجيني وحي الشيتوزان وطلاء لبيي بتكلفة منخفضة، في خطوة واحدة، وطريقة فعالة للتصدي للاستقرار طويل الأجل للنانو أوريغامي الحمض النووي في وسائل الإعلام الغنية نوكلاس والمستنفد مغ. إمكانية الرجوع لتشكيل بوليبليكس يسهل تطبيقه في اختبارات التشخيص متعدد خطوة فيها حماية أوريغامي الحمض النووي ضد نوكليوليتيك تدهور أو نضوب الملح حاسمة في خطوة واحدة ولكن قد يسبب مشاكل في الخطوات الأخرى مثل الحمض النووي التضخيم. بالإضافة إلى ذلك، يتم طلاء بوليكيشن نهج محتملة لتعزيز استيعاب الخلوية للنانو أوريغامي الحمض النووي لإيصال الأدوية التطبيقات28.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.

Acknowledgments

هذا المشروع قد تلقي تمويلاً من أفق 2020 برنامج الاتحاد الأوروبي في البحوث والابتكار تحت منحة الاتفاق رقم 686647. صور تيم سجلت في مورجاجني تعمل على 80 كيلو فولت في مرفق م GmbH المرافق الأساسية في بيوسينتير فيينا (فبكف). نود أن نشكر كيكيتش تاديجا للمساعدة في تصميم الرسوم البيانية واليسا دي ليانو لتصميم nanostructure السلكي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Tags

الكيمياء، 143 قضية، أوريغامي الحمض النووي، بوليبليكس، وتحقيق الاستقرار الطويل الأجل، وتدهور نوكليوليتيك، العلاج الجيني، الروغان
العلاج الجيني وحي بوليكيشن طلاء لحماية النانو أوريغامي الحمض النووي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter