Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Genterapi inspirerade Polycation beläggning för skydd av DNA Origami nanostrukturer

Published: January 19, 2019 doi: 10.3791/58771
Automatic Translation
1, 1
1Molecular Diagnostics, Centre for Health and Bioresources, AIT Austrian Institute of Technology GmbH

Summary

Här presenteras ett protokoll för att skydda DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rich media med naturliga katjoniska polysackarid chitosan och syntetiska linjära polyethyleneimine (LPEI) beläggningar.

Abstract

DNA origami nanostrukturer håller en enorm potential att användas för biologiska och medicinska tillämpningar. Dock inducerar låg salthalt villkor och nukleaser i fysiologiska vätskor denaturering och nedbrytning av själv monterade DNA nanostrukturer. I icke-virala gen leverans, är enzymatiska nedbrytningen av DNA betagen av inkapsling av negativt laddade DNA i ett katjonaktiva skal. Häri, inspirerad av gen leverans framsteg, en enkel, one-step och robust metod presenteras för stabiliseringen av DNA origami nanostrukturer genom att täcka dem med chitosan och linjär polyethyleneimine. Polycation beläggningen skyddar effektivt DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rika medier. Denna metod bevarar också den fullständiga adressering av enzym - och aptamer-baserade funktionalisering av DNA nanostrukturer.

Introduction

DNA är en mångsidig byggsten för de programmerbara självmontering av nanoskala strukturer1. Den mest populära metoden för att skapa DNA nanostrukturer är den DNA-origami-teknik, som bygger på den självmontering av en lång cirkulär, enda stranded DNA strandar Rullställning med hjälp av hundratals kortare form-bestämma syntetiska stapelvara2. Idag är skapandet av DNA nanostrukturer nästan alla geometri och morfologi lätt genomförbart. DNA nanostrukturer kan vara anläggningsvis functionalized med hög precision3,4 och kan programmeras att genomgå Alloster konfirmerande ändringar5,6. Därför erbjuder använda DNA som byggnadsmaterial en unik möjlighet att skapa programmerbara och lyhörd specialdesignade nanostrukturer för applikationer i biosensing, diagnostik och läkemedel. Men DNA nanostrukturer är mottagliga för matsmältningen av exo- och endo-nukleaser och galler-baserat 3D DNA origami nanostrukturer kräver i allmänhet hög salthalt buffertar (t.ex., 5-20 mM Mg+ 2) att upprätthålla sin integritet7,8.

Den snabba nedbrytningen av DNA av nukleaser närvarande i blodet och den extracellular matrisen är ett stort hinder för effektiva i vivo leverans av genetiska produkter in i celler9. För att övervinna denna begränsning, icke-viral genen leveransen, blandas DNA med en katjoniska polymer ett definierade N/P avgift baserat (förhållandet mellan aminer i polycation till fosfater i DNA)10. Komplex av DNA med en katjoniska polymer, känd som polyplex, skyddar DNA från nuclease-medierad nedbrytning och förbättrar dess cellernas upptag11. Inspirerad av gen leverans framsteg, oligolysine12, oligolysine-polyetylen glykol (PEG) sampolymerer13, poly (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-baserade polymerer14, och virus kapsid proteiner15 har använts för att stabilisera DNA origami nanostrukturer.

Nyligen rapporterade vi en metod för skydd av DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rich media med den naturliga katjoniska polysackarid chitosan och den syntetiska linjära polyethyleneimine (LPEI) var rapporterade16. Denna artikel är en anpassning av vårt tidigare arbete och beskriver det detaljerade protokollet för beredning av polyplexes, deras karakterisering, testa stabiliteten i naken och skyddade nanostrukturer i låg salthalt och nuclease-rika medier och undersöka den adressering av enzym - och aptamer-functionalized DNA origami nanostrukturer vid polycation beläggning.

Protocol

1. förbereda Polycation lager lösning

  1. LPEI stamlösning
    1. Lägga till 10 mg LPEI i ett glasbägare som innehåller < 10 mL H2O.
    2. För att helt upplösa LPEI, lägga till HCl (32%) tills når pH 2,0.
    3. Justera pH till 7,0 av NaOH (10 M).
    4. Justera volymen till en slutlig koncentration av 1 mg/mL.
    5. Filtratet LPEI lager lösningen genom ett 0,22 µm membran.
  2. Chitosan stamlösning
    1. Lös 16,6 mg chitosan oligosackarid laktat (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosackarid sammansättning, deacetylated från Chitinen av 90%) i 1 mL ättiksyra (10%) vattenmedium att förbereda en utgångslösning med en koncentration på 10 mg/mL.

2. rening av DNA Origami nanostrukturer

  1. Mix 100 µL av origami DNA-provet (i 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl buffert (betecknas som TB) inklusive 18 mM MgCl2) med motsvarande volymen av 22 mM MgCl kompletterade2 TB (100 µL) i en 1,5 mL tub.
  2. Tillsätt 200 µL av rening buffert (15% (w/v) PEG 8.000, 5 mM Tris, 1 mM EDTA och 505 mM NaCl). Blanda försiktigt genom röret inversion.
  3. Snurra provet vid 16.000 × g i rumstemperatur (r.t.) i 25 min.
  4. Noggrant avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 16 mM MgCl2 kompletteras TB buffert. Supernatanten och pelleten innehålla överflödig krampa kardeler och utfällda DNA-origami, respektive.
  5. Inkubera provet för en dag på r.t. på 650 rpm i en thermomixer. Detta steg är för komplett resuspension av DNA-origami.

3. agaros Gel-elektrofores (år)

  1. Tillsätt 1,6 g agaros och 80 mL 0.5 x TAE buffert (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, 10 mM ättiksyra, pH 8) i en glasbägare att förbereda en 2% agarosgel. Mikrovågsugn för 5 min. snurra innehållet i bägaren för 1 min i ett vattenbad. Tillsätt 352 µL av MgCl2 (2,5 M) att förbereda gelen med 11 mM MgCl2. Pre fläcken gelen med 10 µL av DNA gel fläcken.
  2. Häll en torr gelboxen gellösningen och infoga en gelelektrofores kam. Låt lösningen stelna på r.t. för 15-30 min.
  3. Komplettera det rinnande buffert (0,5 x TAE buffert) med 11 mM MgCl2.
  4. Blanda 10-20 µL av provet med 20% av 6 x lastning buffert (30% (v/v) glycerol, 0,25% (w/v) bromofenolblått, 0,25% (w/v) xylen cyanol FF) och ladda den i agaros gel brunnar.
  5. Kör gelen vid 70 V på r.t. för 2,5 - 3 h.
  6. Visualisera gelen med en UV scanner.

4. negativa fläcken transmissionselektronmikroskopi (nsTEM)

  1. Gäller 5 µL utspädda nanostrukturen eller polyplex på en glöd-urladdat kol-belagd Cu400 TEM rutnät. Låt det adsorbera för ca. 1 min.
  2. Dränera överflödig vätska från kanten av rutnätet genom att en bit av filterpapper.
  3. Tillsätt 5 µL av en 2% uranyl acetat vattenlösning och vänta i 1 min.
  4. Använd filterpapper kanten att helt tömma överflödig vätska från kanten av rutnätet.
  5. Låt rutnätet torka helt innan injicera det i TEM.

5. Polyplex bildandet

Obs: Belysande exempel för att förbereda ett polyplex bestående av DNA-origami och chitosan vid N/P 0,01-8 förhållanden.

  1. Beräkna antalet aminer per polycation använder formel-1 (tabell 1).
  2. Mätning av koncentrationen av renade DNA-origami använder en ultra violett spektrofotometer vid 260 nm. Använda 2 µL av TB buffert som tomrummet för att kalibrera maskinen. Beräkna den ”nmol av fosfat” använda formel-2.
  3. Förbereda 15 µL av de DNA-origami struktur inklusive 1 nmol av fosfat.
  4. Använd formel-3 för att beräkna volymen av kitosan, som behövs för att förbereda polyplex på N/P 0,01-8. Exempelvis för att förbereda polyplex på N/P 8, 1,8 µL av kitosan (0,8 mg/mL) behövs (N/P 8, nmol av fosfat är 1, molekylvikt av kitosan är 5.000 g/mol, koncentration av kitosan stamlösning är 0,8 mg/mL och antalet aminer per chitosan är 28). Lägga till 13,2 µL av TB 1.8 µL av kitosan (0,8 mg/mL). Tillsätt 15 µL chitosan lösning (0,8 mg/mL) i 15 µL av de DNA-origami från steg 5.3 att få en DNA-origami-chitosan polyplex med NP 8. Polyplex bildas spontant.
  5. Upprepa steg 5,4 att förbereda polyplexes på olika N/P nyckeltal.
  6. Utför en ålder som beskrivs i steg 3 (figur 1A). Inkludera den nakna DNA-origami som kontroll.
  7. Bild av polyplex enligt beskrivningen i Steg4 (figur 2).

    Formel-1) antal amine grupper per polycation
    Equation 1

    Formel-2) Mole av fosfat
    =Equation 2

    Formel-3) Volym (µL) av polycations
    =Equation 3

6. avkodning av inkapsling med Dextran sulfat

  1. Beräkna antalet sulfat grupper per dextran sulfat använder formel-4 (tabell 2).
  2. Beräkna volymen av dextran sulfat behövs för decomplexation av polyplex på en fördefinierad A / P förhållandet med formel-5. A / P charge förhållandet är förhållandet mellan sulfat grupperna av polyanion (A) till den DNA-origami fosfat grupperna (P). Ett självriskbelopp dextran sulfat behövs för en effektiv decomplexation av polyplexes (t.ex. 500-1 000). Till exempel decomplex polyplex beredda i avsnitt 5 (polyplex innehåller 1 nmol av fosfat) vid A / P 1000, 3,6 µL av dextran sulfat 40 kDa (50 mg/mL) behövs (A / P är 1000 nmol av fosfat är 1, molekylvikten för dextran sulfat är 40.000 g/mol koncentrationen av dextran sulfat stamlösning är 50 mg/mL och antalet sulfat är 220). Lägga till 3,6 µL dextran sulfat (50 mg/mL) i polyplex från steg 5,4 och blanda väl.
  3. Om arbetar med en chitosan polyplex, tillsätt NaOH för att underlätta decomplexation. Tillsätt NaOH i en slutlig koncentration på 10 mM. Hoppa över detta steg för LPEI polyplexes.
  4. Utför en ålder som beskrivs i steg 3 (figur 1B). Inkludera en naken DNA-origami och polyplex som kontroll.

    Formel-4) antal av sulfat grupper per polyanion =
    Equation 4

    Formel-5) Volym (µL) dextran sulfat
    =Equation 5

7. stabilitet mot Mg utarmning

  1. Tvätta 20 µL av en DNA-origami eller den motsvarande polyplex (inklusive 2 nmol fosfat) med 4 x 600 µL av Mg-noll buffert (5 mM Tris, 1 mM EDTA och 30 mM NaCl) med hjälp av kolumnen ultrafiltrering (MWCO ~ 3 kDa). Snurra varje tvätt på 14.000 × g på r.t. för 3-5 min.
  2. Samla de återstående lösningen (80 µL) och inkubera vid 37 ° C för en dag på 650 rpm i en thermomixer.
  3. Om testning LPEI polyplex, tillsätt 2,5 µL av MgCl2 (500 mM) för en slutlig koncentration på 16 mM MgCl2. Lägg sedan till 7 µL av dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (motsvarande till A / P 1000) nysta kärnan DNA nanostrukturer (avkodning av inkapsling, se steg 6).
    Obs: Hoppa över detta steg om arbetar med chitosan polyplex eller nakna DNA-origami.
  4. Följ nsTEM imaging som beskrivs i steg 3 (figur 2).

8. DNAS jag titrering haltbestämning av Naket DNA Origami nanostrukturer

  1. Blanda 3 µL av nakna DNA-origami inklusive 1 nmol fosfat med 2 µL 10 x DNAS jag buffert (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5 mM CaCl2, pH 7,6) 1 µL av MgCl2 (250 mM), 12 µL av vatten i 0,2 mL PCR-rör. Tillsätt 2 µL av DNAS jag (10 x). Justera DNAS lager koncentration jag (10 x) att få slutgiltiga DNAS jag koncentrationer av 0,25-2 U/mL.
  2. Inkubera proverna vid 37 ° C i 1-2 h i en termocykler.
  3. Sänk ned proverna i isen och inaktivera aktiviteten nucleolytic genom att lägga till 2 µL 500 mM Ditiotreitol (DTT) och 2,5 µL av EGTA (33 mM).
  4. Analysera proverna med en ålder som beskrivs i steg 3.

9. stabilitet av Polyplexes mot DNAS jag

  1. Blanda 4 µL av en polyplex (inklusive 1 nmol av fosfat, beredd på olika N/P nyckeltal) med 1,5 µL av en DNAS jag buffra (10 x), 8 µL av TB och 1,5 µL av DNAS I (100 U/mL) i en 0,2 mL PCR tube.
  2. Inkubera provet för 24 h vid 37 ° C i en termocykler.
  3. Tillsätt 2 µL av proteinas K (20 mg/mL) att smälta den DNAS I. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en termocykler.
    Obs: i stället för enzymatisk nedbrytning, kemisk inaktivering av DNAS I genom att lägga till 1,5 µL DTT (500 mM) och 2 µL av EGTA (33 mM) kan utföras.
  4. Tillsätt 3,6 µL av dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL) (motsvarande till A / P 1000) nysta kärnan DNA nanostrukturer.
  5. Utför ålder som beskrivs i steg 3 (figur 3A, figur 3 c). Inkludera färsk DNA-origami som kontroll för att mäta och jämföra stödnivåerna som band på gelen.
  6. Punktskatt bandet på ålder och extrahera den DNA-origami av en squeeze frysa utvinning kolumn utifrån protokollet tillhandahålls av leverantören.
  7. Följ nsTEM imaging som beskrivs i Steg4 (figur 2).

10. stabilitet mot fostrets bovint Serum (FBS)

  1. Blanda 4 µL nakna DNA-origami eller dess motsvarande polyplex (inklusive 1 nmol av fosfat) med 17 µL av TB + 10% FBS i 0,2 mL PCR-rör. Använd färska tinade FBS.
  2. Inkubera provet vid 37 ° c i en termocykel för 24 h.
  3. Fördjupa provet i ett isbad.
  4. Om testning av polyplex, utför avkodning av inkapsling processen genom att lägga till 3,6 µL av dextran sulfat-40 kDa (50 mg/mL). Lägg dessutom till NaOH om arbetar med chitosan polyplexes (se steg 6.3)
  5. Utför en ålder som beskrivs i steg 3. Inkludera den färska DNA-origami som kontroll för att mäta och jämföra stödnivåerna som band på gelen.
  6. Punktskatt bandet på ålder och extrahera den DNA-origami genom en squeeze frysa utvinning kolumn.
  7. Tillsätt 2 µL av proteinas K (20 mg/mL) till extraherad DNA origami lösningen (20 µL) i en 0,2 mL PCR-rör. Inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en termocykler att smälta serumproteiner bunden till nanostrukturerna.
  8. Tvätta provet med 5 x 500 µL av TB inklusive 16 mM MgCl2 använda kolumnen ultracentrifugering (MWCO ~ 100 kDa) att tvätta proteinas K (MW ~ 28,9 kDa) bort. Snurra varje tvätt på 14.000 × g på r.t. för 3-5 min.
  9. Utföra nsTEM imaging som beskrivs i steg 4 (figur 3).
    Obs: Gel extraherade provet från steg 10,6 kan användas direkt för nsTEM imaging. Bildtagning kan dock mycket utmanande på grund av fastsättning av serumproteiner till DNA origami nanostrukturerna. Proteinas K behandling (steg 10.7-10.9) rekommenderas därför att underlätta avbildningsprocessen.

11. testning av adressering av pepparrotperoxidas enzym (HRP)-functionalized DNA-Origami vid beläggning med Polycations

  1. Rena själv monterade biotinylerade-NR (Biotin-NR) som beskrivs i steg 2.
  2. Inkubera 200 µL av renat Biotin-NR (36 nM, i 16 mM kompletteras TB buffert) med 200 µL av HRP-konjugerad streptividin (540 nM, i TB-buffert). Tillsätt 4,8 µL av MgCl2 (500 mM) till en slutkoncentration på 14 mM. Inkubera vid r.t. för 12 h på 650 rpm i en thermomixer
  3. Rena HRP-functionalized NR (HRP-NR) genom en PEG reningsmetod (som beskrivs i steg 2) för att ta bort de obundna HRP-enzymerna. Återsuspendera den utfällda HRP-NR i TB inklusive 16 mM MgCl2.
  4. Blanda 6,5 µL av renat HRP-NR (36 nM) med 6,5 µL av polycations av variant koncentrationer att förbereda polyplex på N/P nyckeltal 1, 2, 4, 10 och 20 (med formel 3).
  5. Upprepa steg 11.2-11.4 för icke-biotinylerade NR. Som enzymet HRP kan binda icke-specifikt till den DNA-origami, den icke-biotinylerade DNA-origami, som behandlas med HRP enzymer och PEG renat (liknar Biotin-NR), kommer att fungera som kontroll i analysen.
  6. Blanda 6,5 µL destillerat vatten med 6,5 µL av polycations av variant koncentrationer motsvarande de definierade N/P-kvot för 1, 2, 4, 10 och 20. Avhandlingar prover fungera som gruppen tom.
  7. Lägga den beredda lösningen i steg 11,4-11,6 (12,5 µL) till en plattan med 96 brunnar inklusive 72.5 µL av HEPES buffert (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton x-100, 1% DMSO, pH 7,4) och blanda väl.
  8. Tillsätt 10 µL av 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).
  9. Tillsätt 5 µL H2O2 (12 mM) och blanda väl genom pipettering upp och ner. H2O2 initierar reaktionen.
  10. Mät absorbansen vid 421 nm över 4 h med en multimode Plattläsare (figur 4A).

12. testning av adressering av Hemin-bindande Aptamers (HBA)-functionalized DNA-Origami vid beläggning med Polycations

  1. Rena HBA functionalized-NR (HBA-NR) som beskrivs i steg 2. Återsuspendera den utfällda HBA-NR i TB kompletteras med 6 mM MgCl2 (högre saltkoncentration leder till sammanläggning av HBA-NR).
  2. Blanda 10 µL av HBA-NR (40 nM) med 10 µL polycations vid varierande koncentration att förbereda polyplex av definierade N/P nyckeltal 1, 2, 10 och 20.
  3. Blanda 10 µL av nakna-NR (40 nM) eller destillerat vatten med 10 µL polycations på varierande koncentrationer motsvarande N/P nyckeltal 1, 2, 10 och 20.
  4. Lägg till 20 µL beredda lösningen från steg 12.2 och 12.3 i den plattan med 96 brunnar inklusive 60 µL av HEPES buffert (25 mM HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, 0,05% Triton x-100, 1% DMSO, pH 7,4) och blanda väl. Inkludera minst ett blindprov ersätta 20 µL polyplex eller polycation lösningen (från steg 12.2 och 12.3) med vatten.
  5. Tillsätt 5 µL av hemin (0,04 mM) följt av 10 µL av ATBS (15 mM). Placera plattan i orbitalskak för 5 min.
  6. Tillsätt 5 µL H2O2 (12 mM) och blanda väl genom pipettering upp och ner.
  7. Mät absorbansen vid 421 nmover 30 min med multimode plattan läsaren (figur 4B).

Representative Results

Tre DNA origami nanostrukturer av olika konfigurationer utformades, inklusive en nanorod (NR), en nanobottle (NB) och en trådram nanostruktur (WN) (3D-modeller av nanostrukturerna illustreras i figur 2). NR och NB utformades utifrån ett torg och bikakestruktur galler, respektive, med caDNAno17 och WN skapades med hjälp av Daedalus programvara18. Ett omfattande protokoll för design och självmontering av DNA nanostrukturer har varit publicerade redan19,20,21,22. Form-specifika krampa delar beställdes, själv monterade och ytterligare renas baserat på ett protokoll som beskrivs av Stahl et al. 23 (steg 2).

Polyplexes präglades av gel utvecklingsstörning assay och nsTEM imaging. Vid blandning av DNA-origami med polycations, observerades en förskjutning i nakna nanostruktur bandet mot katoden (figur 1A). Detta kan tillskrivas den motvikt av den negativa laddningen av fosfat grupper vid bindning till polycations och den totala storleken ökar av komplexet. Lägga till ett extra belopp på polyanions såsom dextran sulfat kan återföra polyplex bildandet. I detta avseende, dextran sulfat med högre molekylvikt (MW ~ 40 kDa) visade sig vara mer effektivt för den decomplexation jämfört med lägre molekylvikt dextran sulfat (MW ~ 4 kDa) (figur 1B).

Medan avbildning LPEI polyplexes av uranyl acetat negativa fläcken TEM, var det svårt att bild partiklar. Det var en hypotes om att LPEI kan hindra uranyl acetat från att binda till fosfat ryggraden på grund av snäva skärmning av DNA-origami. Därför före nsTEM imaging lades ett självriskbelopp dextran sulfat till LEPI-polyplexes. Avslöjad DNA origami nanostrukturerna visade inga tecken på defekt eller nedbrytning. I stället var chitosan polyplexes framgångsrikt avbildas utan behov av polyanion behandling (figur 2).

Alla nakna DNA nanostrukturer (oavsett deras olika konfigurationer) var denaturerat helt efter en dag av inkubation vid 37 ° C i Mg-noll buffert, vilket bekräftas av nsTEM imaging. Däremot förblev nanostrukturer belagda med LPEI eller chitosan på N/P≥1 intakt. Likaså, DNase jag titrering analyserna visade känslighet av oskyddade nanostrukturer mot enzymatisk nedbrytning. Medan naken nanostrukturer var helt rötas i närvaro av 1 U/mL DNAS stannade jag efter 2 h, LEPI eller chitosan inkapslade DNA-origami intakt i kompletteras Mg-noll buffert med 10 U/mL DNAS jag för minst en dag (figur 2). Högre stabilitet mot nucleolytic matsmältningen uppnåddes genom att öka N/P förhållandet av polyplexes. Dessutom skyddar LPEI DNA nanostrukturerna mer effektivt jämfört med chitosan (figur 3A, figur 3C), förmodligen på grund av högre laddningstätheten LEPI, och således högre affinitet mot DNA24 . Ingen skillnad observerades när du använder LPEI med olika molekylvikt (figur3B).

Adressering av funktionella grupper i DNA nanostrukturer efter inkapsling i en polymer skal är en viktig funktion. Dessutom undersöktes polycation beläggning förenlighet med pepparrotperoxidas enzym (HRP) och hemin-bindande aptamers (HBA) functionalized DNA-origami. Tre biotinylerade krampa delarna var stack från ytan av NR och sedan functionalized med HRP konjugerat streptividin (tre enzymer per DNA-origami). De katalytiskt högaktiv (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') valdes för dessa experiment25. Upp till 24 krampa trådar var stack från NR ytan med en 5-nm längd länkare (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') följt av PS2. M-sekvens (24 aptamers per DNA-origami). Inga anmärkningsvärda hinder av enzymatiska eller aptamer aktivitet observerades vid beläggning HRP - eller HBA-functionalized DNA-origami med LPEI och chitosan variant N/P nyckeltal (figur 4A-B)16. Dock har den kinetiska av HRP enzym dramatiskt ändrats efter bindning till DNA-origami (figur 4C).

Figure 1
Figur 1 : Representativa ålder bilder av polyplex bildandet och avkodning av inkapsling. (A) elektroforetiska mobilitet Skift analysen för NB blandat med chitosan på N/P förhållandet mellan 0,01-8. Varje lane innehåller 1 nmol NB. Den första lanen är referensen NB. (B) avkodning av inkapsling av polyplexes av polyanjonisk dextran sulfat (DS). Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Negativa fläcken TEM micrographs av DNA-origami och polyplexes. 3D modell och nsTEM micrographs av nakna DNA origami nanostrukturer (kolumnerna 1 och 2). nsTEM micrographs LPEI polyplexes (efter avkodning av inkapsling) och chitosan polyplexes (kolumnerna 3 och 4). nsTEM bilder av nakna och skyddade DNA-origami (polyplex) utsätts för Mg utarmning (kolumnerna 5, 6 och 7), enzymatisk nedbrytning (kolumner 8 och 9), serum matsmältningen (kolumner 10 och 11) för en dag vid 37 ° C. LPEI-5 kDa användes i denna analys. Nakna DNA nanostrukturer var förstörd bortom upptäckt på en ålder i närvaro av 1 U/mL DNAS jag eller i TB + 10% FBS efter 2 h inkubation vid 37 ° C. Skala barer: 100 nm. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Representativa resultat av DNAS jag skydd analyser. (A) DNAS jag analys för polyplexes WN med LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa och LPEI-25 kDa beredd på N/P förhållandet mellan 2, 4, 8 och 10. Proverna utsattes för 10 U/mL DNAS för 24 timmar vid 37 ° C. Den senaste lanen är kontrollen WN. Polyplexes var decapsulated före lastning i gelen. (B) normaliserad menar bandet intensiteten för polyplexes av DNA origamis med olika LPEI utvinns ur ålder bild-A. Y-axeln representerar normaliserade menar bandet intensitet. (C) The DNAS jag analys av kitosan-WN polyplexes beredd på N/P nyckeltal 1, 2, 4, 10 och 20. Proverna utsattes för 10 U/mL DNAS för 24 timmar vid 37 ° C. Lane 6 är den kontroll polyplex (N/P 20). Den senaste lanen är kontrollen WN. Alla chitosan polyplexes var decapsulated före lastning i gelen. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: representant resultaten av kolorimetriska enzym - och aptamer-functionalized DNA origami analyser. (A) den kolorimetriska analysen av enzym-functionalized nanostrukturer (HRP-NR) belagd med chitosan 3.7 h efter reaktion. (B) kolorimetriska analys av aptamer-functionalized nanostrukturer (HBA-NR) belagd med chitosan, 6 min efter reaktion inledningen. Y-axeln representerar normaliserade absorbansen. (C) övervaka den kolorimetriska analysen av HRP och HRP-NR över tiden. Denna siffra har ändrats från en tidigare publicerade figur16. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Katjoniska polymerer Chitosan LPEI-5 kDa LPEI-10 kDa LPEI-25 kDa
Molekylvikt av polymer (kDa) 5 5 10 25
Molecualr vikt av monomer (g/mol) 161 43 43 43
Antal amine per monomer 1 1 1 1
Antal amine per polymer 28 116 232 581

Tabell 1. Beräkningen av antalet amine grupper per polycation.

Molekylvikt dextran sulfat (kDa) 4 40
Molekylvikt av monomer (g/mol) 366 366
Antal sulfat per monomer 2 2
Antal sulfat per polymer 22 220

Tabell 2. Beräkningen av antalet sulfat grupper per polyanion.

Discussion

I den självmontering av DNA-origami, krampa trådar vanligtvis läggs i 5-10 överskott förhållande till schavotten. Dessa överskott krampa trådar binder också till den polycation och bildar polyplexes i intervallet monometer som ytterligare är svårt att skiljas från DNA origami polyplexes. Därmed är ett avgörande steg i polyplex bildandet att ta bort överflödig krampa trådar och använda väl renat DNA origami nanostrukturer.

Andra metoder har utvecklats för att stabilisera DNA nanostrukturer såsom ringbildning av DNA-strängar via ett klick reaktion26. Som alkynen - och natriumazid-modifierade krampa delarna krävs för bildandet av förreglad enkelsträngat ringar, denna teknik är begränsad för stabiliseringen av små nanostrukturer sådan en DNA-catenane, och det är inte lätt skalbar för större DNA-origami struktur som används i detta protokoll. Nyligen, Gerling et enl.27 rapporterade en metod för att skapa kovalent cyclobutene pyrimidin dimer (CPD) obligationer mellan närliggande thymidines inom DNA nanostrukturer med ultraviolett bestrålning. Även om denna metod är webbplats-selektiv och skalbar, är dess effektivitet för att skydda DNA-origami mycket lägre än polycation beläggning. Till exempel uthärda CPD-stabiliserad DNA origami objekt bara 0.4 U/mL DNAS jag för 1 h, medan polyplexes var stabil i närvaro av 10 U/mL DNAS jag för minst en dag.

I korthet, genterapi inspirerad chitosan och LPEI beläggning är en låg kostnad, one-step och effektiv metod att ta itu med DNA origami nanostrukturer i Mg-utarmat och nuclease-rika medier långsiktiga stabilitet. Reversibiliteten av polyplex bildandet underlättar dess tillämpning i flera steg diagnostiska tester där skydd av DNA-origami mot nucleolytic nedbrytning eller salt-utarmning är avgörande i ett steg men kan orsaka problem i andra åtgärder såsom DNA förstärkning. Dessutom är polycation beläggning en potentiell strategi för att öka cellulära upptaget av DNA origami nanostrukturer för drog-leverans program28.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter som relaterade till detta betänkande.

Acknowledgments

Detta projekt har fått finansiering från EU: s Horizon 2020 forskning och innovation program under lån avtal nr 686647. TEM bilder har spelats in på en Morgagni som drivs på 80 kV vid EM anläggningen av den Vienna Biocenter Core faciliteter GmbH (VBCF). Vi vill tacka Tadija Kekic för bistånd i grafisk design och Elisa De LIano för att utforma wireframe nanostrukturen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10× DNase I reaction buffer New England Biolab (NEB) B0303
ABTS (2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) Alfa Aesar J65535
Amicon ultracentrifugation columns Merck Millipore UCF500308, UCF510024
Chitosan oligosaccharide lactate (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetylated, 60%. composition oligosaccharide Sigma-Aldrich 523682
Design-specific staple strands Integrate DNA Technologies (IDT)
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 4 kDa) Sigma-Aldrich 75027
Dextran sulfate sodium salt (Mr ~ 40 kDa) Sigma-Aldrich 42867
DNA gel loading dye (6×) ThermoFischer sceintific R0611
DNase I (RNase free) New England Biolab (NEB) M0303
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BioUltra, anhydrous, ≥99% (titration) Sigma-Aldrich EDS
Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns Biorad 7326165
Hemin Sigma-Aldrich H9039
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrogen peroixde slution (32 wt%) Sigma-Aldrich 216763
LPEI-25 kDa Polysciences, Inc 23966-1
NuPAGE Sample Reducing Agent (500 mM dithiothreitol (DTT)) ThermoFischer sceintific NP0004
Polyethylene glycol (PEG, MW ~ 8000 Da) Carl Roth O263.1
Polyethylenimine, linear, average Mn 10,000, PDI ≤1.2 Sigma-Aldrich 765090
Polyethylenimine, linear, average Mn 5,000, PDI ≤1.3 Sigma-Aldrich 764582
Proteinase K solution (20 mg/ml) ThermoFischer sceintific AM2548
Streptavidin-conjugated HRP ThermoFischer sceintific N100
SYBER safe DNA gel stain ThermoFischer sceintific S33102

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jones, M. R., Seeman, N. C., Mirkin, C. A. Nanomaterials. Programmable materials and the nature of the DNA bond. Science. 347 (6224), 1260901 (2015).
  2. Rothemund, P. W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  3. Takabayashi, S., Klein, W. P., Onodera, C., Rapp, B., Flores-Estrada, J., Lindau, E., Snowball, L., Sam, J. T., Padilla, J. E., Lee, J., Knowlton, W. B., Graugnard, E., Yurke, B., Kuang, W., Hughes, W. L. High precision and high yield fabrication of dense nanoparticle arrays onto DNA origami at statistically independent binding sites. Nanoscale. 6 (22), 13928-13938 (2014).
  4. Kuzyk, A., Schreiber, R., Zhang, H., Govorov, A. O., Liedl, T., Liu, N. Reconfigurable 3D plasmonic metamolecules. Nature Material. 13 (9), 862-866 (2014).
  5. Douglas, S. M., Bachelet, I., Church, G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. Science. 335 (6070), 831-834 (2012).
  6. Choi, Y., Choi, H., Lee, A. C., Lee, H., Kwon, S. A Reconfigurable DNA Accordion Rack. Angewandte Chemie International Edition. 57 (11), 2811-2815 (2018).
  7. Kielar, C., Xin, Y., Shen, B., Kostiainen, M. A., Grundmeier, G., Linko, V., Keller, A. On the stability of DNA origami nanostructures in low-magnesium buffers. Angewandte Chemie International Edition. 57 (30), 9470-9474 (2018).
  8. Hahn, J., Wickham, S. F. J., Shih, W. M., Perrault, S. D. Addressing the instability of DNA nanostructures in tissue culture. ACS Nano. 8 (9), 8765-8775 (2014).
  9. Al-Dosari, M. S., Gao, X. Nonviral Gene Delivery: Principle, limitations, and recent progress. The AAPS Journal. 11 (4), 671 (2009).
  10. Ibraheem, D., Elaissari, A., Fessi, H. Gene therapy and DNA delivery systems. International Journal of Pharmaceutics. 459 (1-2), 70-83 (2014).
  11. Pack, D. W., Hoffman, A. S., Pun, S., Stayton, P. S. Design and development of polymers for gene delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (7), 581-593 (2005).
  12. Ponnuswamy, N., Bastings, M. M. C., Nathwani, B., Ryu, J. H., et al. Oligolysine-based coating protects DNA nanostructures from low-salt denaturation and nuclease degradation. Nature Communication. 8, 15654 (2017).
  13. Agarwal, N. P., Matthies, M., Gür, F. N., Osada, K., Schmidt, T. L. Block copolymer micellization as a protection strategy for DNA origami. Angewandte Chemie International Edition. 56 (20), 5460-5464 (2017).
  14. Kiviaho, J. K., Linko, V., Ora, A., Tiainen, T., Järvihaavisto, E., Mikkilä, J., Tenhu, H., Nonappac,, Kostiainen, M. A. Cationic polymers for DNA origami coating - examining their binding efficiency and tuning the enzymatic reaction rates. Nanoscale. 8 (22), 11674-11680 (2016).
  15. Perrault, S. D., Shih, W. M. Virus-inspired membrane encapsulation of DNA nanostructures to achieve in vivo stability. ACS Nano. 8 (5), 5132-5140 (2014).
  16. Ahmadi, Y., De Llano, E., Barišić, I. (Poly)cation-induced protection of conventional and wireframe DNA origami nanostructures. Nanoscale. 10 (16), 7494-7504 (2018).
  17. Douglas, S. M., Marblestone, A. H., Teerapittayanon, S., Vazquez, A., Church, G. M., Shih, W. M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. Nucleic Acids Research. 37 (15), 5001-5006 (2009).
  18. Veneziano, R., Ratanalert, S., Zhang, K., Zhang, F., Yan, H., Chiu, W., Bathe, M. Designer nanoscale DNA assemblies programmed from the top down. Science. 352 (6293), 1534 (2016).
  19. Castro, C. E., Kilchherr, F., Kim, D. N., Shiao, E. L., Wauer, T., Wortmann, P., Bathe, M., Dietz, H. A primer to scaffolded DNA origami. Nature Methods. 8 (3), 221-229 (2011).
  20. Amir, Y., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami. Journal of Visualized Experiment. (106), 51272 (2015).
  21. Ben-Ishay, E., Abu-Horowitz, A., Bachelet, I. Designing a bio-responsive robot from DNA origami. Journal of Visualized Experiment. (77), 50268 (2013).
  22. Wei, B., Vhudzijena, M. K., Robaszewski, J., Yin, P. Self-assembly of complex two-dimensional shapes from single-stranded DNA tiles. Journal of Visualized Experiment. (99), May 52486 (2015).
  23. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  24. Grigsby, C. L., Leong, K. W. Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery. Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).
  25. Li, T., Dong, S., Wang, E. G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work. Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).
  26. Cassinelli, V. 1, Oberleitner, B., Sobotta, J., Nickels, P., Grossi, G., Kempter, S., Frischmuth, T., Liedl, T., Manetto, A. One-Step Formation of "Chain-Armor"-Stabilized DNA Nanostructures. Angewandte Chemie International Edition. 54 (27), 7795-7798 (2015).
  27. Gerling, T., Kube, M., Kick, B., Dietz, H. Sequence-programmable covalent bonding of designed DNA assemblies. Science Advances. , 1157 (2018).
  28. Xia, T., Kovochich, M., Liong, M., Meng, H., Kabehie, S., George, S., Zink, J. I., Nel, A. E. Polyethyleneimine Coating Enhances the Cellular Uptake of Mesoporous Silica Nanoparticles and Allows Safe Delivery of siRNA and DNA Constructs. ACS Nano. 3 (10), 3273-3286 (2009).

Tags

Kemi fråga 143 DNA-origami polyplex långsiktig stabilisering nucleolytic nedbrytning genterapi funktionalisering
Genterapi inspirerade Polycation beläggning för skydd av DNA Origami nanostrukturer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy … More

Ahmadi, Y., Barisic, I. Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures. J. Vis. Exp. (143), e58771, doi:10.3791/58771 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter