Summary
Lav intensitet pulserende ultralyd Stimulation (LIPUS) er en modalitet for non-invasiv mekaniske stimulation af endogene eller manipulerede celler med høj rumlige og tidsmæssige opløsning. Denne artikel beskriver, hvordan man gennemfører LIPUS til en epi-fluorescens mikroskop og hvor hen til bagatellisere akustisk impedans uoverensstemmelse langs stien ultralyd til at forhindre uønsket mekaniske artefakter.
Abstract
Ved at fokusere lavintensive ultralyd pulser, at trænge ind i bløde væv, repræsenterer LIPUS en lovende biomedicinsk teknologi til at fjernstyre og sikkert manipulere neurale fyring, hormonal sekretion og genetisk omprogrammerede celler. Imidlertid er oversættelse af denne teknologi til medicinske applikationer i øjeblikket hæmmet af en mangel på biofysiske mekanismer som målrettet væv følelse og reagere på LIPUS. En egnet metode til at identificere disse mekanismer ville være at bruge optisk biosensorer i kombination med LIPUS til at bestemme underliggende signaling veje. Imidlertid kan gennemføre LIPUS til et fluorescens mikroskop indføre uønsket mekaniske artefakter på grund af tilstedeværelsen af fysiske grænseflader, der afspejler, absorbere og bryder akustiske bølger. Denne artikel præsenterer en trinvis procedure for at indarbejde LIPUS til kommercielt tilgængelige oprejst epi-fluorescens mikroskoper og minimere påvirkning af fysiske grænseflader langs stien akustisk. En simpel procedure er beskrevet til at operere et enkelt element ultralyd transducer og at bringe den centrale zone af transduceren i den objektive omdrejningspunkt. Brugen af LIPUS er illustreret med et eksempel på LIPUS-induceret calcium transienter i kulturperler menneskelige glioblastom celler målt ved hjælp af calcium billeddannelse.
Introduction
Mange sygdomme kræver en form for invasive indgreb. Disse procedurer er ofte dyre, risikabelt, kræver fredninger og dermed tilføje en byrde på sundhedssystemerne. Non-invasiv terapeutiske metoder har potentiale til at skabe sikrere og billigere alternativer til konventionelle kirurgiske procedurer. Nuværende ikke-invasive metoder såsom Farmakoterapi eller transkranial magnetisk stimulation er dog ofte begrænset af afvejninger mellem væv penetration, spatiotemporelle opløsning og uønskede virkninger, off-målet. I denne sammenhæng en fokuseret ultralyd udgør en lovende non-invasiv teknologi med potentiale til at manipulere biologiske funktioner dybt inde i væv med stor spatiotemporelle nøjagtighed og begrænset ud-target effekter.
Fokuseret ultralyd stimulering består af levere akustisk energi på præcise steder dybt inde i levende organismer. Afhængigt af akustiske puls parametre, kan denne energi har en bred vifte af medicinske anvendelser. For eksempel, har Food and Drug Administration godkendt brugen af høj intensitet fokuseret ultralyd (HiFU) for termisk ablation af prostata tumorer, tremor-forårsager hjerneregioner, uterine fibromer og smerte-fremkaldende nerveender i knoglemetastaser1 . HiFu-medieret microbubble kavitation bruges også til forbigående åbne blod - hjerne barrieren for målrettet levering af systemisk administreres therapeutics2. Rumlige-peak pulse-gennemsnitlig intensitet (jegsppa) og rumlige-peak tidsmæssige-gennemsnitlig intensitet (jegspta) anvendes til HiFU applikationer er typisk over flere kW cm-2 og producere puls pres af flere snese MPa. Disse intensitetsværdierne er langt over den FDA-godkendt Isppa og jegspta grænser for diagnostisk ultralyd, 190 W cm-2 og 720 mW cm-2, henholdsvis3. Derimod har nylige undersøgelser vist, at ikke-destruktiv pulserende ultralyd stimulation, der er inden for eller i nærheden af rækken af diagnostisk ultralyd intensitet grænser (LIPUS) kan være effektiv til at fjernstyre og sikkert manipulere neurale fyring4, 5,6,7,8, hormonal sekretion9,10 og bioengineered celler11. Men, af cellulære og molekylære mekanismer som celler fornemme og reagere på ultralyd forbliver uklart, udelukker kliniske oversættelse af LIPUS. Derfor, i de seneste år, undersøgelser af kunstige membraner, dyrkede celler og dyr stimuleret med ultralyd har opnået momentum til at afsløre biofysiske og fysiologiske processer moduleres af LIPUS12,13, 14,15.
Lyd består af en vibration formerings gennem et fysisk medie. Ultralyd er en lyd med frekvenser over det menneskelige hørbare område (dvs. over 20 kHz). I et laboratorium indstilling fremstilles ultralyd bølger generelt af piezoelektriske transducere, der indeholder et materiale, der vibrerer som svar på et elektrisk felt oscillerende i en specifik højfrekvente båndbredde. Der findes to typer af transducere: enkelt element transducere og transducer arrays. Enkelt element piezoelektriske transducere besidder en buet overflade, der fungerer som et fokus linse og derfor koncentrerer akustisk energi i et defineret område kaldet zonen omdrejningspunkt. Enkelt element transducere er meget billigere og nemmere at betjene end transducer arrays. Denne artikel vil fokusere på enkelt element transducere.
Størrelsen af den fokale zone af en fokuseret enkelt element transducer afhænger af de geometriske egenskaber af den akustiske linse og sin akustiske frekvens. For at opnå en millimeter-størrelse fokale zone med et enkelt element transducer, er ultralyd frekvenser i området MHz generelt kræves. Akustiske bølger på sådan hyppighed er desværre meget hurtigt svækket når formeret i en svag medium som luft. Således skal MHz ultralyd bølger genereret og overføres til prøven i et mere fintmasket materiale såsom vand. Dette er den første udfordring i at integrere LIPUS modalitet til et mikroskop.
En anden udfordring er at minimere fysiske grænseflader mellem materialer med forskellige akustiske impedances, (som er et produkt af materielle tæthed og den akustiske hastighed) langs stien akustisk. Disse grænseflader kan afspejle, bryder, scatter og absorbere akustiske bølger, hvilket gør det vanskeligt at kvantificere mængden af akustisk energi effektivt leveret til en prøve. De kan også oprette uønsket mekaniske artefakter. For eksempel, skabe refleksioner producerede vinkelret på akustiske uoverensstemmelse impedans grænseflader backpropagating bølger, der interfererer med fremad-formerings ones. Langs stien indblanding annullere bølgerne hinanden på faste områder af rum kaldet noder og summen op på skiftevis regioner kaldet anti-noder, oprettelse af såkaldte stående bølger (figur 1). Det er vigtigt for experimentalist at kontrollere eller fjerne disse eksperimentelle grænseflader in vitro , som de ikke måske eksisterer in vivo.
Fluorescens målingen af optiske journalister er en velkendt metode til at afhøre gennemsigtig biologiske prøver i realtid og med ingen fysiske forstyrrelser. Denne tilgang er dermed ideel til LIPUS undersøgelser som enhver fysisk sonder til stede i området sonicated vil indføre mekanisk artefakter. Denne protokol beskriver gennemførelsen og driften af LIPUS til en kommerciel epi-fluorescens mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. voksende celler på akustisk Transparent Polyester Film
- Bore et 12 mm hul størrelse nederst på en standard 35 mm kultur parabol ved hjælp af en lodret tryk-boremaskine. Flytte boret langsomt og bære øjenbeskyttelse. Fjerne stykker plastik knyttet til bunden af skålen med en kniv til at skabe en glat overflade på den eksterne side (figur 2).
- Påfør et tyndt lag af marine-grade epoxy eller lim på eksterne bunden overfladen af fadet.
- Placer en folie af polyester (2,5 µm tykkelse) mod eksterne bunden overfladen af fadet og tryk fast for at sikre epoxy/lim. spreder jævnt mellem filmen og de tykke plastik overflade. Træk forsigtigt filmen i en centrifugal måde med fingre til at oprette en flad overflade (figur 2).
- Når epoxy/lim. har tørret, kort skyl-tør polyester-bund fad med 95% ethanol og sterilisere ved at placere skålen og indvendigt overflade af dens låg under en stærk 254 nm UV magnetisering kilde. Justere varighed og intensitet til at levere et UV dosis af ca 330 mJ cm-2 for fuldstændig destruktion af de fleste typer af mikroorganismer. Denne energi svarer ca til en varighed på 5 min ved en 1.000 µW cm-2 UV belysning.
- Alikvot kommercielt tilgængelige ekstracellulære matrix protein blandinger (EMPM) i små rør (50-100 µL) og gemme dem på-20 ° C eller derunder i sterile forhold.
- I et sterilt miljø (f.eks, inde i et skab biosikkerhed), fortyndes en frossen bestand af EMPM med en ønskede næringssubstrat til 1: 100. Arbejde på isen for at forhindre EMPM polymerisering ved stuetemperatur. Hurtigt anvende 100 µL af de mellemstore blandingen på den polyester film. Låget lægges igen på skålen at bevare steriliteten.
- Inkubér EMPM-belagt polyester bunden retter i en celle kultur CO2 inkubator ved 37 ° C i 6-12 timer.
- Efter inkubationen Opsug den overskydende medium og direkte frø overfladen med celler på den ønskede tæthed. Arbejde under steril tilstand at opretholde sterilitet.
2. LIPUS gennemførelse
- Placer en vandtank under målet om en opretstående mikroskop med store arbejdende volumen og uden belysning hardware i stien transmission.
- Ved hjælp af kommercielt tilgængelige optomechanical komponenter, placere en prøveholderen under målet og en transducer indehaveren nedenunder prøveholderen. For efterfølgende prøven søgning og ultralyd justering, skal du montere disse to indehavere på oversættelse faser.
- Placere de bevægelige dele og aktuatorer oversættelse stadier, enten uden for tank eller over vandlinjen at undgå vandskader. Brug kun ikke-ætsende materialer såsom anodiseret aluminium eller rustfrit stål for nedsænket optomechanical komponenter.
- Fyld tanken med deioniseret vand og afgassede vand før udnytte fordybelse transducer. Vandlinjen bør falde sammen med det vandrette plan af prøveholderen (figur 3).
Bemærk: Deioniseret vand forhindrer elektriske kobling i tilstedeværelsen af høje elektriske felter. Afgasning vil også forhindre spredning og ændringer af akustiske bølger. Dræn vand efter hvert eksperiment ved hjælp af en pumpe eller ventil så at vandlinjen falder til under holdning af transduceren. Også, erstatte eller filtrere vand ofte og oprydning vandtanken som nødvendig for at undgå vækst af mikroorganismer.
3. skrå akustiske magnetisering
- Ved hjælp af kommercielt tilgængelige optomechanical komponenter, orient transducer i en skrå stilling med hensyn til den optiske transmissionslængde. Dette vil sikre, at enhver afspejles bølger vil blive dirigeret fra stikprøven (figur 3 og figur 4).
4. kørsel transduceren
Bemærk: Ultralyd transducere konvertere oscillerende elektriske energi til mekanisk udvidelse/sammentrækning af piezoelektriske materialer. Denne konvertering producerer energitab i form af varmeenergi. Derfor, mens transducere besidder en peak indgangsspænding grænse, de også besidder en elektrisk strøm grænse for at undgå termiske skader på den piezoelektriske element:
med pligt cyklus den relative fraktion af tidspunktet for elektriske simulation, P den elektriske effekt (i watt), Vrms root-mean-square spænding (i volt) af alternative spændingskilde og Z den elektriske impedans (i ohm).
med Vpp top til top indgangsspændingen påføres transduceren.
- Oprette en sinusformet bølge formular, der indeholder den ønskede frekvens, antal cyklusser pr. puls, og puls gentagelse frekvens ved hjælp af en kommerciel funktionsgenerator. Den relativt høje Vpp skulle effektivt køre standard ultralyd transducere ofte kræver imidlertid tilføjelsen af en power forstærker til at forstærke output (dvs. øge amplitude af Vpp) funktion generator.
Bemærk: en transducer producent For eksempel angiver magt grænsen, for en given transducer er 35 W. Vil en sinusformet top til top input spænding (Vi) 500 mV på pligt cyklus på 50% og forstærket gennem en 50 dB/100 W forstærker være inden magt for denne transducer?- For at besvare dette spørgsmål, skal du beregne spændingen efter forstærkning. For en radiofrekvens (RF) effektforstærker, er forstærkning faktor (dB) defineret ved:
Således, den forstærkede spænding har en amplitude output Vpp (Vpp = Vud) af:
Ved hjælp af ligninger 1 og 2, og ved hjælp af 50 Ω som elektrisk impedans, er den tilsvarende effekt genereret af denne spænding:
Denne stimulation er derfor inden for den magt transduceren. - Brug ovenstående eksempel, beregne bølgeform parametre (Vpp, frekvens, impulslængde og puls gentagelse frekvens) der svarer til strøm og spænding grænser den transducer producenten. Sørg for at overholde disse grænser for at undgå at beskadige transduceren og andre forbundne instrumenter.
- For at besvare dette spørgsmål, skal du beregne spændingen efter forstærkning. For en radiofrekvens (RF) effektforstærker, er forstærkning faktor (dB) defineret ved:
- Vælg en funktionsgenerator, der opererer inden for en kompatibel med ultralyd transducer frekvensområde. Justere frekvensen af funktionsgenerator nominelle peak hyppigheden af transduceren.
- Oprette en sinusformet spænding puls af den ønskede varighed og gentagelse frekvens bredskærmsoptimiserede tilstand af til funktionsgenerator. Juster top til top spænding til en ønskede værdi. Sørg for at impulslængde er kortere end den forløbne tid mellem to på hinanden følgende pulser.
- Kontroller, at bølgeformen svarer til det ønskede signal ved at forbinde output af til funktionsgenerator til indgangen på et oscilloskop.
- Forbind udgangen af til funktionsgenerator til input af en RF effektforstærker (figur 4). Sørg for at stimulation parametre er inden for grænserne af den transducer producent.
5. stråle justering
- Vælg en audit, der opererer med en frekvens rækkevidde og akustisk intensiteten forenelig med hyppigheden og intensiteten af ultralyd transducer.
- Omhyggeligt bringe spidsen af en audit sonde i fokus inden for den objektive synsfelt på positionen svarende til placeringen af prøven (figur 4).
- Sørg for, at både sonde og transducer er nedsænket i deioniseret vand og afgassede vand. Bump ikke spidsen af audit med ethvert fysisk objekt end vand, da dette vil ændre sin belægning og påvirke målingen.
- Udføre en brutto før justeringen af transduceren af visuelt positionering sin akustiske akse mod audit sonden. Sørger for, at afstanden mellem den transducer overflade og audit tip svarer cirka til den transducer brændvidde.
- Tilslut audit output til en af de oscilloskop signal-input. Tilslut udløseren synkronisering fra funktionsgenerator til en anden oscilloskop input. Visualisere både signaler samtidig på oscilloskopet.
- Drive transducer med par ultralyd cykler på en lav normeret maksimalydelse og lav amplitude til at undgå at beskadige i probe. Check med den audit producent sikker driftsbetingelser til at undgå at beskadige audit tip.
- Justere s/division knop efter rejsetid for ultralyd fra transducerens overflade til audit. Kigge efter en audit signal på oscilloskopet efter synkronisering udløser.
- Langsomt betjene transduceren ved hjælp af en motoriseret eller manuel XYZ stage. Forlade transduceren i den position, der korrelerer med maksimal audit signal (figur 4).
Bemærk: Hvis ingen signal er opdaget, det er muligt at intensiteten af de akustiske pulser er for lavt, eller at strålen er mis justeres eller spredt af et objekt. Kontrol regelmæssigt, at audit og transducer er visuelt pre justeret og at ingen bobler eller fysisk objekt er til stede i stien undtagen den polyester film. Hvis ingen signal registreres stadig, øge indgangsspændingen ved et lille beløb at øge audit signalets amplitude.
6. bestemmelse af ultralyd puls pres og intensitet
- Med strålen justeres, måle top til top amplitude af audit output på oscilloskopet for forskellige spændinger kørsel transduceren. Sørg for ikke at overskride grænseværdien for den audit fabrikanten anbefaler.
- Konvertere disse målinger i pres og/eller akustiske intensitetsværdier ved hjælp af metoden kalibrering af audit producenten.
Bemærk: Den akustiske intensitet kan bestemmes ud fra pres og vice versa ved hjælp af formlen:
med jeg den akustiske pres (i W m-2), Pedersen den akustiske pres (i Pa), Rho tæthed af formeringsmateriale (1.000 kg m-3 for vand) og c lydens i formerings medium hastighed (for vand, c = 1.500 m s-1). - Oprette kalibreringskurverne ved hjælp af disse målinger.
Bemærk: Presset vs spænding og intensitet vs. spænding kurver har en lineær og parabolske form, henholdsvis. - Bestemme pres og/eller intensiteten af en ønskede drivende spænding ved hjælp af den tilsvarende kalibreringskurven.
7. calcium-følsomme/LIPUS Live-celle fluorescens Imaging
- Erstatte den cellekulturmedium med en ønskede imaging buffer indeholdende 5 µM i en celle-permeant calcium-følsomme farvestof (fx Fluo-4 AM). Inkuber kultur fadet i en CO2 inkubator ved 37 ° C i 1 time.
- Forsigtigt vaske celler med samme buffer gratis af farvestof.
- Placer fadet i prøveholderen. Excite celler ved hjælp af blå lys belysning (490 nm) og justere excitation intensitet og kamera eksponering for at undgå overdreven blegning eller pixel mætning.
- Udføre time-lapse imaging ved hjælp af ønskede billede erhvervelse indstillinger. Bruge objektivt fordybelse for bedre billedkvalitet og med lange arbejde afstand til at reducere uønskede refleksioner (Se figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 er et eksempel på LIPUS eksperiment multipleksede med calcium billeddannelse. Glioblastom celler (A-172) blev dyrket på EMPM belagt polyester film i standard næringssubstratet (suppleret med 10% serum og 1% antibiotika) og inkuberes med calcium-følsomme fluorescerende reporter Fluo-4 AM. Celler var afbildet ved hjælp af en 10 X fordybelse linse og belyst med en hvid LED lyskilde og fluorescens lys blev indsamlet ved hjælp af en standard normal god landbrugspraksis filtersæt. LIPUS blev anvendt af manuelt ved at køre en 4 MHz transducer med en puls bølgeform 158 V top til top amplitude, 0,1 ms impulslængde og 10 ms puls gentagelse frekvens (dvs. 1% duty cycle). Disse parametre svarer til jegsppa = 88 W cm-2 (godt under den diagnostiske grænse på 190 W cm-2)og jegspta = 877 mW cm-2 (lidt over den diagnostiske grænse på 720 mW cm-2), henholdsvis. Resultaterne viser, at denne stimulation produceret robust calcium stigninger (figur 5B, 5 C, 5 D).
For kort puls er varigheder (dvs. med ingen signifikant varmeafledning under pulsen) og antager varmekapacitet af prøven (dvs. celler dyrkes på polyester film og nedsænket i vandig opløsning) lig i vand, skift af temperatur (∆Tmax) produceret under hver puls kan estimeres ved16
med en impulslængde på 0,1 ms og puls intensitet af 88 W cm-2
∆Tmax = 0,12 x 0,0001 x 88 ≈ 1 m ° C
med 1% intermittens er den lille mængde varme deponeret på fokale zone under hver 0,1 ms puls sandsynligt fjernet af termisk overledning under 9,9 ms strakte sig mellem to på hinanden følgende pulser. Derfor, robust calcium signaler ses i figur 5B, 5 C, 5 D er mest sandsynligt forårsaget af ikke-termiske mekanismer.
Figur 1: stående bølge dannelse på en reflekterende grænseflade. Tilstedeværelsen af en grænseflade mellem materialer med forskellig akustisk impedans afspejler en indgående pres bølge (blå) med en bølgelængde λ. Da begge bølger rejser i modsatte retninger, er en oscillerende faseskift etableret. Top: på dette tidspunkt, faseskift er 180°, producerer destruktiv interferens af den stående bølge (grøn bølge). Midterste: Når bølgerne har flyttet en afstand svarende til λ/4 med hensyn til det øverste panel, faseskift er null og begge bølger forstærker via konstruktiv interferens, producerer en stående bølge af højere amplitude. Bunden: Når bølgerne har flyttet en ekstra afstand af λ/2 (dermed ialt λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ fra den øverste reference), fase Skift bliver null igen, producerer en stående bølge af høj amplitude, men med omvendt polaritet. Bemærk at nogle positioner inden for stien har en konstant null pres (node, sorte cirkler) mens andre holdninger konstant svinger mellem minimum- og maksimumværdierne pres (antinodes, grønne cirkler). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: voksende celler i akustisk transparent polyesterfolie. Figuren viser den nederste del af en 35 mm skål med en stor 12 mm hul i midten. Hullet er senere dækket med et tyndt polyester film. Filmen er fast limet til eksterne bunden af skålen bruge marine grade epoxy. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: gennemførelse af en ultralyd set-up til en oprejst fluorescens mikroskop. En skræddersyet vandtank er placeret under en opretstående fluorescens mikroskop uden overførte belysning hardware. En motoriseret prøveholderen placeret under målsætningen er knyttet til optomechanical komponenter er fæstnet til tabellen vibrationer uden for tanken. Transduceren er placeret under prøven og knyttet til en oversættelse stage anbringes optomechanical komponenter inde i tanken. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: skematisk diagram over den hele set-up. Set-up omfatter en epi-fluorescens oprejst fluorescens mikroskop for at aktivere fluorescens billeddannelse af dyrkede celler. Transduceren er vist med en skrå orientering med hensyn til den optiske transmissionslængde. Denne konfiguration forhindrer bagud afspejling af akustiske bølger langs den akustiske vej, dermed forhindre stående bølge dannelse og/eller gentagne stimulation af prøven med flere ultralyd ekkoer. En ønskede bølgeform er produceret af en funktionsgenerator, som kan være manuelt tændt eller elektronisk udløst af en computer interface (Transistor-Transistor-logik eller Universal Serial Bus). Amplitude og forsinkelse af signalet måles ved audit nålen (rød) kan analyseres ved hjælp af et oscilloskop. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: eksempel på LIPUS-induceret calciumsignaler i menneskelige glioblastom celler A-172. (A) rå fluorescens billede af A-172 celler dyrkes på en polyester-bunden 35 mm kultur parabol og fyldt med en celle-permeant version af calcium-indikator Fluo-4. De røde spor repræsenterer cellegrænserne automatisk identificeret af et edb-program og mærket som regioner af interesse (ROI). (B) tidsforløb relative fluorescens ændringer (Ft-F0f0, eller ΔF/F0) for hver ROI under en LIPUS eksperiment. Billeder blev erhvervet ved en hastighed på 1 frame pr. sekund af en standard CCD kamera og LIPUS blev anvendt for 10 s mellem rammer 20 og 30. LIPUS bølgeform består af 100 µsec pulser der indeholder 400 cykler på 4 MHz og gentages hver 10 ms for 10 s. (C) Plot viser tidsforløb betyder ΔF/F0 beregnet for alle ROIs (fejllinjer ikke vist). (D) Plot viser percentil af ROI udstiller ΔF/F0 over en bruger-defineret aktivisering tærskel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hovedfordelen ved fokuseret ultralyd er dens evne til at levere ikke-invasivt mekaniske og/eller termisk energi til biologiske prøver med høje spatio-temporale præcision. Andre teknikker til fremme af mekanisk celler normalt beskæftiger invasive fysiske sonder (f.eks. celle-Rode) eller kræver et samspil mellem høj energi laser bjælker med fremmedlegemer (fx Optisk pincet). Opvarmning kan varme specifikke geografiske steder inde i biologiske prøver men kræver tilstedeværelse af udenlandske magnetiske nanopartikler. På den anden side præcise non-invasiv opvarmning af små prøve (fx cellekulturer) i vandige medier er muligt ved hjælp af infrarød eller mikroovn excitation17,18,19.
Da kommercielle systemer udføre ultralyd excitation sammenholdt med Fluorescens mikroskopi ikke er tilgængelig, har mange biophysicists oprettet tilpassede systemer tilpasset deres specifikke programmer8,12 ,13,20. Gennemførelsen af sådanne systemer kan dog være vanskeligt for ikke-eksperter. I denne artikel beskrives den grundlæggende drift for at drive en fokuseret ultralyd stråle mod brændplanet af en opretstående epi-fluorescens mikroskop mål samtidig begrænse akustiske refleksioner og stående bølger artefakter, der er produceret på uoverensstemmelse akustisk impedans grænseflader. Disse akustiske artefakter er ikke normalt udtrykkeligt taget i betragtning i den publicerede litteratur.
Hvis bruger en akustisk stråle vinkelret paa den optiske transmissionslængde, stråle vil i sidste ende støder væske-solid interface dannes ved den forreste linse af en nedsænket mål eller hvis der bruges objektivt luft vand-luft grænseflade over prøven. Disse grænseflader vil afspejle de akustiske bølger tilbage til eksemplet, producerer stående bølger (Se figur 1). For at mindske eller undgå disse refleksioner, anbefales det at placere transduceren med et skråt over for den optiske transmissionslængde.
Brugen af polyester-bunden kultur retter ikke kun minimere akustiske refleksioner produceret af tyk plast kultur retter bunden, de også muligt for experimentalist at stimulere prøve fra undersiden med en opretstående mikroskop. Dette er en bedre konfiguration i forhold til en inverteret mikroskop til at placere en nedsænket transducer med en skrå orientering med hensyn til den optiske transmissionslængde.
Denne protokol er udviklet til brug med fokuseret ultralyd transducere, men experimentalist kan også bruge ikke-fokuseret (planar) ultralyd transducere så godt. Bemærk, at da LIPUS er beregnet til præcis stimulation af ønskede områder inden for væv, fokuseret ultralyd transducere er generelt foretrækkes for både in vitro- og i vivo applikationer. Akustisk bjælker produceret af planar transducere er også bredere, hvilket gør det sværere at reducere refleksioner og andre mekaniske artefakter.
Den centrale zone af et enkelt element fokuseret ultralyd transducer afhænger af mange parametre som element diameter, akustisk hyppigheden og lyd hastigheden af formeringsmateriale. For en standard MHz transducer, er den fokusområde typisk begrænset i en millimetric eller sub millimetric region. Et trade-off findes mellem størrelsen af den fokale zone og den akustiske stråle evne til at trænge ind væv uden for meget tab på grund af dæmpning: jo højere frekvens, jo mindre zonen fokale men den svagere penetration.
Til effektivt for at stimulere cellerne visualiseret under et mikroskop, skal de akustiske fokale zone af transduceren overlapper med det optiske brændplanet af målet. I dette øjemed er det nødvendigt at justere præcist den akustiske stråle ved hjælp af en kommercielt tilgængelig audit. Der er to hovedtyper af Hydrofoner: audit nåle og fiber fiberoptisk systemer. Begge typer kan bruges. Under justering er det vigtigt at sørge for, at den akustiske intensitet er inden pres for at audit, og at hyppigheden af transduceren i frekvensområdet fra de audit følsomhed.
Brug kalibrering leveres af fabrikanten (hvis tilgængelig) til at konvertere spænding amplitude output af audit i faktiske akustiske pres (Hydrofoner er normalt kalibreret med et nummer i V Pa-1 eller lignende enheder). Hydrofoner har også normalt en præferentiel orientering (retningsbestemt) med hensyn til akustiske strålen, derfor det er foretrukket at placere audit i samme retning af den akustiske akse. Hvis ikke muligt, Hydrofoner kan have et diagram af dæmpning vs retningsbestemt vinkel, så retningsbestemt efter korrektion efter målingerne er taget.
Beam justering kan være en frustrerende opgave, især når de opererer en transducer med en smal fokale zone. Audit signal skal vises med en forsinkelse med hensyn til pulsen kørsel transduceren. Denne forsinkelse svarer til den tid, det tager ved ultralyd til at rejse fra den transducer overflade til audit sonden (i vand, lydbølger rejse med en hastighed af cirka 1.500 m s-1) (Se figur 4). Bemærk, at forsinkelsen af RF-signaler rejse gennem elektriske kabler er lille, kun ca 3 ns m-1, som i den foreliggende sag, kan rolig ignoreret. En måde at teste, hvis strålen er godt afstemt er at beregne afstanden mellem transducer og audit ved hjælp af forsinkelsen målt på oscilloskopet og den kendte lyd hastighed i vand. For eksempel, forventes en forsinkelse på ca 17 µs for en transducer med en brændvidde på 25 mm.
Hvis brugen af kommercielle audit ikke er muligt (f.eks. usædvanlig transducer frekvens med ikke matchende Hydrofoner eller begrænset plads til at placere audit), akustisk strålen kan justeres med puls-echo metode20. Dette gøres normalt ved første markedsføring en lille reflekterende objekt af en størrelse lignende eller mindre end lysbundtets diameter af transduceren i fokus i mikroskop synsfelt. Transduceren er derefter anvendt både som akustisk emitter (til at sende ultralydsscanning bælgfrugter) og receiver (at opdage ekko fra den reflekterende objekt). Bemærk, at i denne konfiguration, en dedikeret forstærker er nødvendigt at forstærke snarere små echo signalet kommer ud af transduceren.
For et velfungerende RF instrumenter er det vigtigt, at alle kabler og tilslutninger til instrumenter har matchende elektrisk impedans, ellers uønskede elektriske refleksioner vil opstå, og ændre den elektriske bølgeform. Dette er normalt tilfældet med de fleste bajonet Neill-Concelman (BNC) kabler og RF udstyr at have 50 Ω impedans. Nogle Oscilloskoper, dog har en høj Indgangsimpedans 1 MΩ og således vil afspejle et RF signal fodres gennem en 50 Ω BNC-kablet. I dette tilfælde, bør en simpel 50 Ω feed-through terminator indsættes mellem slutningen af BNC-kablet og oscilloskops input til korrekt opsige signal uden tab.
Denne metode er teknisk begrænset af måleudstyret anvendes til at levere ultralydsscanning bælgfrugter og udføre fluorescens billeddannelse. For eksempel, ville en standard enkelt-foton fluorescens mikroskop kun aktiverer billeddannelse af to-dimensionelle prøver. Det kan dog udføre mere komplekse LIPUS billeddannelse af tre-dimensionelle prøver som hjernen skiver eller små organer ved hjælp af multi photon excitation.
En anden udfordring med LIPUS eksperimenter er at skelne mellem mekanisk vs termiske effekter formidles af akustiske bjælker. En mekanisk forskydning skrå til den optiske transmissionslængde kan påvises, hvis det fortrænger billedet i flyet akse (x, y) eller defocuses prøven i z-aksen. Disse forskydninger afhænger den kombineret optisk opløsning af mikroskop kamera og mål. Desuden, som disse forslag vil kun forekomme under sonikering, skulle man bruge en høj nok til at synkronisere den tidsmæssige overlapning mellem kamera eksponering og puls varighed billedhastighed.
For at undersøge ultralyd-induceret termiske effekter, brug konventionelle fysiske sonder til at måle temperatur ikke anbefales på grund af uundgåelige vibrationer af sonden. Men den teknik beskrevet her er velegnet til at måle temperaturændringer ved hjælp af genetisk kodet thermosensitive fluorescens journalister eller thermosensitive farvestoffer21,22. Fremover, efterhånden som flere biokompatible fluorescerende journalister bliver tilgængelige, vil denne teknik aktiverer studiet af ultralyd virkninger på mange andre biofysiske parametre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Drs. Mikhail Shapiro og Nikita Reznik for frugtbare drøftelser. Dette arbejde blev støttet af start-up midler fra Western University of Health Sciences og NIH give R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , World Neurosurgery. (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O'Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
