Summary
Stimulation d’ultrasons pulsés faible intensité (LIPUS) est une modalité pour une stimulation mécanique non invasif des cellules endogènes ou machinés avec une haute résolution spatiale et temporelle. Cet article explique comment implémenter LIPUS à un microscope épifluorescente et comment minimiser les différences d’impédance acoustique sur le chemin de l’échographie pour empêcher des objets mécaniques non désirés.
Abstract
En se concentrant des pulsations d’ultrasons de basse intensité qui pénètrent dans les tissus mous, LIPUS représente une technologie biomédicale prometteuse à distance et en toute sécurité manipuler tir neuronaux, sécrétion hormonale et cellules reprogrammées génétiquement. Cependant, la traduction de cette technologie pour des applications médicales est actuellement entravée par un manque de mécanismes biophysiques qui ciblés sens de tissus et de répondre aux LIPUS. Une méthode adaptée pour identifier ces mécanismes serait d’utiliser des biocapteurs optiques en combinaison avec LIPUS pour déterminer qui sous-tendent les voies de signalisation. Toutefois, appliquer LIPUS à un microscope à fluorescence peut introduire des objets mécaniques indésirables en raison de la présence d’interfaces physiques qui reflètent, d’absorber et de réfraction des ondes acoustiques. Cet article présente une procédure pas à pas pour se lient LIPUS microscopes épifluorescente verticale disponible dans le commerce tout en minimisant l’influence des interfaces physiques le long de la trajectoire acoustique. On décrit une méthode simple pour l’exploitation d’un seul élément transducteur et à intégrer la zone focale du capteur de point focal objectif. L’utilisation de LIPUS est illustrée par un exemple de calcium induite par LIPUS transitoires dans les cellules de glioblastome humain cultivées mesurées à l’aide d’imagerie calcique.
Introduction
De nombreuses maladies nécessitent une forme quelconque d’intervention médicale invasive. Ces procédures sont souvent coûteux, risqué, exigent des périodes de récupération et donc ajouter un fardeau aux systèmes de soins de santé. Modalités thérapeutiques non invasifs sont susceptibles de fournir des solutions de rechange sûres et peu coûteuse pour des procédures chirurgicales conventionnelles. Toutefois, les approches actuelles non invasives telles que la stimulation magnétique transcrânienne ou de pharmacothérapie sont souvent limités par des compromis entre la pénétration tissulaire, résolution spatio-temporelle et des effets indésirables hors cible. Dans ce contexte, un ultrasons focalisés constituent une technologie non invasive prometteuse avec la possibilité de manipuler les fonctions biologiques profondément à l’intérieur des tissus avec haute précision spatio-temporelle et limité les effets hors cible.
Ultrasons focalisés stimulation consiste en délivrant une énergie acoustique à des emplacements précis profondément à l’intérieur des organismes vivants. En fonction des paramètres d’impulsions acoustiques, cette énergie peut avoir une variété d’utilisations médicales. Par exemple, la Food and Drug Administration a approuvé l’utilisation d’ultrasons de concentré de haute intensité (HiFU) pour ablation thermique de tumeurs prostatiques, causant des tremblements des régions du cerveau, les fibromes utérins et causant douleur de terminaisons nerveuses dans les métastases osseuses1 . Cavitation induite par HiFu microbulles est également utilisée pour ouvrir transitoirement la barrière hémato - encéphalique pour l’administration ciblée de produits thérapeutiques administrés par voie générale2. L’intensité moyenne des impulsions spatiale de pointe (j’aiLECL) et spatial-pic d’intensité moyenne temporelle (j’aispta) utilisé pour HiFU applications sont généralement au-dessus de plusieurs kW cm-2 et produisent la pression différentielle de plusieurs dizaines de MPa. Ces valeurs sont bien au-dessus de la FDA a approuvé ILECL et j’aispta limites d’échographie diagnostique, de 190 W cm-2 et de 720 mW cm-2, respectivement3. En revanche, les études récentes ont montré que la stimulation non destructifs ultrasons pulsés qui sont dans ou près de la plage des limites d’intensité de diagnostic par ultrasons (LIPUS) peut être efficace pour manipuler les neurones à distance et en toute sécurité de tir4, 5,6,7,8, sécrétion hormonale9,10 et génie génétique des cellules11. Pourtant, les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels cellules détecter et répondent aux ultrasons restent floues, excluant la traduction clinique de LIPUS. Donc, dans quelques années, des études des membranes artificielles, des cellules cultivées et des animaux stimulés par des ultrasons ont pris de l’ampleur pour révéler biophysiques et processus physiologiques modulées par LIPUS12,13, 14,15.
Les sons composés d’une vibration se propageant à travers un support physique. Un ultrason est un son avec une fréquence supérieure à la gamme audible humaine (c'est-à-dire supérieures à 20 kHz). Dans un environnement de laboratoire, des ondes ultrasoniques sont généralement fabriqués par des transducteurs piézoélectriques qui contiennent un matériau qui vibre en réponse à un champ électrique oscillant dans une largeur de bande haute fréquence spécifique. Il existe deux types de transducteurs : simple monoéléments et transducteurs. Piézoélectrique monoéléments possèdent une surface courbée qui agit comme une lentille de focalisation et donc se concentre une énergie acoustique dans une région donnée, appelée la zone focale. Monoéléments sont beaucoup moins cher et plus facile à exploiter que les transducteurs. Cet article se concentrera sur monoéléments.
La taille de la zone focale d’un transducteur unique élément dépend des propriétés géométriques de la lentille acoustique et sa fréquence acoustique. Pour atteindre une zone focale millimètre-taille avec un monoélément, fréquences d’ultrasons dans la gamme MHz sont généralement nécessaires. Malheureusement, les ondes acoustiques à une fréquence sont atténués très rapidement lorsque se propageant dans un milieu fragile tel que l’air. Ainsi, des ondes ultrasoniques MHz doivent être générés et propagées à l’échantillon dans un matériau plus dense comme l’eau. Ceci constitue le premier défi en intégrant la modalité LIPUS à un microscope.
Un deuxième défi est de réduire au minimum les interfaces physiques entre les matériaux avec différentes impédances acoustiques (qui est un produit de masse volumique et la vitesse acoustique) le long de la trajectoire acoustique. Ces interfaces peuvent refléter, réfraction, dispersion et absorbent les ondes acoustiques, rendant difficile de quantifier la quantité d’énergie acoustique effectivement livrée à un échantillon. Ils peuvent également créer des objets mécaniques non désirés. Par exemple, les réflexions incompatibilité perpendiculaire à acoustique produit impédance interfaces créent des ondes de backpropagating qui interfèrent avec ceux de multiplication avant. Sur le chemin de l’interférence, les ondes s’annulent mutuellement à des régions fixes des espaces appelés nœuds et résumer en alternant zones appelées anti-noeuds, créant ce que l'on appelle ondes stationnaires (Figure 1). Il est important pour l’expérimentateur d’être en mesure de contrôler ou éliminer ces interfaces expérimentales in vitro comme ils peuvent ne pas exister in vivo.
Mesure de la fluorescence de reporters optiques est une méthode bien connue d’interroger des échantillons biologiques transparents en temps réel et avec aucune perturbation physique. Cette approche est donc idéale pour les études LIPUS car les sondes physiques présents dans la région aux ultrasons présentera des objets mécaniques. Ce protocole décrit la mise en œuvre et le fonctionnement du LIPUS à un microscope épifluorescente commerciale.
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Protocol
1. croissance des cellules sur Film Polyester acoustiquement Transparent
- Percer une taille de trou de 12 mm au fond d’une boîte de Petri standard de 35 mm à l’aide d’un foret de presse vertical. Déplacez la perceuse lentement et porter une protection oculaire. Retirez les morceaux de plastique attachés au fond du plat à l’aide d’une lame pour créer une surface lisse sur la face externe (Figure 2).
- Appliquer une fine couche d’époxy de qualité marine ou de la colle à la surface externe de fond du plat.
- Placer un film de polyester (2,5 µm d’épaisseur) sur la surface externe bas du plat et appuyez fermement pour s’assurer que la colle époxy/se répand uniformément entre le film et la surface en plastique épaisse. Tirez doucement le film de façon centrifuge avec doigts pour créer une surface plane (Figure 2).
- Lorsque/la colle est sèche, brièvement rinçage séchage polyester-fond plat avec l’éthanol à 95 % et stériliser en plaçant le plat et à l’intérieur de son couvercle sous une forte source d’excitation de 254 nm UV. Ajuster la durée et l’intensité pour administrer une dose UV d’environ 330 mJ cm-2 pour la destruction complète de la plupart des types de micro-organismes. Cette énergie correspond approximativement à une durée de 5 min à l’aide d’un éclairage UV-2 de 1 000 µW cm.
- Aliquote mélanges de protéines disponibles dans le commerce de la matrice extracellulaire (EMPM) dans petits tubes (50-100 µL) et magasin à-20 ° C ou moins dans des conditions stériles.
- Dans un environnement stérile (par exemple, à l’intérieur d’une armoire de sécurité biologique), diluer un stock congelé de EMPM avec un milieu de culture souhaité au 1/100. Travailler sur la glace pour empêcher la polymérisation EMPM à température ambiante. Appliquer rapidement 100 µL de mélange moyen sur le film de polyester. Replacez le couvercle sur le plat pour maintenir la stérilité.
- Incuber les plats bas polyester enduit EMPM dans une étuve de cell culture CO2 à 37 ° C pendant 6 à 12 h.
- Après incubation, aspirer l’excès du milieu et des graines directement la surface avec des cellules à la densité voulue. Travailler dans des conditions stériles pour maintenir la stérilité.
2. LIPUS mise en œuvre
- Placer un réservoir d’eau sous l’objectif d’un microscope vertical avec grand volume de travail et sans matériel d’illumination dans la voie de transmission.
- Composants opto-mécaniques disponibles sur le marché, placer un porte-échantillon au-dessous de l’objectif et titulaire d’un transducteur sous le porte-échantillon. Pour l’alignement de rechercher et d’échographie échantillon suivant, monter ces deux titulaires sur les étapes de la traduction.
- Placez les pièces mobiles et les actionneurs des étapes de traduction, soit en dehors de la cuve, soit au-dessus de la ligne d’eau pour éviter les dégâts d’eau. Utilisez uniquement des matériaux non corrosifs tels que l’aluminium anodisé ou en acier inoxydable pour composants opto-mécaniques immergé.
- Remplissez le réservoir avec de l’eau désionisée et dégazé avant utilisant le transducteur de l’immersion. La ligne de flottaison doit coïncider avec le plan horizontal de la porte de l’échantillon (Figure 3).
Remarque : L’eau désionisée empêche couplage électrique en présence de champs électriques élevés. Dégazage n’empêchera également la diffusion et des altérations des ondes acoustiques. Vidanger l’eau après chaque expérience à l’aide d’une pompe ou une vanne pour que la ligne d’eau tombe au-dessous de la position du transducteur. Aussi, remplacer ou filtrer l’eau fréquemment et nettoyer le réservoir d’eau au besoin pour éviter la croissance des micro-organismes.
3. oblique Excitation acoustique
- À l’aide de composants opto-mécaniques disponibles dans le commerce, orientez le capteur dans une position oblique en ce qui concerne le trajet optique. Cela garantira que tout reflète vagues iront loin de l’échantillon (Figure 3 et Figure 4).
4. conduire le transducteur
NOTE : Les transducteurs ultrasons convertissent énergie électrique oscillant en expansion/contraction mécanique d’un matériau piézoélectrique. Cette conversion produit perte d’énergie sous forme d’énergie thermique. Par conséquent, tandis que les transducteurs possèdent une limite de tension d’entrée max., ils possèdent également une limite de puissance électrique pour éviter tout dommage thermique à l’élément piézoélectrique :
avec le duty cycle la fraction relative du temps de simulation électrique, P la puissance électrique (en Watts), Vrms la tension d’entrée de root-mean-square (en Volts) de la source de tension alternative Z électrique impédance (en Ohms).
avec Vpp la tension d’entrée de crête à crête, appliquée à la sonde.
- Créer une forme d’onde sinusoïdale contenant la fréquence souhaitée, le nombre de cycles par impulsion, et à l’aide d’un générateur de fonctions commerciales de fréquence de répétition des impulsions. Toutefois, la Vpp relativement élevé nécessaire pour effectivement conduire transducteurs d’ultrasons standard souvent nécessite l’ajout d’un amplificateur pour amplifier la sortie (c.-à-d., augmentation de l’amplitude de Vpp) de l’appareil.
NOTE : par exemple, fabricant d’un transducteur indique la limite de puissance pour un transducteur donné est de 35 W. Sera une crête à crête sinusoïdal d’entrée tension (Vde) de 500 mV à un droit de 50 % du cycle et amplifié par un 50 dB/100 W amplificateur être dans la limite de la puissance de ce transducteur ?- Pour répondre à cette question, calculer la tension après amplification. Pour un amplificateur de puissance radio-fréquence (RF), le coefficient d’amplification (dB) est défini par :
Ainsi, la tension amplifiée a une amplitude sortie Vpp (Vpp = Vout) de :
En utilisant les équations 1 et 2 et en utilisant 50 Ω comme impédance électrique, la puissance correspondante générée par cette tension est :
Cette stimulation est donc dans la limite de la puissance du transducteur. - À l’aide de l’exemple ci-dessus, calculer les paramètres de forme d’onde (Vpp, fréquence, durée de l’impulsion et la fréquence de répétition des impulsions) qui correspondent à des limites de puissance et tension fournies par le fabricant du transducteur. Veillez à respecter ces limites pour éviter d’endommager le transducteur et autres instruments connectés.
- Pour répondre à cette question, calculer la tension après amplification. Pour un amplificateur de puissance radio-fréquence (RF), le coefficient d’amplification (dB) est défini par :
- Choisissez un générateur de fonction qui opère dans une gamme de fréquences compatible avec le transducteur à ultrasons. Régler la fréquence du générateur de fonction de la fréquence de crête nominale du capteur.
- Créer une impulsion de tension sinusoïdale de la durée et la fréquence de répétition en utilisant le mode rafale de l’appareil. Ajustez la tension de crête à crête à une valeur désirée. Assurez-vous que la durée de l’impulsion est plus courte que le temps écoulé entre deux impulsions consécutives.
- Vérifier que la forme d’onde correspondant au signal désiré en connectant la sortie de l’appareil à l’entrée d’un oscilloscope.
- Connectez la sortie de l’appareil à l’entrée d’un amplificateur RF (Figure 4). Assurez-vous que les paramètres de stimulation sont dans les limites du constructeur de la sonde.
5. alignement du faisceau
- Choisissez un hydrophone qui fonctionne avec une fréquence acoustique et gamme intensité compatible avec la fréquence et l’intensité de la sonde d’échographie.
- Soigneusement, mettre l’extrémité d’une sonde d’hydrophone au point dans le champ de vue objectif sur la position correspondant à la position de l’échantillon (Figure 4).
- S’assurer que la sonde et le transducteur soient immergées dans de l’eau désionisée et dégazé. Ne cognez pas la pointe de l’hydrophone avec n’importe quel objet physique autres que l’eau que cela changera son revêtement et influent sur la mesure.
- Effectuer un alignement préalable brut du capteur de positionnement visuellement son axe acoustique vers la sonde de l’hydrophone. Permet de s’assurer que la distance entre la surface du transducteur et la pointe de l’hydrophone correspond approximativement à la longueur focale du capteur.
- Connectez l’hydrophone de sortie à l’une des entrée de signal de l’oscilloscope. Connectez le déclenchement de la synchronisation de l’appareil à une autre entrée de l’oscilloscope. Visualiser les deux signaux simultanément sur l’oscilloscope.
- Conduire le transducteur avec quelques cycles d’échographie à un faible rapport cyclique et de faible amplitude pour éviter d’endommager la sonde. Vérifier avec les conditions de fonctionnement sécuritaire de l’hydrophone fabricant pour éviter d’endommager l’extrémité de l’hydrophone.
- Réglez le bouton s/division selon le temps de voyage de l’échographie de surface du transducteur à l’hydrophone. Vous recherchez un signal hydrophone sur l’oscilloscope après le déclenchement de la synchronisation.
- Lentement, actionner le transducteur à l’aide d’un stade XYZ motorisé ou manuel. Laissez le transducteur dans la position qui est en corrélation avec le signal hydrophone maximale (Figure 4).
Remarque : Si aucun signal n’est détecté, il est possible que l’intensité des impulsions acoustiques est trop faible ou le faisceau mal aligné ou dispersé par un objet. Vérifier régulièrement que l’hydrophone et transducteur sont visuellement pré alignées et que sans bulles ou un objet sont présents dans le chemin d’accès à l’exception du film de polyester. Si aucun signal n’est détecté encore, augmenter la tension d’entrée par une petite quantité d’augmenter l’amplitude du signal de l’hydrophone.
6. détermination de la pression différentielle de l’échographie et l’intensité
- Avec le faisceau aligné, mesurer l’amplitude crête-à-crête de l’hydrophone à l’oscilloscope pour diverses tensions conduisant le transducteur de sortie. Veillez à ne pas dépasser la limite de la pression recommandée par le fabricant de l’hydrophone.
- Convertir ces mesures en pression et/ou les valeurs d’intensité acoustique à l’aide de la méthode d’étalonnage fournie par le fabricant de l’hydrophone.
Remarque : L’intensité acoustique peut être déterminée par la pression et vice versa selon la formule suivante :
j’ai la pression acoustique (en W m-2), P la pression acoustique (en Pa), ρ la masse volumique des matériels de multiplication (1 000 kg m-3 pour l’eau) et c la vitesse du son dans la propagation du milieu (pour l’eau, c = 1 500 m s-1). - Créer des courbes d’étalonnage à l’aide de ces mesures.
Remarque : Les pression vs tension et intensité vs tension les courbes ont une forme linéaire et parabolique, respectivement. - Déterminer la valeur de pression et/ou l’intensité d’une tension de conduite désirée à l’aide de la courbe d’étalonnage correspondantes.
7. imagerie de Fluorescence des cellules vivantes calcium-sensible/LIPUS
- Remplacer le milieu de culture de la cellule avec un tampon d’imagerie désiré contenant 5 µM d’un colorant sensible au calcium cellulaire perméable (p. ex., Fluo-4 AM). Incuber le plat de la culture dans un incubateur à CO2 à 37 ° C pendant 1 h.
- Se laver soigneusement les cellules avec le même tampon exempt de colorant.
- Placer la capsule dans le porte-échantillon. Excite les cellules à l’aide d’un éclairage lumineux bleu (490 nm) et ajuster l’excitation intensité et caméra exposition afin d’éviter la saturation excessive de blanchiment ou de pixel.
- Effectuer l’imagerie time-lapse utilisant des paramètres d’acquisition image désirée. Utiliser un objectif à immersion pour une meilleure qualité d’image et à longue distance de travail pour réduire les réflexions indésirables (voir Figure 4).
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Representative Results
La figure 5 est un exemple d’expérience LIPUS multiplexé avec imagerie calcique. Cellules de glioblastome (A-172) ont été cultivées sur film polyester EMPM enduit dans le milieu de culture standard (additionné de 10 % de sérum et de 1 % des antibiotiques) et incubés avec le journaliste fluorescent sensible au calcium Fluo-4 AM. Cellules ont été photographiés à l’aide d’un objectif d’immersion X 10 et éclairé par une source de lumière LED blanche et la lumière de fluorescence ont été recueillie à l’aide d’un ensemble standard de filtre GFP. LIPUS a appliqué manuellement par la conduite d’un transducteur de 4 MHz avec une forme d’onde d’impulsion de 158 V amplitude crête à crête, durée d’impulsion 0.1 ms et 10 ms fréquence de répétition des impulsions (c'est-à-dire 1 % cyclique). Ces paramètres correspondent aux ILECL = 88 W cm-2 (bien inférieure au seuil diagnostique de 190 W cm-2)et j’aispta = 877 mW cm-2 (un peu au-dessus de la limite diagnostique de 720 mW cm-2), respectivement. Les résultats montrent que cette stimulation produit élévations de calcium solide (Figure 5 b, 5C, 5D).
Pour les impulsions courtes durées (c'est-à-dire, avec aucune dissipation de la chaleur importante durant l’impulsion) et en supposant que la capacité calorifique de l’échantillon (c'est-à-dire les cellules cultivées sur film polyester et immergé dans une solution aqueuse) est semblable à celle de l’eau, le changement de température (∆Tmax) produite au cours de chaque impulsion peut être estimée par16
avec une durée d’impulsion de 0,1 ms et l’intensité des impulsions de 88 W cm-2
∆Tmax = 0,12 x 0,0001 x 88 ≈ 1 m ° C
avec 1 % rapport cyclique, la petite quantité de chaleur déposé dans la zone focale lors de chaque impulsion 0.1 ms est probable enlevé par conduction thermique pendant les 9,9 ms duré entre deux impulsions consécutives. Le calcium robuste signaux on le voit dans la Figure 5 b, 5C, 5D sont donc probablement induite par l’ou les mécanismes non thermique.
Figure 1 : formation de l’onde stationnaire à une interface réfléchissante. La présence d’une interface entre les matériaux avec différent impédance acoustique reflète une onde de pression entrant (bleue) avec une longueur d’onde λ. Étant donné que les deux vagues se déplacent dans des directions opposées, un décalage de phase oscillante est établi. Top : à cette époque, le déphasage est de 180°, produisant une interférence destructive de l’onde stationnaire (vague verte). Milieu : Après que les vagues ont déplacé d’une distance correspondant à λ/4 en ce qui concerne le panneau supérieur, le déphasage est null et les deux vagues amplifient par des interférences constructives, produisant une onde stationnaire d’une amplitude plus élevée. Bas : Après les vagues ont déplacé d’une distance supplémentaire de λ/2 (donc un total de λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ de la référence), la phase shift devient null encore une fois, produisant une onde stationnaire de forte amplitude, mais avec une polarité inverse. Notez que certains postes au sein de la voie ont une pression constante nulle (cercles de nœud, noir) alors que d’autres positions constamment oscillent entre pressions minimales et maximales (ventres, cercles verts). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : croissance des cellules sur film polyester acoustiquement transparent. La figure montre la partie inférieure d’un plat de 35 mm avec un trou large de 12 mm en son centre. Le trou est ensuite recouvert d’une mince pellicule de polyester. Le film est fermement collé au fond du plat avec de l’epoxy de qualité marine externe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : mise en place d’une configuration d’échographie à un microscope à fluorescence verticale. Un réservoir d’eau sur mesure est placé sous un microscope à fluorescence debout sans aucun autre matériel éclairage transmis. Un porte-échantillon motorisés placé au titre de l’objectif est fixé à composants opto-mécaniques sont fixés à la table de vibration en dehors de la cuve. Le transducteur est placé sous l’échantillon et attaché à une étape de traduction apposée aux composants opto-mécaniques à l’intérieur de la cuve. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : schéma de l’installation entière. L’installation comprend un microscope à fluorescence verticale épifluorescente permettant l’imagerie de fluorescence des cellules cultivées. Le transducteur est montré avec une orientation oblique en ce qui concerne le trajet optique. Cette configuration évite la réflexion vers l’arrière des ondes acoustiques le long de la trajectoire acoustique, empêchant ainsi la formation d’ondes stationnaires et/ou une stimulation répétée de l’échantillon aux multiples échos d’échographie. Une forme d’onde souhaitée est produite par un générateur de fonction qui peut être activé manuellement ou électroniquement déclenché par une interface d’ordinateur (Transistor-Transistor-logique ou Universal Serial Bus). L’amplitude et le retard du signal mesuré par l’aiguille de l’hydrophone (rouge) peuvent être analysés à l’aide d’un oscilloscope. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : exemple de signaux de calcium induite par LIPUS en glioblastome humain cellules A-172. (A) l’image Raw fluorescence des cellules A-172 cultivés sur une boîte de Petri 35 mm polyester-bas et chargé avec une version cell perméable du calcium-indicateur Fluo-4. Les traces rouges représentent les limites d’une cellule identifié automatiquement par un programme informatique et étiquetés comme des régions d’intérêt (ROI). (B) durée de changement de la fluorescence relative (Ft-F0/f0ou ΔF/F0) pour chaque ROI au cours d’une expérience LIPUS. Des images ont été acquises à une vitesse de 1 image par seconde par une caméra CCD standard et LIPUS a été appliquée pendant 10 s entre 20 et 30 cadres. La forme d’onde LIPUS comprend 100 impulsions µsec contenant 400 cycles à 4 MHz et répétée toutes les 10 ms pour 10 s. (C) parcelle de terrain, montrant l’évolution temporelle de la moyenne ΔF/F0 calculé pour tous les ROIs (barres d’erreur non illustrés). (D) emplacement montrant le percentile du ROI présentant ΔF/F0 au-delà d’un seuil d’activation défini par l’utilisateur. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Un avantage principal des ultrasons focalisés est sa capacité à livrer non invasive énergie mécanique ou thermique d’échantillons biologiques avec une grande précision temporelle. Autres techniques destinés à stimuler mécaniquement des cellules habituellement employer envahissantes sondes physiques (p. ex., cellule-piquer) ou requiert l’interaction des faisceaux lasers de haute énergie avec des objets étrangers (p. ex., les pinces optiques). Chauffage magnétique peut chauffer les emplacements spatiaux spécifiques à l’intérieur des échantillons biologiques, mais nécessite la présence de nanoparticules magnétiques étrangers. En revanche, précise chauffage non invasif de petits échantillons (par exemple, les cultures de cellules) en milieu aqueux est possible en utilisant infrarouge ou micro-ondes excitation17,18,19.
Systèmes commerciaux capables d’exécuter conjointement avec la microscopie en fluorescence excitation échographie n’étant pas disponibles, beaucoup des biophysiciens ont créé des systèmes personnalisés, adaptés à leurs applications spécifiques8,12 ,13,20. La mise en œuvre de tels systèmes possible, toutefois, être difficile pour les non-spécialistes. Cet article décrit le fonctionnement de base pour conduire un faisceau d’ultrasons focalisés vers le plan focal d’un objectif de microscope épifluorescente debout tout en limitant l’acoustiques objets de réflexions et d’ondes stationnaires qui sont produites en acoustique de l’incompatibilité interfaces d’impédance. Ces artéfacts acoustiques ne sont pas habituellement expressément pris en considération dans la littérature publiée.
Si à l’aide d’un faisceau acoustique perpendiculaire au chemin optique, la volonté de faisceau finalement rencontre l’interface liquide-solide formé par la lentille frontale d’un objectif immergé ou, si on utilise un objectif de l’air, l’eau-air interface au-dessus de l’échantillon. Ces interfaces reflétera les ondes acoustiques à l’échantillon, produisant des ondes stationnaires (voir Figure 1). Pour atténuer ou éviter ces réflexions, il est conseillé de positionner le capteur avec un angle oblique en ce qui concerne le trajet optique.
L’utilisation de polyester-bas pétri non seulement minimiser les réflexions acoustiques produites par le fond plats de culture en plastique épais, elles permettent aussi l’expérimentateur stimuler l’échantillon du dessous avec un microscope vertical. Il s’agit d’une configuration préférable par rapport à un microscope inversé à positionner un transducteur immergé avec une orientation oblique en ce qui concerne le trajet optique.
Ce protocole est conçu pour une utilisation avec transducteurs d’ultrasons focalisés, mais expérimentateur peut également utiliser des transducteurs d’ultrasons (planaire) axée sur la non ainsi. Notez que, étant donné que LIPUS est destiné à une stimulation précise des zones souhaitées dans le tissu, transducteurs d’ultrasons focalisés sont généralement préférées pour des applications aussi bien in vitro et in vivo . Faisceaux acoustiques produites par capteurs planaires est également plus larges, rendant plus difficile de réduire les reflets et autres objets mécaniques.
La zone focale d’un transducteur à ultrasons seul élément porté dépend de nombreux paramètres tels que le diamètre de l’élément, la fréquence acoustique et la vitesse du son des matériels de multiplication de la. Pour un transducteur MHz standard, le domaine d’intervention est généralement confiné dans une région millimétrique ou Sub millimétrique. Un compromis existe entre la taille de la zone focale et de la capacité du faisceau acoustique de pénétrer à l’intérieur du tissu, sans trop de perte en raison de l’atténuation : plus la fréquence est élevée, plus la zone focale mais plus la pénétration est le plus faible.
Pour stimuler efficacement les cellules visualisées au microscope, la zone focale acoustique du transducteur doit se chevaucher avec optique plan focal de l’objectif. Dans ce but, il est nécessaire d’aligner avec précision le faisceau acoustique à l’aide d’un hydrophone disponible dans le commerce. Il existe deux principaux types d’hydrophones : aiguilles hydrophone et systèmes à fibres optiques. Les deux types peuvent être utilisés. Au cours de l’alignement, il est important de s’assurer que l’intensité acoustique est dans les limites de pression de l’hydrophone et que la fréquence de la sonde est dans la gamme de fréquences de la sensibilité de l’hydrophone.
Utilisez l’étalonnage fourni par le fabricant (si disponible) pour convertir la tension de sortie d’amplitude de l’hydrophone en pression acoustique réelle (hydrophones sont habituellement étalonnés avec un numéro à V Pa-1 ou des appareils similaires). Hydrophones ont aussi généralement une orientation préférentielle (directivité) en ce qui concerne le faisceau acoustique, c’est pourquoi il est préférable de positionner l’hydrophone dans la même direction de l’axe acoustique. Si ce n’est pas possible, hydrophones peuvent avoir un graphique d’atténuation vs angle directionnel, permettant la correction après directionnelle après que les mesures ont été prises.
Alignement du faisceau peut être une tâche frustrante, surtout lorsque vous utilisez un capteur avec une étroite zone focale. Le signal de l’hydrophone doit apparaître avec un retard en ce qui concerne le pouls du transducteur de conduite. Ce délai correspond au temps mis par l’échographie pour se rendre de la surface du transducteur la sonde de l’hydrophone (dans l’eau, ondes sonores voyage à une vitesse d’environ 1 500 m s-1) (voir la Figure 4). Remarque que le retard de RF des signaux voyageant par l’intermédiaire de câbles électriques est petite, seulement environ 3 ns m-1, qui, en l’espèce, peuvent être ignorées sans risque. Un moyen de tester si le faisceau est bien aligné consiste à calculer la distance entre le transducteur et hydrophones utilisant le retard mesuré à l’oscilloscope et la vitesse du son connue dans l’eau. Par exemple, un retard d’environ 17 µs est attendu pour un transducteur avec une longueur focale de 25 mm.
Si l’utilisation d’hydrophone commerciale n’est pas possible (par exemple, la fréquence inhabituelle transducteur assortis ne pas hydrophones ou espace limité pour le placement de l’hydrophone), le faisceau acoustique peut être aligné avec l’impulsion de l’écho méthode20. Ceci est habituellement fait en plaçant d’abord un petit objet réfléchissant d’une taille similaire ou plus petit que le diamètre du faisceau du transducteur dans le focus dans le champ de vision de microscope. Le transducteur est ensuite utilisé comme émetteur acoustique (pour envoyer des impulsions de l’échographie) et récepteur (pour détecter l’écho de l’objet réfléchissant). Notez que dans cette configuration, un amplificateur dédié est nécessaire pour amplifier le signal plutôt faible écho qui sortent du transducteur.
Bon fonctionnement des instruments RF, il est important que tous les câbles et les connexions aux instruments ont une impédance électrique correspondante, sinon les indésirables réflexions électriques vont se produire et modifier la forme d’onde électrique. C’est habituellement le cas avec la plupart des câbles baïonnette Neill-Concelman (BNC) et les équipements RF ayant 50 impédance Ω. Certains oscilloscopes, cependant, ont une haute impédance d’entrée de 1 MΩ et refléteront donc qu'un signal RF alimentés par un Ω 50 câble BNC. Dans ce cas, un terminateur de repiquage 50 Ω simple doit être inséré entre l’extrémité du câble BNC et l’entrée de l’oscilloscope pour terminer correctement le signal sans perte.
Techniquement, cette méthode est limitée par l’instrumentation utilisée pour délivrer des impulsions de l’échographie et d’effectuer l’imagerie de fluorescence. Par exemple, un microscope à fluorescence de photon unique standard permettrait seulement d’imagerie des échantillons à deux dimensions. Toutefois, il peut effectuer l’imagerie LIPUS plus complexe des échantillons en trois dimensions comme des tranches de cerveau ou de petits organes utilisant l’excitation multiphotonique.
Un autre défi avec des expériences LIPUS est de distinguer mécanique contre les effets thermiques par faisceaux acoustiques. Un déplacement mécanique oblique vers le chemin optique peut être détecté s’il déplace l’image dans l’axe de l’avion (x, y) ou défocalise l’échantillon dans l’axe z. Ces déplacements dépendent de la résolution optique combinée de la caméra et l’objectif. En outre, que ces mouvements se produirait seulement au cours de la sonication, il faudrait utiliser une cadence assez élevée pour synchroniser le chevauchement temporel entre la durée de l’exposition et le pouls caméra.
Afin d’étudier les effets thermiques induits par les ultrasons, les sondes de physique utilisation conventionnelle pour mesurer la température n’est pas recommandé à cause de vibrations inévitables de la sonde. Cependant, la technique décrite ici est bien adaptée pour mesurer les variations de température à l’aide de reporters de fluorescence codé génétiquement thermosensibles ou thermosensibles colorants21,22. À l’avenir, comme reporteurs fluorescents biocompatibles deviennent disponibles, cette technique permettra l’étude des effets des ultrasons sur nombreux autres paramètres biophysiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les Drs Mikhail Shapiro et Nikita Reznik de discussions fructueuses. Ce travail a été soutenu par des fonds de démarrage de la Western University of Health Sciences et NIH grant R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
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