Summary
Низкоинтенсивного импульсного УЗИ стимуляции (LIPUS)-это механизм для неинвазивной механической стимуляции эндогенной или инженерии клетки с высоким пространственным и временным разрешением. Эта статья описывает, как реализовать LIPUS epi флуоресцентным микроскопом и как минимизировать акустическая разночтений по УЗИ пути для предотвращения нежелательных механические артефакты.
Abstract
Сосредоточив ультразвук малой интенсивности импульсов, которые проникают мягких тканей, LIPUS представляет перспективных биомедицинских технологий удаленно и безопасно управлять нервных стрельбы, гормональной секреции и генетически перепрограммировать клетки. Однако перевод этой технологии для медицинских применений в настоящее время сдерживается отсутствием биофизических механизмов, с помощью которого направлены тканей чувство и реагировать на LIPUS. Подходящие подход для выявления этих механизмов будет использовать оптические биодатчики в сочетании с LIPUS для определения, лежащие в основе сигнальных путей. Однако реализация LIPUS флуоресцентным микроскопом может ввести нежелательных механических артефактов вследствие наличия физических интерфейсов, которые отражают, поглощать и преломляют Акустические волны. Эта статья представляет пошаговую процедуру для включения LIPUS имеющиеся вертикально epi флуоресценции Микроскопы минимизируя влияние физических интерфейсов для акустических пути. Простая процедура описана работать один элемент ультразвукового датчика и довести зоне фокуса преобразователя в объективных координационным центром. Использование LIPUS иллюстрируется примером транзиентов LIPUS-индуцированной кальция в клетки культивировали глиобластомы человека измеряется с помощью кальция изображений.
Introduction
Многие заболевания требуют некоторые формы инвазивных медицинского вмешательства. Эти процедуры часто дорогие, рискованно, требуют восстановления периоды и таким образом добавить бремя для систем здравоохранения. Неинвазивная терапевтические механизмы имеют потенциал для обеспечения альтернатив безопаснее и дешевле обычных хирургических процедур. Однако текущий неинвазивные подходов, таких как фармакотерапии или транскраниальная магнитная стимуляция часто ограничены компромиссов между ткани проникновения, пространственно-временных резолюции и нежелательных эффектов пробить. В этом контексте фокусированного ультразвука является перспективной технологии неинвазивные с потенциалом для манипулирования биологических функций глубоко внутри ткани с высокой точностью пространственно-временных и ограниченных пробить эффектов.
Фокусированный ультразвук разрушает стимуляции состоит из доставки акустической энергии в точных местах глубоко внутри живых организмов. В зависимости от параметров акустических импульсов эта энергия может иметь множество медицинских применений. Например пищевых продуктов и медикаментов одобрил использование высокой интенсивности ультразвука направлены (HiFU) на тепловой аблация опухолей предстательной железы, вызывая дрожь мозга регионов, миома матки и вызывая боли нервных окончаний в костных метастазов1 . Кавитация при посредничестве HiFu СРТ используется также для временно открыть blood - brain барьер для целенаправленной доставки системно ведении терапии2. Пульс средняя интенсивность пространственных пик (яАЮП) и пространственных пик височной средняя интенсивность (яЗИП) используется для HiFU приложений, как правило, выше несколько кВт см-2 и производят пульсовое давление несколько десятков МПа. Эти значения интенсивности являются намного выше FDA утвержденных яАЮП и яЗИП ограничения для ультразвуковой диагностики, 190 W см-2 и 720 МВт см-2, соответственно3. Напротив недавние исследования показали что неразрушающего импульсных ультразвуковых стимуляции, которые находятся в пределах или вблизи предела ограничения интенсивности ультразвуковой диагностики (LIPUS) может быть эффективным удаленно и безопасно управлять нейронных стрельбы4, 5,6,7,8, гормональной секреции9,10 и биоинженерных клеток11. Тем не менее клеточном и молекулярном механизмы, в которых клетки воспринимают и отвечают к УЗИ остаются неясными, исключающие клинический перевод LIPUS. Таким образом за последние несколько лет, исследования искусственных оболочек, культивируемых клеток и животных стимулируется с УЗИ получили импульс раскрыть биофизических и физиологических процессов модулированные LIPUS12,13, 14,15.
Звук состоит из колебаний, распространяющихся через физический носитель. УЗИ является звук с частотой выше человека слышимого диапазона (то есть, выше 20 кГц). В лабораторных условиях, ультразвуковые волны обычно производятся пьезоэлектрические преобразователи, которые содержат материал, который вибрирует в ответ на колеблющиеся в конкретной полосы пропускания высокой частоты электрического поля. Существует два типа датчиков: совмещенные преобразователи и датчики массивы. Единственный элемент пьезоэлектрические преобразователи имеют изогнутые поверхности, которая действует как фокусирующей линзы и следовательно концентратов акустической энергии в определенную область под названием зоне фокуса. Одноэлементные преобразователи намного дешевле и легче работать, чем массивы датчика. Эта статья будет сосредоточена на одноэлементных преобразователей.
Размер фокуса зоны целенаправленной один элемент датчика зависит от геометрических свойств акустические линзы и акустические частоты. Для достижения миллиметр размер зоны фокуса с одного элемента датчика, обычно требуются ультразвуковые частоты в диапазоне МГц. К сожалению акустических волн на такой частоте являются очень быстро ослабленного при распространении в разреженной среды как воздух. Таким образом МГц ультразвуковые волны необходимо создаются и распространяются на образец в плотный материал, например воды. Это является первой задачей в деле интеграции механизма LIPUS микроскопом.
Вторая задача заключается в минимизации физические интерфейсы между материалами с различных акустических импедансов, (который является продуктом плотности материала и акустическая скорость) вдоль акустического пути. Эти интерфейсы могут отражать, преломляют, точечной и поглощать акустических волн, что делает его трудно подсчитать количество акустической энергии, эффективно доставлен образец. Они также могут создавать нежелательные механические артефакты. Например размышления производится перпендикулярно акустическая несоответствие импеданс интерфейсы создания backpropagating волны, которые мешают те распространяющихся вперед. По пути вмешательства волны компенсируют друг друга на фиксированных регионах пространств под названием узлов и суммировать в чередующихся регионов под названием анти узлов, создание так называемого стоячие волны (рис. 1). Это важно для экспериментатор иметь возможность контролировать или устранить эти экспериментальные интерфейсов в пробирке , как они не могут существовать в естественных условиях.
Флуоресценции измерение оптических журналистов является известный метод допросить прозрачный биологических образцов в режиме реального времени и с без физического воздействия. Таким образом, этот подход идеально подходит для LIPUS исследований, как любой физической зондов, в районе sonicated представит механических артефактов. Этот протокол описывает внедрение и эксплуатация LIPUS для коммерческих epi флуоресцентным микроскопом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. рост клеток на акустически прозрачной полиэфирной пленки
- Просверлите отверстие размером 12 мм в нижней части стандартного 35-мм культуры блюдо с помощью вертикальный пресс сверла. Медленно сверла и носить для защиты глаз. Удалите кусочки пластика, на дно посуды с помощью лезвия для создания гладкой поверхности на внешней стороне (рис. 2).
- Нанесите тонкий слой эпоксидной морской класса или клея на внешней нижней поверхности блюдо.
- Место фильм полиэстера (толщина 2,5 мкм) против внешней нижней поверхности блюдо и с усилием нажмите чтобы убедиться, что Клей эпоксидный равномерно между пленкой и толстые пластиковые поверхности. Осторожно потяните фильм в духе центробежные пальцами для создания плоской поверхности (рис. 2).
- Когда высохнет эпоксидной/клей, кратко промыть сухой полиэстер нижней блюдо с 95% этиловом спирте и стерилизовать, поместив блюдо и внутренней поверхности крышки под сильным источником возбуждения 254 Нм УФ. Настройка длительности и интенсивности доставить дозу УФ приблизительно 330 МДж см-2 для полного разрушения большинства типов микро-организмов. Эта энергия приблизительно соответствует продолжительностью 5 мин, используя 1000 мкВт см-2 УФ освещения.
- Аликвота коммерчески доступных внеклеточная матрица смеси протеина (EMPM) в трубочки (50-100 мкл) и хранить их при-20 ° C или меньше, в стерильных условиях.
- В стерильных условиях (например, внутри биобезопасности кабинета) разбавляют замороженных запас EMPM с желаемой культуры среднего масштаба 1: 100. Работа на льду для предотвращения EMPM полимеризации при комнатной температуре. Быстро применить 100 мкл средних смеси на полиэфирной пленки. Установите крышку обратно на блюдо для поддержания стерильности.
- Инкубируйте EMPM-покрытием полиэстер дно блюда в клетки инкубатор культуры CO2 при 37 ° C для 6-12 ч.
- После инкубации аспирационная превышение среднего и непосредственно семян поверхности с клетки на желаемой плотности. Работа в стерильных условиях для поддержания стерильности.
2. LIPUS осуществление
- Поместите резервуар для воды под цели вертикальном положении микроскопа с большой объем работы и без подсветки оборудования в пути передачи.
- Использование коммерчески доступных оптико компонентов, место держатель образца ниже цели и держатель датчика под держатель образца. Последующие примеры поиска и УЗИ выравнивание смонтируйте эти два держателя на этапы перевода.
- Место движущихся частей и приводов этапы перевода снаружи цистерны или выше линии воды, чтобы избежать повреждения водой. Используйте только неагрессивных материалов, таких как из анодированного алюминия или нержавеющей стали для погружных оптико компонентов.
- Заполните бак с дейонизированной и дегазации воды перед использованием погружения датчика. Линия воды должна совпадать с горизонтальной плоскости держателя образца (рис. 3).
Примечание: Деионизированная вода предотвращает электрической соединительной в присутствии высоких электрических полей. Дегазация также поможет избежать рассеяния и изменения акустических волн. Слить воду после каждого эксперимента, с помощью насоса или клапан, так что линии воды падает ниже позиции датчика. Кроме того заменить или часто фильтрации воды и очистки резервуара для воды, необходимо, чтобы избежать роста микроорганизмов.
3. наклонная акустического возбуждения
- Использование коммерчески доступных оптико компонентов, ориентации датчика в наклонное положение в отношении оптического пути. Это будет гарантировать, что любой отражает волны будет направлен в сторону от образца (рис. 3 и рис. 4).
4. вождение преобразователя
Примечание: Ультразвуковые преобразователи преобразования осциллируя электрической энергии в механическое расширение/сжатие пьезоэлектрического материала. Это преобразование производит потери энергии в виде тепла. Таким образом в то время как преобразователи имеют ограничение входного напряжения пик, они также обладают максимальным электрической мощности чтобы избежать теплового повреждения пьезоэлектрического элемента:
с обязанность цикла относительную долю времени электрических моделирования, P электрическая мощность (в ваттах), Vrms входного корень значит квадрат напряжения (в вольтах) альтернативных напряжения источника и Z электрические Импеданс (в ом).
с Vpp пик пик входного напряжения датчика.
- Создайте форму синусоиды, содержащий нужную частоту, количество циклов в пульс, и частота повторения с использованием коммерческих функции генератора импульсов. Однако относительно высокая Vpp необходимо эффективно управлять стандартных ультразвуковых преобразователей часто требует добавлением усилитель для усиления выходных данных (то есть, увеличение амплитуды Vpp) функции генератора.
Примечание: например, датчик Производитель указывает ограничение мощности для данного преобразователя является 35 Вт. Будет синусоидального пик пик входное напряжение (Vв) 500 мВ на обязанность цикла 50% и усиливается через 50 дБ/100 Вт усилитель в пределах этого преобразователя питания?- Чтобы ответить на этот вопрос, рассчитайте напряжения после усиления. Для усилителя мощности радиочастотного (RF) определяется коэффициент усиления (дБ):
Таким образом, усиливается напряжение имеет амплитуду выходного Vpp (Vpp = Vout) из:
С помощью уравнения 1 и 2 и с использованием 50 Ω как импеданс, соответствующий этой напряжения способен:
Эта стимуляция – поэтому в пределах лимита мощности преобразователя. - Используя приведенный выше пример, вычислить параметры сигнала (Vpp, частоты, длительности импульса и частота повторения импульсов), которые соответствуют ограничения мощности и напряжения, предоставленного изготовителем преобразователя. Убедитесь в том уважать эти ограничения, чтобы избежать повреждения датчика и других подключенных устройств.
- Чтобы ответить на этот вопрос, рассчитайте напряжения после усиления. Для усилителя мощности радиочастотного (RF) определяется коэффициент усиления (дБ):
- Выбор функции генератора, который работает в диапазоне частот, совместимый с ультразвуковой датчик. Отрегулируйте частоту функции генератора на Номинальный пиковый частоту датчика.
- Создайте синусоидального напряжения импульса требуемой продолжительности и частоте повторения, используя пакетный режим функции генератора. Отрегулируйте пик пик напряжения до желаемого значения. Убедитесь, что короче, чем время, прошедшее между двумя подряд импульсы Длительность импульса.
- Убедитесь, что сигнал соответствует желаемого сигнала путем соединения выхода функции генератора на вход осциллографа.
- Соедините выход функции генератора к входу ВЧ усилитель мощности (Рисунок 4). Убедитесь, что параметры стимуляции находятся в пределах преобразователя производителя.
5. пучка выравнивание
- Выберите гидрофонов, который работает с частоты диапазона и акустической интенсивности, совместимым с частотой и ультразвукового преобразователя.
- Тщательно принести кончик зонда гидрофонов в центре внимания в рамках объективного поле зрения в позиции, соответствующей позиции образца (рис. 4).
- Убедитесь, что зонд и датчика погружаются в дейонизированной и дегазации воды. Не удар кончик гидрофон с любым физическим объектом, кроме воды, как это будет изменить его покрытия и влияют на измерение.
- Выполнение брутто предварительного выравнивания датчика визуально размещения своей акустической оси сторону гидрофонов зонд. Гарантирует, что расстояние между поверхностью датчика и кончик гидрофонов примерно соответствуют Фокусное расстояние датчика.
- Соедините выход одной из входного сигнала осциллограф гидрофонов. Подключите триггер синхронизации от функции генератора к другой вход осциллографа. Визуализируйте обоих сигналов одновременно на осциллограф.
- Привод датчика с несколько циклов УЗИ на низкий рабочий цикл и низкой амплитуде, чтобы избежать повреждения датчика. Проверьте с условиями безопасной эксплуатации производителя гидрофонов, чтобы избежать повреждения кончик гидрофонов.
- Отрегулируйте ручку s/отдел согласно время в пути ультразвука от поверхности преобразователя для гидрофонов. Ищите гидрофонов сигнала на осциллограф после синхронизации триггера.
- Медленно нажать датчика с помощью моторизованных или ручной XYZ этап. Оставьте преобразователя в положение, соответствующее максимальной гидрофонов сигнал (рис. 4).
Примечание: Если сигнал не обнаружен, возможно, слишком низкая интенсивность акустических импульсов или что луч неправильно выровнены или разбросаны по объекту. Регулярно проверяйте, что гидрофонных и датчика визуально предварительно согласованы и что без пузырей или физический объект, присутствуют в пути за исключением полиэфирная пленка. Если сигнал не обнаруживается до сих пор, увеличение входного напряжения на небольшую сумму, чтобы увеличить амплитуду сигнала гидрофонов.
6. Определение ультразвуковых импульсов давления и интенсивности
- С краю пучка Измерьте пик пик амплитуда гидрофонов выход на осциллограф для различных напряжений, вождение преобразователя. Убедитесь в том, не должен превышать предел давления, рекомендованные производителем гидрофонов.
- Преобразуйте эти измерения давления и/или акустической интенсивности значения с помощью метода калибровки гидрофонов производителя.
Примечание: Акустической интенсивности может быть определен от давления и наоборот, используя формулу:
с я уровень звукового давления (в Вт м-2), P уровень звукового давления (в Pa), ρ плотность распространения материалов (1000 кг м-3 для воды) и c скорость звука в распространении среднего (для воды, c = 1500 m s-1). - Создайте калибровочных кривых, используя эти измерения.
Примечание: Давление против напряжения и интенсивности против напряжения кривых имеют линейной и Параболическая форма, соответственно. - Определите значение давления и/или интенсивности вождения напряжения с помощью соответствующей калибровочной кривой.
7. кальция чувствительных/LIPUS клеток флуоресцентным изображений
- Замените желаемого изображения буфер, содержащий 5 мкм клеток permeant кальция чувствительных красителя ячейки питательной среды (например, Fluo-4 утра). Инкубируйте культуры блюдо в инкубатор CO2 при 37 ° C за 1 час.
- Тщательно вымойте клетки с тот же буфер бесплатно красителя.
- Поместите блюдо в держателе образца. Возбуждают клетки, используя синий свет освещение (490 Нм) и отрегулируйте интенсивность и камеры подверженности возбуждения избежать чрезмерного насыщения отбеливание или пиксель.
- Выполняйте покадровый изображений, используя параметры приобретения желаемого изображения. Используйте цель погружения с большим рабочим расстоянием и лучшее качество изображения для уменьшения нежелательных отражений (см. Рисунок 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 5 приведен пример LIPUS эксперимента мультиплексированием с кальция изображений. Глиобластома клетки (A-172) были выросли на EMPM покрытием полиэфирной пленки в стандартной среде культуры (дополнена 10% сыворотки и 1% антибиотиков) и инкубировали с кальция чувствительных флуоресцентные репортер Fluo-4 утра. Клетки были образы с помощью 10 X объектив погружения и освещенной с белый светодиодный источник света, и свет Флуоресцирование была собрана с помощью стандартного набора фильтров GFP. LIPUS была применена вручную, ведя преобразователь 4 МГц с импульсного сигнала 158 пик пик амплитуда V, длительность импульса 0,1 мс и частота повторения импульсов 10 мс (т.е. 1% рабочий цикл). Эти параметры соответствуют яАЮП = 88 Вт см-2 (ниже диагностических предела см 190 W-2)иЗИП = 877 МВт см-2 (чуть выше диагностических предел 720 МВт см-2), соответственно. Результаты показывают, это стимулирование производства надежных кальция фасады (Рисунок 5B, 5 C, 5 D).
Для короткого импульса длительностей (т.е., с без существенных тепла во время пульс) и предполагая теплоемкость образца (т.е. клетки, выращенных на полиэфирной пленки и погружается в водном растворе) похож на воды, изменение Температура (∆TМакс) производится во время каждого импульса может быть оценена путем16
при длительности импульса 0.1 ms и интенсивность импульсов 88 Вт см-2
∆TМакс = 0,12 x 0.0001 x 88 ≈ 1 м ° C
с 1% рабочий цикл небольшое количество тепла, депонированных в зоне фокуса во время каждого импульса 0.1 ms вероятно удалены путем теплопроводности в 9,9 мс, растянутым между двух последовательных импульсов. Следовательно надежные кальция сигналы показано на Рисунок 5B, 5 C, 5 D скорее индуцированных механизм(ы)-тепловой.
Рисунок 1: формирование стоячей волны в отражающей интерфейс. Наличие интерфейса между материалами с различными Импеданс акустических отражает входящие волны давления (синий) с длиной волны λ. Поскольку обе волны распространяются в противоположных направлениях, устанавливается осциллируя фазовый сдвиг. Сверху: в это время, фазовый сдвиг составляет 180°, производство разрушительного вмешательства стоячей волны ("Зеленая волна"). Среднего: После волны перемещается на расстояние соответствующее λ/4 в отношении верхней панели, фазовый сдвиг равен null и обе волны усиливают через конструктивного вмешательства, производство стоячей волны выше амплитуды. Дно: После волны перешли дополнительное расстояние λ/2 (следовательно в общей сложности λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ от верхней ссылки), становится сдвиг фазы null снова, производя стоячей волны высокой амплитуды, но с обратной полярности. Обратите внимание, что некоторые позиции в пределах пути постоянного давления null (узел, черные круги) то время как другие должности постоянно колеблются между минимальным и максимальным давлением (antinodes, зеленые круги). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: рост клетки на акустически прозрачной полиэфирной пленки. На рисунке показано в нижней части блюдо 35 мм с большой 12 мм отверстие в ее центре. Отверстие впоследствии покрыта тонкой полиэфирная пленка. Фильм прочно приклеены к внешней нижней части блюдо с использованием морского класса эпоксидной смолы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: осуществление ультразвуковая установка в вертикальном флуоресцентным микроскопом. По индивидуальному заказу резервуар помещается под микроскопом вертикально флуоресценции без передачи освещения оборудования. Моторизованный образца держатель под цель прилагается к оптико компонентов крепится к таблице вибрации снаружи танка. Преобразователя расположены под образца и прилагается к стадии перевода прикреплены к оптико компонентов внутри бака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: схема всего set-up. Установка включает в себя вертикально флуоресценции Микроскоп epi флуоресценции позволяющие флуоресценции изображений культивируемых клеток. Датчика показано с косой ориентации в отношении оптического пути. Эта конфигурация позволяет избежать обратной отражения акустических волн на акустических пути, таким образом предотвращая формирование стоячей волны или повторяющихся стимуляции образца с несколькими ультразвукового эхо. Желаемого сигнала производится функции генератора, которые могут быть вручную включена или электронным вызваны компьютерного интерфейса (транзистор-транзистор-логики или Universal Serial Bus). Амплитудой и задержкой сигнала измеряется гидрофонов иглы (красный) могут быть проанализированы с помощью осциллографа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: пример LIPUS-индуцированной кальция сигналов в человека глиобластома клеток A-172. (A) изображения Raw флуоресценции клеток A-172 вырос на 35 мм полиэстер дно культуры блюдо и загружен с помощью клеток permeant версии кальция индикатор Fluo-4. Красные следы представляют границы ячейки автоматически определены компьютерной программой и помечены как регионы интереса (ROI). (B) время курс изменения относительной флуоресценции (Ft-F0/f0или ΔF/F0) для каждого ROI в ходе эксперимента LIPUS. Изображения были приобретены со скоростью 1 кадра в секунду стандартной камеры CCD и LIPUS был применен для 10 s между 20 и 30 кадров. LIPUS сигнала состоит из 100 µsec импульсов, содержащие 400 циклов на 4 МГц и повторяется каждые 10 мс 10 s. участок (C), показаны время курс средней ΔF/F0 рассчитывается для всех трансформирования (планки погрешностей не показано). (D) участок показаны процентили ROI экспонируется0 ΔF/F выше порога активации пользователем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основным преимуществом фокусированного ультразвука является его способность неинвазивно доставить механических и/или тепловой энергии в биологических образцов с высокой точностью пространственно временной. Другие методы, предназначенные для механически стимулировать клетки обычно используют инвазивных физических датчиков (например, клетки тыкать) или требует взаимодействия лазерных пучков высокой энергии с посторонних предметов (например, Оптический пинцет). Магнитные Отопление может тепла определенных мест пространственных внутри биологических образцов, но требует присутствия иностранных магнитные наночастицы. С другой стороны точные неинвазивные Отопление небольших выборки (например, клеточных культур) в водной возможен с использованием инфракрасного или СВЧ возбуждения17,18,19.
Поскольку коммерческие системы выполнять УЗИ возбуждения в сочетании с микроскопии флуоресцирования не доступны, многие биофизиков создали настроенных систем, с учетом их конкретных приложений8,12 ,13,20. Внедрение таких систем может однако, трудно для неспециалистов. Эта статья описал основные операции водить фокусированного ультразвука луч к фокальную плоскость объективной вертикальном epi флуоресцентным микроскопом ограничивая акустическая размышления и стоячие волны артефактов, которые производятся на несоответствие акустическая Импеданс интерфейсы. Эти акустические артефакты не учитываются обычно явно в опубликованной литературе.
Если с помощью акустического луча, перпендикулярно оптической оси, луч будет в конечном итоге сталкиваются жидкость твердое интерфейс, образованный передней линзы погруженный цель или, если используется объективный воздуха, вода воздух интерфейс выше образце. Эти интерфейсы будут отражать акустических волн обратно к образцу, производство стоячих волн (см. Рисунок 1). Чтобы смягчить или избежать эти размышления, рекомендуется для позиционирования преобразователя с косым углом в отношении оптического пути.
Использование культуры полиэстер дно блюда не только минимизировать акустическая размышления, производимые дно блюда толстые пластиковые культуры, они также позволяют экспериментатор стимулировать образец из под с прямо микроскопом. Это предпочтительно конфигурация по сравнению с инвертированным микроскопом позиционировать погружения датчика с косой ориентации в отношении оптического пути.
Этот протокол предназначен для использования с фокусированного ультразвука преобразователи, но экспериментатор могут также использовать не сосредоточены (плоские) ультразвуковых преобразователей также. Обратите внимание, что, поскольку LIPUS предназначен для точного стимуляции желаемого областей внутри ткани, фокусированный ультразвук разрушает преобразователи обычно предпочтительным для приложений, как in vitro и in vivo . Акустический балки, производимые Вселенский преобразователи также шире, что делает его более трудным для уменьшения отражения и других механических артефактов.
Зоне фокуса один элемент сосредоточены ультразвукового преобразователя зависит от многих параметров, таких как элемент диаметр, акустические частоты и скорости звука размножаемый материал. Для стандартного датчика МГц области обычно ограничивается миллиметрового или югу миллиметрового региона. Существует компромисс между размером зоны фокуса и акустического луча способность проникать внутрь ткани без слишком много потерь вследствие затухания: чем выше частота, тем меньше зоне фокуса, но слабее проникновения.
Эффективно стимулировать клетки визуализированы под микроскопом, акустические зоны фокуса преобразователя должны перекрываться с оптической фокальной плоскости цели. С этой целью необходимо точно выровнять акустического луча, использование коммерчески доступных гидрофона. Существует два основных типа гидрофонов: гидрофонов иглы и волоконно-оптических систем. Можно использовать оба типа. Во время выравнивания важно, чтобы убедиться, что акустической интенсивности в пределах давления гидрофонных и что частота датчика в частотном диапазоне чувствительности гидрофонов.
Используйте калибровки, предоставляемых производителем (если доступно) преобразовать вывод амплитуды напряжения гидрофонов в фактических звукового давления (гидрофонов обычно откалиброван с номером в V ПА-1 или аналогичных единиц). Гидрофоны также обычно имеют преференциальный ориентации (направление) в отношении акустического луча, поэтому она предпочитает, чтобы позиционировать гидрофонов в том же направлении акустической оси. Если не возможно, гидрофоны могут иметь график затухания против направленного угол, позволяя направленная после коррекции, после того, как были приняты измерений.
Пучка выравнивание может быть разочарование задачи, особенно при эксплуатации преобразователя с узкой зоной фокуса. Гидрофонов сигнал появится с задержкой в отношении вождения датчика пульса. Эта задержка соответствует времени УЗИ путешествовать от поверхности преобразователя к гидрофонов зонда (в воде, звуковые волны путешествия со скоростью примерно 1500 m s-1) (см. Рисунок 4). Обратите внимание, что задержка RF сигналов, путешествующих через электрические кабели небольшой, только около 3 НС m-1, который, в данном случае, можно проигнорировать. Способ проверить если луч хорошо скоординированы должен рассчитать расстояние между преобразователем и гидрофонов, используя задержки измеряется на осциллограф и известных скорости звука в воде. Например задержка примерно 17 МКС ожидается для преобразователей с фокусным расстоянием 25 мм.
Если использование коммерческих гидрофонов не представляется возможным (например, необычные преобразователь частота с не соответствующими гидрофоны или ограниченное пространство для размещения гидрофонов), акустического луча может выравниваться с импульс эхо метод20. Обычно это делается путем первого размещения небольшой отражающий объект размера аналогичные или меньше, чем диаметр луча датчика в фокус в поле зрения микроскопа. Датчик используется как акустического излучателя (для отправки ультразвуковых импульсов) и приемника (для выявления эхо от отражающих объекта). Обратите внимание, что в этой конфигурации, посвященный усилитель необходимо усилить сигнал довольно небольшой эхо, выйдя из датчика.
Для бесперебойной работы инструментов RF важно, что все кабели и соединения к документам соответствующий импеданс, иначе нежелательных электрических размышления будут происходить и изменить электрического сигнала. Это обычно бывает с большинством штык Нейл-Concelman (BNC) Кабели и оборудование РФ, имеющие импеданс 50 Ω. Некоторые осциллографов, однако, имеют высокий входной импеданс 1 MΩ и таким образом будет отражать Радиочастотный сигнал подается через 50 Ω BNC кабель. В этом случае простой 50 Ω склеивающий Терминатор следует вставить между концом BNC кабель и вклад осциллограф правильно завершать сигнала без потерь.
Этот метод ограничен технически приборы, используемые для доставки ультразвуковых импульсов и выполнять флуоресценции изображений. Например стандартный Однофотонная флуоресценции Микроскоп только позволит визуализации двухмерной образцов. Однако он может выполнять более сложные LIPUS визуализации трехмерных образцов как срезы мозга или малые органы, с помощью нескольких Фотон возбуждения.
Еще одна проблема с LIPUS экспериментов является различать механические против тепловых эффектов, придали акустическая лучами. Механического перемещения косой для оптического пути могут быть обнаружены, если она смещает изображение в плоскости оси (x, y) или defocuses образец в оси z. Эти перемещения зависит от комбинированных оптическое разрешение камеры микроскопа и цели. Кроме того как эти ходатайства будет происходит только во время sonication, нужно было бы использовать частоту кадров, достаточно высока, чтобы синхронизировать временные перекрытия между камеры длительность экспозиции и импульса.
Расследовать УЗИ индуцированной тепловые эффекты, использование обычных физических зонды для измерения температуры не рекомендуется из-за неизбежных колебаний зонда. Однако метод, описанный здесь хорошо подходит для измерения изменений температуры, с использованием генетически закодированный термочувствительных флуоресценции Репортеры или термочувствительных красители21,22. В будущем как более биосовместимых флуоресцентные Репортеры стали доступны, этот метод позволит исследование ультразвуковое воздействие на многие другие биофизические параметры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Drs. Михаил Шапиро и Никита Резник за плодотворные дискуссии. Эта работа была поддержана начальных средств от Западного университета медицинских наук и низ Грант R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , World Neurosurgery. (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O'Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
