Summary
Låg intensitet pulsad ultraljud stimulering (LIPUS) är en modalitet för noninvasiv mekanisk stimulering av endogen eller modifierade celler med hög rumsliga och temporal upplösning. Denna artikel beskriver hur du implementerar LIPUS till ett epi-fluorescens Mikroskop och hur man kan minimera akustisk impedans obalans på ultraljud vägen att förhindra oönskade mekaniska artefakter.
Abstract
Genom att fokusera låg intensitet ultraljud pulser som penetrerar mjukdelar, representerar LIPUS en lovande biomedicinsk teknik för distans och säkert manipulera neurala bränning, hormonell utsöndring och genetiskt omprogrammerade celler. Översättningen av denna teknik för medicinska tillämpningar hämmas dock för närvarande av bristande biofysiska mekanismer genom vilka riktade vävnader känsla och bemöta LIPUS. En lämplig metod att identifiera dessa mekanismer skulle vara att använda optiska biosensorer i kombination med LIPUS för att fastställa underliggande signalvägar. Dock införa genomföra LIPUS till fluorescens Mikroskop oönskade mekaniska artefakter på grund av fysiska gränssnitt som återspeglar, absorberar och bryter Akustiskt vinkar. Denna artikel presenterar en steg för steg-procedur för att införliva LIPUS till kommersiellt tillgängliga upprätt påljusfluorescens Mikroskop samtidigt minimera påverkan av fysiska gränssnitt på akustisk vägen. En enkel procedur beskrivs att använda ett enda element ultraljudstransducern och föra transducern fokal zon i den objektiva brännpunkten. Användning av LIPUS illustreras med ett exempel på LIPUS-inducerad kalcium transienter i odlade mänskliga glioblastoma celler mäts med hjälp av kalcium imaging.
Introduction
Många sjukdomar kräver någon form av invasiv medicinsk intervention. Dessa förfaranden är ofta dyra, riskfyllda, kräver återhämtningsperioder och därmed lägga en börda till hälso-och sjukvårdssystem. Icke-invasiv terapeutiska modaliteter har potential att ge säkrare och billigare alternativ till konventionella kirurgiska ingrepp. Nuvarande icke-invasiva metoder såsom farmakoterapi eller transkraniell magnetisk stimulering är dock ofta begränsade av avvägningar mellan vävnad penetration, spatiotemporal upplösning och oönskade off-target effekter. I detta sammanhang utgör en fokuserad ultraljud en lovande icke-invasiv teknik med potential att manipulera biologiska funktioner djupt inne i vävnader med hög spatiotemporal noggrannhet och begränsade off-target effekter.
Fokuserat ultraljud stimulering består av att leverera akustisk energi på exakta platser djupt inne i levande organismer. Beroende på akustisk puls parametrar, kan denna energi ha en mängd olika medicinska användningsområden. Till exempel, har Food and Drug Administration godkänt användning av högintensivt fokuserat ultraljud (HiFU) för termisk ablation av prostatacancertumörer, tremor-orsakar hjärnregioner, myom och smärta-orsakar nervändar i skelettmetastaser1 . HiFu-medierad mikrobubblor kavitation används också övergående öppna den blood - brain barriären för riktade leverans av systemiskt administrerat therapeutics2. Spatial-topp puls-genomsnittliga intensiteten (jagsppa) och rumsliga-peak temporal-genomsnittet intensitet (jagspta) används för HiFU tillämpningar är vanligtvis över flera kW cm-2 och producera pulstrycket av flera tiotals MPa. Dessa intensitetsvärden är långt över den FDA-godkända jagsppa och jagspta gränser för diagnostiskt ultraljud, 190 W cm-2 och 720 mW cm-2, respektive3. Däremot har nyare studier visat att icke-förstörande pulsad ultraljud stimulering som är inom eller nära diagnostiskt ultraljud intensitet gränsvärden (LIPUS) kan vara effektivt att distans och säkert manipulera neurala skjuter4, 5,6,7,8, hormonell utsöndring9,10 och bioengineered celler11. De cellulära och molekylära mekanismer genom vilka celler känna och reagera på ultraljud är dock fortfarande oklart, utgör hinder för kliniska översättning av LIPUS. Därför, i de senaste åren, studier av konstgjorda membraner, odlade celler och djur stimuleras med ultraljud har fått fart att avslöja biofysiska och fysiologiska processer moduleras av LIPUS12,13, 14,15.
Ljud består av en vibration som förökningsmaterial genom ett fysiskt medium. Ett ultraljud är ljud med en frekvens över mänsklig hörbara intervallet (dvs. över 20 kHz). I laboratoriemiljö, är ultraljudsvågor allmänt produceras av piezoelektrisk givare som innehåller ett material som vibrerar som svar på ett elektriskt fält oscillerar i en särskild hög frekvens bandbredd. Det finns två typer av givare: inre elementet givare och givaren matriser. Enstaka element piezoelektrisk givare besitter en krökt yta som fungerar som en fokuserande lins och därmed koncentrerar akustisk energi in i en definierad region som kallas fokal zonen. Enstaka element givare är mycket billigare och lättare att manövrera än givaren matriser. Denna artikel kommer att fokusera på enstaka element givare.
Storleken på en fokuserad enda element givare fokal zon beror på akustisk linsen geometriska egenskaper och dess akustiska frekvens. För att uppnå en millimeter-storlek fokal zon med en enda element givare, erfordras ultraljud frekvenser i intervallet MHz i allmänhet. Akustiskt vinkar med sådan frekvens är tyvärr mycket snabbt försvagade när sprids i en svag medium såsom luft. MHz ultraljudsvågor behöver alltså, skapas och sprids till provet i ett tätare material såsom vatten. Detta utgör den första utmaningen i att integrera LIPUS modalitet till Mikroskop.
En andra utmaningen är att minimera fysiska gränssnitt mellan material med olika akustiska impedanser (som är en produkt av materialdensitet och akustiska hastigheten) längs den akustiska väg. Dessa gränssnitt kan reflektera, bryta, scatter och absorbera akustiska vågor, vilket gör det svårt att kvantifiera mängden akustisk energi effektivt levereras till ett urval. De kan också skapa oönskade mekaniska artefakter. Till exempel skapa reflektioner producerade vinkelrätt mot akustisk mismatch impedans gränssnitt backpropagating vågor som störa framåt-förökningsmaterial och kära. Längs sökvägen störningar avbryta vågorna varandra på fasta regioner av utrymmen som kallas noder och sammanfatta på alternerande regioner kallas anti noder, skapa så kallade stående vågor (figur 1). Det är viktigt för experimentalist för att kunna styra eller eliminera dessa experimentella gränssnitt in vitro som de inte kanske finns i vivo.
Fluorescens mätning av optiska reportrar är en välkänd metod för att förhöra transparent biologiska prover i realtid och med ingen fysisk störning. Detta tillvägagångssätt är således perfekt för LIPUS studier som någon fysisk sonder i sonicated området kommer att införa mekaniska artefakter. Det här protokollet beskriver genomförandet och driften av LIPUS till kommersiella påljusfluorescens Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. växande celler på akustiskt Transparent Polyesterfilm
- Borra ett 12 mm hål storlek längst ned i en vanlig 35 mm kultur maträtt med en vertikal tryck-borr. Flytta övningen långsamt och Använd ögonskydd. Ta bort bitar av plast fäst i botten av skålen med ett blad för att skapa en slät yta på den externa sidan (figur 2).
- Applicera ett tunt lager marine-grade epoxi eller lim på externa bottenytan av skålen.
- Placera en film av polyester (2,5 µm tjocklek) mot externa bottenytan av skålen och tryck fast Kontrollera epoxi/limmet sprids jämnt mellan filmen och tjock plast yta. Dra försiktigt filmen på en centrifugal sätt med fingrar för att skapa en plan yta (figur 2).
- När epoxy/limmet har torkat, kort sköljning-torr polyester-botten skålen med 95% etanol och sterilisera genom att placera skålen och insidan ytbehandla av lock under en stark 254 nm UV exciteringskälla. Justera längd och intensitet att leverera en UV-dos av cirka 330 mJ cm-2 för fullständig förstörelse av de flesta typer av mikroorganismer. Denna energi motsvarar ungefär en löptid på 5 min med en 1000 µW cm-2 UV belysning.
- Alikvotens kommersiellt tillgängliga extracellulär matrix protein blandningar (EMPM) i små rör (50-100 µL) och lagra dem vid-20 ° C eller mindre i sterila förhållanden.
- I en steril miljö (t.ex. inuti en biosäkerhet skåp), späd en fryst lager av EMPM med en önskad kultur medium till 1: 100. Arbeta på is för att förhindra EMPM polymerisation i rumstemperatur. Snabbt Tillsätt 100 µL av medellång blandningen på Polyesterfilm. Placera locket på skålen att upprätthålla sterilitet.
- Inkubera EMPM-belagd polyester botten rätter i en cell-kultur CO2 inkubator vid 37 ° C för 6-12 h.
- Efter inkubation, aspirera överskott medium och direkt utsäde ytan med celler på önskad täthet. Arbeta under sterilt skick att upprätthålla sterilitet.
2. LIPUS genomförandet
- Placera en vattentank under syftet med ett upprätt Mikroskop med stora arbetar volym och utan belysning hårdvara i sökvägen överföring.
- Använda kommersiellt tillgängliga optomechanical komponenter, placera en provhållare under målet och en givare hållare under provhållaren. För efterföljande prov Sök och ultraljud justering, montera dessa två innehavare på översättningen arrangerar.
- Placera de rörliga delarna och ställdon av översättningen arrangerar antingen utanför tanken eller ovanför vattenlinjen att undvika vattenskador. Använd endast icke-korrosiva material såsom eloxerad aluminium eller rostfritt stål för nedsänkt optomechanical komponenter.
- Fyll tanken med avjoniserat och avgasade vatten innan utnyttja nedsänkning givaren. Vattenlinjen bör sammanfalla med horisontalplanet av provhållaren (figur 3).
Obs: Avjoniserat vatten förhindrar elektrisk koppling i närvaro av höga elektriska fält. Avgasning kommer också förhindra spridning och förändringar av Akustiskt vinkar. Dränera vatten efter varje experiment med en pump eller en ventil så att vattenytan sjunker under placeringen av givaren. Även ersätta eller filtrera vatten ofta och städa upp vattentanken som behövs för att undvika tillväxt av mikroorganismer.
3. sneda akustiska magnetisering
- Använda kommersiellt tillgängliga optomechanical komponenter, orient givaren i en sned ställning med avseende på den optiska vägen. Detta kommer att säkerställa att någon reflekterade vågor kommer att riktas bort från provet (figur 3 och figur 4).
4. körning givaren
Obs: Ultraljud givare konvertera oscillerande elektrisk energi till mekaniska expansion/kontraktion av en piezoelektriska material. Denna omvandling ger energiförluster i form av värmeenergi. Därför, medan givare äger en maximal inspänning gräns, de besitter också en elektrisk ström gräns för att undvika termiska skador på de piezoelektriska elementet:
med plikt cykel den relativa bråkdel av tid av elektrisk simulering, P den elektriska strömmen (i watt), Vrms root-mean-square inspänningen (i volt) av alternativa spänningskälla och Z El impedans (i ohm).
med Vpp peak-to-peak inspänningen tillämpas på givaren.
- Skapa en sinussignal formulär som innehåller önskad frekvens, antal cykler per puls och puls upprepning frekvens via en kommersiell funktionsgenerator. Relativt hög Vpp behövs för att effektivt driva standard ultraljud givare ofta kräver dock tillägg av en förstärkare att förstärka utdata (dvs. ökning amplituden av Vpp) funktion Generator.
Obs: till exempel en givare tillverkare anger power gräns för en viss givare är 35 W. Kommer en sinusformad peak-to-peak inspänning (Vi) på 500 mV vid en plikt cykel på 50% och förstärks genom en 50 dB/100 W förstärkare vara inom den makt denna givare?- För att besvara denna fråga, beräkna spänningen efter förstärkning. För en radiofrekvens (RF) förstärkare definieras förstärkningsfaktor (dB):
Sålunda, förstärkt spänningen har en amplitud utdata Vpp (Vpp = Vut) av:
Använda ekvationer 1 och 2, och med 50 Ω som elektrisk impedans, är motsvarande kraften som genereras av denna spänning:
Denna stimulering är därför inom power gräns av givaren. - Med exemplet ovan, beräkna vågform parametrarna (Vpp, frekvens, pulslängd och puls upprepning frekvens) som motsvarar de ström och spänning gränser givarens tillverkaren. Se till att respektera dessa gränser för att undvika att skada givaren och andra anslutna instrumenten.
- För att besvara denna fråga, beräkna spänningen efter förstärkning. För en radiofrekvens (RF) förstärkare definieras förstärkningsfaktor (dB):
- Välja en funktionsgenerator som fungerar inom ett frekvensområde som är kompatibel med ultraljud givaren. Justera frekvensen av funktionen generatorn till nominella peak frekvensen av givaren.
- Skapa en sinusformad spänning puls av önskad varaktighet och upprepning frekvens med sekvenstagning funktion Generator. Justera topp-till-topp spänning till ett önskat värde. Se till att pulslängd är kortare än tid mellan två på varandra följande pulser.
- Kontrollera att vågformen motsvarar önskad signal genom att ansluta utdata från funktionsgenerator ingången på ett oscilloskop.
- Anslut utgången på funktionsgenerator till ingången på en RF förstärkare (figur 4). Se till att parametrarna stimulering är inom gränserna för givarens tillverkare.
5. beam justering
- Välja en hydrofon som driver med en frekvens räckvidd och akustisk intensitet kompatibel med frekvensen och intensiteten av ultraljud givaren.
- Försiktigt in spetsen på en hydrofon sond skärpa inom det objektiva synfältet på den position som motsvarar positionen för provet (figur 4).
- Kontrollera att både givaren och sond är nedsänkt i avjoniserat och avgasade vatten. Inte bump spetsen av hydrofon fysiska objekt än vatten eftersom detta kommer att förändra dess beläggning och påverka mätningen.
- Utföra en brutto före justering av givaren av visuellt positionering sin akustiska axel mot hydrofon sonden. Ser till att avståndet mellan givarens yta och hydrofon spets motsvarar ungefärligt till givarens brännvidd.
- Anslut den hydrofon utdata till en av oscilloskopets ingång. Anslut utlösaren synkronisering från funktionsgenerator till oscilloskop ingångskälla. Visualisera båda signaler samtidigt på oscilloskopet.
- Kör givaren med några ultraljud cykler vid en låg intermittens och låg amplitud att undvika att skada sonden. Kontrollera med den hydrofon tillverkaren säker drift villkor att undvika att skada hydrofon spetsen.
- Justera reglaget s/division enligt resatiden av ultraljud från givarens yta att hydrofon. Leta efter en hydrofon signal på oscilloskopet efter synkronisering utlösaren.
- Långsamt actuate givaren med en motoriserad eller manuell XYZ stage. Lämna givaren in i placera som korrelerar med maximal hydrofon signalen (figur 4).
Obs: Om ingen signal detekteras är det möjligt att intensiteten av de akustiska pulserna är för låg eller som balken mis justeras eller spridda av ett objekt. Kontrollera regelbundet att hydrofon och givaren är visuellt före arrangera i rak linje och att inga bubblor eller fysiskt objekt finns i vägen förutom Polyesterfilm. Om ingen signal detekteras fortfarande, öka inspänningen med en liten mängd att öka amplituden av hydrofon signal.
6. bestämning av ultraljud pulstrycket och intensitet
- Med balken linje, mäta peak-to-peak amplituden av den hydrofon utgång på oscilloskopet för olika spänningar driver givaren. Se till att inte överskrida den trycket av den hydrofon tillverkaren rekommenderade.
- Konvertera dessa mätningar i tryck och/eller akustiska intensitetsvärden med den kalibreringsmetod som tillhandahålls av den hydrofon tillverkaren.
Obs: Akustisk intensiteten kan bestämmas från de påtryckningar och vice versa med hjälp av formeln:
med jag akustiska trycket (i W m-2), Persson akustiska trycket (i Pa), ρ tätheten av förökningsmaterial (1000 kg m-3 för vatten) och c som rusas av solitt i föröknings medium (för vatten, c = 1.500 m s-1). - Skapa kalibreringskurvorna med hjälp av dessa mätningar.
Obs: Tryck vs. spänning och intensitet vs. spänning kurvorna har en linjär och paraboliska form, respektive. - Bestämma tryck och/eller intensitet av en önskad drivande spänning genom att använda motsvarande kalibreringskurvan.
7. kalcium-känslig/LIPUS Live-Cell fluorescens Imaging
- Ersätta cellens odlingsmedium med önskad imaging buffert innehållande 5 µM av ett cell-diffusionskoefficient kalcium känsliga färgämne (t.ex. Fluo-4 AM). Inkubera kultur skålen i en CO2 inkubator vid 37 ° C för 1 h.
- Noggrant tvätta cellerna med samma bufferten gratis av färgämne.
- Placera skålen i provhållaren. Excitera cellerna med blå ljus belysning (490 nm) och justera excitation intensitet och kamera exponering för att undvika överdriven blekning eller pixel mättnad.
- Utföra time-lapse bildåtergivning med önskad bild förvärv inställningar. Använda en nedsänkning mål för bättre bildkvalitet och med långa arbetsavstånd för att minska oönskade reflektioner (se figur 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 5 är ett exempel av LIPUS experiment multiplexade med kalcium imaging. Glioblastoma celler (A-172) var odlas på EMPM belagd polyester film i standard odlingsmedium (kompletteras med 10% serum och 1% antibiotika) och inkuberas med kalcium-känsliga fluorescerande reporter Fluo-4 AM. Cellerna var avbildats med en 10 X nedsänkning objektiv och belyst med en vit LED-ljuskälla och fluorescens ljus samlades använder en standarduppsättning med GFP filter. LIPUS tillämpades av manuellt genom att köra en 4 MHz givare med en puls vågform av 158 V peak-to-peak amplitud, 0.1 ms pulslängd och 10 ms puls upprepning frekvens (dvs 1% intermittens). Dessa parametrar motsvarar jagsppa = 88 W cm-2 (väl under den diagnostiska gränsen 190 W cm-2)och jagspta = 877 mW cm-2 (något över diagnostiska gränsen för 720 mW cm-2), respektive. Resultaten visar denna stimulering produceras robust kalcium förhöjda (figur 5B, 5 C, 5 D).
För kort puls är varaktigheter (dvs, med ingen betydande värmeavledning under puls) och förutsatt att värmekapaciteten av provet (dvs celler odlas på Polyesterfilm och nedsänkt i vattenlösning) liknande till det av vatten, ändringen av temperatur (∆Tmax) produceras under varje puls kan uppskattas av16
med pulslängd av 0.1 ms och puls intensitet 88 W cm-2
∆Tmax = 0,12 x 0.0001 x 88 ≈ 1 m ° C
med 1% intermittens sannolikt den lilla mängden värme sätts in vid zonen fokal under varje 0,1 ms puls bort av termisk ledning under 9,9 ms spännas mellan två på varandra följande pulser. Därför robust kalcium signaler ses i figur 5B, 5 C, 5 D är mest sannolikt orsakas av icke-termisk mekanismerna.
Figur 1: stående våg bildande på ett reflekterande gränssnitt. Förekomsten av ett gränssnitt mellan material med olika akustiska impedansen återspeglar en inkommande Pressa vinkar (blå) med en våglängd λ. Eftersom både vågor färdas i motsatta riktningar, etableras en oscillerande fasförskjutning. Toppen: vid denna tid, fasförskjutning är 180°, producerar destruktiv interferens av stående vågen (grön våg). Mellersta: Efter vågorna har flyttat ett avstånd motsvarande λ/4 med avseende på den övre panelen, fasförskjutning är null och båda vågorna förstärker via konstruktiva störningar, producerar en stående våg av högre amplitud. Botten: Efter vågorna har flyttat en ytterligare avstånd av λ/2 (därav totalt λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ från övre referensen), fasen Skift blir null igen, producerar en stående våg av hög amplitud men med Omvänd polaritet. Observera att vissa befattningar inom sökvägen har ett konstant null tryck (nod, svarta cirklar) medan andra befattningar ständigt pendlar mellan högsta och lägsta tryck (antinodes, gröna cirklar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: växande celler på akustiskt transparent Polyesterfilm. Figuren visar den nedersta delen av en 35 mm maträtt med en stor 12 mm hål i sitt centrum. Hålet är sedan täckt med en tunn Polyesterfilm. Filmen är ordentligt limmade till externa botten av skålen med marin kvalitet epoxi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: genomförandet av ett ultraljud set-up till en upprätt fluorescens Mikroskop. En skräddarsydd vattentank placeras under en upprätt fluorescens Mikroskop utan överförda belysning hårdvara. En motoriserad provhållaren placerad under målet bifogas optomechanical delar fast tabellen vibrationer utanför tanken. Givaren är placerad under provet och bifogas en översättning etapp fästs optomechanical komponenter inuti tanken. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Schematisk bild av hela set-up. Set-up innehåller ett påljusfluorescens upprätt fluorescens Mikroskop om du vill aktivera fluorescens avbildning av odlade celler. Givaren är visas med en sned orientering med avseende på den optiska vägen. Denna konfiguration undviker bakåt speglar akustiska vågor längs sökvägen akustisk, därmed förhindra stående våg bildas och/eller repetitiva stimulering av provet med flera ultraljud ekon. En önskad vågform är producerad av en funktionsgenerator som kan vara påslagen manuellt eller elektroniskt utlöses av ett datorgränssnitt (Transistor-Transistor-Logic eller Universal Serial Bus). Amplituden och fördröjning av signalen mätt med hydrofon nålen (röd) kan analyseras med hjälp av ett oscilloskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: exempel på LIPUS-inducerad kalcium signaler i mänskliga glioblastoma celler A-172. (A) Raw fluorescens bild av A-172 celler odlas på en polyester-botten 35 mm kultur maträtt och laddad med en cell-diffusionskoefficient version av kalcium-indikator Fluo-4. Rött spår representerar cellgränserna identifieras automatiskt av ett datorprogram och märkt som regioner av intresse (ROI). (B) tidsförloppet för relativa fluorescens förändring (Ft-F0f0, eller ΔF/F0) för varje ROI under en LIPUS experiment. Bilder har förvärvats vid en hastighet av 1 bildruta per sekund genom en vanlig CCD-kamera och LIPUS tillämpades för 10 s mellan ramar 20 och 30. LIPUS vågformen består av 100 µsec pulser som innehåller 400 cykler på 4 MHz och upprepas varje 10 ms för 10 s. (C) tomt visar tidsförloppet för den genomsnittliga ΔF/F0 beräknas för alla ROIs (felstaplar visas inte). (D) tomt visar percentilen av ROI uppvisar ΔF/F0 en användardefinierad aktiveringen tröskelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En stor fördel av fokuserat ultraljud är dess förmåga att leverera icke-invasivt mekanisk eller termisk energi till biologiska prover med hög plats och tid precision. Andra tekniker avsedda att mekaniskt stimulera celler brukar anställa invasiva fysiska sonder (t.ex. cell-PETA) eller kräver samverkan mellan hög energi laser balkar och främmande föremål (t.ex. optisk pincett). Magnetiska värme kan värma specifika rumsliga platser inuti biologiska prover men kräver närvaro av utländska magnetiska nanopartiklar. Däremot, exakt icke-invasiv uppvärmning av små prov (t.ex. cellkulturer) i vattenlösning är möjligt med hjälp av infraröd eller mikrovågsugn excitation17,18,19.
Eftersom kommersiella system kunna utföra ultraljud magnetiseringen i samband med fluorescensmikroskopi inte är tillgängliga, har många biophysicists skapat anpassade system anpassade till deras specifika program8,12 ,13,20. Genomförandet av sådana system kan dock vara svårt för icke-experter. Den här artikeln beskrivs grundläggande funktioner för att driva en fokuserad ultraljud stråle mot fokalplanet ett upprätt påljusfluorescens Mikroskop mål samtidigt begränsa akustiska reflektioner och stående vågor artefakter som produceras vid matchningsfel akustisk impedans gränssnitt. Dessa akustisk artefakter är vanligtvis uttryckligen beaktas inte i publicerad litteratur.
Om använder en akustisk strålen vinkelrätt mot den optiska vägen, balken ska i slutändan får vätska-solid gränssnittet bildas av den främre linsen ett nedsänkt mål eller, om ett air-mål används, gränssnittet vatten-luften ovanför provet. Dessa gränssnitt kommer att återspegla det akustiska vinkar tillbaka till provet, producerar stående vågor (se figur 1). För att mildra eller undvika dessa reflektioner, rekommenderas det att placera givaren med en sned vinkel med avseende på den optiska vägen.
Användning av polyester-botten kultur rätter inte bara minimera akustiska reflektioner produceras av tjock plast kultur rätter botten, de möjliggör även experimentalist att stimulera provet från undersidan med ett upprätt Mikroskop. Detta är en bättre konfiguration jämfört med en inverterade Mikroskop för att placera ett nedsänkt givare med en sned orientering med avseende på den optiska vägen.
Detta protokoll är utformad för användning med fokuserat ultraljud givare, men experimentalist kan använda icke-fokuserad (plana) ultraljud givare samt. Notera att, eftersom LIPUS är avsedd för exakt stimulering av önskade områden inom vävnad, fokuserat ultraljud givare är generellt att föredra för både in vitro- och in-vivo applikationer. Akustiska balkar produceras av planar givare är också bredare, vilket gör det svårare att minska reflektioner och andra mekaniska artefakter.
En enda element fokuserat ultraljud givare fokal zon beror på många parametrar såsom element diameter, akustisk frekvens och ljud hastigheten av förökningsmaterialet. Standard MHz givaren, är fokusområde vanligtvis begränsad i en region millimetric eller sub millimetric. En kompromiss finns mellan storleken på zonen fokal och akustiska balken förmåga att tränga in vävnad utan alltför mycket förlust på grund av Dämpning: ju högre frekvens, desto mindre den fokala zon men svagare penetration.
Att effektivt stimulera celler visualiseras under ett mikroskop, måste den akustiska fokala zon av givaren överlappa med optisk fokalplanet målet. I detta syfte är det nödvändigt att exakt anpassa akustiska balken använder en kommersiellt tillgänglig hydrofon. Det finns två huvudtyper av hydrofoner: hydrofon nålar och fiber optic system. Båda typerna kan användas. Under justering är det viktigt att se till att akustiska intensiteten är inom pressar gränserna för hydrofon och att frekvensen av givaren är inom den hydrofon känslighet frekvensområdet.
Använd den kalibrering som tillhandahålls av tillverkaren (om tillgängligt) för att omvandla spänningen amplitud utdata från hydrofon till faktiska akustiska trycket (hydrofoner är vanligtvis kalibrerade med ett nummer i V Pa-1 eller liknande enheter). Hydrofoner har också oftast en förmånliga orientering (riktningen) med avseende på den akustiska strålen, därav det är att föredra att placera hydrofon i samma riktning som den akustiska axeln. Om inte möjligt, hydrofoner kan ha ett diagram av dämpning vs. riktad vinkel, möjliggör riktad efter korrigering efter mätningarna har tagits.
Beam justering kan vara en frustrerande uppgift, speciellt när du använder en givare med en smal fokal zon. Hydrofon signalen ska visas med en fördröjning när det gäller pulsen körning givaren. Denna försening motsvarar den tid som Ultraljudet att resa från givarens yta till hydrofon sonden (i vatten, ljudvågor resa med en hastighet av cirka 1.500 m s-1) (se figur 4). Observera att fördröjningen av RF signalerar reser genom elektriska kablar är liten, bara ca 3 ns m-1, som i förevarande fall kan ignoreras. Ett sätt att testa om balken är väl i linje är att beräkna avståndet mellan givaren och hydrofon använder fördröjningen mäts vid oscilloskopet och den kända ljud hastigheten i vatten. Exempelvis väntas en fördröjning på cirka 17 µs givaren med en brännvidd 25 mm.
Om användningen av kommersiella hydrofon inte är möjligt (t.ex. ovanliga omformare frekvens med inte matchande hydrofoner eller begränsat utrymme för att placera hydrofon), akustisk balken kan justeras med puls-echo metod20. Detta görs vanligen genom första att placera en liten reflekterande föremål för en storlek liknande eller mindre än beam diameter givaren i fokus inom Mikroskop synfältet. Givaren används både som akustiska sändaren (att skicka ultraljud pulser) och mottagaren (för att upptäcka ekot från det reflekterande objektet). Observera att en dedikerad förstärkare i den här konfigurationen är nödvändigt att förstärka ganska liten echo signalen kommer från givaren.
För smidig drift av RF instrument är det viktigt att alla kablar och anslutningar till instrument har matchande elektrisk impedans, annars oönskad elektrisk reflektioner kommer att uppstå och förändra den elektriska vågformen. Detta är vanligtvis fallet med de flesta bajonett Neill-Concelman (BNC) kablar och RF utrustning med 50 Ω impedans. Några oscilloskop, men har en hög ingångsimpedans av 1 MΩ och således kommer att återspegla en RF-signal matas genom en 50 Ω BNC kabel. I detta fall införas en enkel 50 Ω foder-genom terminator mellan slutet av BNC kabeln och oscilloskopets ingång till korrekt avsluta signalen utan förlust.
Denna metod är tekniskt begränsad av de instrument som används för att leverera ultraljud pulser och utföra fluorescens imaging. Standard singel-photon fluorescens Mikroskop skulle exempelvis bara aktivera avbildning av tvådimensionella prover. Det kan däremot utföra mer komplexa LIPUS avbildning av tredimensionella prover som hjärnan skivor eller lilla organ använder flera photon excitation.
En annan utmaning med LIPUS experiment är att skilja mekaniska vs. termiska effekter förmedlas av akustiska balkar. En mekanisk förskjutning sneda till den optiska vägen kan upptäckas om det förskjuter bilden i planet axel (x, y) eller defocuses provet i z-axeln. Dessa förskjutningar beror på den kombinerade optisk upplösningen av mikroskopet kamera och syfte. Dessutom som dessa förslag skulle bara förekomma under ultraljudsbehandling, skulle man behöva använda en bildfrekvens som är tillräckligt hög för att synkronisera temporal överlappningen mellan kamera exponering och puls varaktighet.
För att undersöka ultraljud-inducerad termiska effekter, rekommenderas inte användning konventionella fysiska sonderna att mäta temperaturen på grund av oundvikliga vibrationer av sonden. Den teknik som beskrivs här är dock väl lämpade för att mäta temperaturförändringar med genetiskt-kodade värmekänslig fluorescens reportrar eller värmekänslig färgämnen21,22. I framtiden när mer biokompatibla fluorescerande reportrar blir tillgängliga, denna teknik gör det möjligt för studiet av ultraljud effekter på många andra biofysiska parametrar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Drs. Mikhail Shapiro och Nikita Reznik för givande diskussioner. Detta arbete stöds av nystartade fonder från Western University of Health Sciences och NIH bevilja R21NS101384.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , World Neurosurgery. (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O'Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
