Summary
Düşük yoğunluklu Geniş puls ultrason stimülasyon (LIPUS) yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile endojen veya mühendislik hücrelerinin non-invaziv mekanik uyarılması için bir yöntemi var. Bu makalede nasıl bir epi-floresan mikroskop LIPUS uygulanacağı ve akustik empedans uyuşmazlığı istenmeyen mekanik eserler önlemek için ultrason yol boyunca en aza indirmek nasıl açıklanır.
Abstract
Yumuşak dokulara nüfuz düşük yoğunluktaki ultrason darbeleri odaklanarak, LIPUS sinir ateş, hormon salgılanması ve genetik olarak yeniden programlanan hücreleri uzaktan ve güvenli bir şekilde işlemek için umut verici bir biyomedikal teknoloji temsil eder. Ancak, bu teknoloji tıbbi uygulamalar için çeviri şu anda tarafından hangi biyofiziksel mekanizmaları eksikliği doku anlamda hedef ve LIPUS için yanıt engel oluyor. Bu mekanizmalar tanımlamak için uygun bir yaklaşım sinyal yolları temel belirlemek için LIPUS ile birlikte optik biyosensörler kullanmak olacaktır. Ancak, LIPUS floresan mikroskop için uygulama yansıtmak, emer ve akustik dalgalar yetisiyle fiziksel arabirimleri varlığı nedeniyle istenmeyen mekanik eserler tanıştırayım. Bu makale LIPUS için piyasada bulunan dik epi-floresan mikroskoplar akustik yol boyunca fiziksel arabirimleri etkisini en aza indirerek dahil etmek için adım adım bir yordam sunar. Basit bir yordam bir tek öğeli Ultrason çevirici çalışmasına ve dönüştürücü odak bölge objektif odak noktası getirmek için tasvir edilmiştir. LIPUS kullanımı ile LIPUS kaynaklı kalsiyum geçişler kalsiyum Imaging'i kullanma ölçülen kültürlü insan glioblastoma hücrelerdeki örneği gösterilmektedir.
Introduction
Birçok hastalığın bazı formu invaziv tıbbi müdahale gerektirir. Bu yordamları çoğu kez pahalı, riskli, kurtarma dönemleri gerektirir ve böylece bir yük sağlık sistemleri için ekleyin. Non-invaziv tedavi yöntemleri konvansiyonel cerrahi işlemler daha güvenli ve daha ucuz alternatifler sunmak potansiyeline sahip. Ancak, farmakoterapi veya Transkraniyal Manyetik stimülasyon gibi güncel non-invaziv yaklaşımları kez ticaret-off doku penetrasyon, kronolojik zamanmekansal çözünürlük ve istenmeyen hedef kapalı etkileri arasında tarafından sınırlıdır. Bu bağlamda, biyolojik fonksiyonları işlemek için potansiyeli olan umut verici bir non-invaziv teknoloji odaklı bir ultrason teşkil derin dokularda yüksek kronolojik zamanmekansal doğruluk ve sınırlı hedef kapalı etkileri içinde.
Odaklı ultrason stimülasyon oluşur hassas yerlerde akustik enerji sunma Derinlerde yaşayan organizmalar. Akustik darbe parametreleri bağlı olarak, bu enerji çeşitli tıbbi kullanımlar olabilir. Örneğin, gıda ve İlaç İdaresi onaylanmış yoğun odaklı ultrason (HIFU) kullanımı için prostat tümörleri, tremor neden olan beyin bölgeleri, uterin fibroids ve kemik metastazı1 ağrı neden sinir uçlarının termal ablasyon . HIFU aracılı difüzörü kavitasyon de geçici kan - beyin bariyerini sistemik tarafından idare edilen tedavi2hedeflenen teslim etmek için açmak için kullanılır. Kayma en yüksek Nabız-ortalama yoğunluğu (bensppa) ve kayma en yüksek ortalama zamansal yoğunluk (benspta) uygulamalar genellikle birkaç kW cm-2 ve nabız basıncı MPa birkaç onlarca üretmek HIFU için kullanılan. Bu yoğunluk değerleri çoğu uzakta FDA onaylı bensppa vespta sınırları tanılama ultrason, 190 W cm-2 ve 720 mW cm-2, sırasıyla3. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda içinde veya yakınında tanılama ultrason yoğunluğu sınırları (LIPUS) dizi etkili ve güvenli bir şekilde uzaktan nöral işlemek için4ateş vardır o tahribatsız pulsed ultrason stimülasyon göstermiştir, 5,6,7,8, hormon salgılanması9,10 ve Biyomühendislik hücreleri11. Henüz, hangi hücreleri hissediyorum ve ultrason için yanıt hücresel ve moleküler mekanizmaları belirsiz, klinik LIPUS tercümesi iyileştirmelerden kalır. Dolayısıyla, son birkaç yıl içinde Yapay membran, kültürlü hücreleri ve hayvanlar ultrason ile uyarılan biyofiziksel ortaya çıkarmak için bir ivme kazanmış ve fizyolojik süreçleri LIPUS12,13tarafındanmodülasyonlu, 14,15.
Fiziksel bir medya yayılıyor bir titreşim ses oluşur. Ultrason ile bir frekans insan sesli aralığı (Yani, yukarıda 20 kHz) yukarıda bir sesi. Bir laboratuvar ortamda ultrason dalgaları genellikle belirli bir yüksek frekans bant içinde salınan bir elektrik alanı cevaben titreşir bir materyal içeren piezoelektrik güç çeviriciler tarafından üretilmektedir. Güç çeviriciler iki türü bulunmaktadır: tek öğe dönüştürücüler ve dönüştürücü diziler. Tek öğe piezoelektrik güç çeviriciler odaklama bir objektif olarak geçecek olan ve, bu nedenle akustik enerji odak bölgesi adı verilen tanımlanmış bir bölgeye yoğunlaşmaktadır bir eğri yüzey sahip. Tek öğe güç çeviriciler çok daha ucuz ve daha kolay dönüştürücü diziler çalıştırmak. Bu madde tek öğe dönüştürücü üzerinde durulacak.
Bir odaklanan tek öğe çevirici odak bölgenin boyutunu akustik mercek geometrik özellikleri ve akustik frekansını bağlıdır. Bir milimetre boyutunda odak bölge bir tek öğe çevirici ile elde etmek için ultrason frekansları MHz aralığında genellikle gereklidir. Ne yazık ki, bu tür frekansta akustik dalgalar çok hızlı bir şekilde ne zaman hava gibi ince bir ortamda yayılır zayıflatılmış. Böylece, MHz ultrason dalgaları üretilecek ve su gibi daha yoğun bir malzeme örnek yayılır gerek. Bu LIPUS modalite mikroskop için entegre ilk meydan okuma kabul ettiğiniz anlamına gelir.
Fiziksel arabirimler arasında (ki bir ürün malzeme yoğunluğu ve akustik hız) farklı akustik impedances akustik yol boyunca malzemelerle en aza indirmek için ikinci bir mücadeledir. Bu arabirimler yansıtabilir, olurlar, dağılım ve akustik dalgalar, etkili bir örnek için teslim akustik enerji miktarı ölçmek üzere emerler. Onlar istenmeyen mekanik eserler acabilirsiniz. Örneğin, ileri yayılıyor olanlar ile müdahale backpropagating dalgalar yansımaları üretilen dik akustik uyuşmazlığı empedans arabirimleri oluşturun. Girişime yol boyunca dalgalar her diğer alanlarda düğümleri ve anti-düğümleri, denilen bölgeler alternatif, özetle denilen sabit bölgelerinde, sözde duran dalgalar (Şekil 1) oluşturmayı iptal etmek. Onlar içinde vivoolmayabilir gibi bu deneysel arabirimler içinde vitro ortadan kaldırmak veya kontrol edebilmek deneyci için önemlidir.
Optik gazetecilere floresans ölçüm şeffaf biyolojik örnekler gerçek zamanlı olarak ve hiçbir fiziksel rahatsızlık ile sorguya çekmek için iyi bilinen bir yöntemdir. Bu yaklaşım böylece herhangi bir fiziksel probları sonicated alanında mevcut mekanik eserler tanıtacak olarak LIPUS çalışmaları için idealdir. Bu iletişim kuralı uygulama ve LIPUS çalışması için bir ticari epi-floresan mikroskop açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. artan akustik şeffaf Polyester Film hücrelerdeyse
- 12 mm delik boyutunu dikey bir basın matkap kullanarak standart 35 mm Kültür çanak alt matkap. Matkap yavaş hareket ve göz koruma giymek. Dış tarafta (Şekil 2) pürüzsüz bir yüzey oluşturmak için bir bıçak kullanarak çanak alt bağlı plastik parçaları kaldırın.
- Deniz-grade epoksi veya tutkal yemeğin dış alt yüzeyinde ince bir tabaka uygulayın.
- Polyester (2.5 µm kalınlık) çanak dış alt yüzeyine karşı bir film yerleştirin ve sıkıca Epoksi/Yapıştırıcı film ve kalın plastik yüzey arasında eşit olarak yayılır emin olmak için tuşuna basın. Yavaşça film ile a düz yüzey (Şekil 2) oluşturmak için parmak santrifüj bir şekilde çekin.
- Epoksi/tutkal kuruduktan sonra kısaca durulama kuru polyester-alt çanağı ile % 95 etanol ve çanak ve içine yerleştirerek sterilize kapağı güçlü bir 254 nm UV uyarma kaynağı altında yüzey. Süresi ve yoğunluğu yaklaşık 330 mJ cm-2 en tip-in mikro-organizmaların tam imha için bir UV doz teslim etmek için ayarlayın. Bu enerji yaklaşık 5 dk 1000 µW cm-2 UV aydınlatma kullanarak bir süreye karşılık gelir.
- Aliquot ticari olarak mevcut hücre dışı matriks protein karışımları (EMPM) küçük tüpler (50-100 µL) ve store veya daha az steril koşullarda-20 ° C'de onları.
- Steril bir ortamda (Örneğin, bir Biyogüvenlik kabini içine), EMPM donmuş bir hisse senedi ile istenen bir kültür orta ve 1: 100 oranında seyreltin. Buz EMPM polimerizasyon oda sıcaklığında önlemek için çalışın. Hızla 100 µL üzerine polyester film orta karışımı uygulamak. Kısırlık korumak için kapağını geri yemek yer.
- EMPM kaplamalı polyester alt yemekleri 37 ° C'de kuluçka hücre kültür CO2 6-12 h için kuluçkaya.
- Kuluçka sonra aşırı orta Aspire edin ve doğrudan istenen yoğunluğu hücreleri ile yüzey temel olarak belirler. Kısırlık korumak için steril koşullar altında çalışır.
2. LIPUS uygulama
- Amacı, büyük çalışma hacmi ve aydınlatma donanımı olmayan dik bir mikroskop altında bir su deposu iletim yoluna koyun.
- Piyasada bulunan mikroskoplar bileşenleri'ni kullanarak, amacı aşağıda bir örnek sahibi ve bir dönüştürücü sahibi örnek sahibi altına yerleştirin. Sonraki örnek hizalama için arama ve ultrason, bu iki sahipleri çeviri etaplar bağlayın.
- Hareketli parçaları ve aktüatörler Çeviri aşamaları tank dışında veya su su zarar görmemesi için satırın üstüne yerleştirin. Sadece anodize alüminyum ve paslanmaz çelik gibi aşındırıcı malzemeler dalmış mikroskoplar bileşenlerinin kullanın.
- Tank daldırma dönüştürücü kullanarak daha önce deiyonize ve degassed su ile doldurun. Su hattı örnek sahibi (Şekil 3) yatay düzlemde ile aynı hizaya gelmelidir.
Not: Deiyonize su elektrik kaplin yüksek elektrik alanları huzurunda önler. Gaz giderme Ayrıca saçılma ve akustik dalgalar değişikliklere önleyecektir. Su hattı dönüştürücü konum altında düşüyor bir pompa veya Vana kullanarak her deneme sonra su tahliye. Ayrıca, değiştirmek veya sık sık su filtre ve temizleme su deposu mikroorganizmaların gelişimini önlemek için gerektiği gibi.
3. eğik akustik uyarma
- Piyasada bulunan mikroskoplar bileşenleri'ni kullanarak, dönüştürücü bir eğik pozisyonda optik yol ile ilgili gelecek şekilde yönlendirin. Bu herhangi dalgalar-ecek var olmak matuf (Şekil 3 ve Şekil 4) örnek uzak yansıyan sağlayacaktır.
4. sürüş dönüştürücü
Not: Ultrason güç çeviriciler salınan elektrik enerjisini mekanik genişleme/daralma bir piezoelektrik malzeme dönüştürmek. Bu dönüşüm enerji kaybı ısı enerjisi şeklinde üretir. Güç çeviriciler en yüksek giriş voltajı sınırı sahip iken, bu nedenle, onlar da piezoelektrik öğesine termal zarar görmemesi için bir elektrik güç sınırı sahip:
zaman elektrik simülasyon, P elektrik gücü (Watt) içinde göreli kısmını ile görev döngüsü Vrms alternatif gerilim kaynağı ve Z elektrik giriş ortalama kare kökü gerilimi (Volt içinde) Empedans (ohm içinde).
V,s dönüştürücü için uygulanan en yüksek tepe giriş voltajı.
- İstenen frekansı, nabız, devir sayısı içeren bir sinüs dalga formu oluşturmak ve darbe tekrarlama frekansı bir ticari fonksiyon jeneratör kullanarak. Ancak, etkili bir şekilde standart ultrason güç çeviriciler kez sürücü için gerekli nispeten yüksek Vpp işlev üreteci (Yani, artış Vsgenliği) çıkışını yükseltmek için güç amplifikatörü eklenmesi gerektirir.
Not: belirli bir çevirici 35 dir. Örneğin, bir çevirici'nın üretici güç sınırını belirtir W. Sinüsoidal tepe-için-pik gerilimi (Viçinde) 500 giriş mV adlı bir görev döngüsü % 50 ve 50 dB ile güçlendirilmiş/100 W amplifikatör bu dönüştürücü güç sınırı içinde?- Bu soruyu cevaplamak için amplifikasyon sonra gerilim hesaplayın. Radyo frekanslı (RF) güç amplifikatörü için büyütme faktörü (dB) tarafından tanımlanır:
Böylece, güçlendirilmiş gerilim genlik çıkış Vs vardır (Vs Vdışarı=) in:
Denklemler 1 ve 2 kullanarak ve 50 Ω Elektrik empedans kullanarak, bu gerilim tarafından oluşturulan karşılık gelen güçtür:
Bu stimülasyon bu nedenle dönüştürücü güç sınırı içinde. - Yukarıdaki örnekte kullanarak, dönüştürücü'nın üreticisi tarafından sağlanan güç ve gerilim sınırları karşılık gelen dalga formu parametreleri (Vpp, frekans, darbe süresi ve darbe tekrarlama frekansı) hesaplama. Dönüştürücü ve bağlı diğer enstrümanlar zarar görmesini önlemek için bu sınırları saygı emin olun.
- Bu soruyu cevaplamak için amplifikasyon sonra gerilim hesaplayın. Radyo frekanslı (RF) güç amplifikatörü için büyütme faktörü (dB) tarafından tanımlanır:
- Ultrason dönüştürücü ile uyumlu bir frekans aralığındaki çalışır bir işlev üreteci seçin. İşlev üreteci dönüştürücü nominal en yüksek frekansa frekansını ayarlamak.
- İstenen süre ve tekrarlama frekansı işlev üreteci çekim modu kullanarak bir sinüsoidal gerilim darbe oluşturun. Tepe tepe gerilim istenen bir değere ayarlayın. Bu darbe süresi iki ardışık darbeleri arasında geçen saat daha kısa olduğundan emin olun.
- İşlev üreteci çıktısını bir osiloskop girişine bağlanarak istenen sinyalin dalga karşılık gelen onay.
- İşlev üreteci çıktısını bir RF Amplifikatör (Şekil 4) girifline ba¤lan›r. Stimülasyon parametreleri dönüştürücü'nın üretici sınırları içinde olduğundan emin olun.
5. ışın hizalama
- Bir frekans aralığı ve akustik yoğunluk frekans ile uyumlu ve ultrason dönüştürücü yoğunluğu ile çalışır bir hidrofon seçin.
- Dikkatle hidrofon sonda ucu konumundaki örnek (Şekil 4) konumuna karşılık gelen objektif görüş alanı içinde odak haline getirmek.
- Sonda ve dönüştürücü deiyonize ve degassed suya daldırılır emin olun. Bu onun kaplama alter ve ölçüm etkiler gibi su fiziksel herhangi bir nesne ile hidrofon ucu çarpmamayınasıl.
- Dönüştürücü bir brüt öncesi hizalamasını görsel olarak akustik ekseni hidrofon sonda doğru konumlandırma tarafından gerçekleştirin. Dönüştürücü'nın yüzeyi ve hidrofon ucu arasındaki mesafe yaklaşık dönüştürücü'nın odak uzaklığı karşılık emin olur.
- Bir osiloskop'ın sinyal girişi için çıkış hidrofon bağlayın. Eşitleme tetikleyici işlevi jeneratör başka bir osiloskop girişine bağlayın. Osiloskop üzerinde aynı anda her iki sinyali görselleştirin.
- Dönüştürücü ile birkaç ultrason döngüsü sırasında düşük iş hacmi ve sonda zarar görmesini önlemek için düşük genlik sürücü. Hidrofon'ın üreticisi güvenli kullanım koşulları ile hidrofon ipucu zarar görmesini önlemek için kontrol edin.
- S/bölümü topuzu hidrofon için dönüştürücü'nın yüzeyinden ultrason seyahat zamana göre ayarlayın. Osiloskop üzerinde hidrofon sinyal Eşitleme tetikleyici sonra arayın.
- Yavaş yavaş bir motorlu veya el ile XYZ sahne kullanarak dönüştürücü harekete. Dönüştürücü maksimal hidrofon sinyal (Şekil 4) ile ilişkili olan pozisyon içine bırakın.
Not: sinyal yok mümkün olduğunu tespit edilirse akustik bakliyat yoğunluğu çok düşük olan veya ışın yanlış hizalanan veya bir nesne tarafından dağınık. Düzenli olarak hidrofon ve dönüştürücü görsel olarak önceden hizalanmış ve hiçbir kabarcıklar veya fiziksel nesne yolu polyester film dışında mevcut olduğunu kontrol edin. Sinyal hala algılanırsa, hidrofon sinyal genliği artırmak için küçük bir miktar tarafından giriş voltajı yükseltin.
6. ultrason nabız basıncı ve yoğunluk tayini
- Hizalanmış ışın ile çeşitli voltaj dönüştürücü sürüş için osiloskop, çıkış hidrofon en yüksek zirve genliğini ölçmek. Hidrofon'ın üretici tarafından önerilen basınç sınırını aşmayacak şekilde emin olun.
- Bu ölçümler basıncı ve/veya kalibrasyon yöntemiyle hidrofon'ın üreticisi tarafından sağlanan akustik yoğunluk değerleri dönüştürmek.
Not: Akustik yoğunluk formülü kullanarak baskı ve tersi belirlenebilir:
ben (W m-2), akustik basınç ile P (Pa), akustik basınç ρ malzeme (1.000 kg m-3 su için) ve c orta propaganda içinde ses hızı yayma yoğunluğu (su, c = 1500 m s-1). - Bu ölçüler kullanarak kalibrasyon eğriler oluşturmak.
Not: Basınç vs gerilim ve yoğunluk vs. gerilim eğrileri sırasıyla bir doğrusal ve parabolik şekli var. - İstenen bir sürüş gerilim basıncı ve/veya yoğunluk değeri karşılık gelen kalibrasyon eğrisi kullanarak belirleyin.
7. kalsiyum-duyarlı/LIPUS canlı hücre floresans görüntüleme
- İstenen görüntü arabellek bir hücre permeant kalsiyum duyarlı boya 5 mikron içeren hücre kültür orta yerine (Örneğin, Fluo-4 değilim). Kültür çanak CO2 kuluçka 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya.
- Dikkatli bir şekilde hücreleri aynı tampon boya ücretsiz ile yıkayın.
- Çanak örnek tutucuya yerleştirin. Mavi ışık aydınlatma kullanarak hücreleri heyecanlandırmak (490 nm) ve aşırı ağartma veya piksel doygunluk kaçınmak için uyarma yoğunluğu ve fotoğraf makinesi pozlama ayarı.
- Hızlandırılmış görüntüleme istediğiniz görüntü alma ayarlarını kullanarak gerçekleştirin. Bir daldırma amacı istenmeyen yansımalar (bkz. Şekil 4) azaltmak için daha iyi görüntü kalitesi ve uzun çalışma mesafesi ile kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 5 LIPUS deney ile kalsiyum görüntülemede Multiplexed komutu örneğidir. Glioblastoma hücreleri (A-172) standart Kültür (% 10 serum ve % 1 antibiyotik ile desteklenmiş) orta EMPM kaplı polyester film üzerinde yetiştirilen ve kalsiyum duyarlı floresan muhabir Fluo-4 ile inkübe AM. Hücreleri bir 10 X daldırma lens ile ve bir beyaz LED ışık kaynağı ile aydınlatılan görüntüsü ve floresan ışık standart GFP filtre kümesi kullanılarak toplanmıştır. LIPUS tarafından el ile 4 MHz transducer nabız dalga 158 V pik pik genlik, 0.1 ms darbe süresi ve 10 ms darbe tekrarlama frekansı (Yani, % 1'iş hacmi) ile sürüş tarafından uygulandı. Bu parametreler için karşılık gelensppa 88 W cm-2 (190 W cm-2tanı sınırı altında)ve benspta = = 877 mW cm-2 (biraz üzerinde tanılama sınırını 720 mW cm-2), anılan sıraya göre. Bu uyarımı üretilen sağlam kalsiyum yükselmeler sonuçlar gösterir (Şekil 5B, 5 C, 5 D).
Kısa darbe süreleri (Yani, hiçbir önemli ısı dağıtımı sırasında darbe ile) ve ısı kapasitesi (polyester film üzerinde büyüdü ve sulu çözüm batırmaYani, hücreleri) örneğinin varsayarak su, değiştirmek için benzer Her darbe sırasında üretilen ısı (∆Tmax)16 tarafından tahmin edilebilir
0.1 ms ve 88 W cm-2 yoğunluğunu darbe darbe süresi olan
∆Tmax = 0,12 0,0001 88 ≈ 1 m ° C x x
% 1'iş hacmi ile odak bölgede her 0.1 ms darbe sırasında yatırılır ısı az miktarda ısı iletim sırasında 9.9 arasında iki ardışık darbeleri yayılmış ms tarafından kaldırıldı olasıdır. Bu nedenle, sağlam kalsiyum Şekil 5B, 5 C, görülen sinyalleri 5 D olasılıkla termal mechanism(s) tarafından indüklenen.
Şekil 1: duran dalga oluşumu yansıtan bir arayüzüne. Malzeme farklı akustik empedans ile arasında bir arabirim varlığı bir gelen basınç (mavi) ile dalga dalga boyu λ yansıtır. Her iki dalgaları ters yönde seyahat beri salınan bir faz kayması kuruldu. Üst: Şu anda duran dalga (yeşil dalga) yıkıcı girişim üreten 180 ° faz kayması olduğunu. Orta: Dalgalar bir mesafe taşıdıktan sonra λ/4 ile ilgili üst panel, karşılık gelen faz kayması null'dır ve daha yüksek genlik bir duran dalga üreten yapıcı etkileşimler yoluyla , her iki dalgalar yükseltmek. Alt: Dalgalar λ/2 ek bir mesafe taşıdıktan sonra (dolayısıyla toplam λ / 4 + λ/2 = 3/4 λ en iyi referans üzerinden), faz kayması olur tekrar null, yüksek genlik ama Ters polarite ile duran dalga üreten. Not Bazı pozisyonları yolun içinde sürekli sabit boş basınç (düğüm, siyah daireler) diğer pozisyonları var salınım minimum ve maksimum baskılar arasında (antinodes, yeşil daireler). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre akustik şeffaf polyester film büyüyen. Rakam büyük 12 mm delik ile bir 35 mm çanak alt kısmı onun merkezinde gösterir. Delik daha sonra ince bir polyester film ile kaplıdır. Film sıkıca deniz sınıf epoksi kullanarak çanak dış altına yapıştırılmış olan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir dik floresans mikroskobu bir ultrason set-up uygulanması. Özel yapım su deposu iletilen aydınlatma donanımı olmayan bir dik floresan mikroskop altında yer alıyor. Amaç altında konumlandırılmış bir motorlu örnek tutucu tankı dışında titreşim tabloya sabit mikroskoplar bileşenleri bağlı olduğu. Dönüştürücü örnek altında konumlandırılmış ve mikroskoplar bileşenleri tank içinden yapıştırılmış bir çeviri sahne bağlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: tüm set-up Şematik diyagramı. Set-up floresans görüntüleme kültürlü hücre etkinleştirmek için bir epi-floresan dik floresans mikroskobu içerir. Dönüştürücü optik yol ile ilgili olarak eğik bir yönlendirme ile gösterilir. Bu yapılandırma böylece duran dalga oluşumu ve/veya tekrarlayan örnek birden fazla ultrason yankıları ile uyarılması engelleyen akustik dalgalar akustik yol boyunca geriye doğru yansıması önler. İstenen bir dalga formu el ile açık veya elektronik olarak bir bilgisayar arayüzü (transistör transistör mantığı veya evrensel seri veri yolu) tarafından tetiklenen bir işlev üreteci tarafından üretilmektedir. Genlik ve hidrofon iğne (kırmızı) tarafından ölçülen sinyalin gecikme bir osiloskop kullanılarak analiz edilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: örnek insan glioblastoma LIPUS kaynaklı kalsiyum sinyallerin hücreleri A-172. (A)ham floresan görüntü bir 35 mm polyester-alt kültür çanak üzerinde büyüdü ve kalsiyum-gösterge Fluo-4 hücre permeant sürümünü ile A-172 hücre. Kırmızı izler bir bilgisayar programı ile otomatik olarak tanımlanır ve faiz (ROI) bölgeleri olarak etiketli hücre sınırlarını temsil eder. (B) zaman ders LIPUS deney sırasında her yatırım getirisi için göreli floresans değişim (Ft-F0/f0veya ΔF/F0). Görüntüleri elde saniyede 1 kare hızında tarafından standart bir CCD kamera ve LIPUS için 10 uygulandığı s 20-30 çerçeveler arasında. LIPUS dalga formu 400 döngüsü sırasında 4 MHz içeren 100 µsn bakliyat oluşur ve her 10 ms demek ΔF/F0 saat ders gösterilen 10 s. (C) arsa için tüm ROIs (hata çubukları gösterilmez) hesaplanan tekrarladı. (D) Arsa ΔF/F0 Kullanıcı tanımlı harekete geçirmek eşiğin sergilenmesi yatırım getirisi yüzde birlik gösterilen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Büyük avantajı odaklı ultrason non-invaziv mekanik ve/veya termal enerji yüksek spatio-temporal hassasiyetle biyolojik örnekler sunmak için onun yetenek olduğunu. Mekanik olarak teşvik amacıyla diğer teknikleri genellikle istihdam invaziv fiziksel problar (Örneğin, hücre alay) hücreleri veya yabancı nesneler (Örneğin, Optik cımbız) yüksek enerjili lazer ışınları etkileşim gerektirir. Manyetik Isıtma biyolojik örnekler içinde belirli uzamsal konumları ısı olabilir ama yabancı Manyetik Nano tanecikleri olmasını gerektirir. Öte yandan, küçük örneği (Örneğin, hücre kültürlerinde) sulu ortamda hassas non-invaziv Isıtma kızılötesi özelliğini kullanarak mümkündür veya mikrodalga uyarma17,18,19.
Ticari sistemler floresans mikroskobu ile birlikte ultrason uyarma yapmak mümkün kullanılabilir olmadığı için birçok biophysicists kendi özel uygulamalar8,12 ' ye uygun özelleştirilmiş sistemler oluşturduk ,13,20. Ancak, bu tür sistemlere uygulanması için uzmanlar zor olabilir. Bu makalede açıklanan temel işlemin uyuşmazlığı akustik üretilen akustik yansımaları ve duran dalgalar eserler sınırlama dik epi-floresan mikroskop objektif odak düzlem doğru odaklanmış ultrason ışın götürmek için Empedans arabirimleri. Bu akustik eserler genellikle açıkça Yayınlanan Edebiyat dikkate alınmaz.
Sonuçta bir akustik ışını optik yolun ışın dikey kullanarak dalmış bir amaç ön lens tarafından kurulan sıvı-katı arabirimi karşılaşırsanız, bir hava hedef kullanılmakta ise, su-hava arayüzü veya yukarıdaki örneğini. Bu arabirimler duran dalgalar (bkz. Şekil 1) üreten akustik dalgalar geri örnek için yansıtır. Azaltmak veya bu yansımaları önlemek için bu dönüştürücü ile bir eğik açı optik yol ile ilgili olarak konumlandırmak için tavsiye edilir.
Polyester-alt kültür yemekleri kullanımı sadece en aza indirmek akustik yansımaları kalın plastik kültür yemekleri alt tarafından üretilen, ayrıca alınan örneğin altında dik bir mikroskopla uyarmak deneyci olanağı verir. Bu optik yol ile ilgili olarak eğik bir yönlendirmede dalmış bir dönüştürücü konumlandırmak için ters bir mikroskop ile karşılaştırıldığında tercih bir yapılandırmadır.
Bu iletişim kuralı odaklı ultrason dönüştürücüler ile kullanılmak üzere tasarlanmış, ama deneyci de sigara odaklı (planar) ultrason dönüştürücüler de kullanabilirsiniz. LIPUS kesin doku içindeki istenilen alanların uyarılması için tasarlanmıştır beri odaklı ultrason güç çeviriciler vitro ve in vivo uygulamalar için genellikle tercih olduğunu unutmayın. Düzlemsel güç çeviriciler tarafından üretilen akustik ışınları da daha geniş, yansımalar ve diğer mekanik eserlerin azaltmak daha zorlaştırır.
Bir tek öğe odaklı ultrason çevirici odak bölgenin öğe çapı, akustik frekans ve yayılıyor malzeme ses hızı gibi birçok parametreleri bağlıdır. Standart MHz transducer için odak alanı genellikle bir millimetric veya alt millimetric bölgede sınırlı olduğunu. Odak bölge boyutunu ve akustik ışın zayıflama nedeniyle çok fazla kayıp olmaksızın doku içine nüfuz yeteneği arasında bir denge var: yüksek frekans, küçük odak bölge ama zayıf penetrasyon.
Etkili bir mikroskop altında görüntülenir hücreleri uyarmak için dönüştürücü akustik odak bölgenin objektif optik odak düzlemi ile örtüşmesi gerekir. Bu amaç için tam olarak bir ticari olarak mevcut hidrofon kullanarak akustik ışın hizalamak gereklidir. Hidrofon iki ana türü vardır: hidrofon iğneler ve fiber optik sistemleri. Her iki tür-ebilmek var olmak kullanılmış. Hizalama sırasında akustik yoğunluk hidrofon basınç sınırları içinde ve dönüştürücü sıklığını hidrofon'ın hassasiyeti frekans aralığı içinde olduğundan emin olmak önemlidir.
(Varsa) (hidrofon genellikle V Pa-1 veya benzer birimleri sayıya ile kalibre,) gerçek akustik basınç hidrofon gerilim genlik çıkışını dönüştürmek için üretici tarafından sağlanan ayarı'nı kullanın. Hidrofon da genellikle Tercihli yönlendirmeye (Yön) ile ilgili olarak akustik ışın sahip olması, dolayısıyla hidrofon akustik ekseni aynı yönde pozisyon için tercih edilir. Aksi takdirde mümkün, hidrofon açının ölçüleri ele geçirdikten sonra yön sonrası düzeltme izin zayıflama vs yön, bir grafik olabilir.
Işın hizalama özellikle bir çevirici dar bir odak bölge ile çalışırken sinir bozucu bir görev olabilir. Hidrofon sinyal dönüştürücü sürüş darbe ile ilgili olarak bir gecikmeyle görüntülenmesi gerekir. Bu gecikme karşılık gelen dönüştürücü'nın yüzeyinden hidrofon sonda (suda, ses dalgaları seyahat yaklaşık 1,500 m s-1hızında) seyahat için ultrason tarafından geçen süre (bkz. Şekil 4). RF gecikme elektrik kablolarından süzülerek seyahat sinyalleri Not olan, mevcut durumda, güvenle yoksayılabilir sadece 3 ns m-1hakkında küçüktür. Işın de hizalanmışsa test etmek için bir dönüştürücü ve hidrofon osiloskop ve bilinen ses hızı suda ölçülen gecikme kullanarak arasındaki uzaklığı hesaplamak için yoldur. Örneğin, yaklaşık 17 µs bir gecikme için bir çevirici ile 25 mm odak uzunluğunu bekleniyor.
Ticari hidrofon kullanımı mümkün değilse (hidrofon veya hidrofon yerleştirmek için sınırlı alanlarda eşleşen değilÖrneğin, sıradışı dönüştürücü frekans), akustik ışını ile nabız-yankı Yöntem20hizalanabilir. Bu genellikle ilk bir büyüklükte küçük bir yansıtıcı nesne benzer veya dönüştürücü ışın çapı daha küçük odak içinde mikroskop görüş alanı içine yerleştirerek yapılır. Dönüştürücü daha sonra hem akustik emitör (ultrason bakliyat göndermek için) ve alıcı (yankıyı yansıtan nesneden algılamak için) olarak kullanılır. Bu yapılandırmada, adanmış bir amplifikatör dönüştürücü dışarı geliyor oldukça küçük yansıma sinyali yükseltmek için gerekli olduğunu unutmayın.
RF araçları düzgün çalışması için tüm kabloları ve bağlantıları aletleri için eşleşen Elektrik empedans var, aksi takdirde istenmeyen elektrik yansımaları oluşur ve elektrik dalga formu değiştirmek önemlidir. Bu genellikle çoğu süngü Neill-Concelman (BNC) kabloları ve 50 Ω empedans sahip RF ekipman ile durumdur. Bazı Osiloskoplar, ancak 1 MΩ bir yüksek giriş empedansı sahip ve böylece bir RF sinyal 50 Ω BNC kablo beslenen yansıtır. Bu durumda, bir basit 50 Ω Sonlandırıcı besleme yoluyla BNC kablosunun ucunu ve düzgün sinyal kaybı olmadan sona erdirme osiloskop'ın giriş arasında takılmalıdır.
Bu yöntem Teknik olarak ultrason darbeleri teslim etmek için ve floresan görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılan araçları tarafından sınırlıdır. Örneğin, standart tek foton floresan mikroskop yalnızca iki boyutlu örnekleri görüntüleme sağlayacak. Ancak, daha karmaşık LIPUS görüntüleme gibi beyin dilimler veya küçük organları çok foton uyarma kullanarak üç boyutlu örnekleri gerçekleştirebilirsiniz.
LIPUS deneyleri ile başka bir sorun akustik ışınları tarafından öğretilir mekanik ve termal etkileri ayırt etmektir. O uçak eksen (x, y) görüntüyü değiştirir veya z ekseni örnekte defocuses mekanik deplasman optik yol eğik tespit edilebilir. Bu talebiyle mikroskop kamera ve objektif optik kombine çözünürlüğüne bağlıdır. Bu hareketleri yalnızca sonication sırasında oluşacak gibi Ayrıca, bir fotoğraf makinesi pozlama ve darbe süresi arasında geçici örtüşme eşitlemek için yüksek bir kare hızı kullanmak gerekir.
Ultrason kaynaklı termal etkileri araştırmak için sıcaklığı ölçmek için kullanım geleneksel fiziksel sondalar tavsiye edilmez sonda kaçınılmaz titreşimler yüzünden. Ancak, burada açıklanan tekniği genetik olarak kodlanmış thermosensitive floresan gazetecilere veya thermosensitive boyalar21,22kullanarak sıcaklık değişiklikleri ölçmek için de uygundur. Gelecekte, biyouyumlu floresan muhabir kullanıma sunulduğunda, bu tekniğin birçok diğer biyofiziksel parametrelere etkisi ultrason çalışmanın sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Drs. Mikhail Shapiro ve Nikita Reznik verimli tartışmalar için teşekkür ederiz. Bu eser Western Üniversitesi Sağlık Bilimleri fonlarından start-up tarafından desteklenen ve NIH R21NS101384 verin.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| upright microscope with large working volume | Thorlabs | CERNA | |
| upright microscope with large working volume | Scientifica | SliceScope | |
| optomechanical components | Thorlabs | n/a | |
| needle hydrophone | ONDA Corporation | HNP/C/R/A/T series + AH/G pre-amplifier | |
| needle hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| fiber optic hydrophone | ONDA Corporation | HFO series | |
| fiber optic hydrophone | Precision Acoustics | n/a | |
| oscilloscope | Keysight Technology | DSOX2004A (4-channels 70MHz) | |
| function generator | Keysight Technology | 33500B (20MHz single-channel) | |
| RF power amplifier | Electronic Navigation Industries (ENI) | 325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA | |
| RF power amplifier | Electronics & Innovation (E&I) | ||
| immersion ultrasound transducer | Olympus | focused immersion transdcuers | |
| immersion ultrasound transducer | Benthowave Instrument | HiFu transducer BII-76 series | |
| immersion ultrasound transducer | Precision Acoustics | Piezo-ceramic or HiFu transducers | |
| immersion ultrasound transducer | Ultrasonic-S-lab | HiFu transducers made to order | |
| high-density Matrigel | Corning | VWR 80094-330 | |
| Mylar film 2.5 microns | Chemplex | CAT.NO:107 |
References
- Elhelf, I. A. S., et al. High intensity focused ultrasound: The fundamentals, clinical applications and research trends. Diagnostic and Interventional Imaging. 99 (6), 349-359 (2018).
- Toccaceli, G., Delfini, R., Colonnese, C., Raco, A., Peschillo, S. Emerging strategies and future perspective in neuro-oncology using Transcranial Focused Ultrasound Technology. , World Neurosurgery. (2018).
- Duck, F. A. Medical and non-medical protection standards for ultrasound and infrasound. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 176-191 (2007).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nature Neuroscience. 17 (2), 322-329 (2014).
- Tyler, W. J. The mechanobiology of brain function. Nature Reviews: Neuroscience. 13 (12), 867-878 (2012).
- Tyler, W. J. Noninvasive neuromodulation with ultrasound? A continuum mechanics hypothesis. Neuroscientist. 17 (1), 25-36 (2011).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Tyler, W. J., et al. Remote excitation of neuronal circuits using low-intensity, low-frequency ultrasound. PloS One. 3 (10), e3511 (2008).
- Suarez Castellanos, I., et al. Calcium-dependent ultrasound stimulation of secretory events from pancreatic beta cells. Journal of Therapeutic Ultrasound. 5, 30 (2017).
- Suarez Castellanos, I., Jeremic, A., Cohen, J., Zderic, V. Ultrasound Stimulation of Insulin Release from Pancreatic Beta Cells as a Potential Novel Treatment for Type 2 Diabetes. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (6), 1210-1222 (2017).
- Ibsen, S., Tong, A., Schutt, C., Esener, S., Chalasani, S. H. Sonogenetics is a non-invasive approach to activating neurons in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 6, 8264 (2015).
- Prieto, M. L., Firouzi, K., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. Activation of Piezo1 but Not NaV1.2 Channels by Ultrasound at 43 MHz. Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (6), 1217-1232 (2018).
- Kubanek, J., et al. Ultrasound modulates ion channel currents. Scientific Reports. 6, 24170 (2016).
- Prieto, M. L., Omer, O., Khuri-Yakub, B. T., Maduke, M. C. Dynamic response of model lipid membranes to ultrasonic radiation force. PloS One. 8 (10), e77115 (2013).
- Sato, T., Shapiro, M. G., Tsao, D. Y. Ultrasonic Neuromodulation Causes Widespread Cortical Activation via an Indirect Auditory Mechanism. Neuron. 98 (5), 1031-1041 (2018).
- O'Brien, W. D. Ultrasound-biophysics mechanisms. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 93 (1-3), 212-255 (2007).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Corrigendum: Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 8, 16148 (2017).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nature Communications. 3, 736 (2012).
- Shapiro, M. G., Priest, M. F., Siegel, P. H., Bezanilla, F. Thermal mechanisms of millimeter wave stimulation of excitable cells. Biophysical Journal. 104 (12), 2622-2628 (2013).
- Hwang, J. Y., et al. Investigating contactless high frequency ultrasound microbeam stimulation for determination of invasion potential of breast cancer cells. Biotechnology and Bioengineering. 110 (10), 2697-2705 (2013).
- Nakano, M., et al. Genetically encoded ratiometric fluorescent thermometer with wide range and rapid response. PloS One. 12 (2), e0172344 (2017).
- Donner, J. S., Thompson, S. A., Kreuzer, M. P., Baffou, G., Quidant, R. Mapping intracellular temperature using green fluorescent protein. Nano Letters. 12 (4), 2107-2111 (2012).
