Summary
ويهدف هذا البروتوكول تقييم إيمونوثيرابيوتيك سيتوتوكسيسيتي تي خلية (سيارة تي خلية) المعاد توجيهها ضد الخلايا السرطانية منظم 3D (الماغنيسيوم) في الوقت الحقيقي.
Abstract
وقد أصبح العلاج المناعي مجال يحظى باهتمام متزايد في مجال مكافحة السرطان وإلا غير قابل للعلاج. من بين جميع الطرق إيمونوثيرابيوتيك، توجيه مستقبلات مستضد تشيميريك (السيارات) خلايا تي الحصول على النتائج الأكثر إثارة، ولا سيما مع سرطان الدم الليمفاوي الحاد ب طب الأطفال (ب-الكل). أساليب التحقق من الصحة الكلاسيكية من خلايا "تي السيارة" تعتمد على استخدام خصوصية وفحوصات وظائف الخلايا T سيارات ضد الخلايا المستهدفة في التعليق وفي نماذج xenograft. ولسوء الحظ، الملاحظات المبداة في المختبر هي غالباً ما تنفصل عن النتائج التي تم الحصول عليها في فيفو ويمكن ادخار الكثير من الجهد والحيوانات بإضافة خطوة أخرى: استخدام الثقافة 3D. ويمثل إنتاج الماغنيسيوم خارج الخلايا المستهدفة المحتملة التي تحاكي بنية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية عندما كانوا هم انجرافتيد في نموذج الحيوان بديلاً مثاليا. هنا، نحن تقرير أسلوب بأسعار معقولة وموثوق بها وسهلة لإنتاج الماغنيسيوم من خط خلية القولون ترانسدوسيد كأداة التحقق من صحة للعلاج بالخلايا التبني (يتجلى هنا في خلايا تي سيارة CD19). ويقترن هذا الأسلوب مع نظام تصوير حية متقدمة التي يمكن تتبع نمو كروي، المستجيب الخلايا سيتوتوكسيسيتي وورم الخلايا المبرمج.
Introduction
ويمثل نقل الخلية التبني (قانون) علاج السرطان الجيل القادم. أنها تعتمد على حقن خلايا المستجيب (أو ناغورني كاراباخ-الخلايا التائية) إلى مريض. يمكن أن تكون هذه الخلايا المعدلة وراثيا مع مستقبل التي سيتم توجيهها إلى أهدافها، الورم، وتدميره. وأبدى هذا النهج مؤخرا يكون ممكناً عندما قدم مستقبلات مستضد تشيميريك (سيارة) الموجهة ضد علامة الخلية ب CD19 في خلايا المريض تي لقتل صفحته/صفحتها السرطان1. في حالة السيارة، ومستقبلات مصطنعة، يتكون من أجزاء جسم معين، على التصميم مستضد ملزمة المجال ينحصر كيان معين واحد في سلسلة جزء متغير (سكفف)، مرتبطة بالمجالات مما يشير إلى خلايا T. على الرغم من أن هناك العديد من التصاميم، الإصدارات الأكثر استخداماً المشار إليها كالجيل الثاني من سيارة التصاميم، وتتألف من CD3z للإشارات تكر والمجال كوستيمولاتوري واحد (CD28، 4-1BB، OX40، إلخ.) 1 , 2-مجال العلاج المناعي الموجه أكثر من اهتمامها بهذا الشكل الجديد من القانون عندما تعامل الخلايا CD19 سيارة تي فعالية العديد من المرضى مع الخلية بالاورام الخبيثة3،4. بعد هذا النجاح، حاول الباحثون لاستغلال تصاميم مماثلة باستهداف الأخرى [ابيتوبس] للأورام الصلبة نجاحا محدودا. ولسوء الحظ، ندرة الورم المستضدات محددة وميكرونفيرونمينتس الورم أقسى المقدمة "سيارة تي" الخلايا أقل فعالية تجاه الأورام الصلبة5.
حاليا، تعتمد استراتيجيات التحقق من الصحة الأكثر استخداماً في المختبر على نظم ثنائية الأبعاد (2D) تلبي سوى جزء من التحديات التي سبق ذكره الأورام الصلبة. كلاسيكي، 2D في المختبر نظم تشمل مزيجاً من الخلايا T سيارات وخطوط خلايا السرطان المستهدفة مونولاييرس لتقييم الأداء الوظيفي وخصوصية هذه الخلايا المستجيب. على الرغم من أن هذه الاستراتيجيات أجزاء هامة وحيوية من الدراسات، أنها لا تأخذ في الاعتبار مورفولوجيا المعقدة وثلاثي الأبعاد (3D) هيكل من خلايا السرطان6. الخلايا السرطانية المستزرعة في نظم 3D، المشار إليها الماغنيسيوم، اكتساب الصفات المظهرية الجديدة من خلال أحداث تغييرات في الجينات التعبير الشخصية7، التي قد تؤثر على الاعتراف بواسطة خلايا المستجيب المعاد توجيهها. بيرجيرسدوتير وزملاؤه أظهرت أن خط خلية سرطان الغدد الليمفاوية (HL) هودجكن عندما تزرع فقط في نموذج ثلاثي الأبعاد ثقافة يكتسب ملف تعريف تعبير جينات مشابهة ل عينات الورم الرئيسي8. ولذلك، الماغنيسيوم أو 3D مماثلة الثقافة عرض المنهجيات ذات الصلة أكثر في نماذج المختبر بدلاً من نظم 2D القياسية. هذه النظم أيضا مشابهة للدراسات المجراة في التي ينظر إليها كخطوة أخيرة في عملية التحقق من الصحة لسيارة معينة. وبالنظر إلى أن تفشل الأنظمة 2D لمحاكاة مورفولوجية مجموعات السرطان، الماغنيسيوم تقدم تشكيلات مماثلة لتقييم الأداء الوظيفي للخلايا T السيارة قبل في النماذج الحية. في دراسة واحدة، بيكل et al. حددت أن نموذج كروي من مستقبلات عامل نمو البشرة البشرية (HER2) أوفيريكسبريسينج الخلايا السرطانية أظهرت الملامح إشارات مماثلة في النماذج الحية9. وهذا يدعم كذلك أن الماغنيسيوم تقديم تقييم فيفو تكون أكثر ذات الصلة وانتهاء-إلى-في الخلايا T السيارة. بالإضافة إلى ذلك، قد يساعد التحقق من السيارة تي-خلية ضد الماغنيسيوم تقييم فعاليتها أكثر حاسمة ومنع بعض التصاميم من الانتقال إلى الدراسات المجراة في قبل الأوان10؛ وبالتالي، المساهمة في البحوث المعنية أخلاقيا بالتضحية بعدد أقل من الحيوانات. وعلاوة على ذلك، بروتوكولات استخدام الماغنيسيوم ليست أغلى من نظم 2D الكلاسيكية وأسرع بكثير بالمقارنة مع الدراسات الكلاسيكية في فيفو . أخذت معا، أحد يستطيع أن يتنبأ أن إدراج دراسات كروي سيصبح قريبا الممارسة القياسية الربط بين الدراسات في المختبر والمجراه.
نقدم هنا، إعداد الماغنيسيوم من خط خلية سرطان القولون 116 كليات التقنية العليا. تم تعديل هذا الخط خلية للتعبير عن الجزيء CD19 البشرية لجعلها حساسة للخلايا T السيارة CD19 وتوفير تقييم واضح لقتل بنية سيارة سريرياً تم التحقق من صحتها باستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-جيل الماغنيسيوم من خط خلية سرطان القولون والمستقيم
- مونولاييرس خلية يغسل HCT 116 (ستابلي ترانسدوسيد للتعبير عن الكتلة 19 التمايز (CD19) والبروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)) مع الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني؛ 5 مل 25 سم2 أو 10 مل لقارورة2 75 سم). إضافة التربسين (0.5 مل 25 سم2 أو 1 مل لقارورة2 75 سم)، واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- التحقق من مفرزة الخلية تحت مجهر، وإبطال مفعول إنزيم تفكك الخلية بالكامل روزويل بارك التذكاري معهد 160 المتوسطة (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + مع الجنتامايسين؛ 10 مل 25 سم2 أو 20 مل لقارورة2 75 سم).
- إزالة طافية باستخدام ماصة تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز 5 كحد أدنى وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات مع 5 مل من إكمال RPM1 1640 المتوسطة.
- عد الخلايا باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق في عداد خلية متوافقة.
- إزالة طافية باستخدام ماصة تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز 5 كحد أدنى وريسوسبيند في المتوسط ربمي للحصول على 5 × 103 خلايا/مل.
- نقل تعليق خلية إلى خزان عقيمة والاستغناء عن 200 ميليلتر/بئر إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحات استخدام ماصة متعددة القنوات.
- نقل اللوحة إلى جهاز التصوير الآلي داخل حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة).
- تسجيل الدخول إلى برنامج اقتناء، وتحديد الجدول الزمني لاكتساب | إضافة إطلاق السفينة | المسح الضوئي في الجدول | إنشاء السفينة: جديدة.
-
حدد نوع المسح الضوئي: كروي. تحديد القنوات للفائدة: المرحلة + برايتفيلد (متابعة النمو الماغنيسيوم)، الأخضر (اتباع الإشارات الورم، وقت اقتناء 300 مللي) والأحمر (لمتابعة المبرمج، اكتساب الوقت 400 مللي ثانية).
- حدد التكبير المطلوب: 10 x.
- اختيار نموذج لوحة وموقفها في الدرج. حدد موضع الآبار الصورة. أدخل وصفاً للتجربة: الاسم، ونوع من الخلايا، وعدد الخلايا.
- لتحليل الإعداد، حدد أرجاء التحليل حتى وقت لاحق. انقر على الحق في الجدول الزمني وتحديد خيار تعيين تحديد مسح الفاصل الزمني للمجموعة وتعيين إضافة مسح كل ح 4 و عن إجمالي إلى حاء 24 تعيين وقت البدء المطلوب (على الأقل 1 ح بعد حضانة في جهاز التصوير الآلي).
-
تحقق من كل يومين لنمو الماغنيسيوم قبل تسجيل الدخول إلى برامج التصوير.
- اختر خيار عرض مؤخرا بمسح وانقر نقراً مزدوجاً فوق التجربة المرجوة. حدد برايتفيلد في لوحة القنوات الصورة وثم استخدم أداة ملامح صورة التدبير لقياس القطر الماغنيسيوم. يستغرق 6 أيام كروي للوصول إلى الحجم المطلوب: 0.5 مم للقطر. إضافة 50 ميليلتر الكامل ربمي المتوسطة الواحدة وكذلك في اليوم الرابع للحد من تأثير التبخر متوسطة.
2-توليد خلايا تي سيارة CD19
-
توسيع نطاق خلايا تي سيارة CD19
ملاحظة: تعبير مستقر من خلايا تي سيارة CD19 اشترتها توصيل معظم الفيروسات التراجعية من الجهة المانحة صحية ببمكس كما هو موضح سابقا16. الترميز بناء النسخ العكسي لسيارة CD19 سيارة الجيل الثاني ويتكون من سلسلة سكفف fmc63 والمفصلي CD8 والمجال transmembrane، مجال 4-1BB كوستيمولاتوري، وأخيراً مجال CD3ζ.- لتوسيع, الخلايا الثقافة تي ترانسدوسيد حضور الخرز المغناطيسية المضادة-CD3/28 مع خلية بنسبة 1:1 حبة لأيام 10 – 11. خلال التوسع، خلايا في المتوسط كاملة (15 س-فيفو، 5% استبدال المصل، و 100 يو/مليلتر الماشوب البشري إيل-2).
ملاحظة: كثافة مثالية لزيادة كفاءة 1 إلى 2 × 106 خلايا/مل. اعتماداً على العدد الأولى، يمكن توسيع الخلايا في قوارير (25 سم2 قوارير إلى 20 مل، وقوارير 75 سم2 إلى 40 مل حجم الإجمالي) في حاضنة ثقافة خلية (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة). - كمجموعة مراقبة سلبية لفحوصات التالية، وتشمل غير ترانسدوسيد ببمكس (سوف يشار موك) إلى البروتوكول توسع مواز للخلايا T السيارة CD19.
- في يوم 3 وإضافة متوسطة جديدة كل يوم فصاعدا، وتقسيم الخلايا إلى قوارير الثقافة أكثر إذا لزم الأمر.
- في يوم 10 – 11، خلايا أجهزة الطرد المركزي في 500 x غ 5 كحد أدنى لإزالة المادة طافية ودمج كافة الخلايا في أنبوب 50 مل واحد وريسوسبيند الخلايا في ~ 30 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة.
- ضع أنبوب 50 مل تحتوي على خلايا ريسوسبينديد على الوقوف مغناطيسي لفصل الخرز المغناطيسي من المتوسط الثقافة.
- انتظر لمدة 2-3 دقيقة الخرز جمع إلى جانب الأنبوب.
- إزالة المتوسطة الثقافة مع ماصة ونقل إلى أنبوب جديد دون لمس مناطق جمع حبة المغناطيسية.
- كرر الخطوات المتعلقة باستئصال حبة (2.1.5–2.1.7) مرة أخرى الحد من عدد الخرز المتوسط الثقافة النهائية.
- ريسوسبيند وحساب الخلايا، وضبط الكثافة إلى 1 إلى 2 × 106 خلايا/مل في المتوسط كاملة.
- بقية الخلايا لمالا يقل عن 4 ح حتى بين عشية وضحاها. ثم مباشرة تجميدها لأسفل في-80 درجة مئوية، ونقل في القنينات لخزان النتروجين سائل اليوم التالي للتخزين على المدى الطويل. وبدلاً من ذلك، واحد يمكن أن تطيل بقية تصل إلى بين عشية وضحاها للاستخدام الفوري.
- لتوسيع, الخلايا الثقافة تي ترانسدوسيد حضور الخرز المغناطيسية المضادة-CD3/28 مع خلية بنسبة 1:1 حبة لأيام 10 – 11. خلال التوسع، خلايا في المتوسط كاملة (15 س-فيفو، 5% استبدال المصل، و 100 يو/مليلتر الماشوب البشري إيل-2).
-
سيارة CD19 التعبير التحكم في خلايا تي الأولية
- حساب عدد الخلايا T الموسع كالأرقام قد تختلف بشكل طفيف بعد الثقافة بين عشية وضحاها أو معتدلاً بعد تجميد/ذوبان الجليد.
- نقل الخلايا5 من كل سيارة CD19 5 × 10 وخلايا تي الابتدائي صورية لفصل أنابيب التدفق الخلوي.
- تغسل الخلايا مع 200 ميكروليتر من "تدفق المخزن المؤقت" (2% FBS في برنامج تلفزيوني) وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 500 x ز للحد الأدنى 5 كرر الخطوات الغسيل للتخلص من أي العناصر الملموسة الناجمة عن المتوسط الثقافة.
- إعداد جسم الأولية (البيوتين الماعز الماوس المضادة "مفتش"، ₂ F(ab') بلغة محددة) عن طريق إجراء تخفيف 1: 200 في "تدفق المخزن المؤقت".
- ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة كل أنبوب واحتضان على الجليد ل 15 دقيقة كرر الخطوة الغسيل السابقة مرتين لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
- إعداد جسم الثانوي (ستريبتافيدين-PE) تمييع 1: 400 في "تدفق المخزن المؤقت".
- ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من مزيج الأجسام المضادة كل أنبوب واحتضان على الجليد ل 15 دقيقة كرر الخطوة السابقة الغسيل مرتين للتخلص من الأجسام المضادة الزائدة.
- ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من "المخزن المؤقت لتدفق" كل أنبوب ونحللها في سيتوميتير تدفق.
- استخدام خلايا "تي وهمية" لإقامة بوابة السلبية والإيجابية وتحليل CD19 سيارة ترانسدوسيد خلايا تي تبعاً لذلك.
3-3D ورم كروي قتل الإنزيم
-
بعد 6 أيام أو الماغنيسيوم مرة واحدة تصل إلى الحجم المطلوب، وإزالة اللوحة من الحاضنة. استخدام ماصة متعددة القنوات، بلطف بإزالة 100 ميليلتر/البئر متوسطة 1640 رمبي كاملة من لوحات كروي.
- لهذه الخطوة، زاوية النصائح نحو الداخل الجدار للوحة 96-الآبار، وتجنب الاتصال مع الجزء السفلي من البئر للتقليل من اضطراب الماغنيسيوم. تبقى وحدة التخزين يجب أن تكون حوالي 100 ميليلتر.
- تحضير حل 1: 200 أنيكسين الخامس أحمر بخلط 50 ميليلتر Annexin الخامس أحمر مع مل 9.95 في المتوسط RPMI 1640 كاملة.
- إضافة من 1: 200 الحل الخامس Annexin أحمر 100 ميليلتر/جيدا.
- نقل اللوحة إلى حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة) لمدة 15 دقيقة.
- حصاد الخلايا T CD19 سيارة ترانسدوسيد في الأنبوبة 15 مل والطرد المركزي لهم في 500 x ز للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية باستخدام ماصة وريسوسبيند من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات مع 2 مل من إكمال RPM1 1640 المتوسطة.
- عد الخلايا باستخدام الاستبعاد تريبان الأزرق في عداد خلية متوافقة.
- إزالة طافية باستخدام ماصة تعليق خلية أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز 5 كحد أدنى وريسوسبيند في المتوسط ربمي للحصول على 2 × 105 خلايا/مل.
- نقل تعليق خلية إلى خزان عقيمة والاستغناء عن 100 ميليلتر/بئر إلى 96-فضلا عن جولة أسفل لوحة كروي استخدام ماصة متعددة القنوات.
- نقل اللوحة مرة أخرى إلى جهاز التصوير الآلي داخل حاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO2، 95% رطوبة).
-
تسجيل الدخول إلى برنامج اقتناء، حدد "الجدول الزمني للحصول على".
- زر الماوس الأيمن فوق المخطط الزمني المسح الضوئي، وحدد تحرير الجدول الزمني. انقر بالزر الأيمن على مجموعة المسح الضوئي وحذفه. انقر بالزر الأيمن على جدول زمني، وحدد خيار تعيين تحديد مسح الفاصل الزمني للمجموعة وتعيين إضافة مسح كل ح 1.5 و ما مجموعة 24 ساعة.
- تعيين وقت البدء المطلوب (على الأقل 1 ح بعد حضانة في جهاز التصوير الآلي). حدد حفظ جدولة عمليات التفحص.
4-تحليل الصورة الآلي
- تسجيل الدخول إلى اقتناء واختيار خيار عرض مؤخرا بمسح وحدد الخيار بدء تحليل . حدد إنشاء تعريف جديد لتحليل | نوع التحليل: كروي. ضع علامة على قنوات الصورة لتحليل (المرحلة + برايتفيلد والأخضر والأحمر).
- حدد الصور التمثيلية على الأقل 10: 1 بشكل عام، كل حالة وعلى الأقل 3 نقاط الوقت (بداية والأوسط ونهاية لاقتناء).
- تحليل معاينة الافتراضي الداخلي على المكدس الصورة بأكملها.
- قم بتعديل المعلمات لقناع برايتفيلد. معلمات نموذجية: حساسية 10، فتحه ملء 1,000 ميكرومتر2، دقيقة بمنطقة 1,000 ميكرومتر2. معاينة على المكدس الصورة بأكملها، والتحقق من أن المعلمات المحدد كشف الماغنيسيوم دقة.
- قم بتعديل المعلمات للقناع الأخضر (التجارة والنقل). معلمات نموذجية: تجزئة قبعة مع دائرة نصف قطرها 200 ميكرومتر وعتبة 3 جامعة جلاسجو كالدونيان، حافة انشقت، وملء الحفرة 5,000 ميكرومتر2، ضبط الحجم-2 بكسل، منطقة دقيقة 3,000 ميكرومتر2. معاينة على المكدس الصورة بأكملها، والتحقق من أن المعلمات المحدد كشف الماغنيسيوم دقة.
- قم بتعديل المعلمات للقناع الأحمر (أنيكسين V). معلمات نموذجية: تجزئة قبعة مع دائرة نصف قطرها 150 ميكرومتر وعتبة 2 جامعة جلاسجو كالدونيان، حافة انشقت، وملء الحفرة 5,000 ميكرومتر2، وضبط حجم 0 بكسل، منطقة دقيقة 1,000 ميكرومتر2. معاينة على المكدس الصورة بأكملها، والتحقق من أن المعلمات المحدد كشف الماغنيسيوم دقة.
-
بدء تشغيل المحلل.
- بمجرد القيام بالتحليل، استخراج قياس الفائدة. حدد الملف تم تحليلها ومن ثم خيار مقاييس الرسم البياني . تحديد المقاييس للفائدة، والمسح الضوئي والبئر. عادة، يعطي كثافة الأحمر والأخضر مجموع حدود برايتفيلد قياسات أكثر دقة بتقييد الإشارة الواردة من الأسفار إلى حدود الماغنيسيوم يحدده القناع برايتفيلد (الشكل 3). استخراج المقاييس المحددة في عدة تنسيق الملف عن طريق النقر على "تصدير البيانات".
- المضي قدما لاستخراج الصور والأفلام عن طريق تحديد الملف تم تحليلها ومن ثم حدد خيار تصدير الصور والأفلام . يتوفر خياران، أما ك "عرض" لاسترداد الصور والأفلام كما ينظر في برامج التصوير (الصور المركبة عادة)، أما "كتخزين" لاسترداد البيانات الخام للتحليل الخارجي من خلال برامج الجزء الثالث.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وكما يتبين في الشكل 1، من الأهمية بمكان للتحقق من التدفق الخلوي مستوى التعبير عن السيارة CD19 على خلايا تي (الشكل 1A) ومستوى CD19 في خطوط الخلايا السرطانية HCT116 (الشكل 1B). الشكل 2 تجسد نتائج تجربة نموذجية كروي. جهاز التصوير الآلي، تلتقط صوراً في أربع قنوات مختلفة: حقل مشرق، والأسفار المرحلة والأخضر والأحمر. يتم استخدام القناة المرحلة لتأكيد تشكيل الماغنيسيوم بعرض الحدود يتناقض شديدة القرب من الماغنيسيوم (وعلامة على تشكيل كروي). يتم استخدام الحقل مشرق أثناء عملية التحليل للكشف عن حجم الماغنيسيوم وتقييد إشارة خضراء (الورم) وإشارة حمراء (المبرمج) إلى الحدود المذكورة آنفا. أنه يسمح لأحد عدم النظر في أحداث لا علاقة لها مباشرة الماغنيسيوم (الخلايا السرطانية على سبيل المثال معزولة وعلى المبرمج). وتمثل الخطوط الخضراء والحمراء الإشارات الخضراء والحمراء على التوالي نظرت في حساب المقاييس. في الشكل 2، حقل مشرق، استخرجت القنوات المرحلة والأخضر والأحمر من خلال خيار "كما هو مخزن" حين استخرجت من خلال خيار "عرض" الصور المركبة وهي الممثل للمقاييس التي عرضها في الشكل 3. كما يتبين في الشكل 2، خلافا لخلايا "تي موك"، خلايا "تي CD19 سيارة" كانت قادرة على قتل على وجه التحديد الماغنيسيوم ويقلل كثيرا من عدد الخلايا السرطانية الحية.
يعرض الشكل 3 تطور إجمالي الخضراء وقياس إشارة حمراء داخل حدود كروي على مر الزمن. كما يمكن أن يرى، قريبا بعد حقن الخلايا CD19 سيارة تي، حجم الماغنيسيوم ينكمش بسرعة (مقاسا بإشارة الفلورية الخضراء) وإشارة المبرمج الزيادات بسرعة (مقاسا بإشارة حمراء الأسفار).
رقم 1: سطح التعبير سيارة CD19 و CD19. (أ) التعبير السطحي CD19 سيارة في خلايا تي ريتروفيرالي ترانسدوسيد. وجرى تحليل الخلايا بالتدفق الخلوي قبل مقايسة كروي عن طريق مكافحة-موس-القوات المسلحة البوروندية بيوتينيلاتيد الأولية ومكافحة--ستريبتافيدين--PE كجسم الثانوية. (ب) التعبير السطحية من CD19 في ريتروفيرالي ترانسدوسيد HCT116 الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تقييم السيارة CD19 تي خلية سيتوتوكسيسيتي ضد الورم الماغنيسيوم. الفاصل الزمني للنمو كروي HCT116؛ عند t = ح 138، أدخلت خلايا وهمية أو CD19 سيارة تي في كثافة الخلايا 20000/جيدا. يتوافق مع إشارة خضراء للتجارة والنقل HCT116 + الخلايا ويتوافق مع مخطط الخضراء كروي تم الكشف عنها. إشارة حمراء يناظر المبرمج كما رصدتها V أننيكسين وأحمر يتوافق مع الأحداث التي تم الكشف عنها المبرمج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: قناع القياسات من مجموع الإشارات الحمراء والخضراء داخل برايتفيلد الحدود مع مرور الوقت- وتم الحصول على مجموع الإشارات الحمراء والخضراء ضمن المقاييس قناع برايتفيلد بعد تحليلها ورسم كدالة للزمن. خط متقطع يناظر إدخال خلايا المستجيب (CD19CAR أو وهمية الخلايا التائية). يناظر التدبير يعني ± ووزارة شؤون المرأة (n = 12). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أصبح استخدام الماغنيسيوم كأداة مبتكرة للتحقق من صحة علاج السرطان مستقبلا مجال يحظى باهتمام متزايد في السنوات الأخيرة. الماغنيسيوم تمثل خطوة وسيطة بين الكلاسيكية 2D تحليل في المختبر والمجراه في التقييم. الأسلوب كذلك يحمل الكثير من الأمل فيما يتعلق بقوتها من ناحية الورم الصغير-بيئة محاكاة فضلا عن الجينات التنميط7. البروتوكول الواردة في هذا المنشور تم تكييفها من ساهين et al.11 إلى S3 إينكوسيتي ويمثل طريقة سهلة وميسورة التكلفة لإنتاج الماغنيسيوم الورم 3D من خطوط خلايا القولون والمستقيم. اقتران جيل كروي لجهاز تصوير الفائق تصاريح موثوق بها وسرعة الفحص لمجموعة واسعة من العوامل المضادة للورم ورصد قدرة الوكيل المذكور آنفا على زعزعة استقرار هيكل الورم.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لتأخذ في الاعتبار فيما يتعلق بهذا البروتوكول. أولاً، يحتاج انطلاق عدد الخلايا السرطانية ضبط التحديد. إذا كانت كثافة خلية البداية عالية جداً، الخلايا سوف تتحلل في PLL طلاء سريعاً وسوف تبدأ في شكل أحادي الطبقة ملتصقة. من ناحية أخرى، سوف يعرض عدد قليل من الخلايا تقلب عالية من حيث حجم كروي وعدد الماغنيسيوم كل بئر. ثانيا، استخدام جهاز التصوير الآلي هو تعريض الخلايا لالضيائيه المحتملة (خاصة إذا كان يتم استخدام العديد من القنوات الأسفار)؛ من المستحسن لضبط تردد الصورة إلى أدنى حد من الأضرار التي لحقت الماغنيسيوم. أنها معلمة حرجة للنظر من أجل التقاط الأحداث التي تهم موثوق (صورة كل 4 ساعات قبل إدخال خلية المستجيب وواحد يمثل كل 90 دقيقة بعد أفضل حل وسط على حد علمنا). ثالثا، نوصي بعناية خاصة لتجنب التبخر المتوسطة التي يمكن أن تحدث بعد إدخال خلية المستجيب بضعة أيام. رابعا، عدد المستجيب الخلايا يحتاج أيضا إلى تعديل التحديد: العدد المطلوب يحتاج إلى أن تكون مرتفعة بما يكفي لقتل الورم الماغنيسيوم كفاءة ولكن أيضا منخفض ممكن للسماح بإمكانية أعلى لعملية التصوير الأمثل. خامسا، في تجربة نموذجية، بئر يحتوي على الماغنيسيوم 2 إلى 4 التي يمكن بلورتها في واحدة؛ يوصي بإيلاء اهتمام للمسامير المحتملة التي قد تندلع في المقاييس عقب هذا الحدث، وتجاهل لهم. سادسا، على لوحة 96، حسنا، في متوسط 20 إلى 50 بئرا تحتوي على الماغنيسيوم في العدد المطلوب والحجم؛ نوصي بالتحقق من الآبار للنظر في التحليل قبل إدخال خلايا المستجيب، فإنه سيتم حفظ حساب الوقت. وأخيراً، التحليل الآلي جزئيا لكن يستلزم بعض المدخلات من المستخدم فيما يتعلق بمعايير مختلفة. من المستحسن جداً أن عناية خاصة في هذه الخطوة، والتركيز على إيجاد توازن بين الحساسية والنوعية. إذا كان نوع علاج مدمني المخدرات خلايا المستجيب تختلف على نطاق واسع داخل تجربة واحدة، قد يكون من اللازم لتشغيل أنواع مختلفة من تحليل لاختيار واحد يلائم الأفضل.
هذا الأسلوب حتى الآن تقتصر على نوع معين من خط خلية ملتصقة (في هذا المنشور HCT 116)؛ كذلك التنمية مطلوب للتعميم هذا البروتوكول لكل خط خلية سرطانية. على الرغم من مجموعة واسعة من الأساليب متاحة بالفعل لعدد أكبر من الهدف خلايا12،،من1314،15، معظمهم من الاعتماد على استخدام إجراءات مكلفة أو معقدة. أسلوبنا، على الرغم من أن يقتصر على أنواع قليلة من الخلايا الهدف حتى الآن، من المثير للاهتمام أنه يتطلب مدخلات محدودة للغاية من المجرب وتسمح شاشة سريع وسهل من مختلف المخدرات و/أو العلاج المناعي (الخلايا CD19 سيارة هنا). مصداقيتها وقدرتها على أن تتكيف مع أنواع مختلفة من العلاجات تجعل هذا الأسلوب أداة قوية في سياق عملية التحقق من صحة العلاج المضادة للسرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
هذا العمل كان يدعمها "مجلس البحوث النرويجي" إطار المنح #244388، #254817 و #284983؛ جمعية السرطان النرويجية (#6829007)؛ المنطقة الصحية النرويجية جنوب شرق تحت منحة #17/00264-6 و #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
