Summary
该方案旨在实时评估免疫治疗重定向 t 细胞 (car t 细胞) 对三维结构癌细胞 (球体) 的细胞毒性。
Abstract
免疫治疗已成为人们对抗癌斗争越来越感兴趣的领域, 否则是无法治疗的。在所有的免疫治疗方法中, 嵌合抗原受体 (car) 重定向 t 细胞获得了最壮观的结果, 特别是与儿科 b 急性淋巴细胞白血病 (b-all)。传统的 car t 细胞验证方法依赖于使用特异性和功能检测的 car t 细胞对目标细胞在悬浮和异种移植模型。不幸的是, 在体外进行的观测往往与在体内获得的结果脱钩, 通过增加另一个步骤, 可以避免大量的努力和动物的使用: 使用3d 培养。在将肿瘤细胞移植到动物模型中时, 从模仿肿瘤细胞三维结构的潜在靶细胞中产生球体是一种理想的选择。在这里, 我们报告了一种经济实惠、可靠和简单的方法, 从被转移的结直肠细胞系中生产球体, 作为采用细胞治疗的验证工具 (cd19 car t 细胞就是这里的例子)。该方法与先进的活体成像系统相结合, 可跟踪球体生长、效应细胞细胞毒性和肿瘤细胞凋亡。
Introduction
采用细胞转移 (act) 是下一代癌症治疗。它依赖于向患者注射效应细胞 (t-或 nk 细胞)。这些细胞可以用受体进行基因改造, 引导它们找到目标--肿瘤, 并摧毁它。最近, 当针对 b 细胞标记 cd19 的 chimeric 抗原受体 (car) 被引入患者 t 细胞以杀死他/她的癌症1时, 这种方法被证明是可行的。在 car 的情况下, 这是一个人工受体, 设计包括特定的抗体片段, 抗原结合域减少到一个实体指定的单链变量片段 (scfv), 链接到 t 细胞信令域。虽然有几种设计, 最常用的版本被称为第二代 car 设计, 包括 cd3z 的 tcr 信号和一个共同刺激域 (cd28, 4-1b, ox40 等)1,2. 当 cd19 car-t 细胞有效地治疗了许多 b 细胞恶性肿瘤患者 3,4时, 免疫治疗领域的大部分注意力都集中在了这种新的 act 形式上。在这一成功之后, 研究人员试图利用类似的设计, 将其他表位瞄准实体肿瘤, 但成效有限。不幸的是, 肿瘤特异性抗原的缺乏和更恶劣的肿瘤微环境使 car t 细胞对实体肿瘤的效果降低5。
目前, 最常用的体外验证策略依赖于二维 (2d) 系统, 这些系统只解决已经提到的实体肿瘤挑战的一个片段。传统上, 2d体外系统涉及 car t 细胞和目标癌细胞系的混合物作为单层, 以评估这些效应细胞的功能和特异性。虽然这些策略是研究的重要和重要部分, 但它们没有考虑到癌细胞的复杂形态和三维结构.在三维系统中培养的癌细胞, 称为球体, 通过基因表达谱7的变化获得新的表型特征, 这可能会影响定向效应细胞的识别。birgersdotter 和他的同事证明, 霍奇金淋巴瘤 (hl) 细胞系, 当只生长在三维培养模型中时, 获得的基因表达谱与原发肿瘤样本相似8。因此, 与标准的2d 系统相比, 球体或类似的3d 培养方法提供了更相关的体外模型。这类系统也类似于体内研究, 这些研究被视为特定 car 验证过程的最后一步。考虑到2d 系统无法模拟癌症簇的形态, 球体提供了类似的形态, 以评估 car t 细胞的功能之前, 体内模型。在一项研究中, pickl 等人确定, 人类表皮生长因子受体 (her2) 过度表达的球状模型显示出与体内模型9相似的信号特征。这进一步支持了球体提供了更相关和更接近体内的 car t 细胞评估。此外, car t 细胞对球体的验证可能有助于更严格地评估其有效性, 并防止一些设计过早转移到体内研究 10;因此, 通过牺牲较少的动物来促进伦理相关的研究。此外, 与经典的体内研究相比, 使用球体的协议并不比经典的 2d系统昂贵得多, 而且速度也更快。综合来看, 可以预测, 纳入球体研究将很快成为将体外研究和体内研究联系起来的标准做法。
在这里, 我们提出了从结肠癌细胞系 hct 116 的球体的制备。对该细胞系进行了修饰, 以表达人类 cd19 分子, 使其对 cd19 car t 细胞敏感, 并使用临床验证的 car 结构对杀灭事件进行明确评估。
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Protocol
1. 大肠癌细胞系的球虫生成
- 清洗 hct 116 (稳定地转化为表达分化 19 (cd19) 和绿色荧光蛋白 (gfp) 的细胞单层与磷酸盐缓冲盐水 (pbs; 5 ml 为 25 cm 2 或 10 ml 为 75 cm 2瓶)。加入胰蛋白酶 (25 厘米2或1毫升为75厘米2瓶 0.5 ml) , 并在37°c 孵育细胞5分钟。
- 在显微镜下检查细胞分离, 并与完整的罗斯威尔公园纪念研究所160培养基 (rpmi 1640) 中和细胞离解酶 (rpmi 1640 + 10% fcs + 庆大霉素; 75 厘米2瓶25厘米或20毫升10 毫升) 。
- 离心细胞悬浮液在 500 x克5分钟内, 使用移液器去除上清液, 并用5毫升的完整 rpm1 1640 介质上下移液多次重新悬浮。
- 在兼容的单元格计数器上使用 trypan 蓝色排除计数单元格。
- 将细胞悬浮液离心为 500 x g 5分钟, 用移液器去除上清液, 在 rpmi 介质中重新悬浮, 以获得 5 x10 3 cells/mL ml。
- 将细胞悬浮液转移到无菌储液库中, 并使用多通道移液器将200μl·井放入96孔圆形底板中。
- 将板材转移到孵化器内的自动成像设备 (37°c、5% co2、95% 湿度)。
- 登录到采集软件, 选择获取计划启动添加容器按计划扫描创建容器: 新建。
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选择扫描类型: 水手。选择感兴趣的渠道: 相位 + 光明场 (跟随球体生长), 绿色 (跟随肿瘤信号, 获取时间 300 ms) 和红色 (跟随细胞凋亡, 获取时间 400 ms)。
- 选择所需的放大倍率: 10倍。
- 选择板模型及其在抽屉中的位置。选择要图像的井的位置。输入实验的描述: 名称、单元格类型、单元格数。
- 对于分析设置, 请选择 "推迟分析到以后"。右键单击时间线, 然后选择 "设置选定的扫描组间隔"选项, 并将"添加扫描 " 设置为 4小时, "总" 为 24小时. 设置所需的开始时间 (在自动成像设备中孵化后至少 1小时)。
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通过登录成像软件, 每2天检查一次球体的生长情况。
- 选择"查看最近扫描" 选项,然后双击所需的实验。在图像通道面板中选择"光明场", 然后使用"测量图像特征" 工具测量球体的直径。球体需要6天时间才能达到所需的尺寸: 直径 0.5 mm。在第4天每口井中加入50μl 的完整 rpmi 介质, 以限制介质蒸发效应。
2. cd19 car t 细胞的产生
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cd19 car t 细胞的扩展
请注意:如前所述,通过对健康供体 pbmc 的大容量抗逆转录病毒转导获得 cd19 ctt 细胞的稳定表达。cd19 car 的逆转录病毒构造编码是第二代 car, 由 fmc63 scfv 链、cd8 铰链和跨膜域、4-1bb 共刺激域和 cd3 域组成。- 为了扩大, 在抗 cding-28 磁珠的存在下培养被转移的 t 细胞, 其细胞与珠子的比率为 1:1, 为期10-11天。在扩张过程中, 细胞处于完全的培养基中 (x-vivo 15, 5% 血清置换术和 100 uml 重组人 il-2)。
请注意:有效扩展的理想密度为1至 2 x10 6 cells/mL ml。根据初始数量, 细胞可以在细胞培养孵化器 (37°c、 5% co 2、95% 湿度) 中以烧瓶 ( 25 厘米2瓶到20毫升, 75 厘米2瓶至总体积40毫升) 的单位扩大. - 作为以下检测的阴性对照组, 将非转换的 pbmc (称为 mock) 纳入与 cd19 car t 细胞平行的扩展协议。
- 在第3天及以后, 每天添加新鲜培养基, 必要时将细胞分成更多的培养瓶。
- 在第10-11 天, 离心细胞在 500 x g 5分钟内取出上清液, 并将所有细胞合并成一个50毫升管, 并将细胞重新悬浮在约30毫升的新鲜完整培养基中。
- 将装有重新悬浮细胞的50毫升管放置在磁支架上, 将磁珠与培养基分离。
- 等待 2-3分钟, 珠子在管的一侧收集。
- 用移液器取出培养基, 转移到新管, 而不接触磁珠收集区。
- 再次重复有关去除珠子 (2.1.5 – 2.1.7) 的步骤, 以限制最终培养基中的珠子数量。
- 重新扫描和计数细胞, 调整密度为1到 2x106 细胞在完整的介质。
- 将细胞休息至少 4小时, 直到一夜。然后直接将它们冷冻在-80°c, 并在第二天将小瓶转移到液氮罐中进行长期储存。或者, 可以将剩下的延长到夜间立即使用。
- 为了扩大, 在抗 cding-28 磁珠的存在下培养被转移的 t 细胞, 其细胞与珠子的比率为 1:1, 为期10-11天。在扩张过程中, 细胞处于完全的培养基中 (x-vivo 15, 5% 血清置换术和 100 uml 重组人 il-2)。
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cd19 汽车对原代 t 细胞的表达控制
- 计算扩大 t 细胞的数量, 因为这些数字在夜间培养后可能略有变化, 在冻融后略有变化。
- 从 cd19 car 和 moock 原代 t 细胞转移 5 x 10 5 细胞, 以分离流式细胞术管。
- 用200μl 的流量缓冲器清洗细胞 (pbs 中的 2% fbs), 并以 500 x g离心管 5分钟. 重复清洗步骤, 以消除由培养基引起的任何伪影。
- 通过在流量缓冲器中进行1:200 稀释, 制备原代抗体 (生物肌抗小鼠 igg、f (ab) 片段)。
- 将每个管100μl 抗体混合中的细胞重新注射, 在冰上孵育 15分钟. 重复上一步的清洗步骤两次, 去除多余的抗体。
- 在流动缓冲器中制备 1: 400 稀释的二级抗体 (streptavidin-pe)。
- 将每个管100μl 抗体混合中的细胞重新注射, 在冰上孵育 15分钟. 重复上一步的清洗步骤两次, 以去除多余的抗体。
- 将每个管200μl 的流动缓冲液中的细胞重新移植, 并在流式细胞仪上进行分析。
- 利用模拟 t 细胞建立负门和正门, 并相应地分析 cd19 car 转移 t 细胞。
3. 3d 肿瘤球虫杀病检测
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6天后或一旦球体达到所需的大小, 从孵化器中取出盘子。使用多通道移液器, 轻轻地从球体板中取出 100μl/井的完整 rmpi 1640 介质。
- 在这一步中, 将尖端朝向96井板的内壁, 避免与井底接触, 以最大限度地减少球体的干扰。剩余体积应在100μl 左右。
- 通过将附件素 v 红色50μl 与完整 rpmi 1640 介质的 9.95 ml ml 混合, 制备附件素 v 红色的1:200 溶液。
- 加入100μl/井的 1: 200 附件 v 红色溶液。
- 将板材转移到孵化器 (37°C, 5% co2, 95% 湿度) 15分钟。
- 在15毫升管中采集被转移的 car cd19 t 细胞, 并以 500 x g的速度离心, 用移液器取出上清液, 用完整 rpm1 1640 介质的2毫升上下移液多次重新悬浮。
- 在兼容的单元格计数器上使用 trypan 蓝色排除计数单元格。
- 将细胞悬浮液离心为 500 x g 5分钟, 用移液器去除上清液, 在 rpmi 介质中重新悬浮, 以获得 2 x10 5 cells/mL ml。
- 将细胞悬浮液转移到无菌储液库中, 并使用多通道移液器将100μl·well 放入96孔圆形底部球体板中。
- 将印版转移回孵化器内的自动成像设备 (37°c、5% co2、95% 湿度)。
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登录到采集软件, 选择 "获取计划"。
- 右键单击 "扫描时间线", 然后选择"编辑时间线"。右键单击扫描组并将其删除。右键单击时间线, 然后选择 "设置选定的扫描组间隔" 选项,并将"每小时添加扫描" 设置为 1.5 h,将总扫描设置为24小时。
- 设置所需的开始时间 (在自动成像设备中孵育后至少 1小时)。选择"保存计划扫描"。
4. 自动图像分析
- 登录到获取, 选择"查看最近扫描"选项, 然后选择"启动分析"选项。选择"创建新的分析定义"分析类型: 球体。标记要分析的图像通道 (相位 + 光明场、绿色和红色)。
- 选择至少10张代表性图像: 通常为每个条件 1个, 至少3个时间点 (采集的开始、中间和结束)。
- 预览整个图像堆栈上的默认分析过程。
- 修改明田掩码的参数。典型参数为: 灵敏度 10, 孔填充 1, 000μm 2, 最小面积 1, 000μm2.预览整个图像堆栈, 并检查所选参数是否准确地检测到球体。
- 修改绿色掩码 (gfp) 的参数。典型参数是: 顶帽子分割半径为 200μm, 阈值为 3 gcu, 边缘拆分, 孔填充5, 000μm 2, 调整大小-2 像素,面积最小 3, 000μm 2。预览整个图像堆栈, 并检查所选参数是否准确地检测到球体。
- 修改红色掩码 (附件 v) 的参数。典型参数是: 顶帽子分割半径为 150μm, 阈值为 2 gcu, 边缘拆分, 孔填充5, 000μm 2, 调整大小0像素,面积最小 1, 000μm 2。预览整个图像堆栈, 并检查所选参数是否准确地检测到球体。
-
启动分析仪。
- 分析完成后, 提取兴趣的度量值。选择分析的文件, 然后选择"图形指标"选项。选择感兴趣的指标、扫描和油井。通常情况下, 明亮场边界内的总红色和绿色强度通过将荧光信号限制在由明亮场掩码确定的球体边界来提供最准确的测量 (图 3)。点击 "导出数据", 以多种文件格式提取选定的指标。
- 通过选择分析的文件继续提取图像和影片, 然后选择 "导出图像和电影"选项。有两个选项可用, 一种是 "显示" 用于检索成像软件 (通常是复合图像) 上显示的图像和电影, 也可以是 "作为存储" 检索原始数据, 以便通过第三方软件进行外部分析。
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Representative Results
如图 1所示, 通过流式细胞仪检查 cd19 car 在 t 细胞上的表达水平 (图 1 a) 和 cd19 在 hct116 肿瘤细胞系上的表达水平 (图 1 b) 是至关重要的。图 2说明了典型球体实验的结果。自动成像仪在四个不同的通道中拍照: 明亮的场、相位、绿色和红色荧光。相位通道是用来断言球体的形成, 通过显示高度对比边界附近的球体 (这是一个球体形成的标志)。在分析过程中, 利用明亮场检测球体的大小, 并将绿色信号 (肿瘤) 和红色信号 (凋亡) 限制在上述边界内。它允许你不考虑事件直接地与球体无关 (例如被隔绝的肿瘤细胞和他们的细胞凋亡)。绿色和红色轮廓分别表示指标计算中考虑的绿色和红色信号。在图 2中, 明亮的字段、相位、绿色和红色通道是通过 "如存储" 选项提取的, 而复合图像是通过 "如显示" 选项提取的, 是图 3中显示的指标的代表。如图 2所示, 与 mockt 细胞不同, cd19 car t 细胞能够专门杀死球体, 并大大减少活体肿瘤细胞的数量。
图 3显示了在球体边界内测量的总绿色和红色信号随时部的演变情况。可见, cd19 car t 细胞注射后不久, 球体的大小迅速缩小 (用绿色荧光信号测量), 凋亡信号迅速增加 (用红色荧光信号测量)。
图 1: cd19 car 和 cd19 的表面表达式.(a) cd19 car 在逆转录病毒 t 细胞上的表面表达。在球囊法之前, 通过抗小鼠法 b 生物素化作为原代和抗流孢他卜素-pe 作为二级抗体, 用流式细胞仪对细胞进行分析。(b) cd19 在逆转录病毒 hct116 细胞上的表面表达。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: cd19 car t 细胞细胞毒性对肿瘤球体的评估.hct116 球体生长的时间推移在 t此时 133小时, 在20000细胞/井的密度下引入了 mock 或 cd19 car t 细胞。绿色信号对应于 hct116 gfp + 细胞, 绿色轮廓对应于检测到的球体。红色信号对应于由附件素 v 监测的细胞凋亡, 红色轮廓对应于检测到的凋亡事件。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 随着时间的推移, 在明亮场掩码边界内测量总的红色和绿色信号.通过对明亮场掩模指标中的红色和绿色信号进行分析并绘制为时间函数后, 获得了总的红色和绿色信号。虚线对应于效应细胞的介绍 (cd19car 或 mock t 细胞)。测量对应于平均±sem (n邦 12)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在过去几年里, 使用球体作为验证未来癌症治疗的创新工具已成为一个越来越受关注的领域。球体是经典的二维体外分析和体内评估之间的中间步骤。该方法在肿瘤微环境模拟和基因分析方面对其效力有进一步的希望.本出版物中提出的协议从 saheen 等人11 改编为 inculyte s3, 是一种从结肠直肠细胞系生产三维肿瘤球体的经济实惠且简单的方法。将球体生成到高通量成像设备, 可以可靠和快速地筛选各种抗肿瘤药物, 并监测上述药物破坏肿瘤结构稳定的能力。
在本议定书方面, 有几个关键步骤需要考虑。首先, 肿瘤细胞的起始数需要精确调整。如果起始细胞密度过高, 细胞将迅速降解 pll 涂层, 并开始形成粘附单层。另一方面, 少量的细胞会在球体大小和每口球体数量方面引入高变异性。其次, 使用自动成像设备是使细胞暴露在潜在的光毒性下 (特别是在使用多个荧光通道的情况下);建议调整图像频率, 以最大限度地减少对球体的伤害。它是一个关键的参数, 以可靠地捕获感兴趣的事件 (在效应单元引入之前每4小时拍摄一次图像, 在90分钟后每隔90分钟显示对我们所知的最佳妥协)。第三, 我们建议特别小心, 避免介质蒸发, 可能发生几天后, 效应细胞引入。第四, 效应细胞的数量也需要精确调整: 所需的数量需要足够高, 以有效地杀死肿瘤球体, 但也尽可能低, 以允许最佳成像过程的最大潜力。第五, 在一个典型的实验中, 一口井包含2到4个球体, 可以合并成一个;建议注意此事件后指标中可能爆发的潜在峰值, 并忽略它们。第六, 在96孔板上, 平均20至50口井含有所需数量和大小的球体;我们建议在引入效应电池之前检查要考虑进行分析的井, 因为这样可以节省计算时间。最后, 分析是部分自动化的, 但需要用户提供有关不同参数的一些输入。强烈建议在这一步骤中特别注意, 并注重敏感性和特异性之间的平衡。如果在一个实验中, 效应细胞药物治疗的类型差别很大, 则可能需要运行不同类型的分析, 以选择最适合的分析。
到目前为止, 这种方法只限于某种类型的粘附细胞系 (在本出版物 hct 116 中);需要进一步发展, 将这一协议推广到每一个癌细胞系。虽然已经有广泛的方法可用于更多的目标单元 12,13,14, 15, 其中大多数依靠使用昂贵和复杂的程序.我们的方法, 虽然到目前为止仅限于少数类型的目标细胞, 是有趣的, 因为它需要非常有限的投入, 从实验者, 并允许各种药物和/或免疫治疗 (这里 car cd19 细胞) 快速和容易的屏幕。它的可靠性和适应不同种类治疗的能力, 使这种方法成为抗癌治疗验证过程中的有力工具。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了挪威研究理事会在赠款 #244388、#254817 和 #284983 项下的支持;挪威癌症协会 (#6829007);根据赠款 #17/00264-6 和 #2016006, 挪威健康地区东南部。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
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