Summary
Denne protokollen er utformet for å vurdere immunterapeutisk omadresserte T-celle (bil T-celle) cytotoksisitet mot 3D strukturert cancerous celler (spheroids) i sanntid.
Abstract
Immunterapi blitt et felt av økende interesse i kampen mot kreft noe annet botemiddel. Blant alle immunterapeutisk metoder Omdirigert chimeric antigen reseptor (bil) T celler Hentet mest spektakulære resultater, spesielt med pediatric B-akutt lymfatisk leukemi (B-alle). Klassisk validering metoder for bil T celler er avhengige av bruk av spesifisitet og funksjonalitet analyser av bilen T-celler mot målet celler i suspensjon og xenograft modeller. Dessverre observasjoner gjort i vitro er ofte skilt fra resultatene i vivo og mye innsats og dyr kan bli spart ved å legge til et trinn: bruk av 3D kultur. Produksjonen av spheroids av potensielle målcellene som etterligner 3D strukturen av kreftceller når de er engrafted inn i dyr modellen representerer et ideelt alternativ. Her rapporterer vi et rimelig, pålitelig og enkel metode for å produsere spheroids fra en transduced colorectal cellen linje som en validering verktøy for adopsjon cellen terapi (eksemplifisert her ved CD19 bil T celler). Denne metoden er kombinert med et avansert live tenkelig system som kan følge spheroid vekst, Effektor celler cytotoksisitet og tumor celle apoptose.
Introduction
Adopsjon celle overføring (ACT) representerer neste generasjon kreftbehandling. Det er avhengig av injeksjon av Effektor celler (T - eller NK-cellene) i en pasient. Disse cellene kan være genmodifiserte med en reseptor som vil veilede dem til sine mål, svulst, og ødelegge den. Nylig viste denne tilnærmingen seg å være mulig da Chimeric Antigen reseptor (bil) rettet mot B-celle markøren CD19 ble introdusert i pasienten T-celler å drepe sin kreft1. I bilen, som er en kunstig reseptor, design består av spesifikt antistoff, antigen bindende domene redusert til en enhet angitt enkelt kjede variabel fragment (scFv), knyttet til T-celle signalnettverk domenene. Men det er flere design, de mest brukte versjonene omtales som andre generasjon design, består av CD3z for TCR signalering og ett co-stimulatory domene (CD28, 4-1BB, OX40, etc.) 1 , 2. feltet immunterapi rettet mesteparten av sin oppmerksomhet til denne nye formen for ACT når CD19 bil-T celler efficaciously behandlet mange pasienter med B-cell malignancies3,4. Etter denne suksessen, forskere forsøkt å utnytte lignende design av målretting andre epitopes for solide svulster med begrenset suksess. Dessverre, mangelen på svulst bestemt antigener og strengere svulst microenvironments gjengitt bil T celler mindre effektiv mot solide svulster5.
Foreløpig er de mest brukte i vitro validering strategiene avhengige av todimensjonal (2D) systemer som bare adressen et fragment av allerede nevnte solid tumor utfordringene. Klassisk, innebære 2D i vitro systemer en blanding av bilen T celler og målet kreftcelle linjer som monolayers å vurdere funksjonalitet og spesifisitet av disse Effektor celler. Selv om disse strategiene er viktig og avgjørende deler av studiene, tar de ikke hensyn kompleks morfologi og tredimensjonale (3D) strukturen av kreft celler6. Kreftceller kultivert i 3D systemer, referert til som spheroids, få nye fenotypiske trekk gjennom endringer i gene expression profil7, som kan påvirke erkjennelsen av omadresserte Effektor celler. Birgersdotter og kolleger viste at en Hodgkin lymfom (HL) cellen linje når bare vokst i en 3D kultur modell kjøper en genet uttrykk profil som ligner primære svulst prøver8. Derfor kultur spheroids eller lignende 3D metoder tilbyr mer relevante i vitro modeller i motsetning til standard 2D systemer. Slike systemer er også like i vivo studier som er sett på som det siste trinnet i valideringsprosessen for en gitt bil. Tatt i betraktning at 2D systemer mislykkes å etterligne morfologi av kreft klynger, spheroids tilbyr lignende formasjoner for å vurdere funksjonaliteten til bilen T celler før i vivo modeller. I en studie, Pickl et al. identifisert at en spheroid modell av menneskelig epidermal vekstfaktor reseptor (HER2) overexpressing kreftceller vist lignende signalnettverk profiler i vivo modeller9. Dette støtter ytterligere spheroids tilby mer relevant og close-til-in vivo vurdering av bilen T-celler. I tillegg bil T-cellevalidering mot spheroids kan hjelpe vurdere deres effekt mer kritisk og hindre noen av designene i å flytte til i vivo studier for tidlig10; dermed bidrar til etisk berørte forskning med å ofre færre dyr. Videre er protokollene ved hjelp spheroids ikke dyrere enn klassisk 2D systemer og mye raskere sammenlignet med klassisk i vivo studier. Sammen kan en forutsi at inkludering av spheroid studier vil snart bli vanlig praksis å koble i vitro og in vivo studier.
Her presenterer vi utarbeidelsen av spheroids fra kolon kreft cellen linje HCT 116. Denne cellen linjen ble endret for å uttrykke den menneskelige CD19 molekylet å gjengi den følsomme for CD19 bil T celler og gi en klar vurdering av drapet bruke en klinisk godkjent bil konstruksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon Spheroids fra tykktarmskreft cellen linje
- Vask HCT 116 (stabilt transduced for å uttrykke Cluster for differensiering 19 (CD19) og grønn fluorescens Protein (GFP)) cellen monolayers med fosfat bufret saltvann (PBS, 5 mL for en 25 cm2 eller 10 mL for en 75 cm2 kolbe). Legg trypsin (0,5 mL for en 25 cm2 eller 1 mL for en 75 cm2 kolbe) og ruge celler ved 37 ° C i 5 minutter.
- Når cellen avdeling under et mikroskop og nøytralisere celle dissosiasjon enzymet med komplett Roswell Park Memorial Institute 160 medium (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + Gentamycin; 10 mL for en 25 cm2 eller 20 mL for en 75 cm2 kolbe).
- Sentrifuger celle suspensjon på 500 x g for 5 min. Fjern supernatant bruker en pipette og resuspend av pipettering opp og ned flere ganger med 5 mL av komplett RPM1 1640 medium.
- Telle celler med Trypan blå utelukkelse på en kompatibel celle teller.
- Sentrifuger celle suspensjon på 500 x g for 5 min. Fjern supernatant bruker en pipette og resuspend i RPMI medium å få 5 x 103 celler/mL.
- Overføre celle suspensjon til et sterilt reservoar og dispensere 200 µL/godt inn i en 96-brønns rundt bunnplater bruker en flerkanals pipette.
- Overføre platen til den automatiserte tenkelig apparatet inne en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet).
- Logge oppkjøpet programvaren, velg Planen å skaffe | Lanseringen legge fartøyet | Skanne etter planen | Opprette fartøy: ny.
-
Velg Skann Type: Spheroid. Velg kanalene av interesse: fase + Brightfield (å følge spheroids vekst), grønn (for å følge svulst signal, oppkjøpet tid 300 ms) og rød (for å følge apoptose, oppkjøpet tid 400 ms).
- Velg ønsket forstørrelsen: 10 x.
- Velg platen modellen og sin posisjon i skuffen. Velg stillingen brønner å image. Angi beskrivelsen av eksperimentet: navn, type celler, antall celler.
- For analyse oppsett, velger du Utsette analyse til senere. Høyreklikk på tidslinjen og Angi valgt skanne Grupperingsintervall alternativet og sette legge til skanner hver 4 h og totalt til 24 h. angitt ønsket starttidspunktet (minst 1 time etter inkubasjon i automatiserte tenkelig apparatet).
-
Sjekk hver 2 dager for veksten av spheroids ved å logge inn i tenkelig programvare.
- Velg alternativet Vis siste skanner og dobbeltklikk på ønsket eksperimentet. Velg Brightfield i kanalpanelet bildet og deretter bruke funksjonene mål bildeverktøyet måle diameteren på spheroids. Det tar 6 dager for en spheroid å nå ønsket størrelse: 0,5 mm i diameter. Legge til 50 µL av komplett RPMI medium per brønn på dag 4 begrense middels fordampning effekt.
2. generasjon CD19 bil T celler
-
Utvidelse av CD19 bil T celler
Merk: Stabil uttrykk for CD19 bil T celler ble kjøpt av bulk retroviral signaltransduksjon fra frisk donor PBMCs beskrevet tidligere16. Retroviral konstruere koding for CD19 bil er en andregenerasjons bil og består av fmc63 scFv kjeden, CD8 hengsel og transmembrane domene, et 4-1BB co-stimulatory domene og til slutt et CD3ζ-domene.- For å utvide, kultur transduced T celler i nærvær av anti-CD3/28 magnetiske perler med en celle til perle forholdet 1:1 for 10 – 11 dager. Utvidelsen, celler er i fullstendig medium (X-VIVO 15, 5% Serum erstatning og 100 U/mL rekombinant menneskelige IL-2).
Merk: Den ideelle tettheten for en effektiv ekspansjon er 1 til 2 x 106 celler/mL. Avhengig av hvor første kan celler utvides i flasker (25 cm2 flasker til 20 mL, 75 cm2 flasker til 40 mL av totalt volum) i en celle kultur inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet). - Som en negativ kontrollgruppe for de følgende analyser, inkludere ikke-transduced PBMCs (vil bli referert som uekte) for utvidelsen protokollen parallelt CD19 bil T-celler.
- Dag 3 og, legge frisk medium hver dag og dele cellene i mer kultur flasker, hvis nødvendig.
- På dag 10-11, sentrifuger cellene på 500 x g for 5 min. fjerne nedbryting og kombinere alle cellene i en 50 mL tube og resuspend cellene i ~ 30 mL av fersk komplett medier.
- Plass den 50 mL tuben som inneholder de resuspended cellene på en magnetisk stand til å skille de magnetiske perlene fra kultur medium.
- Vent i 2-3 min for perler å samle på siden av røret.
- Fjerne kultur medium med Pipetter og overføring til en ny tube uten å berøre sonene magnetiske perle samling.
- Gjenta om perle fjerning (2.1.5–2.1.7) igjen for å begrense antall perler i siste kultur medium.
- Resuspend og telle celler, justere tettheten til 1 til 2 x 106 celler/mL i fullstendig medium.
- Hvile celler for minst 4 h opp over natten. Deretter direkte fryse dem ned på-80 ° C og overføre hetteglass til en flytende nitrogen tank på dagen for langtidslagring. Alternativt kan en forlenge resten opp til over natten for omgående bruk.
- For å utvide, kultur transduced T celler i nærvær av anti-CD3/28 magnetiske perler med en celle til perle forholdet 1:1 for 10 – 11 dager. Utvidelsen, celler er i fullstendig medium (X-VIVO 15, 5% Serum erstatning og 100 U/mL rekombinant menneskelige IL-2).
-
CD19 bil uttrykk kontroll på primær T-celler
- Antall utvidede T celler tall kan variere litt etter overnatting kultur eller moderat fryse/tine.
- Overføre 5 x 105 celler fra begge CD19 bil og Mock primær T-celler å skille flyt cytometri rør.
- Vask cellene med 200 μL av Flow Buffer (2% FBS i PBS) og sentrifuger rørene på 500 x g for 5 min. Gjenta vask trinnene å kvitte seg med alle artefakter som skyldes kultur medium.
- Forberede det primære antistoffet (Biotin geit anti-musen IgG, F(ab') ₂ Fragment bestemt) ved å utføre 1:200 fortynning Flow buffer.
- Resuspend cellene i 100 μL antistoff blanding per rør og ruge på is for 15 min. Gjenta vaskemaskin to ganger for å fjerne overflødig antistoff.
- Forberede sekundære antistoffer (Streptavidin-PE) som 1:400 fortynning Flow buffer.
- Resuspend cellene i 100 μL antistoff blanding per rør og ruge på is for 15 min. Gjenta vaskemaskin to ganger for å bli kvitt overflødig antistoff.
- Resuspend cellene i 200 μL av flyt Buffer per rør og analysere dem på en flyt cytometer.
- Bruk håne T celler å sette opp negative og positive porten og analysere CD19 bil transduced T celler tilsvarende.
3. 3D svulst Spheroid drapet analysen
-
Etter 6 dager eller når spheroids nå ønsket størrelse, fjerne platen fra inkubator. Bruker en flerkanals pipette, forsiktig fjerne 100 µL/vel fullstendige RMPI 1640 medium fra spheroid platene.
- For dette trinnet, vinkel tips mot innsiden av 96-wells platen, unngå kontakt med bunnen av brønnen for å minimere forstyrrelse av spheroids. Gjenværende volumet bør være rundt 100 µL.
- Klargjør en 1:200 løsning Annexin v røde ved å blande 50 µL Annexin v rød med 9.95 mL av komplett RPMI 1640 medium.
- Legg 100 µL/godt av 1:200 Annexin V rød løsning.
- Overføre platen til en inkubator (37° C, 5% CO2, 95% fuktighet) i 15 min.
- Høste transduced bil CD19 T cellene i en 15 mL rør og sentrifuger på 500 x g for 5 min. fjerne nedbryting bruker en pipette og resuspend av pipettering opp og ned flere ganger med 2 mL komplett RPM1 1640 medium.
- Telle celler med Trypan blå utelukkelse på en kompatibel celle teller.
- Sentrifuger celle suspensjon på 500 x g for 5 min. Fjern supernatant bruker en pipette og resuspend i RPMI medium å få 2 x 105 celler/mL.
- Overføre celle suspensjon til et sterilt reservoar og dispensere 100 µL/godt inn i en 96-brønns rundt bunnplaten formet med en flerkanals pipette.
- Overføre platen tilbake til den automatiserte tenkelig apparatet inne en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fuktighet).
-
Logge oppkjøpet programvaren, Velg planen å skaffe.
- Høyreklikk på skanning tidslinjen og velg Rediger tidslinjen. Høyreklikk gruppen skanning og slette den. Høyreklikk på tidslinjen og Angi valgt skanne Grupperingsintervall alternativet og angi legge til skanner hver til 1,5 t og totalt til 24 h.
- Angi ønsket starttidspunktet (minst 1 time etter inkubasjon i automatiserte tenkelig apparatet). Velg Lagre tidsramme avsøker.
4. automatiske bildeanalyser
- Logg inn oppkjøpet, velge alternativet Vis siste skanner og Starte analysen alternativet. Velg Opprett ny analyse definisjon | Analysetypen: Spheroid. Sjekke bildekanalene å analysere (fase + Brightfield, grønn og rød).
- Velg minst 10 representant bilder: vanligvis 1 per tilstand og minst 3 tidspunkt (begynnelsen, midten og slutten av oppkjøpet).
- Forhåndsvisning standard analysere prosedyre i hele bildet stakken.
- Endre parametere for brightfield maske. Typisk parametere: følsomhet 10, hull fyll 1000 µm2, min området 1000 µm2. Forhåndsvis i hele bildet stakken og kontrollere at de valgte parameterne oppdage spheroids nøyaktig.
- Endre parameterne for grønne maske (GFP). Typisk parametere: flosshatt segmentering med radius 200 µm og terskelen 3 GCU, Edge skilt ut, hull fylle 5000 µm2, Juster størrelsen -2 piksler, området min 3000 µm2. Forhåndsvis i hele bildet stakken og kontrollere at de valgte parameterne oppdage spheroids nøyaktig.
- Endre parameterne for rød maske (Annexin V). Typisk parametere: flosshatt segmentering med radius 150 µm og terskelen 2 GCU, Edge skilt ut, hull fylle 5000 µm2, Juster størrelse 0 piksler, området min 1000 µm2. Forhåndsvis i hele bildet stakken og kontrollere at de valgte parameterne oppdage spheroids nøyaktig.
-
Lansere analyserer.
- Når analysen er ferdig, Pakk måling av interesse. Velg filen analysert og deretter alternativet Graf beregninger . Velg beregningene av interesse, skanne og brønnen. Vanligvis totale røde og grønne intensitet innenfor brightfield gi de mest nøyaktige målingene ved å begrense signalet fra fluorescens til spheroids grensene fastsatt av brightfield masken (Figur 3). Pakk ut merkede beregninger i flere filformat ved å klikke på "Eksportere Data".
- Videre til utvinning av bilder og filmer ved å velge filen analysert og velg alternativet Eksporter bilder og filmer . To valgmulighetene er anvendelig, enten "som vises" å hente bilder og filmer som sett på tenkelig programvare (vanligvis kompositt bilder), enten "som lagret" hente rådata til ekstern analyse gjennom tredje-del programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som kan ses i figur 1, er det avgjørende å sjekke av flowcytometri uttrykk for CD19 bilen på T-celler (figur 1A) og nivået av CD19 på HCT116 svulst cellelinjer (figur 1B). Figur 2 eksemplifiserer utfallet av en typisk spheroid eksperiment. Det automatiserte tenkelig apparatet tar bilder i fire ulike kanaler: lysende felt, fase, grønt og rødt fluorescens. Fase kanalen brukes å hevde dannelsen av spheroids ved å vise svært kontrast grenser nær spheroids (som er et tegn på formet formasjon). Lyse feltet brukes under analyseprosessen å finne størrelsen på spheroids og begrenser grønt signal (tumor) og røde signalet (apoptose) til nevnte grensene. Det gjør det mulig å ikke vurdere hendelser direkte relatert til spheroids (for eksempel isolert kreftceller og deres apoptose). Grønne og røde omriss representerer henholdsvis grønne og røde signaler vurdert i beregningen av beregninger. I figur 2, lyse feltet ble fase, grønt og rødt kanaler Hentet gjennom alternativet "som lagret" mens kompositt bilder ble hentet gjennom alternativet "Som viste" og er representant for beregningene vises i Figur 3. Som kan ses i figur 2, i motsetning til håne T-celler, var CD19 bil T celler spesielt drepe spheroids og sterkt redusere antall live kreftceller.
Figur 3 viser utviklingen av totalt grønne og røde signalet måles forutsetter spheroid over tid. Som kan sees, kort tid etter CD19 bil T celle injeksjon, spheroids' størrelse krymper raskt (idet avmålt av grønne fluorescens signal) og apoptose signal øker raskt (som målt ved røde fluorescens signal).
Figur 1: overflaten uttrykk for CD19 bilen og CD19. (A) overflate uttrykk for CD19 bilen på retrovirally transduced T-celler. Cellene ble analysert av flowcytometri før spheroid analysen via mouse-Fab biotinylated som primær- og anti-Streptavidin-PE som sekundær antistoff. (B) overflate uttrykk for CD19 på retrovirally transduced HCT116 celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: vurdering av CD19 bil T-celle cytotoksisitet mot svulst spheroids. Tidsforløp HCT116 formet vekst; ved t = 138 h, Mock eller CD19 bil T celler ble innført på en tetthet 20000 celler/godt. Grønt signal tilsvarer HCT116 GFP + celler og grønne disposisjon tilsvarer den oppdaget formet. Røde signalet tilsvarer apoptose som overvåkes av Annexin V og rød kontur tilsvarer oppdaget apoptose hendelsene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: målinger av totale røde og grønne signalet i brightfield maske grenser over tid. Totalt røde og grønne signaler i brightfield maske beregninger ble innhentet etter analysert og skal tegnes som en funksjon av tid. Stiplet linje tilsvarer innføring av Effektor celler (CD19CAR eller Mock T-celler). Mål tilsvarer gjennomsnittlig ± SEM (n = 12). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruk av spheroids som en nyskapende verktøy for å validere fremtidige kreftbehandling blitt et felt av økende interesse i de siste årene. Spheroids representerer et mellomtrinn mellom klassisk 2D i vitro analyser og i vivo vurdering. Metoden videre har mye løfte om deres styrke i svulst mikro-miljø mimicking samt gene profilering7. Protokollen presentert i denne publikasjonen ble tilpasset fra Saheen et al.11 til Incucyte S3 og representerer en rimelig og enkel metode for å produsere 3D svulst spheroids fra colorectal linjer. Kopling spheroid generasjon til en høy gjennomstrømming bildeenheten tillater pålitelig og rask screening av en rekke anti-svulst agenter og overvåke evne til nevnte agent å destabilisere svulst struktur.
Det er flere viktige skritt å ta i betraktning om denne protokollen. Først må startnummeret for kreftceller justeres nøyaktig. Hvis start celle tetthet er for høy, cellene vil svekke PLL belegg raskt og begynner å danne en tilhenger monolayer. På den annen side, vil et lavt antall celler innføre en høye variasjon i spheroid størrelse og antall spheroids per brønn. Andre, bruk av en automatisert bildeenhet viser celler til potensielle Phototoksisitet (spesielt hvis flere fluorescens kanaler brukes); Det anbefales å justere bildet frekvensen for å minimere skader på spheroids. Det er en viktig parameter å vurdere for å fange hendelsene rundt pålitelig (et bilde hver 4 timer før effektor celle introduksjon og en hver 90 min etter representerer det beste kompromisset vet). Tredje, anbefaler vi å være spesielt forsiktig for å unngå middels fordampning som kan oppstå noen dager etter effektor celle introduksjon. Fjerde, antall Effektor celler må også justeres nøyaktig: ønsket nummer må være høy nok til å drepe svulst spheroids effektivt, men også så lavt som mulig å tillate det høyeste potensialet for optimal avbildingsprosessen. Femte i et typisk forsøk inneholder en godt 2 til 4 spheroids som kan koaliserer inn i ett; Det anbefales å være oppmerksom på potensielle topper som kan bryte ut i beregningene etter denne hendelsen og å ignorere dem. Sjette i en 96-brønns plate, i gjennomsnitt 20 til 50 brønner inneholde spheroids i ønsket antall og størrelse. Vi anbefaler å sjekke brønnene anses for analyse før innføringen av Effektor celler det vil spare beregning tid. Til slutt, analysen er delvis automatisert men nødvendiggjør noen innspill fra brukeren om forskjellige parametere. Det anbefales sterkt å ta spesielt vare i dette trinnet og fokusere på en balanse mellom sensitivitet og spesifisitet. Hvis typen Effektor celler/behandling varierer i et eksperiment, kan det være nødvendig å kjøre forskjellige typer analyser for å velge den som passer best.
Denne metoden er så langt bare begrenset til en bestemt type tilhenger cellen linje (i denne publikasjonen HCT 116). Videre er utvikling nødvendig å generalisere denne protokollen for hver cancerous celle linje. Selv om en rekke metoder er allerede tilgjengelig for et større antall målet celler12,13,14,stole15, de fleste av dem på bruk av dyre og/eller komplekse prosedyrer. Vår metode, er begrenset til noen typer målcellene hittil interessant som det krever svært begrenset innspill fra eksperimentator og tillater en rask og enkel skjerm av ulike stoffer og/eller immunterapi behandlinger (her bil CD19 celler). Pålitelighet og dens evne til å tilpasses ulike typer behandlinger gjør denne metoden et kraftig verktøy i forbindelse med anti-kreft behandling valideringsprosessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Norges forskningsråd under tilskudd #244388, #254817 og #284983; den norske Kreftforeningen (#6829007); Norske helse regionen Sørøst under Grant #17/00264-6 og #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
