Summary
Этот протокол предназначен для оценки иммунотерапевтических перенаправленный цитотоксичность T-клеток (автомобилей Т-клеток) против 3D структурированные раковые клетки (сфероидов) в режиме реального времени.
Abstract
Иммунотерапия стала полем растущий интерес к борьбе против рака в противном случае неизлечимого. Среди всех методов иммунотерапевтических химерных антигена рецепторов (автомобиль) перенаправлены Т-клеток, полученные наиболее впечатляющих результатов, в частности с детской B-острый лимфобластный лейкоз (B-ALL). Методы классической проверки автомобилей Т-клеток полагаются на использование специфики и анализов функциональность автомобиля Т-клеток против клеток-мишеней в суспензии и в моделях ксенотрансплантата. К сожалению, замечания, сделанные в пробирке часто отделены от результатов, полученных в естественных условиях, и много усилий и животных можно избежать, добавив еще один шаг: использование 3D культуры. Производство сфероидов из потенциальных клеток-мишеней, которые имитируют 3D структура опухолевых клеток, когда они являются прижившимися в животной модели является идеальной альтернативой. Здесь мы приводим доступный, надежный и простой способ получения сфероидов от линии transduced толстого кишечника клетки как инструмент проверки для приемных клеточной терапии (здесь подтверждается CD19 автомобилей Т-клетки). Этот метод в сочетании с передовой живой тепловизионной системы, которая может следовать сфероида роста, эффекторные клетки цитотоксичности и опухоли апоптоза клеток.
Introduction
Приемных клеток передачи (ACT) представляет следующее поколение лечения рака. Он полагается на инъекции эффекторных клеток (Т - и NK-клеток) в пациента. Эти клетки могут быть генетически модифицированных с рецепторами, которые будут направлять их в свои цели, опухоль и уничтожить его. Недавно этот подход был показан быть осуществимым, когда рецептор химерных антигена (автомобиль), направленных против B-клетки маркер CD19 был введен в клетки пациента T убить его рака1. В случае автомобиль, который является искусственным рецепторов, конструкция состоит из фрагментов специфическое антитело, антиген привязки домене сокращен до сущности назначенный одной цепи переменных фрагмента (scFv), связан с Т-клеточной сигнализации доменов. Хотя есть несколько конструкций, наиболее часто используемые версии упоминаемый как второго поколения автомобилей конструкций, состоят из CD3z для сигнализации TCR и один co-stimulatory домен (CD28, 4-1BB, OX40, и т.д.) 1 , 2. поле иммунотерапии направлено большую часть своего внимания к этой новой форме акта когда CD19 автомобилей-Т-клетки эффективно многочисленных пациентов с B клетки злокачественных опухолей3,4. После этого успеха исследователи пытались использовать подобные конструкции, ориентация другие epitopes для солидных опухолей с ограниченным успехом. К сожалению нехватка специфических антигенов тумора и жестче опухоли микросреды, оказываемых автомобилей T клетки менее эффективными, к5солидных опухолей.
В настоящее время наиболее часто используемых в vitro проверки стратегии полагаются на двухмерный (2D) систем, которые касаются только фрагмент проблем уже упоминалось твердые опухоли. Классически 2D в vitro систем представляет собой смесь автомобилей Т-клеток и целевой рак клеточных линий как монослои оценить функциональность и специфика этих клеток-эффекторов. Хотя эти стратегии являются важной и неотъемлемой частью исследований, они не учитывать сложную морфологию и трехмерные (3D) Структура клетки рака6. Раковые клетки культивировали в 3D систем, именуемый сфероидов, приобрести новые фенотипических признаков путем внесения изменений в ген выражение профиля7, которые могут повлиять на признание перенаправленный эффекторных клеток. Birgersdotter и коллеги продемонстрировал, что линия клетки лимфомы (HL) Ходжкина когда только выращенные в модели 3D культуры приобретает профиль выражение гена, который похож на первичной опухоли образцы8. Таким образом сфероидов или аналогичных 3D культуры методологии предложение более актуальными в моделях in vitro в отличие от стандартных 2D систем. Такие системы аналогичны также в vivo исследований, которые рассматриваются как последний шаг в процессе проверки данного автомобиля. Учитывая, что 2D системы не могут имитировать морфология рака кластеров, сфероидов предлагают аналогичные образований оценить функциональность автомобиля Т-клетки до в естественных условиях модели. В одном исследовании, Pickl et al. определили, что модель сфероида рецептора человека эпидермального фактора роста (HER2), экспрессирующих раковые клетки продемонстрировали аналогичные сигнализации профили в естественных условиях модели9. Это далее поддерживает сфероидов предлагают более актуальной и закрыть чтобы в vivo оценки автомобиля Т-клеток. Кроме того, проверка автомобилей Т-клеток против сфероидов может помочь более критически оценить их эффективность и предотвратить некоторые из образцов от переезда в vivo исследований преждевременно10; Таким образом вклад этически соответствующих исследований, жертвуя меньше животных. Кроме того протоколы, используя сфероидов не дороже, чем классический 2D систем и гораздо быстрее по сравнению с классической в vivo исследований. Взятые вместе, можно предсказать, что включение исследований сфероида вскоре станет стандартной практикой для увязки исследований в vitro и in vivo.
Здесь мы представляем подготовки сфероидов от линии клетки рака толстой кишки HCT 116. Эта линия клетки была изменена, чтобы выразить человека CD19 молекулы оказать чувствительны к CD19 автомобилей Т-клеток и обеспечить четкую оценку убийства, используя клинически проверенных автомобиль конструкт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. поколение сфероидов от колоректального рака клеток линии
- Мыть HCT 116 (стабильно преобразованы выразить Кластер дифференцировки 19 (CD19) и зеленый флуоресценции белков (ГПУП)) клеток монослои с фосфатом буфер солевой раствор (PBS; 5 мл на 25 см2 или 10 мл флакон2 75 см). Добавить трипсина (0,5 мл на 25 см2 или 1 мл раствора для в колбу2 75 см) и инкубации клеток при 37 ° C за 5 мин.
- Проверьте ячейки отряд под микроскопом и нейтрализовать фермента диссоциации клеток с полным Розуэлл парк Мемориальный институт 160 среднего (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + гентамицин; 10 мл 25 см2 или 20 мл флакон2 75 см).
- Суспензию клеток центрифуги на 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз несколько раз с 5 мл полного среднего RPM1 1640.
- Подсчет количества ячеек, с помощью исключения Трипановый синий на совместимый мобильный счетчика.
- Суспензию клеток центрифуги на 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте в среде RPMI для получения 5 x 103 клеток/мл.
- Передать резервуар стерильной суспензии клеток и отказаться от 200 мкл/колодец в 96-луночных вокруг нижней пластины с помощью многоканальных дозаторов.
- Передать пластины аппарата автоматизированных изображений внутри инкубатора (37 ° C, 5% CO2, влажность 95%).
- Войдите в приобретении программного обеспечения, выберите Расписание для приобретения | Добавить запуска корабля | Сканирование по расписанию | Создать судна: новые.
-
Выберите тип сканирования: сфероида. Выберите каналы интерес: фаза + Brightfield (последовать сфероидов роста), зеленый (следовать опухоли сигнал, приобретение время 300 мс) и красный (следовать апоптоза, приобретение время 400 мс).
- Выберите нужный масштаб: 10 x.
- Выберите модель пластины и его позиции в ящик. Выберите положение скважин для изображения. Введите описание эксперимента: имя, тип клеток, количество ячеек.
- Для анализа программы установки выберите Отложить анализ пока позже. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите параметр Задать интервал группировки выбран сканирования и задать Добавить сканирует каждый -4 h и в общей сложности до 24 ч. установите желаемое время начала (по крайней мере 1 час после инкубации в автоматизированной обработки изображений аппарат).
-
Проверьте каждые 2 дня для роста сфероидов, войдя в программу обработки изображений.
- Выберите параметр Представление последних сканирует и дважды щелкните нужный эксперимент. Выберите Brightfield на панели каналов изображения, а затем используйте инструмент мера изображения возможности измерить диаметр сфероидов. Она занимает 6 дней на сфероиде достичь желаемого размера: 0,5 мм в диаметре. 50 мкл полного RPMI среды за хорошо в день 4 ограничить средний испарения эффект.
2. поколение CD19 автомобилей Т-клеток
-
Расширение CD19 автомобилей Т-клеток
Примечание: Стабильные выражение CD19 автомобилей Т-клеток была приобретена компанией массовых ретровирусных трансдукции здорового донора получения как описано16. Кодирование ретровирусной конструкции для автомобиля CD19 второго поколения автомобилей и состоит из fmc63 scFv цепи, CD8 петли и трансмембранных доменов, домен co-stimulatory 4-1BB и, наконец, CD3ζ домена.- Для расширения, культуры transduced T клетки присутствии анти CD3/28 Магнитные бусы с ячейкой шарик соотношение 1:1 для 10-11 дней. Во время расширения, клетки находятся в полной среды (X-VIVO 15, 5% сыворотки замены и 100 ед/мл рекомбинантного человеческого IL-2).
Примечание: Идеальной плотности для эффективного расширения — 1-2 х 106 клеток/мл. В зависимости от первоначального числа клетки могут быть расширены в колбах (25 см2 фляги по 20 мл, флакон2 75 см до 40 мл общего объема) в инкубатор культуры клеток (37 ° C, 5% CO2, 95% влажности). - Как группа отрицательный контроль для следующих анализов включают не преобразованы репликацию (будет упоминаться как макет) расширения протокола параллельно CD19 автомобилей Т-клеток.
- День 3, добавить свежие среднего каждый день и разделить более колбы культуры клетки, при необходимости.
- День 10-11, центрифуги клетки на 500 x g для 5 минут удалить супернатант и объединить все клетки в один тюбик 50 мл и Ресуспензируйте клетки в ~ 30 мл свежего полный средств массовой информации.
- Место Тюбик 50 мл, содержащие ресуспензированы клеток на магнитной подставке отделить магнитные шарики от питательной среды.
- Подождите 2-3 мин для Бусины для сбора на стороне трубки.
- Удаление питательной среды с пипеткой и передачу новой трубки не прикасаясь к магнитного шарик коллекции зон.
- Повторите шаги относительно изъятия из бисера (2.1.5–2.1.7) еще раз, чтобы ограничить количество бисера в окончательном питательной среды.
- Ресуспензируйте и подсчитать количество ячеек, регулировка плотности от 1 до 2 х 106 клеток/мл в полной среды.
- Остальные клетки для по крайней мере 4 ч до ночлега. Затем непосредственно заморозить их вниз на-80 ° C и передать жидким азотом танка флаконов на следующий день для длительного хранения. Кроме того один можно продлить остальные до на ночь для немедленного использования.
- Для расширения, культуры transduced T клетки присутствии анти CD3/28 Магнитные бусы с ячейкой шарик соотношение 1:1 для 10-11 дней. Во время расширения, клетки находятся в полной среды (X-VIVO 15, 5% сыворотки замены и 100 ед/мл рекомбинантного человеческого IL-2).
-
CD19 автомобиль выражения управления на первичных клеток T
- Подсчитать количество расширенных Т-клеток, как цифры могут немного отличаться, после ночи культуры или умеренно после замораживания/оттаивания.
- Передача 5 x 105 клетки от обоих автомобилей CD19 и макет основной Т-клетки для разделения потока цитометрии трубы.
- Вымыть клетки с 200 мкл буфера потока (2% FBS в PBS) и центрифуги, трубы на 500 x g за 5 минут, повторите Стиральная избавиться от каких-либо артефактов, вызванных питательной среды.
- Подготовьте основное антитело (биотина коза анти мыши IgG, F(ab') ₂ конкретного фрагмента), выполняя разбавления 1: 200 в буфере потока.
- Ресуспензируйте клетки в 100 мкл антител смеси в трубку и инкубировать на льду за 15 минут повторите предыдущий шаг Стиральная дважды, чтобы удалить избыток антитела.
- Готовить вторичные антитела (стрептавидина-PE) в разведении 1: 400 в буфере потока.
- Ресуспензируйте клетки в 100 мкл антител смеси в трубку и инкубировать на льду за 15 минут повторите предыдущий шаг Стиральная дважды, чтобы избавиться от избыточных антитела.
- Ресуспензируйте клетки в 200 мкл буфера потока в трубку и проанализировать его на проточный цитометр.
- Использовать макет Т-клеток созданы негативные и позитивные ворота и анализировать CD19 автомобилей преобразованы Т-клеток, соответственно.
3. 3D опухоли сфероида убийство Assay
-
После 6 дней или один раз сфероидов достичь желаемого размера, удалить пластину из инкубатора. С помощью многоканальных дозаторов, аккуратно удалите 100 мкл/ну полный RMPI 1640 среды из плит сфероида.
- Для этого шага, угол советы к внутренней стены пластины 96-Уэллс, избегая контакта с нижней части скважины для того, чтобы свести к минимуму нарушение сфероидов. Остальные тома должно быть около 100 мкл.
- Подготовьте раствор 1: 200 Annexin V красный, смешивая 50 мкл Annexin V красный с 9,95 мл полного среднего RPMI 1640.
- Добавьте 100 мкл/ну 1: 200 красный Annexin V решение.
- Передача пластину в инкубатор (37° C, влажность 95%, 5% CO2), 15 мин.
- Урожай transduced автомобиль CD19 Т-клеток в 15 мл трубки и центрифуги их в 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте, закупорить вверх и вниз несколько раз с 2 мл полного среднего RPM1 1640.
- Подсчет количества ячеек, с помощью исключения Трипановый синий на совместимый мобильный счетчика.
- Суспензию клеток центрифуги на 500 x g для 5 минут удалить супернатант с помощью пипетки и Ресуспензируйте в среде RPMI для получения 2 x 105 кл/мл.
- Передать резервуар стерильной суспензии клеток и отказаться от 100 мкл/колодец в 96-луночных раунд сфероида днище с помощью многоканальных дозаторов.
- Передача пластины обратно в аппарате автоматизированных изображений внутри инкубатора (37 ° C, влажность 95%, 5% CO2).
-
Войти в приобретении программного обеспечения, выберите расписание для приобретения.
- Щелкните правой кнопкой мыши на шкале времени сканирования и выберите пункт Изменить сроки. Щелкните правой кнопкой мыши на группе сканирования и удалите его. Щелкните правой кнопкой мыши на временной шкале и выберите параметр Задать интервал группировки выбран сканирования и Добавить сканирует каждый 1,5 ч и в общей сложности до 24 ч.
- Установите нужное время начала (по крайней мере 1 час после инкубации в автоматизированной обработки изображений аппарат). Выберите сохранить расписание сканирования.
4. автоматизированный анализ
- Войдите в приобретение, выберите параметр Просмотр последних сканирует и выберите опцию Запустить анализ . Выберите создать новое определение анализ | Тип анализа: сфероида. Отметьте каналы изображения для анализа (фаза + Brightfield, зеленый и красный).
- Выберите по крайней мере 10 представитель изображения: как правило, 1 за состояние и по крайней мере 3 моменты времени (начало, середину и конец приобретения).
- Предварительный просмотр по умолчанию проанализировать процедуры в стеке всего изображения.
- Измените параметры для brightfield маска. Типичные параметры: чувствительность 10, отверстие заполнения 1000 мкм2, мин области 1000 мкм2. Предварительный просмотр в стеке все изображение и убедитесь, что выбранные параметры точно обнаруживать сфероидов.
- Измените параметры для зеленой маски (ГПУП). Типичные параметры являются: Top hat сегментации с радиусом 200 мкм и порог 3 ОПП, край отделились, отверстие заполнения 5000 мкм2, отрегулируйте размер -2 пикселей, площадь мин 3000 мкм2. Предварительный просмотр в стеке все изображение и убедитесь, что выбранные параметры точно обнаруживать сфероидов.
- Измените параметры для Красная маска (Annexin V). Типичные параметры являются: Top hat сегментации с радиусом 150 мкм и порог 2 ОПП, край отделились, отверстие заполнения 5000 мкм2, отрегулируйте размер 0 пикселей, площадь мин 1000 мкм2. Предварительный просмотр в стеке все изображение и убедитесь, что выбранные параметры точно обнаруживать сфероидов.
-
Запуск анализатора.
- После анализа, извлечения измерения интереса. Выберите анализируемый файл, а затем параметр Граф метрики . Выберите метрики интересов, сканирования и хорошо. Как правило общая интенсивность красного и зеленого в границах brightfield дают наиболее точные измерения ограничивая сигнал флуоресценции сфероидов границы определяется маска brightfield (рис. 3). Извлечение выбранных метрик в нескольких формат файла, нажав на «Экспорт данных».
- Приступить к добыче изображения и фильмы, выбрав анализируемого файла, а затем выберите параметр экспортировать изображения и фильмы . Доступны два варианта, либо как «отобразить» для получения изображений и фильмов как увидено на изображений программное обеспечение (обычно композитных изображений), либо «как хранится» для получения необработанных данных для внешнего анализа через третья часть программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как видно на рисунке 1, важно проверить подачей cytometry уровень выражения CD19 автомобиля на Т-клеток (рис. 1A) и уровень CD19 на HCT116 опухолевых клеток линии (рис. 1B). Рисунок 2 иллюстрирует результат эксперимента типичный сфероида. Автоматизированный аппарат изображений принимает фотографии в четырех различных каналов: яркие области, фаза, зеленый и красный флуоресценции. Фаза канал используется для утверждать формирования сфероидов, показывая очень контрастирует границы вблизи сфероидов (который является признаком формирования сфероида). Яркие поле используется во время процесса анализа для определять размер сфероидов и ограничить вышеупомянутых границ зеленый сигнал (опухоли) и красный сигнал (апоптоз). Это позволяет не рассматривать события, непосредственно не связанные с сфероидов (например изолированных опухолевых клеток и их апоптоз). Зеленые и красные кривые представляют соответственно зеленый и красный сигналы, считается в расчете метрики. Рисунок 2, светлые области, фаза, зеленый и красный каналы были извлечены через опцию «как сохраненные» тогда как составного изображения были извлечены через опцию «Как отображаемые» и представитель метрики, отображаемые на рисунке 3. Как видно на рисунке 2, в отличие от МОКА Т-клеток, CD19 автомобилей Т-клетки смогли специально убить сфероидов и значительно уменьшить количество живых опухолевых клеток.
Рисунок 3 показывает эволюцию всего зеленый и красный сигнал измеряется в пределах границ сфероида с течением времени. Как видно, вскоре после инъекции клеток T автомобилей CD19, сфероидов размер уменьшаются быстро (измеряемый сигнал зеленый флуоресценции) и апоптоза сигнала увеличивается быстро (измеряемый сигнал красной флуоресценцией).
Рисунок 1: поверхности выражение CD19 автомобиля и CD19. (A) поверхности Экспрессия CD19 автомобиля на retrovirally transduced Т-клеток. Клетки были проанализированы проточной цитометрии до сфероида assay через mouse-Fab биотинилированным как первичный и анти стрептавидина-PE как вторичные антитела. (B) поверхности Экспрессия CD19 на retrovirally transduced HCT116 клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Оценка автомобилей CD19 Т-клеточной цитотоксичности против опухоли сфероидов. Промежуток времени HCT116 сфероида роста; при t = 138 h, макет или CD19 автомобилей T клетки были введены на плотности 20000 клеток/хорошо. Зеленый сигнал соответствует HCT116 GFP + клеток и соответствует зеленый контур обнаруженного сфероида. Красный сигнал соответствует апоптоза под наблюдением Annexin V а красный контур обнаруженного апоптоз события. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: измерения всего красного и зеленого сигнала в пределах brightfield маска границы со временем. Всего красный и зеленый сигналов в brightfield маска метрики были получены после анализа и как функцию от времени. Пунктирная линия соответствует введения эффекторных клеток (CD19CAR или макет Т-клетки). Мера соответствует среднее ± SEM (n = 12). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование сфероидов как новаторский инструмент для проверки будущих рака лечение стало поле растущий интерес в последние годы. Сфероидов представляют собой промежуточный шаг между классического 2D в пробирке анализа и оценки в естественных условиях. Метод также проводит много обещаний относительно их эффективность с точки зрения опухоли микро среды, подражая а также гена, профилирование7. Протокол, представленное в настоящей публикации был адаптирован от Saheen et al.11 Incucyte S3 и представляет метод доступным и легко производить 3D опухоли сфероидов от колоректального клеточных линий. Сцепка сфероида поколения высокопроизводительных устройств обработки изображений позволяет надежный и быстрый показ широкий спектр противоопухолевых агентов и контролировать вышеупомянутых агента способность дестабилизировать структуры опухоли.
Есть несколько важных шагов принимать во внимание относительно настоящего Протокола. Во-первых начальное количество опухолевых клеток необходимо скорректировать точно. Если начальная плотность ячеек слишком высока, клетки будет деградировать PLL покрытие быстро и начнет формировать адэрентных монослоя. С другой стороны небольшое количество клеток представит высокой изменчивости с точки зрения сфероида размер и количество сфероидов за хорошо. Во-вторых использование автоматизированных устройств обработки изображений является разоблачение клетки для потенциальных Фототоксичность (особенно если используется несколько флуоресценции каналов); рекомендуется для регулировки частоты изображения для сведения к минимуму ущерба сфероидов. Это критический параметр рассмотреть с целью захвата событий интерес надежно (изображение каждые 4 часа до введения эффекторных клеток и один каждые 90 минут после представляет собой наилучший компромисс наши знания). В-третьих мы рекомендуем, особенно стараясь избежать средних испарения, которое может произойти через несколько дней после введения эффекторных клеток. В-четвертых, количество эффекторные клетки также необходимо скорректировать точно: требуемое число должна быть достаточно высокой, чтобы убить опухоли сфероидов эффективно, но и как низко как можно разрешить самый высокий потенциал для оптимальной визуализации процесса. В-пятых в типичном эксперименте, также содержит сфероидов 2-4, которые могут сливаются в один; рекомендуется обратить внимание на потенциальные шипы, которые могут перерасти в метриках после этого события и игнорировать их. В-шестых на 96-луночных блюдо, в среднем 20 – 50 скважин содержат сфероидов в нужное количество и размер; Мы рекомендуем проверять скважин будет считаться для анализа до введения эффекторных клеток как это сэкономит время вычислений. Наконец анализ частично автоматизирован, но требует некоторых входных данных от пользователя относительно различных параметров. Настоятельно рекомендуется проявлять особую осмотрительность в этом шаге и сосредоточить внимание на баланс между чувствительностью и специфичностью. Если тип эффекторных клеток/лечения различается в пределах одного эксперимента, было бы необходимо выполнять различные виды анализа, чтобы выбрать тот, который подходит лучше всего.
Этот метод до сих пор лишь ограниченные определенным типом адэрентных клеток линии (в этой публикации HCT 116); требуется дальнейшее развитие обобщить этот протокол к каждой строке раковых клеток. Хотя широкий спектр методов уже доступен для большего числа целевых клеток12,13,14,15, большинство из них основаны на использовании дорогих и/или сложных процедур. Наш метод, хотя и ограничена несколько типов клеток-мишеней, пока что, интересно как он требует очень ограниченного вклада от экспериментатора и позволяет быстро и легко экрана различных наркотиков и/или лечения иммунотерапия (здесь автомобиль CD19 клетки). Его надежность и его способность быть адаптированы к различным видам лечения делают этот метод мощный инструмент в контексте борьбы против рака лечение проверки процесса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Норвежский исследовательский совет под грантов #244388, #254817 и #284983; в Норвегии онкологическое общество (#6829007); Норвежский здравоохранения региона Юго-Восточной под Грант #17/00264-6 и #2016006.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | SIGMA-ALDRICH | D8537-500ML | Lot Number: RNBG7037 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 430639 | Lot Number: 2218002 |
| 75 cm² growth area flasks | VWR | 734-2705 | Lot Number: 3718006 |
| Trypsin-EDTA | SIGM-ALDRICH | T3924-100ml | Lot Number: SLBTO777 |
| RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL | Life Technology (Gibco) | 21875-091 | Lot Number: 1926384 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | Lot Number: 08Q3066K |
| Gentamicin | Thermo Fischer | 15750060 | Lot Number: 1904924A |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fischer | 15250061 | Lot Number: 1886513 |
| 96 well plate, round bottom | VWR | 734-1797 | Lot Number: 33117036 |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Thermo Fischer | 11132D | - |
| X-VIVO 15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L | BioNordika | BE02-060Q | Lot Number: 8MB036 |
| CTS Immune Cell Serum Replacement | Thermo Fischer | A2596102 | Lot Number: 1939319 |
| IL-2 Proleukin | Novartis | Lot Number: 505938M | |
| IncuCyte Annexin V Red Reagent | Essen Bioscience | 4641 | Lot Number: 17A1025-122117 |
| Reagent Reservoir | VWR | 89094-672 | Lot Number: 89094-672 |
| 15 mL tubes | VWR | 734-1867 | Lot Number: 19317044 |
| anti-human CD19-PE | BD Biosciences | 555413 | Lot Number: 4016990 RRID: AB_395813 |
| Biotin-SP (long spacer) AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-066-072 | Lot Number: 129474: RRID: AB_2338583 |
| Streptavidin-PE | BD Biosciences | 554061 | Lot Number: 5191579: RRID: AB_10053328 |
| HCT 116 Colorectal Carcinoma Line | ATCC | CCL-247 | - |
| Incucyte S3 | Essen Bioscience |
References
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Brentjens, R. J., et al. CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia. Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138 (2013).
- Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).
- D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors. Cell Death & Disease. 9 (3), 282 (2018).
- Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), e92511 (2014).
- Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration. Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).
- Birgersdotter, A., et al. Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern. Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Galateanu, B., et al. Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response. International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).
- Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer. Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).
- Izraely, S., et al. The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells. International Journal of Cancer. , (2018).
- Khawar, I. A., et al. Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma. Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).
- Merker, M., et al. Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children. Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).
- Mittler, F., et al. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncolology. 7, 293 (2017).
- X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5. Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).
