Summary
Strukturelt relaterede proteiner udøve ofte forskellige biologiske funktioner. Udveksling af tilsvarende regioner af disse proteiner for at skabe kimære proteiner udgør en innovativ tilgang til at identificere kritiske protein regioner, der er ansvarlige for deres funktionelle divergens.
Abstract
Målet med denne protokol omfatter udformningen af kimære proteiner, forskellige regioner af en protein erstattes af deres tilsvarende sekvenser i et strukturelt lignende protein, for at bestemme den funktionelle betydning af disse regioner. Disse kimærer er genereret ved hjælp af et indlejret PCR-protokol ved hjælp af overlappende DNA fragmenter og tilstrækkeligt designet primere, efterfulgt af deres udtryk inden for et pattedyr system til at sikre indfødte sekundær struktur og posttranslationelle modifikationer.
Den funktionelle rolle i et særskilt område angives derefter med et tab af aktiviteten af chimera i en passende udlæsning assay. Derfor identificeres regioner huser en række kritiske aminosyrer, der kan være yderligere screenet af supplerende teknikker (f.eks. site-directed mutagenese) at øge molekylære opløsning. Selv om begrænset til tilfælde, hvor der kan findes en strukturelt relaterede proteiner med forskellige funktioner, er kimære proteiner blevet med held ansat til at identificere kritiske bindende regioner i proteiner som cytokiner og cytokin receptorer. Denne metode er særligt egnet i tilfælde, hvor det protein funktionelle regioner ikke er veldefineret, og udgør et værdifuldt første skridt i styret evolution tilgange til at indsnævre regioner af interesse og reducere screening kræfter involveret.
Introduction
Flere typer af proteiner, herunder cytokiner og vækstfaktorer, er grupperet i familier hvis medlemmer deler lignende tredimensionale strukturer, men ofte lægge forskellige biologiske funktioner1,2. Denne funktionelle mangfoldighed er normalt følge af små forskelle i aminosyresammensætning inden for det molekyle aktive steder3. Identifikation af sådanne websteder og funktionaldeterminanter ikke kun tilbyder værdifuld evolutionære indsigt men også til at designe mere specifikke agonister og hæmmere4. Men det store antal forskelle i rest sammensætning ofte findes mellem strukturelt relaterede proteiner komplicerer denne opgave. Selvom konstruere store biblioteker, der indeholder hundredvis af mutanter er i dag muligt, vurdere hver enkelt rest variation og kombinationer af dem er stadig en udfordrende og tidskrævende indsats5.
Teknikker vurdere store protein regioner funktionelle betydning er således af værdi at reducere antallet af mulige rester til et overskueligt antal6. Afkortet proteiner har været den mest anvendte metode til at tackle dette problem. Regioner er derfor anses for at være funktionelt relevante, hvis funktionen protein under undersøgelse er påvirket af fjernelsen af en bestemt region7,8,9. En stor begrænsning af denne metode er dog at sletninger kan påvirke det protein sekundær struktur, fører til misfoldning, sammenlægning og manglende evne til at studere den tilsigtede region. Et godt eksempel er en trunkeret version af cytokin oncostatin M (OSM), hvor en indre sletning større end 7 rester resulterede i en fejlfoldede mutant, der ikke kunne yderligere undersøgt10.
Generation af kimære proteiner udgør en alternativ og innovative tilgang, der tillader analyse af større protein regioner. Målet med denne metode er at udveksle regioner af interesse i et protein af strukturelt beslægtede sekvenser i et andet protein, for at vurdere bidrag af de udskiftede dele til specifikke biologiske funktioner. Udbredt inden for signalering receptorer til at identificere funktionelle domæner11,12, er kimære proteiner særligt nyttige til at undersøge protein familier med lidt aminosyre identitet men bevarede sekundær struktur. Relevante eksempler kan findes i klassen af interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, såsom interleukin-6 og ciliaere neurotrope faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukæmi hæmmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, hvor den følgende protokol er baseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kimære Protein Design
- Vælg en egnet protein (donor) at udveksle regioner med protein af interesse (modtageren) donor protein bør være strukturelt ens, ideelt tilhører samme protein familie, men mangler den biologiske aktivitet skal bruges som udlæsning. Hvis ingen strukturelt relaterede proteiner er kendt, kan potentielle kandidater identificeres ved hjælp af en automatiseret værktøj såsom vektor justering søgning værktøj (VAST)14,15
- Protein Data Bank (FBF)16 europæiske hjemmeside (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), indføre navnet på protein af interesse i søgefeltet i øverste højre hjørne, og klik på 'Søg'. Forudsat at der er en krystalstruktur til rådighed, ikke ned PDB id (PDB ID; f.eks. 1evs for OSM).
Bemærk: hvis strukturelle data ikke er tilgængelige på det foreløbige budgetforslag, homologi model af protein kan være genereret af et værktøj som SWISS-MODEL17 i stedet, ved hjælp af tilgængelige trinvise protokoller18. - Få adgang til enorme hjemmesiden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). I tilfælde af en PDB-ID er tilgængeligt, Rul ned til 'Hente pre beregnede resultater' sektionen, tillægge FBF-ID i boksen 'Vis lignende strukturer for', og klik på 'Go'. I den følgende skærm, skal du klikke på 'Oprindelige store' og derefter 'Hele kæden' at se en liste over FBF-id'er for potentielle strukturelt lignende kandidater.
- Hvis en PDB ID ikke er tilgængelig, men en homologi model blev genereret, Rul ned til sektionen 'Søg med en ny struktur' og klik på linket 'Enorme Søg'. Upload filen FBF model ved at klikke på 'Gennemse' ud for 'Send FBF fil', vælge filen og klikke på 'Send'.
- Efter FBF fil er uploadet, skal du klikke på knappen 'Start' for at starte beregningen af enorme. Når beregningen er udført, skal du klikke på hele kæden under domæner Se FBF-id'er af strukturelt lignende proteiner.
- Vurdere de biologiske funktioner af interesse (f.eks. receptor aktivering, enzymatisk aktivitet, transskription faktor aktivitet) af topkandidater, enten eksperimentelt i ordningen udlæsning af valg eller gennem en litteratursøgning. Vælg en donor protein med divergerende funktion i forhold til protein af interesse.
- Protein Data Bank (FBF)16 europæiske hjemmeside (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), indføre navnet på protein af interesse i søgefeltet i øverste højre hjørne, og klik på 'Søg'. Forudsat at der er en krystalstruktur til rådighed, ikke ned PDB id (PDB ID; f.eks. 1evs for OSM).
- Få protein amino acid sekvenser af modtager og donor proteiner fra Reference sekvens (RefSeq) database19 .
- Få adgang til afsnittet gen i RefSeq websiden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), Skriv navnet på protein af interesse i den ransage boks og klik på 'Søg'. Klik på navnet genet for den ønskede arter i den resulterende liste.
- Rul ned til afsnittet RefSeq at se alle dokumenterede isoformer. Klik på sekvens-id for isoform af interesse (begyndende med NM), Rul ned og klik på 'CDS' at fremhæve det protein kodende region af genet. Nederst til højre på skærmen, klik på 'FASTA' og kopiere gensekvens.
- Gemme DNA sekvens ved hjælp af en egnet DNA redigeringssoftware. Når du bruger frit tilgængelige ApE20, åbne programmet, indsætte den kopierede sekvens i boksen være tom, skal du vælge navnet sekvens og klik på 'Gem'.
Bemærk: Gentag trin 1.2.1. til 1.2.3. for en eller flere donor proteiner markeret.
- Vælg regionerne protein til erstattes i de forskellige kimære konstruktioner.
- Opdele protein sekvens af interesse i forskellige strukturelle regioner. Ideelt set vil forskellige domæner for det pågældende protein er blevet beskrevet i litteraturen. Hvis dette ikke er tilfældet, bør eksistensen af forskellige bevarede strukturelle funktioner (helices, sløjfer) vurderes i trin 1.3.1.1. til 1.3.1.4.
- Hent de strukturelle data af protein af interesse fra webstedet FBF (Se trin 1.1.1.). Få adgang til siden FBF for protein, og Hent FBF-filen ved at klikke på 'download' på højre side af skærmen.
- Åbn filen FBF i en molekylær visualisering system som PyMOL (https://pymol.org/). I PyMOL, vise af nucleotidsekvensen (ved at klikke på Vis > sekvens på), skjule den standard strukturelle data (ved at klikke H ved siden af det foreløbige budgetforslag-ID, og vælge 'alt') og vælg visningen 'tegneserie' klart visualisere proteinets struktur funktioner (klikke S ved siden af det foreløbige budgetforslag-ID, og vælge 'tegning').
- Klik på nucleotidsekvensen øverst på skærmen for at fremhæve forskellige dele af molekylet, at bemærke ned de aminosyrer, der svarer til hver strukturelle særkende.
- Anmærke de forskellige strukturelle regioner på DNA-sekvens i ApE. For at gøre dette, åbne DNA-sekvens fra trin 1.2.3., Vælg nukleotider kodning for aminosyrer i en region, Højreklik på markeringen, og vælg 'Nye Feature' at give det et navn og en farve. Gentag processen for hvert strukturelle område, som identificeres i det forrige trin.
Bemærk: Nukleotid udvalg kan blive kontrolleret ved at klikke på ORFs > Oversæt og derefter klikke på OK, at sikre at de kode til den korrekte aminosyresekvens. - Juster rester sekvenser af de to proteiner beskæftiger et protein justering værktøj (f.eks. Clustal Omega21).
Bemærk: Da kimærer er fremstillet i et pattedyr ekspressionssystem, disse sekvenser bør indeholde proteiner signal peptider.- Få de fulde aminosyresekvenser af donor og receptor proteiner i ApE, ved at åbne DNA-sekvenser fra trin 1.2.3., at vælge dem og klikke på ORFs > Oversæt.
- Få adgang til websiden Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) og tillægge aminosyresekvenser af de to proteiner, så Rul ned og klik 'Indsend'. Hver sekvens bør være fortsatte af en tekstlinje med ' > ProteinName' kan identificeres korrekt.
- Hente filen justering ved at klikke på fanen justering overførselsfilen og gemme den. Denne fil kan åbnes af tekst redigering program.
- Ved hjælp af filen justering som reference, anmærke de tilsvarende strukturelle regioner af donor protein i deres DNA-sekvens (Se trin 1.3.2.).
- Beslutte, hvilke protein regioner til udveksling i kimære proteiner og designe de passende nukleotidsekvenser for kimærer.
Bemærk: I mangel af detaljerede oplysninger om funktionel betydning af de forskellige regioner, er det foreslået for at vælge store erstatninger som hele sløjfer eller helices at vurdere hvilken af dem har en indvirkning på protein funktion. Denne første sonderende eksperiment kan derefter blive efterfulgt af en anden runde af kimære protein design, fokuseret på mindre udskiftninger i de pågældende regioner.- Opret en kopi af den kommenterede DNA sekvens af receptor protein fra trin 1.3.2. og omdøbe den som en kimære protein. Åbn den omdøbte DNA-sekvens i ApE, vælge og slette nucleotide sequence kodning for regionen for at blive udvekslet, og erstattes af de tilsvarende region i donor protein (kopieret fra den kommenterede sekvens skabt taktfast 1.3.3.), derefter gemme ændringerne.
Bemærk: Oprette en ny kopi og Gentag dette trin for hver forskellige chimera designet.
- Opret en kopi af den kommenterede DNA sekvens af receptor protein fra trin 1.3.2. og omdøbe den som en kimære protein. Åbn den omdøbte DNA-sekvens i ApE, vælge og slette nucleotide sequence kodning for regionen for at blive udvekslet, og erstattes af de tilsvarende region i donor protein (kopieret fra den kommenterede sekvens skabt taktfast 1.3.3.), derefter gemme ændringerne.
- Opdele protein sekvens af interesse i forskellige strukturelle regioner. Ideelt set vil forskellige domæner for det pågældende protein er blevet beskrevet i litteraturen. Hvis dette ikke er tilfældet, bør eksistensen af forskellige bevarede strukturelle funktioner (helices, sløjfer) vurderes i trin 1.3.1.1. til 1.3.1.4.
2. forberedelse til molekylære kloning
- Vælg en plasmid vektor egnet til ekspressionssystem af valg. For pattedyr udtryk anbefales en høj-udtryk vektor som pCAGGS22 eller pcDNA vektor serien.
- For begrænsning enzym-baserede kloning demonstreret i denne protokol, sikre, at entydige begrænsning websteder i flere kloning webstedet (MCS) af vektoren er kompatibel med protein af interesse. For at gøre dette, åbne DNA-sekvens af de kimære konstruktioner med ApE, klik på ' enzymer > enzym selector' og kontrollere, at mindst to af begrænsning steder i MCS er fraværende i sekvensen (viser en nul ved siden af deres navn).
- Design de terminal primere ved hjælp af en DNA editor såsom ApE.
- Opret en ny DNA-fil (fil > ny) og indlede den N-terminale primer med en leder sekvens (3-9 ekstra basepar, f.eks. AAAGGGAAA), efterfulgt af den første begrænsning websted valgt i vektor MCS (6-8 basepar, f.eks. TTAATTAA for PacI), en valgfri spacer (f.eks. GCTAGCGCATCGCCACC i pCAGGS vektor bruges i eksemplet) og de oprindelige 18-27 basepar af gen af interesse (f.eks. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG for OSM).
- I en ny DNA-fil, den C-terminale primer sekvens starter med endelige 18-27 basepar af gen af interesse (f.eks. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA for et gen med et 6xHistidine C-terminale tag), efterfulgt af en valgfri spacer (f.eks. TAGCGGCCGC i pCAGGS vektor), den anden begrænsning site valgt (f.eks. GGCGCGCC for spejdere) og leader sekvens (f.eks. AAAGGGAAA). Fremhæve hele sekvensen, højreklik og vælg 'Reverse-supplement"til at få den omvendte primer.
- Design primere for hver af grænseregionerne i de kimære konstruktioner.
- Åbn DNA-sekvens af chimera (skabt taktfast 1.3.4.1.) og fremhæve en 30 basepar region i den zone, hvor de oprindelige og indsatte sekvenser er i kontakt med, bestående af 15 basepar af hver sekvens. Kopiere regionen (højreklik og vælg 'Copy') og indsætte det i en ny DNA-fil; denne sekvens bliver den fremskudte primer.
- Lave en kopi af den fremskudte primer genereret i den foregående skridt og omdøbe den som reverse primer. Fremhæve primer sekvensen, højreklik og vælg "Reverse-supplement" til at generere den omvendte primer sekvens.
- Gentag trin 2.3.1. og 2.3.2. for hver kontakt zone i den kimære DNA-sekvens. Generelt, to sæt frem/tilbage primere er forpligtet til at generere en kimære, medmindre udskiftningen opstår på den N-terminal eller C-terminale regioner.
- Bestil de terminal og interne primere fra en oligonukleotid syntese udbyder.
Noter: Ved hjælp af meget renset terminal primere (f.eks. HPLC-renset) kan have en positiv indvirkning i protokollens succesrate. Afsaltede interne primere giver normalt gode resultater. - Hent skabelon sekvenser af generne, donor og receptor.
Bemærk: Ansættelse af plasmider, der indeholder de åbne læserammer (ORFs) af disse sekvenser som en skabelon meget letter proceduren og anbefales. Alternativt, supplerende DNA (cDNA) genereret fra en cellelinje, kendt for at udtrykke disse gener kan bruges som en skabelon for efterfølgende trin.
3. polymerase Chain Reaction (PCR) forstærkning af individuelle DNA fragmenter danner Chimera
- Forbered en individuel PCR reaktionsblanding for hver af de af glassplinterne komponere den kimære protein. En typisk kimære protein vil kræve tre individuelle fragmenter: N-terminal del, regionen skal indsættes, og den C-terminale del.
Noter: Bruge en high-fidelity DNA polymerase (f.eks. Phusion High Fidelity DNA Polymerase) for at undgå at indføre mutationer i sekvensen. PCR reaktionen kan sætte om aftenen og køre natten over.- Sæt en 1,5 mL mikrofuge tube på is og afpipetteres de forskellige reagenser af PCR-blandingerne i den rækkefølge, der er vist i tabel 1, sikre korrekte primere og skabeloner er ansat for hver PCR reaktion (Se tabel 2).
- Etiket to tyndvæggede 0,2 mL PCR rør til hver reaktion, og overføre 20 µL af den tilsvarende PCR-blandingen i hver tube. Overføre PCR-rør i en PCR thermocycler og indlede den protokol, der er beskrevet i tabel 3.
Bemærk: udglødning temperatur skal være mindst 5 grader lavere end de smeltepunktet af de designede primere.
- Mens PCR kører, forberede 100 mL af en 1%-agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer. Til dette formål, afvejes 1 g af agarosegelelektroforese, bland med 100 mL TAE buffer i et glas kolbe og mikroovn indtil Agarosen er fuldstændigt opløst, hvirvlende kolben hver 30-40 sekunder. Tillad køling til cirka 50 ° C, tilføje 2-3 µL af ethidiumbromid (eller en tilsvarende DNA-farvestof) og hæld i en gel bakke med de ønskede godt kamme.
Forsigtighed: ethidiumbromid er en kendt mutagen, sikre anvendelse af passende beskyttelsesudstyr. - Efter PCR reaktionen er afsluttet, skal du tilføje 4 µL af 6 x DNA loading bufferen i hver tube. Indsæt 1%-agarosegel i en elektroforese enhed, dække med TAE buffer og omhyggeligt indlæse prøverne i gelen sammen med en molekylevægt stige.
Bemærk: i forbindelse med lastning, det er at foretrække at forlade tomme baner mellem prøverne at lette DNA opsving bagefter. - Kør gelen på 80-120 V i 20-45 minutter.
Bemærk: bands under 1.000 basepar kan normalt være electrophoresed på omkring 20 minutter på 120 V, mens større bands vil kræve længere kørende gange. - Slukke elektroforese enhed, tag agarosegel og visualisere de amplificerede DNA bands under UV-lys. Ved hjælp af et barberblad skæres ud enkelte DNA fragmenter fra gelen, og overføre dem til mærket 2 mL mikrofuge rør.
Bemærk: Minimere eksponeringstiden for UV-lys for at undgå DNA-skader. - Bruge en PCR clean-up kit (Se Tabel af materialer) til at rense de forskellige DNA-fragmenter.
- Tilsættes 500 µL af NTI buffer, som kit til hvert rør, der indeholder en gel fragment. Overførsel til en thermomixer på 50-55 ° C og ryster ved 1000 rpm, indtil gel er helt opløst i bufferen.
- Hver opløsning overføres til en kolonne med mærket kit, spin i en microcentrifuge (30-60 ' erne, 11.000 x g) og kassér flowthrough. Tilføje 700 µL af den kit NT3 vaskebuffer, centrifugeres igen under de samme indstillinger og kassér flowthrough. Der centrifugeres kolonner igen for 1-2mins på 11.000 x g tørre silica membran inde i kolonnen.
- Overføre kolonne til et mærket 1,5 mL mikrofuge rør, afpipetteres 30 µL nukleasen-gratis vand ind i kolonnen, lad stå i 1 minut og centrifugeres 30-60 ' erne på 11.000 x g at eluere DNA.
- Kvantificere mængden af DNA inddrives ved at måle Absorbansen for prøven på 260 nm og 340 nm i et spektrofotometer (Se Tabel af materialer). DNA-koncentrationen er beregnet ved at fratrække den 340 nm læsning fra 260 nm tallet, derefter at multiplicere resultatet af DNA'S extinction koefficient (50 µg/mL)23.
Noter: Yderligere målinger på 230 nm og 280 nm tillade evaluering af DNA renhed: 260/280 og 260/230 nøgletal over 1,8 er generelt betragtes som ren for DNA. Protokollen kan være midlertidigt efter dette trin, gemme den eluted DNA på 4 ° C (kort sigt) eller -20 ° C (længere sigt).
4. PCR-amplifikation at generere kimære DNA-sekvens
- Sat op 50 µL af en PCR reaktion til at sammensmelte de separate bestanddele af Kimæren. Følg de samme trin som beskrevet i punkt 3.1, ansætte de N-terminal og C-terminale primere sammen med 10 ng af hver af DNA fragmenter opnået i trin 3.7.
Bemærk: PCR reaktionen kan indstilles i om aftenen og køre natten over. - Gentag trin 3.2 til 3.7 at restituere sig og kvantificere den renset DNA-fragment i 30 µL nukleasen-gratis vand. Dette fragment indeholder de kimære DNA-sekvens, flankeret af begrænsning sites inkluderet i de terminal primere.
5. indsættelse af de kimære DNA i en udtryk vektor
- Label to 1,5 mL mikrofuge rør og afpipetteres forskellige reagenserne i rækkefølge angivet i tabel 4, tilføjer 1 µg for den valgte udtryk vektor i en tube og 1 µg af det gendannede DNA-fragment i den anden. Inkuber i 1-4 timer ved 37 ° C til at udføre fordøjelse med de valgte restriktionsenzymer.
Noter: Sikre begge restriktionsenzymer er kompatible med den buffer, der er ansat. Hvis de kræver helt forskellige buffere, udføre disse trin først med kun et af enzymerne og Gentag. Den tid, der kræves for fordøjelsen kan variere afhængigt af restriktionsenzymer valgt: henvise til producentens anvisninger for detaljerede oplysninger. - Gentag trin 3.2 til 3.7 for at rense og genoprette den fordøjet DNA fragmenter og udtryk vektor i 30 µL nukleasen-gratis vand. Kvantificere mængden af DNA inddrives som før.
- Beregning af Indsæt DNA, der kræves for forholdet 3:1 Indsæt/vektor kindtand i ligatur reaktionen, ved hjælp af følgende ligning.
Indsæt (ng) = molære forhold * vektor (ng) * Indsæt størrelse (bp) / vektor størrelse (bp)
Bemærk: Forskellige Indsæt/vektor molære forhold kan testes, selvom forholdet 3:1 er normalt tilstrækkelig til at opnå tilstrækkelige resultater. - Opsætning af 20 µL af en ligatur reaktion i en 1,5 mL mikrofuge tube med 40 ng af udtrykket vektor mængden af kimære DNA beregnet i trin 5.3, buffer og T4 DNA ligase efter den rækkefølge, der er angivet i tabel 5, og der inkuberes natten over ved 16 ° C.
Bemærk: Ligatur effektivitet generelt øges ved at udføre reaktion overnatning på 16 ° C, men alternativt reaktion kan være inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. - Omdan 5-10 µL af ligatur blandingen i kemisk kompetente Escherichia coli (E. coli) udarbejdet efter standardprotokoller24 vokse i udvalg plader og vælge enkelt kolonier til ekspansion og plasmid DNA isolation ifølge etablerede protokoller25.
Bemærk: E. coli XL1-blå stamme var ansat i denne protokol, men andre E. coli varianter kan også bruges. - Fordøje 1 µg de isolerede plasmider med de passende restriktionsenzymer følge vejledningen i trin 5.1, og vurdere tilstedeværelsen af et DNA band af en størrelse svarende til den kimære sekvens af elektroforese i en agarosegel (Se trin 3.2-3.5).
Bemærk: Det anbefales, at den indsatte sekvens er kontrolleret ved hjælp af en DNA-sekventering service. - Efter vellykket sekvens verifikation, kan plasmider produceret i større mængder og ansat i et pattedyr ekspressionssystem af følgende veletablerede protokoller26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktion og produktion af en kimære protein (figur 1) vil blive eksemplificeret med to medlemmer af familien interleukin-6 cytokin OSM og LIF, som var genstand for en nyligt offentliggjort undersøgelse6. Figur 2 viser de tre-dimensionelle struktur af disse proteiner. Begge molekyler vedtage den karakteristiske sekundær struktur af klasse jeg cytokiner, med fire helices (betegnes A til D) pakket i en bundle og følgeskab af loops28. Justeret aminosyre strukturer af de menneskelige proteiner kan ses i figur 3A. I dette eksempel BC loop region af OSM blev udvekslet ved den tilsvarende LIF sekvens til at oprette en OSM-LIF chimera med aminosyresekvens som vist i figur 3B.
Til dette formål, DNA-sekvensen af OSM og LIF blev indhentet og regionen kodning aminosyre svarende til BC løkke blev identificeret for begge cytokiner og erstattet (figur 4). En 6-histidin tag var desuden indarbejdet i C-terminus at lette downstream protein oprensning. Næste, en egnet vektor for pattedyr udtryk (pCAGGS) blev valgt, og unikke begrænsning websteder inden for dens flere kloning site var valgte (PacI og AscI) efter at sikre, at de ikke var til stede i den kimære gensekvens (Se trin 2.1.1.).
Primere var udformet som vist i tabel 4. Den N-terminale fremskudte OSM primer inkluderet en førende sekvens af 9 basepar, efterfulgt af webstedet PacI begrænsning, et plasmid-specifikke spacer og de indledende 27 basepar af OSM. Den C-terminale omvendte primer indarbejdet den førende sekvens efterfulgt af webstedet AscI begrænsning, en spacer og de 27 sidste basepar af det gen, som i denne sag svarede til den C-terminale histidin tag. Derudover var 30-basepar primere spanning samlingspunkter af BC løkken påkrævet i både forward og reverse retningslinjer.
Den første PCR forstærkning trin bestod af tre separate reaktioner. Den N-terminale OSM fragment, som krævede N-terminale OSM frem og BC start omvendt primere, bruges OSM som skabelon. LIF BC løkke blev opnået gennem BC start frem og BC ende omvendt primere med LIF som skabelon. Den C-terminale OSM fragment bruges BC ende frem samt C-terminale OSM omvendt primere og OSM som skabelon. Disse tre fragmenter, med forventede størrelser af 385, 75 og 321 basepar henholdsvis, kan ses i figur 5A efter separation i en 1%-agarosegel.
Disse renset fragmenter blev derefter brugt som en skabelon i den anden PCR reaktion, sammen med N-terminalen OSM frem og C-terminale OSM reverse primere. Resultatet af denne forstærkning, svarende til OSM-LIF BC loop gensekvens og er vist i figur 5B. Dette skridt blev efterfulgt af rensning, en 4-timers fordøjelse af genet fragment og valgte plasmid, gelelektroforese og rensning, overnight ligatur på 16 ° C, og omdannelsen til E. coli XL1-blå. Enkelte plasmider blev isoleret og screenet af begrænsning enzym fordøjelsen for ordentlig indsættelse af DNA-fragment (figur 6). Endelig blev positiv hits sendt til sekvensering til at kontrollere, at sekvensen svarede til den påtænkte OSM-LIF BC loop chimera før fortsætter til protein udtryk, rensning og test i funktionelle assays6.
Figur 1 : Skematisk fremstilling af kimære protein generation. (A) kimære designprocessen: efter udvælgelse af regioner skal udveksles, rækkefølgen af de ønskede chimera og de nødvendige primere er konstrueret ved hjælp af DNA redigeringssoftware. (B) de vigtigste skridt i generation af kimære proteiner er afbildet. To trin af PCR-amplifikation producere en kimære gensekvens, som derefter fordøjes med de passende restriktionsenzymer og forbundet til et udtryk vektor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Strukturelle ligheder mellem OSM og LIF. Repræsentation af krystal strukturer af OSM29 (FBF: 1EVS) og LIF30 (FBF: 2Q7N), sammen med en omtrentlig repræsentation af de designede chimera. Disse cytokiner vedtage en fire-spiralformet bundt kropsbygning følgeskab af loops. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i bindingssted III af menneskelige Oncostatin M (OSM) er påkrævet for OSM receptor aktivering. J. Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © forfatterne6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Sammenligning af OSM og LIF aminosyresekvenser. (A) justering af de fuld-længde aminosyresekvenser af menneskelige OSM og LIF, med regionen BC loop fremhævet. Stjerner (*) angiver fuldt bevaret rester, koloner (:) svarer til aminosyrer med stærkt lignende egenskaber og punktummer (.) betegne dem med svagt lignende funktioner. (B) aminosyresekvens af OSM BC kredsløb kimære, med BC loop region af OSM erstattet af LIF tilsvarende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : DNA sekvens af OSM BC kredsløb kimære. Sekvens af den kimære OSM protein. Regionen indsat fra LIF er fremhævet i orange. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Forstærkning af OSM BC kredsløb kimære DNA fragmenter. (A) skyldes den første PCR-amplifikation med bands svarende til den N-terminale region (lane 2), BC loop (lane 3) og C-terminale region (lane 4). (B) et resultat af den anden PCR-amplifikation, hvor de tre bands opnået i den første forstærkning er kombineret til at generere OSM chimera. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Indsættelse af OSM BC kredsløb kimære i plasmid vektor. Begrænsning enzym fordøjelsen af de genererede plasmider, med en lavere band stede ved ~ 700 basepar med angivelse af den korrekte indsættelse af OSM chimera gensekvens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Reagens | Stock koncentration | Volumen (i 50 µL) |
| Sterilt vand | til 50 µL | |
| PCR Buffer | 10 X | 5 ΜL |
| dNTP'er | 10 mM | 1 ΜL |
| DMSO | 100% | 1,5 ΜL |
| Fremad Primer | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Omvendt Primer | 10 ΜM | 1 ΜL |
| DNA-Template | Variabel | Som det kræves for 2,5-12,5 ng af plasmid DNA |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase | 2 enheder/µL | 0,5 ΜL |
Tabel 1: Reagenser kræves til PCR reaktionsblanding.
| N-terminale fragmenter | Kimære indsættelse | C-terminale fragmenter | |
| Fremad Primer | N-terminal frem | Første krydset frem | Anden krydset frem |
| Omvendt Primer | Første junction omvendt | Anden krydset omvendt | C-terminale reverse |
| DNA-Template | Modtageren | Donor | Modtageren |
Tabel 2: Primer og skabeloner, der er nødvendige for generation af en standard kimære protein.
| Cyklus trin | Temperatur | Tid | Antal cyklusser |
| Indledende denaturering | 98 ºC | 30s | 1 |
| Denaturering | 98 ºC | 10s | 23-25 |
| Udglødning | 68 ºC * | 25s | 23-25 |
| Udvidelse | 72 ºC | 30s pr. kilobase | 23-25 |
| Endelige udvidelse | 72 ºC | 300s | 1 |
| Hold | 4 ºC | ∞ | 1 |
| * Mindst 5 ºC lavere end primer smeltende temperatur | |||
Tabel 3: PCR-protokol bruges til at forstærke de kimære fragmenter og den fulde kimære protein.
| Reagens | Stock koncentration | Volumen (i 50 µL) |
| Sterilt vand | til 50 µL | |
| Begrænsning enzym Buffer * | 10 X | 5 ΜL |
| DNA-Template | Variabel | Som det kræves for 1 µg af DNA |
| Enzym #1 | Variabel | 1 ΜL |
| Enzym #2 | Variabel | 1 ΜL |
| * Sikre, at begge enzymer er kompatible med den buffer, der er valgt | ||
Tabel 4: Komponenter af begrænsning enzym fordøjelsen reaktion.
| Reagens | Stock koncentration | Volumen (i 20 µL) |
| Sterilt vand | til 20 µL | |
| T4 DNA Ligase Buffer | 10 X | 2 ΜL |
| Vektor DNA | Variabel | Som det kræves for 40 ng af DNA |
| Indsæt DNA | Variabel | Som det kræves i forholdet 3:1 molær |
| T4 DNA Ligase | Variabel | 1-2 ΜL |
Tabel 5: Reagenser kræves for ligatur reaktion.
| Navn | Primer sekvens |
| N-terminale OSM fremad primer (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-terminal HisTag omvendt primer (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| BC loop start frem | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| BC loop starte reverse | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| BC loop ende frem | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| BC loop ende vende | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Tabel 6: Primere bruges i generation af OSM BC kredsløb kimære.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generation af kimære proteiner udgør en alsidig teknik, som er i stand til at gå ud over grænserne for afkortede proteiner til løsning af spørgsmål såsom modularitet af cytokin-receptor binding domæner13. Design af kimærer er et vigtigt skridt i denne form for undersøgelser, og kræver nøje overvejelse. Foreløbige undersøgelser at etablere funktionelle domæner vil generelt kræve substitution af brede regioner i en første fase, mens mindre udskiftninger af variabel længde er mere velegnet til detaljerede undersøgelser af en enkelt region. Særlig opmærksomhed bør gives til tilstedeværelsen af små bevarede motiver inden for en protein familie i dette trin, da disse ofte er vejledende i funktionelle steder31,32. Personlig erfaring viser, at mere end ét kredsløb kimære protein design kan være nødvendigt for at indsnævre en centrale funktionelle region, med hver runde kræver betydelig tid (uger til måneder) fra indledende design til funktionelle Analysetestning.
Så længe der eksisterer et strukturelt lignende protein til protein af interesse, men besidder forskellige biologiske funktioner, denne metode kan anvendes til enhver sekvens af interesse, selv om det skal være optimeret til hver bestemt gen på grund af sin afhængighed af PCR forstærkning. Især gener besidder GC-rige regioner kan vise sig særligt udfordrende mål, da disse typer af sekvenser er kendt for at reducere effektiviteten af forstærkning33. Problemerne kan normalt løses ved forskellige midler, såsom tilføjelsen af forskellige tilsætningsstoffer (f.eks. betain) reaktion, anvendelse af specialiseret DNA polymerase buffere eller ændring af den udgloedning parametre34. Derfor kræver det generelt nogle trial and error før passende betingelser for gen af interesse er fundet.
Protokollen i henhold er baseret på klassiske begrænsning enzym-baserede kloning metoder, der er generelt tilgængelige for hver type af laboratorium, men det kan yderligere tilpasses for at tage fordel af mere avancerede kloningsteknikker. For eksempel ved hjælp af gateway kloning, ville som letter kloning den samme Indsæt i flere forskellige vektorer (f.eks. Hvis forskellige udtryk systemer skal testes sideløbende), blot kræve særlig attB rekombination websteder på plads af begrænsning websteder detaljeret i denne protokol35. Andre nyere kloning metoder kan omgå behovet for en anden PCR reaktion (f.eks. bruger36 eller Gibson forsamling37) og ligatur (fx sekvens og ligatur-uafhængig kloning (SLIC)38 eller i fusion forsamling 39). mens der kræver forskellige reagenser og primer designstrategier, læsere med adgang til disse metoder, opfordres til at anvende dem til at væsentligt fremskynde generation af kimære konstruktioner efter at have fulgt de grundlæggende designprincipper detaljeret i trin 1 i denne protokol.
Samlet set kan ved anvendelse af denne metode levere værdifuld indsigt vedrørende af mekanismer som andre protein biologiske funktioner finder sted, navnlig vedrørende protein-protein eller protein-nucleic acid interaktioner, og udgør et nyttigt redskab til at identificere og angive unikke struktur-funktion relationer inden for et protein familie6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Max Planck Society og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del af denne forskning blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i bindingssted III af menneskelige Oncostatin M (OSM) er påkrævet for OSM receptor aktivering. J. Biol. Chem. 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
