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Biochemistry

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

Published: January 8, 2019 doi: 10.3791/58786
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Strukturell verwandte Proteine üben häufig unterschiedliche biologische Funktionen. Der Austausch von äquivalenten Regionen dieser Proteine um Chimären Proteinen zu schaffen stellt einen innovativen Ansatz zur kritischen Protein Regionen zu identifizieren, die für ihre funktionale Divergenz verantwortlich sind.

Abstract

Das Ziel dieses Protokolls umfasst das Design von Chimären Proteinen in die unterschiedliche Regionen eines Proteins durch ihre entsprechenden Sequenzen in einem strukturell ähnlichen Protein ersetzt werden, um die funktionelle Bedeutung dieser Regionen zu ermitteln. Diese Chimären entstehen mittels einer verschachtelten PCR-Protokoll mit überlappenden DNA-Fragmente und angemessen entworfen, Grundierungen, gefolgt von ihren Ausdruck in einem Säugetier-System nativen Sekundärstruktur und post-translationalen Modifikationen zu gewährleisten.

Die funktionale Rolle der eigenständige Region wird dann durch einen Verlust der Aktivität der Schimäre in einer entsprechenden Anzeige-Assay. In der Folge werden Regionen beherbergen eine Reihe von wichtigen Aminosäuren identifiziert, die weiter durch ergänzende Techniken (z.B. Site-verwiesene Mutagenese) zur Erhöhung der molekularen Auflösung gezeigt werden. Obwohl auf Fälle begrenzt, in denen strukturell verwandte Proteine mit unterschiedlichen Funktionen gefunden werden kann, haben Chimäre Proteinen erfolgreich eingesetzt worden, um kritische verbindliche Regionen in Proteine wie Zytokine und Zytokin-Rezeptoren zu identifizieren. Diese Methode eignet sich besonders in Fällen, in denen das Protein funktionale Regionen nicht gut definiert sind, und ist einen wertvollen erste Schritt gerichtete Evolution Ansätze zur Eingrenzung der Regionen von Interesse und reduzieren den Aufwand für Screening.

Introduction

Verschiedene Arten von Proteinen, einschließlich Zytokine und Wachstumsfaktoren, werden in Familien zusammengefasst, deren Mitglieder teilen ähnliche dreidimensionale Strukturen aber oft üben unterschiedliche biologische Funktionen1,2. Diese Funktionsvielfalt ist in der Regel die Folge der kleine Unterschiede in der Aminosäure-Zusammensetzung innerhalb des Moleküls aktive Zentren3. Identifikation von solchen Websites und funktionelle Determinanten bieten nicht nur evolutionäre Erkenntnisse sondern auch spezifischere Agonisten und Inhibitoren4zu entwerfen. Allerdings erschwert die große Zahl der Unterschiede in der Zusammensetzung der Rückstände häufig zwischen strukturell verwandten Proteinen gefunden diese Aufgabe. Obwohl große Bibliotheken mit Bau Hunderte von Mutanten ist heute machbar, Beurteilung jedes einzelnen Rückstände Variation und Kombinationen davon bleibt noch ein schwieriger und zeitaufwendiger Aufwand5.

Techniken, die Beurteilung der funktionalen Bedeutungdes des großen Protein Regionen sind somit von Wert, die Anzahl der möglichen Rückstände auf eine überschaubare Zahl6zu reduzieren. Abgeschnittene Proteine wurden die am häufigsten verwendete Ansatz, dieses Problem anzugehen. Dementsprechend gelten Regionen werden funktionell relevant, wenn die Funktion des Proteins unter Studie durch das Löschen einer bestimmten Region7,8,9betroffen ist. Eine große Einschränkung dieser Methode ist jedoch, dass Löschungen Sekundärstruktur des Proteins, führende Fehlfaltung, Aggregation und die Unfähigkeit die vorgesehene Region studieren auswirken können. Ein gutes Beispiel ist eine verkürzte Version von Zytokin Oncostatin M (OSM), in denen eine interne Löschung größer als 7 Rückstände fehlgefaltete Mutant geführt, die nicht weiter sein könnte10untersucht.

Die Generation von Chimären Proteinen bildet einen alternativen und innovativeren Ansatz, der die Analyse der größeren Protein Regionen ermöglicht. Das Ziel dieser Methode ist es, die Regionen von Interesse in einem Protein von strukturell verwandten Sequenzen in ein anderes Protein, zu tauschen, um den Beitrag der ersetzten Abschnitte bestimmten biologischen Funktionen zu bewerten. Weit verbreitet im Bereich der Signalisierung Rezeptoren zu identifizieren, Funktionsbereiche11,12, sind Chimäre Proteinen besonders nützlich, Proteinfamilien mit wenig Aminosäure Identität aber konservierte Sekundärstruktur zu studieren. Entsprechende Beispiele finden Sie in der Klasse von Interleukin-6 (IL-6) Typ Zytokine, wie Interleukin-6 und ciliary Neurotrophic Faktor (6 % Sequenz Identität)13 oder Leukämie hemmenden Faktor (LIF) und OSM (20 % Identität)6, auf denen die nach Protokoll basiert.

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Protocol

(1) chimäres Protein-Design

  1. Wählen Sie eine geeignete Protein (Spender), Regionen mit dem Protein des Interesses (Empfänger) auszutauschen, die die Spender-Protein strukturell ähnlich, im Idealfall, gehören zur gleichen Proteinfamilie, aber es fehlte die biologische Aktivität als Anzeige verwendet werden sollen. Wenn keine strukturell verwandte Proteine bekannt sind, können potenzielle Kandidaten identifiziert mit Hilfe eines automatisierten Tools wie die Vector Alignment Search Tool (VAST)14,15
    1. Zugriff auf die Protein Data Bank (PDB)16 Europäische Website (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), einzuführen, den Namen des Proteins des Interesses in das Suchfeld in der oberen rechten Ecke, und klicken Sie auf "Suchen". Sofern eine Kristallstruktur verfügbar, nicht auf die PDB-ID (PDB ID; z.B. 1evs für OSM).
      Hinweis: Wenn strukturelle Daten nicht auf die PDB-Datei verfügbar ist, könnte eine Homologie-Modell des Proteins durch ein Tool wie SWISS-Modell17 stattdessen generiert werden mit verfügbaren detaillierte Protokolle18.
    2. Zugriff auf die riesige Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). Für den Fall, dass eine PDB-ID zur Verfügung steht, scrollen Sie "Vorberechnete Ergebnisse abrufen" Abschnitt imput die PDB-ID im Feld "Zeigen ähnliche Strukturen für", und klicken Sie auf "Go". Klicken Sie im folgenden Fenster auf 'Original große' und dann 'Kette', eine Liste der PDB IDs für strukturell ähnlichen Kandidaten zu sehen.
      1. Wenn eine PDB-ID nicht verfügbar ist, aber eine Homologie-Modell generiert wurde, führen Sie einen Bildlauf nach unten zum Abschnitt "Suche mit einer neuen Struktur" und klicken Sie auf den Link "Große Suche". Laden Sie die PDB-Datei des Modells durch Klicken auf "Durchsuchen" neben "Einreichen PDB-Datei", wählen Sie die Datei und klicken auf "Senden".
      2. Nach der PDB-Datei hochgeladen ist, klicken auf "Start", um die riesigen Berechnung starten. Nachdem die Berechnung abgeschlossen ist, klicken Sie auf "Gesamtkette" unter Domains, die PDB-IDs der strukturell ähnliche Proteine zu sehen.
    3. Die biologischen Funktionen von Interesse (z.B. Rezeptor Aktivierung, enzymatische Aktivität, Transkription Faktor-Aktivität) der Top-Kandidaten, entweder experimentell in der Auslesesystem Wahl oder durch eine Literaturrecherche zu beurteilen. Wählen Sie ein Spender-Protein mit unterschiedlicher Funktion im Vergleich zu dem Protein des Interesses.
  2. Erhalten Sie die Protein-Aminosäure-Sequenzen der Empfänger und Spender Proteine von Referenzsequenz (RefSeq) Datenbank19 .
    1. Zugreifen Sie die gen-Abschnitt in der RefSeq-Webseite (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), geben Sie den Namen des Proteins des Interesses in das Suchfeld ein und klicken Sie auf "Suchen". Klicken Sie auf den Namen des Gens für die gewünschten Arten in die Ergebnisliste.
    2. Scrollen Sie zum Abschnitt RefSeq, alle dokumentierte Isoformen zu sehen. Klicken Sie auf die Sequenz-ID für die Isoform von Interesse (beginnend mit NM), scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf "CDS", die Protein-kodierenden Region des Gens hervorzuheben. Rechts unten auf dem Bildschirm klicken Sie auf "FASTA" und kopieren Sie die gen-Sequenz.
    3. Speichern Sie die DNA-Sequenz mit einer geeigneten DNA Bearbeitungs-Software. Wenn Sie die frei verfügbare ApE20verwenden, öffnen Sie das Programm, fügen Sie die kopierten Reihenfolge in das leere Feld, wählen Sie den Sequenznamen und klicken Sie auf "Speichern".
      Hinweis: Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1. zu 1.2.3. für die einen oder mehrere Spender Proteine ausgewählt.
  3. Wählen Sie die Protein-Regionen in den verschiedenen Chimären Konstrukten ersetzt werden.
    1. Unterteilen Sie die Proteinsequenz des Interesses an verschiedene strukturelle Regionen. Idealerweise werden verschiedene Domains für das fragliche Protein in der Literatur beschrieben worden. Wenn dies nicht der Fall ist, sollte die Existenz von unterschiedlichen konservierten Strukturmerkmale (Helices, Schleifen) in Schritten 1.3.1.1 bewertet werden. zu 1.3.1.4.
      1. Die Strukturdaten des Proteins des Interesses von der PDB-Website herunterladen (siehe Schritt 1.1.1.). Rufen Sie die PDB-Seite für das Protein, und laden Sie die PDB-Datei durch Klicken auf "download" auf der rechten Seite des Bildschirms.
      2. Öffnen Sie die PDB-Datei in eine molekulare Visualisierung wie PyMOL (https://pymol.org/). In PyMOL, Anzeigen der Nukleotidsequenz (indem Sie auf Anzeige > Sequenz auf), Ausblenden der Standard-Strukturdaten (durch H neben der PDB-ID klicken, und wählen "alles") und wählen Sie die Ansicht "Cartoon" eindeutig das Protein strukturelle visualisieren Funktionen (auf der S neben der PDB-ID und auswählen "cartoon").
      3. Klicken Sie auf die Nukleotidsequenz am oberen Rand des Bildschirms, um verschiedene Teile des Moleküls, notieren die Aminosäuren entspricht jedes strukturelle Besonderheit hervorheben.
    2. Beschriften Sie die unterschiedlichen strukturellen Regionen auf die DNA-Sequenz in ApE. Dazu öffnen Sie die DNA-Sequenz aus Schritt 1.2.3., wählen Sie die Nukleotiden, die Kodierung der Aminosäuren in einer Region, mit der rechten Maustaste auf die Auswahl und wählen Sie "Neu", um ihm einen Namen und eine Farbe. Wiederholen Sie den Vorgang für jede strukturelle Region, die im vorherigen Schritt identifiziert.
      Hinweis: Die Nukleotid-Auswahl kann durch Anklicken des ORFs überprüft > übersetzen, dann klicken Sie auf OK, um sicherzustellen, dass sie die richtige Aminosäuresequenz codieren.
    3. Richten Sie die Rückstände Sequenzen der beiden Proteine mit einem Protein-Alignment-Tool (z.B. Clustal Omega21).
      Hinweis: Da die Chimären in einem Säugetier Expressionssystems hergestellt werden sollen, sollten diese Sequenzen der Proteine-Signal-Peptide enthalten.
      1. Erhalten Sie die volle Aminosäuresequenzen von Spender und Empfänger Proteinen in ApE, durch die Öffnung der DNA-Sequenzen aus Schritt 1.2.3., Sie sie auswählen und anklicken ORFs > Translate.
      2. Clustal Omega-Webseite (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) zugreifen und imput die Aminosäure-Sequenzen der beiden Proteine, dann scrollen Sie nach unten und klicken Sie auf "Absenden". Jede Sequenz sollte ging durch eine Textzeile mit "> ProteinName" richtig identifiziert werden...
      3. Die Ausrichtung-Datei durch Klicken auf die Registerkarte "Ausrichtung" Downloaddatei"" abrufen und speichern. Diese Datei kann von jedem Textbearbeitungsprogramm geöffnet werden.
      4. Mit der Ausrichtung-Datei als Referenz, die entsprechende strukturelle Bereiche des Proteins Spender in ihrer DNA-Sequenz mit Anmerkungen versehen (siehe Schritt 1.3.2.).
    4. Entscheiden Sie, welche Regionen Protein zum Austausch in den Chimären Proteinen und die entsprechenden Nukleotidsequenzen für die Chimären zu entwerfen.
      Hinweis: Keine detaillierten Informationen über funktionale Bedeutung der verschiedenen Regionen, es wird empfohlen, große Substitutionen wie ganze Schleifen auswählen oder Helices, welche von ihnen bewerten auf Proteinfunktion auswirken. Dieses erste explorative Experiment kann gefolgt von einer zweiten Runde von Chimären Protein-Design, konzentrierte sich auf kleinere Ersetzungen innerhalb der jeweiligen Regionen.
      1. Erstellen Sie eine Kopie der kommentierten DNA-Sequenz des Rezeptor-Proteins aus Schritt 1.3.2. und benennen Sie es als ein chimäres Protein. Öffnen Sie die umbenannte DNA-Sequenz in ApE, wählen Sie aus und löschen Sie die Nukleotid Reihenfolge Codierung für die Region ausgetauscht werden, und ersetzen Sie es durch die entsprechende Region in der Spender-Protein (kopiert aus der kommentierten Sequenz erstellt in Schritt 1.3.3.), dann speichern die Änderungen.
        Hinweis: Erstellen Sie eine neue Kopie und wiederholen Sie diesen Schritt für jede unterschiedliche Chimäre entworfen.

2. Vorbereitung für Molecular Cloning

  1. Wählen Sie einen Plasmid-Vektor für den Ausdruck-System der Wahl. Für Säuger Ausdruck hoher Expressionsvektor wie pCAGGS22 oder PcDNA Vector Serie empfohlen.
    1. Das Restriktionsenzym-basierte Klonen demonstriert in diesem Protokoll, sicherstellen Sie, dass die einzigartige Restriktionsschnittstellen vorhanden, in der mehrere cloning Site (MCS) des Vektors mit dem Protein des Interesses kompatibel sind. Dazu die DNA-Sequenz von Chimären Konstrukten mit ApE zu öffnen, klicken Sie auf "Enzyme > Enzym-Selektor" und stellen Sie sicher, dass mindestens zwei der Restriktionsschnittstellen in der MCS fehlen in der Sequenz (Anzeige eine Null neben ihrem Namen).
  2. Entwerfen Sie die Klemme Primer mit einem DNA-Editor wie z. B. ApE.
    1. Erstellen Sie eine neue DNA-Datei (Datei > neu) und initiieren die N-terminale Grundierung mit einer Leader-Sequenz (3-9 zusätzliche Basenpaare, z. B. AAAGGGAAA), gefolgt von der ersten Einschränkung Website ausgewählt in den Vektor MCS (6-8 Basenpaare, z. B. TTAATTAA für PacI), eine optionale Abstandhalter (z. B. GCTAGCGCATCGCCACC in der pCAGGS-Vektor der im Beispiel verwendete) und die ersten 18-27 Basenpaare des Gens von Interesse (z.B. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG für OSM).
    2. In einer neuen DNA-Datei, die C-terminale Primer Sequenz beginnt mit Finale 18-27 Basenpaare des Gens von Interesse (z.B. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA für ein Gen mit einem 6xHistidine C-terminale), gefolgt von einem optionalen Abstandhalter (z.B. TAGCGGCCGC in die pCAGGS-Vektor), die zweite Einschränkung site gewählt (z. B. GGCGCGCC für AscI) und einer Leader-Sequenz (z.B. AAAGGGAAA). Markieren Sie die gesamte Sequenz, mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Reverse-Ergänzung", die rückwärts-Primer zu erhalten.
  3. Entwerfen Sie Primer für jede der Grenzregionen in den Chimären Konstrukten.
    1. Öffnen Sie die DNA-Sequenz von der Chimera (erstellt in Schritt 1.3.4.1.) und markieren Sie eine 30 Basenpaar-Region in der Zone, wo die ursprüngliche und eingefügten Sequenzen in Kontakt, bestehend aus 15 Basenpaaren jeder Sequenz. Kopieren Sie der Region (mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Kopieren") und fügen Sie ihn in eine neue DNA-Datei; dieser Sequenz werden die vorderen Grundierung.
    2. Erstellen Sie eine Kopie der vorwärts Grundierung erzeugt in der vorherigen Schritt und benennen Sie es als rückwärts-Primer. Markieren Sie die Grundierung-Sequenz, mit der rechten Maustaste und wählen Sie "Reverse-Ergänzung", die rückwärts-Primer Sequenz zu generieren.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 2.3.1. und 2.3.2. für jede Kontaktzone der chimeric DNA-Sequenz. Im Allgemeinen sind zwei Sätze von vorwärts/rückwärts-Primer zur Erzeugung einer Chimäre, erforderlich, wenn der Ersatz an die N-terminale oder C-terminale Regionen auftritt.
  4. Bestellen Sie die Klemme und interne Primer einem Oligonukleotid-Synthese-Anbieter.
    Noten: Mittels terminal Primer gereinigt (z. B. HPLC gereinigt) in das Protokoll Erfolgsquote einen positiven Einfluss haben kann. Entsalzte interne Zündkapseln liefern in der Regel gute Ergebnisse.
  5. Erhalten Sie Vorlage-Sequenzen der Spender und Rezeptor-Gene.
    Hinweis: Plasmide enthalten die open Reading Frames (ORFs) dieser Sequenzen als Vorlage stark erleichtert das Verfahren und wird empfohlen. Alternativ kann komplementäre DNA (cDNA) generiert aus einer Zelllinie bekannt, diese Gene auszudrücken als Vorlage für spätere Schritte verwendet werden.

(3) Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Verstärkung der einzelnen DNA-Fragmente bilden die Chimäre

  1. Bereiten Sie einen einzelnen PCR Reaktionsgemisch für jedes der Fragmente der Chimäre Protein zu komponieren. Ein typisches chimäres Protein benötigen drei einzelne Fragmente: die N-terminale Teil, die Region eingefügt werden soll und der C-terminalen Teil.
    Noten: Verwenden Sie ein High-Fidelity-DNA-Polymerase (z.B. Phusion-High Fidelity-DNA-Polymerase) um zu vermeiden, Einführung von Mutationen in der Sequenz. Die PCR-Reaktion kann richten Sie abends und über Nacht laufen.
    1. Ein 1,5 mL Microfuge Rohr auf Eis und Pipettieren der verschiedenen Reagenzien der PCR Mischungen in der in Tabelle 1angegebenen Reihenfolge gewährleisten korrekte Grundierungen und Vorlagen für jede PCR-Reaktion beschäftigt sind (siehe Tabelle 2).
    2. Beschriften Sie zwei dünnwandige 0,2 mL PCR-Röhrchen für jede Reaktion, und übertragen Sie 20 µL der entsprechenden PCR Mischung in jedem Röhrchen zu. Übertragen Sie die PCR-Röhrchen in eine PCR-Thermocycler und initiieren Sie das Protokoll detailliert in Tabelle 3zu.
      Hinweis: Ausglühen Temperatur sollte mindestens 5 Grad niedriger als die Schmelztemperatur der gestalteten Primer.
  2. Während die PCR ausgeführt wird, bereiten Sie 100 mL einer 1 % Agarose-Gel im Puffer Tris-Acetat-EDTA (TAE). Zu diesem Zweck wiegen 1 g Agarose, mischen Sie mit 100 mL TAE Puffer in einem Glaskolben und Mikrowelle, bis die Agarose wirbeln die Flasche alle 30-40 Sekunden vollständig aufgelöst ist. Kühlung auf etwa 50 ° C, fügen Sie 2-3 µL Interkalation Bromid (oder eine entsprechende DNA-Farbstoff) und gießen Sie in ein Gel-Fach mit der gewünschten gut kämmen.
    Vorsicht: Interkalation Bromid ist ein bekannter Mutagen, sorgen für die Verwendung der richtigen Schutzausrüstung.
  3. Nachdem die PCR-Reaktion abgeschlossen ist, fügen Sie 4 µL 6 X DNA Loading Puffer in jedem Röhrchen. Legen Sie das 1 % Agarose-Gel in einer Elektrophorese-Gerät mit TAE Puffer abdecken und vorsichtig die Proben in das Gel zusammen mit einem Molekulargewicht Leiter laden.
    Hinweis: zum Zeitpunkt der Verladung ist es vorzuziehen, lassen Sie leere Gassen zwischen den Proben DNA Erholung danach zu erleichtern.
  4. Führen Sie das Gel bei 80-120 V, für 20-45 Minuten.
    Hinweis: Bands unter 1.000 Basenpaare können in der Regel electrophoresed werden in etwa 20 Minuten bei 120 V, während größere Bands längere Laufzeiten benötigen.
  5. Schalten Sie das Gerät Elektrophorese, nehmen Sie das Agarosegel und visualisieren Sie der amplifizierten DNA-Bänder unter UV-Licht zu. Mit einer Rasierklinge, die einzelnen DNA-Fragmente aus dem Gel geschnitten Sie aus, und übertragen Sie sie auf markierte 2 mL Microfuge Röhren.
    Hinweis: Minimieren Sie die Belichtungszeit mit UV-Licht um DNA-Schäden zu vermeiden.
  6. Verwenden eine Bereinigung von PCR kit (siehe Tabelle der Materialien), um die verschiedenen DNA-Fragmente zu reinigen.
    1. Fügen Sie 500 µL des Puffers NTI zur Verfügung gestellt durch das Kit für jedes Rohr mit einer Gel-Fragment. Transfer zum Thermomixer bei 50-55 ° C und 1000 u/min schütteln, bis das Gel in den Puffer vollständig gelöst ist.
    2. Jede Lösung einer beschrifteten Kit-Spalte zu übertragen, drehen in einem Microcentrifuge (30-60 s, 11.000 x g) und entsorgen der Bestrahlungskammer. Fügen Sie 700 µL Waschpuffer das Kit NT3, Zentrifugieren Sie wieder unter den gleichen Einstellungen und verwerfen Sie der Bestrahlungskammer. Zentrifugieren Sie die Spalten wieder für 1-2 min bei 11.000 x g Kieselsäure-Membran in der Spalte zu trocknen.
    3. Übertragen Sie die Spalte zu einem beschrifteten 1,5 mL Microfuge Schlauch, Pipettieren 30 µL Nuklease-freies Wasser in die Spalte stehen lassen für 1 Minute und 30-60 s bei 11.000 x g, die DNA zu eluieren zentrifugieren.
  7. Quantifizierung der Menge an DNA erholt durch Messung der Extinktion der Probe bei 260 nm und 340 nm in einem Spektrophotometer (siehe Tabelle der Materialien). Die DNA-Konzentration errechnet sich durch Subtraktion der 340 nm-Lesung aus der 260 nm Figur, dann multipliziert das Ergebnis mit DNA vom Aussterben bedroht-Koeffizient (50 µg/mL)23.
    Noten: Weitere Messungen bei 230 nm und 280 nm ermöglichen für die Bewertung der DNA Reinheit: 260/280 und 260/230 Verhältnisse über 1,8 gelten gemeinhin als reine DNA. Das Protokoll kann nach diesem Schritt Speichern der eluierten DNS bei 4 ° C (kurzfristig) oder-20 ° C (langfristig) angehalten werden.

(4) PCR Verstärkung die Chimeric DNA-Sequenz zu erzeugen

  1. Richten Sie 50 µL einer PCR-Reaktion, die separate Bestandteile der Schimäre zu verschmelzen. Die gleichen Schritte detailliert 3.1, beschäftigt die N-terminale und das C-terminale Primer zusammen mit 10 ng eines jeden der DNA Fragmente in erhaltenen Schritt 3.7.
    Hinweis: Die PCR-Reaktion kann legen Sie abends und über Nacht laufen.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.7 zu erholen und das gereinigte DNA-Fragment in 30 µL Nuklease-freies Wasser zu quantifizieren. Dieses Fragment enthält die chimeric DNA-Sequenz, flankiert von den Restriktionsschnittstellen im terminal Primer enthalten.

(5) einsetzen der Chimeric DNA in eine Expressionsvektor

  1. Label zwei 1,5 mL Microfuge Röhren und Pipettieren der verschiedenen Reagenzien in der Reihenfolge entnehmen Sie Tabelle 4, Hinzufügen von 1 µg des ausgewählten Ausdrucks Vektor in eine Röhre und 1 µg der wiederhergestellten DNA-Fragment in der anderen. Inkubieren Sie für 1-4 h bei 37 ° C, die Verdauung mit der gewählten Restriktionsenzymen durchzuführen.
    Noten: Stellen Sie sicher, dass beide Restriktionsenzymen kompatibel mit dem Puffer beschäftigt sind. Für den Fall, dass sie völlig unterschiedliche Puffer erfordern, führen Sie diese Schritte zuerst mit nur einem der Enzyme und wiederholen. Der Zeitaufwand für die Verdauung nach die Restriktionsenzyme ausgewählt je kann: beziehen sich auf die Angaben des Herstellers für detaillierte Informationen.
  2. Wiederholen Sie die Schritte 3.2 bis 3.7 zu reinigen und den verdauten DNA-Fragment und Ausdruck Vektor in 30 µL Nuklease-freies Wasser zu erholen. Quantifizieren Sie die Menge an DNA erholt wie zuvor.
  3. Berechnen Sie die Höhe der Einlage DNS für eine 3:1 einfügen/Vektor Molverhältnis in der Ligatur-Reaktion unter Verwendung der folgenden Gleichung.

    Legen Sie (ng) = Molverhältnis * Vektor (ng) * Plattengröße (bp) / Vektor Größe (bp)

    Hinweis: Verschiedene einfügen/Vektor molaren Verhältnissen können getestet werden, obwohl in der Regel ein Verhältnis von 3:1 ausreichen, um entsprechende Ergebnisse zu erhalten.
  4. Einrichten von 20 µL einer Ligatur Reaktion in einem 1,5 mL Microfuge Rohr mit 40 ng des Ausdrucks Vektor-die Höhe der chimeric DNA in Schritt 5.3, Puffer und T4 DNA-Ligase nach der in Tabelle 5angegebenen Reihenfolge berechnet und Inkubation über Nacht bei 16 ° C.
    Hinweis: Ligation Effizienzsteigerung in der Regel durch die Durchführung der Reaktion über Nacht bei 16 ° C, aber Alternativ kann die Reaktion 2 h bei Raumtemperatur inkubiert werden.
  5. Transformation von 5-10 µL der Ligatur Mischung in chemisch kompetente Escherichia coli (E. Coli) nach Standardprotokollen24 wachsen in Auswahl Platten zubereitet und wählen Sie einzelne Kolonien für Expansion und Plasmid-DNA Isolierung gemäß etablierte Protokolle25.
    Hinweis: Die E. Coli XL1-Blue-Belastung wurde für dieses Protokoll eingesetzt, aber anderen E. Coli -Varianten können auch verwendet werden.
  6. 1 µg der isolierten Plasmide mit den geeigneten Restriktionsenzymen gemäß den Anweisungen in Schritt 5.1 zu verdauen, und das Vorhandensein einer DNA-Bande von einer Größe entsprechend der Chimären Reihenfolge durch Elektrophorese in einem Agarosegel zu beurteilen (siehe Schritte 3.2-3.5).
    Hinweis: Es wird empfohlen, dass die eingefügte Sequenz durch einen DNA-Sequenzierung Service überprüft wird.
  7. Nach der erfolgreichen Sequenz Überprüfung können Plasmide in größeren Mengen produziert und folgenden etablierte Protokolle26,27in einem Säugetier Expressionssystems angestellt.

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Representative Results

Konstruktion und Erstellung von ein chimäres Protein (Abbildung 1) werden mit zwei Mitgliedern der Familie Zytokin Interleukin-6, OSM und LIF, die Gegenstand einer kürzlich veröffentlichten Studie6waren veranschaulicht werden. Abbildung 2 zeigt die dreidimensionale Struktur dieser Proteine. Beide Moleküle übernehmen die charakteristische Sekundärstruktur der Klasse ich Zytokine, mit vier Helices (genannt A bis D) in einem Paket verpackt und zusammen mit Schleifen28. Die ausgerichteten Aminosäure-Strukturen der menschlichen Proteine ist in Abbildung 3ersichtlich. In diesem Beispiel der BC-Loop-Region von OSM durch die entsprechenden LIF Sequenz, eine OSM-LIF-Chimäre mit der Aminosäure-Sequenz, wie in Abbildung 3Bausgetauscht werden.

Für diesen Zweck, die DNA-Sequenz von OSM und LIF stammen und die Codierung Aminosäure Region entspricht die BC-Schleife wurde für beide Zytokine identifiziert und ersetzt (Abbildung 4). Ein 6-Histidin-Tag wurde zusätzlich in dem C-Terminus zur nachgelagerten Proteinreinigung Erleichterung aufgenommen. Als nächstes ein geeigneter Vektor Säugetier-Ausdruck (pCAGGS) wurde gewählt, und einzigartige Restriktionsschnittstellen innerhalb ihrer Site mit mehreren Klonen wurden ausgewählte (PacI und AscI) Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sie nicht in die Chimären Gensequenz vorhanden waren (siehe Schritt 2.1.1.).

Primer wurden entwickelt, wie in Tabelle 4. Die N-terminale vorwärts OSM Grundierung enthalten eine führende Sequenz 9 Basenpaaren, gefolgt von der PacI Einschränkung Website, ein Plasmid-spezifische Abstandhalter und die ersten 27 Basenpaare von OSM. Die C-terminale rückwärts-Primer integriert die führende Sequenz, gefolgt von der AscI Einschränkung Website, Abstandshalter und die 27 letzten Basenpaare des Gens, das in diesem speziellen Fall das C-terminale Histidin Tag entsprach. Darüber hinaus mussten 30 Basenpaare Primer überspannt die Knotenpunkten der BC-Schleife in vorwärts und rückwärts Orientierungen.

Der erste Schritt der PCR-Amplifikation bestand aus drei separaten Reaktionen. Das N-terminale OSM Fragment, das N-terminale OSM nach vorne und BC Start reverse Primer erforderlich, gebrauchte OSM als Vorlage. Die LIF BC-Schleife wurde durch BC Start nach vorne und BC Ende reverse Primer mit LIF als Vorlage erhalten. Das C-terminale OSM-Fragment verwendet BC Ende nach vorn sowie C-terminale OSM reverse Primer und OSM als Vorlage. Diese drei Fragmente mit erwarteten Größen von 385, 75 und 321 Basenpaaren bzw. Abbildung 5A nach der Trennung in einem 1 % Agarose-Gel entnehmen.

Diese gereinigt Fragmente dienten dann als eine Vorlage in der zweiten PCR-Reaktion zusammen mit N-terminale OSM nach vorn und eine C-terminale OSM Primer umzukehren. Das Ergebnis dieser Verstärkung, entspricht die OSM-LIF BC Schleife Gensequenz und ist in Abbildung 5Bgezeigt. Diesem Schritt folgte Reinigung, eine 4-Stunden-Verdauung von gen-Fragment und die gewählten Plasmid, Gelelektrophorese und Reinigung, über Nacht Ligatur bei 16 ° C und Umwandlung in E. Coli XL1-Blue. Einzelnen Plasmide wurden isoliert und abgeschirmt durch Beschränkung Enzym Verdauung für korrekte Einsetzen des DNA-Fragments (Abbildung 6). Zu guter Letzt wurden positive Treffer geschickt für die Sequenzierung zu überprüfen, ob die Reihenfolge der beabsichtigten OSM-LIF BC Schleife Chimäre bevor Sie fortfahren, um Protein-Expression, Reinigung und Prüfung in funktionelle Assays6entsprach.

Figure 1
Abbildung 1 : Schematische Darstellung der Chimären Protein-Generation. (A) Chimäre Designprozess: nach Auswahl der Regionen ausgetauscht werden, sind die Reihenfolge der gewünschten Chimäre und die notwendigen Primer durch DNA-editing-Software aufgebaut. (B) die wichtigsten Schritte bei der Erzeugung von Chimären Proteinen werden dargestellt. Zwei Schritte der PCR-Amplifikation produzieren eine Chimäre Gensequenz, die dann mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut und in eine Expressionsvektor ligiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Strukturelle Ähnlichkeiten zwischen OSM und LIF. Darstellung von Kristallstrukturen von OSM29 (PDB: 1EVS) und LIF30 (PDB: 2Q7N), sowie eine ungefähre Darstellung der entworfenen Schimäre. Diese Zytokine verabschieden eine vier spiralförmige Bundle Konformation zusammen mit Schleifen. Diese Forschung wurde im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Die AB Schleife und D-Helix in Bindungsstelle III des menschlichen Oncostatin M (OSM) sind für die OSM-Rezeptor-Aktivierung erforderlich. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © der Autoren-6. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Vergleich der OSM und LIF Aminosäure-Sequenzen. (A) Ausrichtung der Full-length Aminosäure-Sequenzen von menschlichen OSM und LIF, mit der BC-Loop-Region hervorgehoben. Sternchen (*) geben vollständig erhaltenen Rückstände, Doppelpunkte (:)) entsprechen Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften und Punkte (.) zu bezeichnen, die mit schwach ähnliche Funktionen. (B) Aminosäure-Sequenz der OSM BC Schleife Schimäre mit der BC-Loop-Region von OSM durch seine LIF Entsprechung ersetzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : DNA-Sequenz der OSM BC Schleife Schimäre. Sequenz des Proteins Chimären OSM. Die Region von LIF eingefügt ist Orange hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5 : Verstärkung der OSM BC Schleife Chimäre DNA-Fragmenten. (A) ergeben sich aus der ersten PCR-Amplifikation mit Bands, die entsprechend der N-terminalen Region (Bahn 2) BC Schleife (Bahn 3) und C-terminalen Region (Bahn 4). Ergeben Sie (B) sich aus der zweiten PCR Verstärkung, in der die drei Bands erhalten bei der ersten Verstärkung kombiniert werden, um die OSM-Chimäre zu generieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6 : Einfügen von OSM BC Schleife Chimäre in Plasmid Vector. Beschränkung Enzym Verdauung der generierten Plasmide, mit einer niedrigeren Band bei ~ 700 Basenpaare zeigt das korrekte Einfügen der Gensequenz OSM Schimäre anwesend. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Reagenz Lager Konzentration Volumen (in 50 µL)
Steriles Wasser zu 50 µL
PCR-Puffer 10 X 5 ΜL
dNTPs 10 mM 1 ΜL
DMSO 100 % 1,5 ΜL
Forward Primer 10 ΜM 1 ΜL
Rückwärts-Primer 10 ΜM 1 ΜL
Schablone DNA Variable Je nach Bedarf für 2,5-12,5 ng von Plasmid DNA
Phusion-High Fidelity-DNA-Polymerase 2 Einheiten/µL 0,5 ΜL

Tabelle 1: Reagenzien für die PCR Reaktionsmischung erforderlich.

N-terminale fragment Chimären einfügen C-terminale fragment
Forward Primer N-terminale vorwärts Erste Kreuzung nach vorne Zweite Kreuzung nach vorne
Rückwärts-Primer Erste Kreuzung reverse Zweiten Kreuzung reverse C-terminale Rückseite
Schablone DNA Empfänger Spender Empfänger

Tabelle 2: Grundierung und Vorlagen für die Erzeugung von einem standard chimäres Protein benötigt.

Zyklus-Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen
Anfängliche Denaturierung 98 ° C 30er Jahre 1
Denaturierung 98 ° C 10 s 23-25
Glühen 68 ° C * 25 s 23-25
Erweiterung 72 º C 30 s pro kilobase 23-25
Letzte Erweiterung 72 º C 300 s 1
Halten 4 º C ∞ 1
* Mindestens 5 ° c niedriger als die Schmelztemperatur primer

Tabelle 3: PCR-Protokoll verwendet, um die Chimäre Fragmente und das volle chimäres Protein zu verstärken.

Reagenz Lager Konzentration Volumen (in 50 µL)
Steriles Wasser zu 50 µL
Restriktionsenzym Puffer * 10 X 5 ΜL
Schablone DNA Variable Je nach Bedarf für 1 µg DNA
Enzym #1 Variable 1 ΜL
Enzym #2 Variable 1 ΜL
* Sicherstellen Sie, dass beide Enzyme sind kompatibel mit dem Puffer ausgewählt

Tabelle 4: Komponenten der Beschränkung Enzym Verdauung Reaktion.

Reagenz Lager Konzentration Volumen (in 20 µL)
Steriles Wasser zu 20 µL
T4 DNA-Ligase Puffer 10 X 2 ΜL
Vektor-DNA Variable Je nach Bedarf für 40 ng DNA
Einfügen von DNA Variable Je nach Bedarf für eine molare Verhältnis von 3:1
T4-DNA-Ligase Variable 1-2 ΜL

Tabelle 5: Reagenzien für die Ligatur Reaktion erforderlich.

Name Primer Sequenz
N-terminale OSM forward Primer (PacI) AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG
C-terminalen HisTag rückwärts-Primer (AscI) TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG
BC-Schleifenstart nach vorne AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC
BC-Schleife start reverse GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT
BC-Schleifenende nach vorn GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC
BC Schleifenende umkehren GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC

Tabelle 6: Primer verwendet in der Generation der OSM BC Schleife Schimäre.

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Discussion

Die Generation von Chimären Proteinen stellt eine vielseitige Technik, die über die Grenzen der abgeschnittenen Proteine zu Fragen wie die Modularität der Zytokin-Rezeptor bindende Domänen13gehen kann. Das Design der Chimären ist ein wichtiger Schritt in dieser Art von Studien und erfordert eine sorgfältige Prüfung. Vorstudien, Funktionsbereiche zu etablieren erfordert in der Regel Substitution von weite Regionen in einer ersten Phase, während kleinere Erneuerungen von variabler Länge für detaillierte Studien einer einzelnen Region besser geeignet sind. Besondere Aufmerksamkeit sollte auf das Vorhandensein von kleinen konservierte Motive innerhalb einer Proteinfamilie in diesem Schritt gegeben werden, da diese oft kennzeichnend für funktionale Websites31,32sind. Persönliche Erfahrung zeigt, dass mehr als eine Runde von Chimären Protein-Design kann sinnvoll sein, um eine funktionelle Schlüsselregion einzugrenzen, bei jeder Runde erfordern erhebliche Zeit (Wochen bis Monate) vom ersten Entwurf, funktionelle Assay getestet.

Solange gibt es ein strukturell ähnlichen Protein zu Protein des Interesses, sondern besitzen unterschiedliche biologische Funktionen, die Methode für jede Sequenz von Interesse, gilt obwohl es für jedes bestimmte gen wegen seiner Abhängigkeit von PCR optimiert werden muss Verstärkung. Insbesondere könnte Gene besitzen GC-reichen Regionen besonders herausfordernde Ziele, da diese Arten von Sequenzen bekannt sind, um die Effizienz der Verstärkung33zu reduzieren. Diese Probleme können in der Regel mit unterschiedlichen Mitteln, wie die Zugabe von verschiedenen Zusätzen (z.B. Betain) die Reaktion, die Verwendung von speziellen DNA-Polymerase-Puffer oder die Änderung der Glühen Parameter34gelöst werden. Daher wird es in der Regel einige Trial And Error erfordern, bevor angemessene Bedingungen für das gen des Interesses zu finden sind.

Das Protokoll zur Verfügung gestellt basiert auf klassischen Restriktionsenzym Klonen Methoden, die für jede Art von Labor allgemein zugänglich sind, aber es kann weiter angepasst werden, um Nutzen weiter fortgeschritten Klonierungstechniken. Zum Beispiel durch Gateway zu klonen, würde erleichtert das Klonen des gleichen Einsatzes in mehreren verschiedenen Vektoren (z.B. wenn andere Expressionssysteme sind parallel getestet werden), lediglich erfordern besondere AttB Rekombination Seiten an Platz von der in diesem Protokoll35detailliert Restriktionsschnittstellen. Andere neueren Klonen Methoden können die Notwendigkeit für eine zweite PCR-Reaktion (z. B. Benutzer36 oder Gibson Montage37) und Ligatur (z. B. Sequenz und Ligatur-unabhängige Klonen (SLIC)38 oder In-Fusion-Baugruppe umgehen. 39). während die Forderung verschiedenen Reagenzien und Grundierung Designstrategien, Leser mit Zugriff auf diese Methoden werden ermutigt, sie anwenden, um die Generation der Chimären Konstrukten nach folgenden grundlegenden Gestaltungsprinzipien erheblich beschleunigen in Schritt 1 dieses Protokolls im Detail.

Die Anwendung dieser Methode kann insgesamt wertvolle Erkenntnisse über die Mechanismen liefern, durch welche anderen Protein biologische Funktionen stattfinden, insbesondere mit Protein-Protein oder Eiweiß-Nuclein-Säure Interaktionen, und stellt ein nützliches Instrument zur identifizieren und einzigartige Struktur-Funktions-Beziehungen innerhalb einer Protein-Familie-6angeben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und der Schüchtermann-Klinik (Bad Rothenfelde, Deutschland) unterstützt. Teil dieser Forschung wurde ursprünglich im Journal of Biological Chemistry veröffentlicht. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Die AB Schleife und D-Helix in Bindungsstelle III des menschlichen Oncostatin M (OSM) sind für die OSM-Rezeptor-Aktivierung erforderlich. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © der Autoren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labcycler thermocycler Sensoquest 011-103 Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000C  DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladder ThermoFisher Scientific SM0241
GeneRuler DNA Ladder Mix ThermoFisher Scientific SM0331
AscI restriction enzyme New England Biolabs R0558
PacI restriction enzyme New England Biolabs R0547
Phusion Hot Start II DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F-549S
dNTP set (100 mM) Invitrogen 10297018
T4 DNA ligase Promega M1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit Macherey-Nagel 740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock ThermoFisher Scientific MHS6278-202857165
LE agarose Biozym 840004
Primers Sigma-Aldrich Custom order
Human Oncostatin M cDNA Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

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References

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