Summary
Proteine strutturalmente correlate spesso esercitano funzioni biologiche distinte. Lo scambio di equivalenti regioni di queste proteine al fine di creare proteine chimeriche costituisce un approccio innovativo per identificare le aree critiche della proteina che sono responsabili della loro divergenza funzionale.
Abstract
L'obiettivo del presente protocollo comprende la progettazione di proteine chimeriche in cui regioni distinte di una proteina sono sostituite dai loro corrispondenti sequenze in una proteina strutturalmente simile, al fine di determinare l'importanza funzionale di queste regioni. Tali chimere vengono generate mediante un protocollo PCR annidato utilizzando frammenti di DNA sovrapposti e adeguatamente progettato gli iniettori, seguiti dalla loro espressione all'interno di un sistema mammifero affinché nativo struttura secondaria e post-traduzionali.
Il ruolo funzionale di una distinta regione allora è indicato da una perdita di attività della chimera in un'analisi appropriata lettura. Di conseguenza, le regioni che ospitano una serie di aminoacidi critici sono identificate, che può essere ulteriormente proiettato di tecniche complementari (ad es. mutagenesi sito-diretta) per aumentare la risoluzione molecolare. Anche se limitata a casi in cui una proteina strutturalmente correlata con differenti funzioni può essere trovata, proteine chimeriche sono state impiegate con successo per identificare le aree critiche associazione di proteine come recettori di citochine e citochine. Questo metodo è particolarmente adatto nei casi in cui regioni funzionali della proteina non sono ben definite e costituisce un primo passo importante negli approcci di evoluzione diretto a restringere le regioni di interesse e ridurre lo sforzo di screening.
Introduction
Diversi tipi di proteine, tra cui citochine e fattori di crescita, sono raggruppati in famiglie i cui membri condividono simili strutture tridimensionali ma spesso esercitano funzioni biologiche distinte1,2. Questa diversità funzionale è di solito la conseguenza di piccole differenze nella composizione di aminoacidi all'interno siti attivi3 della molecola. Identificazione di tali siti e funzionali determinanti non solo offrono preziose intuizioni evolutive ma anche per progettare più specifici inibitori e agonisti4. Tuttavia, il gran numero di differenze nella composizione del residuo trovato frequentemente tra proteine strutturalmente correlate complica questo compito. Anche se la costruzione di grandi biblioteche contenenti centinaia di mutanti al giorno d'oggi è fattibile, valutando ogni variazione di singolo residuo e combinazioni di loro rimane ancora un impegnativo e richiede tempo sforzo5.
Tecniche di valutazione l'importanza funzionale delle proteine grandi regioni sono così di valore per ridurre il numero di possibili residui a un numero gestibile6. Proteine tronche sono stati l'approccio più utilizzato per affrontare questo problema. Di conseguenza, le regioni sono considerate essere funzionalmente rilevanti se la funzione della proteina in esame è influenzata tramite l'omissione di una particolare regione7,8,9. Tuttavia, una limitazione importante di questo metodo è che le omissioni possono influenzare la struttura secondaria della proteina, che conduce al misfolding, aggregazione e l'impossibilità di studiare la regione desiderata. Un buon esempio è una versione troncata della citochina oncostatin M (OSM), in cui un'omissione interna più grande di 7 residui ha provocato un mutante misfolded che potrebbe non essere ulteriormente studiato10.
La generazione di proteine chimeriche costituisce un approccio alternativo e innovativo che permette l'analisi delle più grandi regioni della proteina. L'obiettivo di questo metodo è per lo scambio di regioni di interesse in una proteina di sequenze strutturalmente correlate in un'altra proteina, al fine di valutare il contributo delle sezioni sostituite per specifiche funzioni biologiche. Ampiamente usato nel campo della segnalazione recettori per identificare i domini funzionali11,12, proteine chimeriche sono particolarmente utili per lo studio di famiglie di proteine con l'identità dell'amminoacido poco ma conservata struttura secondaria. Esempi appropriati possono essere trovati nella classe di interleukin-6 (IL-6) tipo citochine, come interleukin-6 e ciliary neurotrophic factor (6% identità di sequenza) fattore inibitorio13 o leucemia (LIF) e (20% identità) OSM6, su cui la seguendo il protocollo si basa.
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Protocol
1. proteina chimerica Design
- Selezionare una proteina adatta (donatore) per lo scambio di regioni con la proteina di interesse (destinatario), che la proteina del donatore deve essere strutturalmente simile, idealmente appartenenti alla stessa famiglia di proteine, ma manca l'attività biologica per essere utilizzato come lettura. Se non sono noti proteine strutturalmente correlate, potenziali candidati possono essere identificati utilizzando uno strumento automatico come il vettore allineamento ricerca strumento (VAST)14,15
- Accedere al sito europeo di Protein Data Bank (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introdurre il nome della proteina di interesse nella casella di ricerca in alto a destra e clicca su 'Cerca'. Condizione che una struttura di cristallo è disponibile, non verso il basso l'identificatore PDB (PDB ID; ad esempio 1evs per OSM).
Nota: se non sono disponibili presso il PDB dati strutturali, un modello di omologia della proteina potrebbe essere generato da uno strumento come SWISS-modello17 invece, utilizzando protocolli dettagliate disponibili18. - Accesso al sito vasto (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). Nel caso in cui è disponibile un ID di PDB, scorri fino alla sezione 'Recuperare risultati pre-calcolati', imput PDB ID nella casella 'Visualizza strutture simili per' e fare clic su 'Go'. Nella schermata seguente, fare clic su 'Originale vasto' e quindi 'Intera catena' per vedere un elenco di ID di PDB per potenziali candidati strutturalmente simili.
- Se un PDB ID non è disponibile, ma è stato generato un modello di omologia, scorri fino alla sezione 'Ricerca con una nuova struttura' e clicca sul link 'Cerca vasto'. Caricare il file PDB del modello facendo clic su 'Sfoglia' accanto a 'File PDB di presentare', selezionando il file e facendo clic su 'Invia'.
- Dopo il file PDB file viene caricato, fare clic sul pulsante 'Start' per avviare il calcolo di vasto. Una volta che il calcolo viene eseguito, fare clic su 'Intera catena' sotto domini per vedere il PDB ID delle proteine strutturalmente simili.
- Valutare le funzioni biologiche di interesse (ad esempio l'attivazione del recettore, l'attività enzimatica, attività di fattore di trascrizione) dei primi candidati, sia sperimentalmente nel sistema della lettura di scelta o attraverso una ricerca di letteratura. Selezionare una proteina donatore con funzione divergente rispetto alla proteina di interesse.
- Accedere al sito europeo di Protein Data Bank (PDB)16 (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), introdurre il nome della proteina di interesse nella casella di ricerca in alto a destra e clicca su 'Cerca'. Condizione che una struttura di cristallo è disponibile, non verso il basso l'identificatore PDB (PDB ID; ad esempio 1evs per OSM).
- Ottenere le sequenze dell'amminoacido della proteina delle proteine recettivi ed erogatori dalla sequenza di riferimento (RefSeq) database19 .
- Accedere alla sezione di gene nella pagina Web RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), digitare il nome della proteina di interesse nella casella di ricerca e clicca su 'Cerca'. Fare clic sul nome del gene per la specie desiderata nell'elenco risultante.
- Scorri fino alla sezione di RefSeq per vedere tutto documentato isoforme. Clicca sull'identificatore di sequenza per l'isoforma di interesse (a partire da NM), scorrere verso il basso e clicca su 'CD' per evidenziare la regione di codificazione della proteina del gene. In basso a destra dello schermo, fare clic su 'FASTA' e copiare la sequenza del gene.
- Salvare la sequenza di DNA usando un DNA adatto software di editing. Quando si utilizza l'ApE liberamente disponibili20, aprire il programma, incollare la sequenza copiata nella casella vuota, selezionare il nome della sequenza e fare clic su 'Salva'.
Nota: Ripetere i passaggi da 1.2.1. a 1.2.3. per le proteine uno o più donatori selezionate.
- Scegli le regioni della proteina deve essere sostituito nei diversi costrutti chimerici.
- Dividere la sequenza della proteina di interesse in distinte regioni strutturali. Idealmente, domini diversi per la proteina in questione sono stati descritti nella letteratura. Se questo non è il caso, l'esistenza di caratteristiche strutturali conservate distinte (eliche, loop) dovrebbe essere valutato nei passaggi 1.3.1.1. a 1.3.1.4.
- Scaricare i dati strutturali della proteina di interesse dal sito PDB (v. punto 1.1.1). Accedere alla pagina PDB per la proteina e scaricare il file PDB facendo clic su 'download' sul lato destro dello schermo.
- Aprire il file PDB in un sistema di visualizzazione molecolare come PyMOL (https://pymol.org/). In PyMOL, visualizzare la sequenza nucleotidica (facendo clic su Visualizza > sequenza su), nascondere i dati strutturali predefiniti (facendo clic H accanto all'ID di PDB e selezionando 'tutto') e selezionare la visualizzazione di 'fumetto' per visualizzare chiaramente strutturali della proteina Caratteristiche (scegliendo la S accanto il PDB ID e selezionando 'fumetto').
- Fare clic sulla sequenza del nucleotide nella parte superiore dello schermo per evidenziare le diverse parti della molecola, annotando gli amminoacidi corrispondenti a ogni caratteristica distintiva strutturale.
- Annotare le regioni strutturali distinte nella sequenza di DNA in ApE. A tale scopo, aprire la sequenza di DNA dal punto 1.2.3., selezionare i nucleotidi che codificano per gli amminoacidi in una regione, pulsante destro del mouse sulla selezione e scegliere 'Novità' per dargli un nome e un colore. Ripetere il processo per ogni regione strutturale identificato nel passaggio precedente.
Nota: La selezione del nucleotide può essere ricontrollata facendo ORFs > tradurre, quindi fare clic su OK, per garantire che essi codice per la sequenza di amminoacido corretto. - Allineare le sequenze di residui delle due proteine che impiegano uno strumento di allineamento di proteine (ad es. Clustal Omega21).
Nota: Poiché le chimere sono ad essere prodotto in un sistema di espressione dei mammiferi, queste sequenze dovrebbero includere i peptidi di segnale le proteine.- Ottenere le sequenze dell'amminoacido completo delle proteine donatore e recettore in ApE, aprendo le sequenze di DNA dal punto 1.2.3., selezionandoli e cliccando ORFs > tradurre.
- Accedere alla pagina Web di Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) e imput le sequenze di aminoacidi delle due proteine, quindi scorrere verso il basso e fare clic su 'Invia'. Ogni sequenza dovrebbe essere proceded da una riga di testo con ' > ProteinName' essere correttamente identificato...
- Recuperare il file di allineamento facendo clic sulla scheda 'Scarica file di allineamento' e salvarlo. Questo file può essere aperto da qualsiasi editor di testo.
- Utilizzando il file di allineamento come riferimento, annotare le corrispondenti regioni strutturali della proteina donatore nella loro sequenza di DNA (v. punto 1.3.2).
- Decidere quali regioni della proteina per scambiare delle proteine chimeriche e progettare le sequenze del nucleotide appropriato per le chimere.
Nota: In assenza di informazioni dettagliate riguardanti l'importanza funzionale delle diverse regioni, si consiglia di selezionare grandi sostituzioni come intero loop o eliche per valutare quale di essi hanno un impatto sulla funzione della proteina. Questo primo esperimento esplorativo può quindi essere seguito da una seconda fase di progettazione la proteina chimerica, focalizzata sulle più piccole sostituzioni all'interno delle regioni rilevanti.- Creare una copia della sequenza del DNA con annotazioni della proteina recettore dal punto 1.3.2. e rinominarlo come una proteina chimerica. Aprire la sequenza di DNA rinominata in ApE, selezionare ed eliminare la sequenza del nucleotide che codifica per la regione essere scambiati e sostituirla con la regione corrispondente nella proteina del donatore (copiata dalla sequenza con annotazioni creata nel passaggio 1.3.3.), quindi salvare le modifiche.
Nota: Creare una nuova copia e ripetere questo passaggio per ogni diverso chimera progettato.
- Creare una copia della sequenza del DNA con annotazioni della proteina recettore dal punto 1.3.2. e rinominarlo come una proteina chimerica. Aprire la sequenza di DNA rinominata in ApE, selezionare ed eliminare la sequenza del nucleotide che codifica per la regione essere scambiati e sostituirla con la regione corrispondente nella proteina del donatore (copiata dalla sequenza con annotazioni creata nel passaggio 1.3.3.), quindi salvare le modifiche.
- Dividere la sequenza della proteina di interesse in distinte regioni strutturali. Idealmente, domini diversi per la proteina in questione sono stati descritti nella letteratura. Se questo non è il caso, l'esistenza di caratteristiche strutturali conservate distinte (eliche, loop) dovrebbe essere valutato nei passaggi 1.3.1.1. a 1.3.1.4.
2. preparazione per clonazione molecolare
- Selezionare un vettore plasmidico adatto per il sistema di espressione di scelta. Per l'espressione dei mammiferi, un vettore di espressione di alta come pCAGGS22 o la serie di vettore pcDNA sono raccomandata.
- Per la base di enzima di restrizione clonazione ha dimostrato in questo protocollo, garantire che i siti di restrizione unici presenti nel polylinker (MCS) del vettore siano compatibili con la proteina di interesse. A tale scopo, aprire la sequenza di DNA dei costrutti chimerici con ApE, fare clic su ' enzimi > Selettore di enzima ' e verificare che almeno due dei siti di restrizione il MCS sono assenti nella sequenza (visualizzare uno zero accanto al loro nome).
- Progettare il primer terminale utilizzando un editor di DNA come ApE.
- Creare un nuovo file di DNA (File > nuovo) e avviare il primer N-terminale con una sequenza leader (3-9 extra coppie di basi, ad es. AAAGGGAAA), seguito dal primo sito di restrizione selezionato in MCS del vettore (6-8 paia di basi, ad esempio TTAATTAA per PacI), un distanziale opzionale (ad esempio GCTAGCGCATCGCCACC nel vettore pCAGGS utilizzato nell'esempio) e le coppie di basi iniziali 18-27 del gene di interesse (ad es. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG per OSM).
- In un nuovo file di DNA, la sequenza di primer C-terminale inizia con finale 18-27 coppie di basi del gene di interesse (ad es. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA per un gene con un tag di 6xHistidine C-terminale), seguite da un distanziale opzionale (ad es. TAGCGGCCGC in il vettore di pCAGGS), la seconda restrizione del sito prescelto (ad es. GGCGCGCC per AscI) e una sequenza di leader (ad es. AAAGGGAAA). Evidenziare l'intera sequenza, pulsante destro del mouse e selezionare 'Reverse-complemento' per ottenere il primer reverse.
- Disegnare primers per ciascuna delle regioni di confine in costrutti chimerici.
- Aprire la sequenza di DNA della chimera (creato nel passaggio 1.3.4.1.) ed evidenziare un'area di 30 coppie di basi nella zona dove le sequenze originali e inserite sono in contatto, composto da 15 paia di basi di ogni sequenza. Copiare l'area (tasto destro del mouse e selezionare 'Copia') e incollarlo in un nuovo file di DNA; Questa sequenza sarà il primer in avanti.
- Fare una copia del primer avanti generato nel precedente passaggio e rinominarlo come reverse primer. Evidenziare la sequenza dei primer, pulsante destro del mouse e selezionare 'Reverse-complemento' per generare la sequenza del reverse primer.
- Ripetere i passaggi da 2.3.1. e 2.3.2. per ogni zona del contatto nella sequenza del DNA chimerica. In genere, due insiemi degli iniettori di avanti/indietro sono necessari per generare una chimera, a meno che la sostituzione si verifica al N-terminale o regioni C-terminale.
- Ordinare i primer terminali e interni da un provider di sintesi del oligonucleotide.
Note: Utilizzando altamente purificato primer terminale (ad es. purificato per HPLC) può avere un impatto positivo nel tasso di successo del protocollo. Dissalate primer interno di solito forniscono buoni risultati. - Ottenere il modello sequenze dei geni dei donatori e del ricevitore.
Nota: Utilizzando plasmidi contenenti l'open reading frame (ORF) di queste sequenze come un modello notevolmente facilita la procedura ed è consigliato. In alternativa, DNA complementare (cDNA) generato da una linea cellulare conosciuta per esprimere questi geni utilizzabile come modello per i passaggi successivi.
3. polymerase Chain Reaction (PCR) amplificazione dei frammenti del DNA individuale formando la Chimera
- Preparare una miscela di reazione PCR individuale per ciascuno dei frammenti che compongono la proteina chimerica. Una proteina chimerica tipica richiederà tre frammenti individuali: la parte N-terminale, la regione deve essere inserito e la parte C-terminale.
Note: Utilizzare una DNA polimerasi (ad es. Phusion alta fedeltà DNA polimerasi) ad alta fedeltà per evitare l'introduzione di mutazioni nella sequenza. La reazione di PCR può essere impostare la sera ed eseguire durante la notte.- Insieme una microfuge 1,5 mL tubo su ghiaccio e dispensare i reagenti differenti delle miscele PCR nell'ordine indicato in tabella 1, garantire la corretta primer e modelli sono impiegati per ogni reazione di PCR (Vedi tabella 2).
- Etichettare due provette per PCR a parete sottile 0,2 mL per ogni reazione e trasferire 20 µ l della miscela PCR corrispondente in ogni provetta. Trasferire i tubi PCR in un termociclatore PCR e iniziare il protocollo dettagliato nella tabella 3.
Nota: temperatura di ricottura dovrebbe essere almeno 5 gradi inferiori alla temperatura di fusione degli iniettori progettati.
- Mentre la PCR è in esecuzione, preparare 100 mL di un gel di agarosio 1% in tampone Tris-acetato-EDTA (TAE). Per questo scopo, pesare 1 g di agarosio, mescolare con 100 mL di tampone TAE in un fiasco di vetro e forno a microonde fino a quando l'agarosio è completamente sciolto, agitando la beuta ogni 30-40 secondi. Consentire il raffreddamento a circa 50 ° C, aggiungere 2-3 µ l di etidio bromuro (o un equivalente colorante DNA) e versare in un vassoio di gel con i pettini bene desiderati.
Attenzione: bromuro di etidio è un noto agente mutageno, garantire l'uso di dispositivi di protezione appropriati. - Una volta completata la reazione di PCR, aggiungere 4 µ l di tampone di caricamento del DNA 6x in ogni provetta. Inserire il gel di agarosio 1% in un'unità di elettroforesi, coprire con tampone TAE e accuratamente caricare i campioni nel gel insieme con una scala del peso molecolare.
Nota: al momento del caricamento, è preferibile lasciare vuote corsie tra i campioni per facilitare il recupero di DNA in seguito. - Esegua il gel a 80-120 V per 20-45 minuti.
Nota: bande sotto 1.000 paia di basi possono solitamente essere electrophoresed in circa 20 minuti a 120 V, mentre bande più grandi richiedono tempi di esecuzione più lunghi. - Spegnere l'unità di elettroforesi, togliere il gel di agarosio e visualizzare le bande di DNA amplificate sotto luce UV. Utilizzando una lama di rasoio, tagliato i singoli frammenti di DNA dal gel e trasferirli con etichetta 2ml microfuge tubi.
Nota: Ridurre al minimo il tempo di esposizione ai raggi UV, al fine di evitare danni al DNA. - Utilizzare un PCR clean-up kit (Vedi Tabella materiali) per purificare i diversi frammenti di DNA.
- Aggiungere 500 µ l di buffer NTI fornito dal kit in ogni provetta contenente un frammento di gel. Trasferire un thermomixer a 50-55 ° C e scuotendo a 1000 giri/min fino a quando il gel è completamente sciolta nel buffer.
- Ogni soluzione di trasferimento a una colonna con etichetta kit, gira in una microcentrifuga (30-60 anni, 11.000 x g) e scartare l'attraversamento. Aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio del kit NT3, centrifugare nuovamente sotto le stesse impostazioni e gettare l'attraversamento. Centrifugare le colonne ancora per 1-2 min a 11.000 x g per asciugare la membrana di silice all'interno della colonna.
- Trasferire la colonna ad un tubo di microfuge etichettati 1,5 mL, pipettare 30 µ l di acqua esente da nucleasi nella colonna, lascia riposare per 1 minuto e centrifugare 30-60s a 11.000 x g per eluire il DNA.
- Quantificare la quantità di DNA recuperato misurando l'assorbanza del campione a 260 nm e 340 nm in uno spettrofotometro (Vedi Tabella materiali). La concentrazione di DNA viene calcolata sottraendo la lettura 340 nm dalla figura 260 nm, quindi moltiplicando il risultato per estinzione coefficiente (50 µ g/mL)23 di DNA.
Note: Ulteriori misure a 230 nm e 280 nm consentono per la valutazione della purezza del DNA: 260/280 e 260/230 rapporti sopra 1.8 sono generalmente considerati come puro per il DNA. Il protocollo può essere messo in pausa dopo questo passo, conservare il DNA eluito a 4 ° C (a breve termine) o -20 ° C (a lungo termine).
4. PCR amplificazione per generare la sequenza di DNA chimerico
- Impostare 50 µ l di una reazione di PCR per fondere i costituenti separati della chimera. Seguire la stessa procedura dettagliata in 3.1, impiegando i primer N-terminale e C-terminale insieme a 10 ng di ciascuno del DNA frammenti ottenuti nel passaggio 3,7.
Nota: La reazione di PCR può essere impostata in serata ed eseguire durante la notte. - Ripetere i passaggi da 3.2 a 3,7 per recuperare e quantificare il frammento di DNA purificato in 30 µ l di acqua priva di nucleasi. Questo frammento contiene la sequenza di DNA chimerica, affiancata dai siti di restrizione inclusi nel primer del terminale.
5. inserimento del DNA chimerico nel vettore di espressione
- In una provetta e 1 µ g del frammento del DNA recuperato in altro vettore etichetta due provette da 1,5 mL microfuge e dispensare i reagenti differenti nell'ordine indicati nella tabella 4, l'aggiunta di 1 µ g dell'espressione selezionata. Incubare per 1-4 h a 37 ° C per eseguire la digestione con gli enzimi di restrizione selezionate.
Note: Garantire che entrambi gli enzimi di restrizione sono compatibili con il buffer impiegato. Nel caso in cui essi richiedono buffer completamente diverso, eseguire la procedura in primo luogo con soltanto uno degli enzimi e ripetere. Il tempo necessario per la digestione può variare a seconda degli enzimi di restrizione selezionati: fare riferimento alle istruzioni del produttore per informazioni dettagliate. - Ripetere i passaggi da 3.2 a 3,7 per purificare e recuperare il vettore di frammento e l'espressione del DNA digerito in 30 µ l di acqua priva di nucleasi. Quantificare la quantità di DNA recuperato come prima.
- Calcolare la quantità di DNA inserto richiesto per un rapporto molare di 3:1 inserto/vettore nella reazione di legatura, usando la seguente equazione.
Inserire (ng) = rapporto molare * vettoriale (ng) * Dimensione inserto (bp) / dimensione del vettore (bp)
Nota: Rapporti molari differenti inserto di vettore possono essere testati, anche se un rapporto di 3:1 è solitamente sufficiente per ottenere risultati adeguati. - Impostare la pagina di 20 µ l di una reazione di legatura in una provetta da 1,5 mL microfuge con 40 ng dell'espressione vettoriale la quantità di DNA chimerico calcolato nel punto 5.3, buffer e T4 DNA ligasi seguendo l'ordine indicato nella tabella 5e incubare per una notte a 16 ° C.
Nota: Generalmente aumenta l'efficienza di legatura eseguendo la reazione durante la notte a 16 ° C, ma in alternativa la reazione può essere incubata per 2 ore a temperatura ambiente. - Trasformazione 5-10 µ l della miscela legatura in chimicamente competente Escherichia coli (Escherichia coli) preparato seguendo protocolli standard24 Grow in piatti di selezione e scegliere singole colonie per espansione e plasmide DNA isolamento secondo protocolli stabiliti25.
Nota: Il ceppo di e. coli XL1-blu è stato impiegato per questo protocollo, ma possono essere utilizzati anche altre varianti di e. coli . - Digerire 1 µ g plasmide isolati con gli enzimi di restrizione appropriati seguendo le istruzioni al punto 5.1 e valutare la presenza di una banda di DNA di dimensioni corrispondenti alla sequenza chimerica mediante elettroforesi in un gel di agarosio (vedere passaggi 3.2-3.5).
Nota: È consigliabile che la sequenza inserita viene verificata per mezzo di un servizio di sequenziamento del DNA. - Al momento della verifica riuscita sequenza, i plasmidi possono essere prodotte in quantità maggiori e impiegati in un sistema di espressione dei mammiferi dalle seguenti protocolli ben stabiliti26,27.
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Representative Results
Costruzione e produzione di una proteina chimerica (Figura 1) verrà essere esemplificati con due membri della famiglia citochina interleuchina-6, OSM e LIF, che sono stati oggetto di una studio recentemente pubblicato6. La figura 2 Mostra la struttura tridimensionale di queste proteine. Entrambe le molecole adottano la caratteristica struttura secondaria di classe ho citochine, con quattro eliche (definiti da A D) confezionato in un pacchetto e affiancato da loop28. Le strutture allineate aminoacido delle proteine umane possono essere visto in Figura 3A. In questo esempio la regione di loop BC di OSM è stato scambiato dalla sequenza LIF corrispondente per creare una chimera di OSM-LIF con la sequenza dell'amminoacido, come illustrato nella Figura 3B.
Per questo scopo, la sequenza di DNA di OSM e LIF sono stati ottenuti e codifica regione dell'amminoacido corrispondente al loop BC è stata identificata per entrambe le citochine e sostituito (Figura 4). Un tag 6-istidina inoltre è stato incorporato nel C-terminus per facilitare la purificazione della proteina a valle. Successivamente, è stato scelto un vettore adatto per espressione mammifera (pCAGGS) e siti di restrizione unici all'interno del suo polylinker erano selezionati (PacI e AscI) dopo aver verificato che non erano presenti nella sequenza del gene chimerico (vedere il passaggio 2.1.1.).
Gli iniettori sono stati progettati come mostrato nella tabella 4. Il primer OSM in avanti di N-terminale incluso una sequenza leader di 9 coppie di basi, seguito dal sito di restrizione di PacI , un distanziatore di plasmide-specifici e le coppie di basi 27 iniziale di OSM. Il primer reverse C-terminale incorporato la sequenza leader seguita dal sito di restrizione AscI , un distanziale e le 27 Ultima coppie di basi del gene, che in questo caso particolare ha corrisposto al tag istidina C-terminale. Inoltre, Primer 30-appaiamento che attraversa i punti di giunzione del ciclo BC erano tenuti in orientamenti sia avanti e indietro.
Il primo passo di amplificazione di PCR ha consistito di tre reazioni separate. OSM N-terminale frammento, che ha richiesto N-terminale OSM in avanti ed iniettori d'inversione di inizio BC, OSM usate come modello. Il ciclo LIF BC è stato ottenuto attraverso start BC in avanti ed iniettori d'inversione di BC fine utilizzando LIF come modello. Il frammento C-terminale OSM usato BC fine in avanti ed iniettori d'inversione del C-terminale OSM, nonché OSM come modello. Questi tre frammenti, con dimensioni previsti di coppie di basi 385, 75 e 321 rispettivamente, possono essere visto in Figura 5A dopo la separazione in un gel di agarosio 1%.
Questi purificato frammenti sono stati poi utilizzati come un modello a seconda della reazione PCR, insieme a N-terminale OSM in avanti e C-terminale OSM reverse primer. Il risultato di questa amplificazione, corrispondenti a OSM-LIF la sequenza del gene BC per ciclo e viene mostrato nella Figura 5B. Questo passaggio è stato seguito da purificazione, una 4 ore di digestione del frammento genico e selezionato plasmide, elettroforesi del gel e purificazione, la legatura durante la notte a 16 ° C e la trasformazione in e. coli XL1-blu. Plasmidi individuale è stati isolati e schermati da digestione degli enzimi di restrizione per il corretto inserimento del frammento del DNA (Figura 6). Infine, risultati positivi sono stati inviati per il sequenziamento verificare che la sequenza ha corrisposto per la chimera di ciclo OSM-LIF BC prevista prima di procedere all'espressione della proteina, purificazione e test in saggi funzionali6.
Figura 1 : Rappresentazione schematica della generazione di proteina chimerica. (A) processo di progettazione chimerico: dopo la selezione delle regioni lo scambio, la sequenza di chimera desiderata e i primer necessari sono costruiti mediante DNA software di editing. (B) i passaggi chiave nella generazione di proteine chimeriche sono raffigurati. Due passaggi di amplificazione di PCR producono una sequenza del gene chimerico, che viene poi digerita con gli enzimi di restrizione appropriati e legata in un vettore di espressione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Somiglianze strutturali tra OSM e LIF. Rappresentazione delle strutture di cristallo di OSM29 (PDB: 1EVS) e LIF30 (PDB: 2Q7N), insieme a una rappresentazione approssimativa della chimera progettato. Queste citochine adottano una conformazione di quattro-elicoidale bundle affiancata da loop. Questa ricerca è stato originariamente pubblicata nel Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, M. J., Schindler, N., gatto, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Il ciclo di AB e D-elica nel sito di legame III di umano Oncostatin M (OSM) sono necessari per l'attivazione del recettore OSM. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © autori6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Confronto di sequenze aminoacidiche OSM e LIF. (A) l'allineamento delle sequenze dell'amminoacido full-length di umani OSM e LIF, con evidenziata la regione del ciclo BC. L'asterisco (*) residui completamente conservati, i due punti (:) corrispondono agli aminoacidi con proprietà fortemente simili e punti (.) indicano quelli con caratteristiche simili debolmente. (B) la sequenza di amminoacido della chimera ciclo OSM BC, con la regione di ciclo BC di OSM sostituito dal suo equivalente LIF. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Sequenza di DNA della chimera ciclo OSM BC. Sequenza della proteina chimerica OSM. La regione inserita da LIF è evidenziata in arancione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Frammenti di amplificazione del DNA OSM BC ciclo chimera. (A) risultato dall'amplificazione di PCR prima, con bande corrispondenti alla regione N-terminale (lane 2), ciclo di BC (corsia 3) e la regione C-terminale (vicolo 4). (B) risultato dalla seconda amplificazione PCR, in cui le tre bande ottenute nell'amplificazione prima vengono combinate per generare la chimera OSM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Inserimento della chimera ciclo OSM BC nel vettore plasmidico. Digestione degli enzimi di restrizione del plasmide generati, con una banda inferiore presente a ~ 700 paia di basi che indica il corretto inserimento della sequenza del gene chimera OSM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Concentrazione d'archivio | Volume (in 50 µ l) |
| Acqua sterile | a 50 µ l | |
| Tampone di PCR | 10 X | 5 Μ l |
| dNTP | 10 mM | 1 Μ l |
| DMSO | 100% | 1,5 Μ l |
| Forward Primer | 10 ΜM | 1 Μ l |
| Reverse Primer | 10 ΜM | 1 Μ l |
| Modello del DNA | Variabile | Come richiesto per 2,5-12,5 ng di DNA plasmidico |
| Phusion alta fedeltà DNA polimerasi | 2 unità / µ l | 0,5 Μ l |
Tabella 1: Reagenti necessari per la miscela di reazione PCR.
| Frammento N-terminale | Inserimento chimerico | Frammento C-terminale | |
| Forward Primer | N-terminale in avanti | Primo incrocio in avanti | Secondo incrocio in avanti |
| Reverse Primer | Primo incrocio inverso | Secondo incrocio inverso | C-terminale inverso |
| Modello del DNA | Destinatario | Donatore | Destinatario |
Tabella 2: Primer e i modelli necessari per la generazione di una proteina chimerica standard.
| Passaggio di ciclo | Temperatura | Tempo | Numero di cicli |
| Denaturazione iniziale | 98 ° C | 30s | 1 |
| Denaturazione | 98 ° C | 10s | 23-25 |
| Ricottura | 68 ° C * | 25s | 23-25 |
| Estensione | 72 ° C | 30s per kilobase | 23-25 |
| Estensione finale | 72 ° C | 300S | 1 |
| Tenere premuto | 4 ° C | ∞ | 1 |
| * Almeno 5 ° c inferiore rispetto il primer temperatura di fusione | |||
Tabella 3: Protocollo PCR utilizzato per amplificare i frammenti chimerici e la proteina chimerica completa.
| Reagente | Concentrazione d'archivio | Volume (in 50 µ l) |
| Acqua sterile | a 50 µ l | |
| Enzima di restrizione Buffer * | 10 X | 5 Μ l |
| Modello del DNA | Variabile | Come richiesto per 1 µ g di DNA |
| Enzima #1 | Variabile | 1 Μ l |
| Enzima #2 | Variabile | 1 Μ l |
| * Garantire che entrambi gli enzimi sono compatibili con il buffer selezionato | ||
Tabella 4: Componenti della reazione di digestione degli enzimi di limitazione.
| Reagente | Concentrazione d'archivio | Volume (in 20 µ l) |
| Acqua sterile | a 20 µ l | |
| T4 DNA ligasi Buffer | 10 X | 2 Μ l |
| DNA di vettore | Variabile | Come richiesto per 40 ng di DNA |
| Inserire il DNA | Variabile | Come richiesto per un rapporto molare di 3:1 |
| T4 Ligasi del DNA | Variabile | 1-2 Μ l |
Tabella 5: Reagenti necessari per la reazione di legatura.
| Nome | Sequenza più superelegante |
| N-terminale OSM forward primer (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-terminale HisTag reverse primer (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| Inizio del ciclo BC in avanti | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| Ciclo di BC avviare inversa | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| Fine del ciclo di BC in avanti | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| Fine del ciclo di BC invertire | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Tabella 6: Primers utilizzati nella generazione della chimera ciclo OSM BC.
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Discussion
La generazione di proteine chimeriche costituisce una tecnica versatile, che è in grado di andare oltre i limiti di proteine tronche per affrontare questioni quali la modularità di citochina-recettore associazione domini13. Il design delle chimere è un passo fondamentale in questo tipo di studi e richiede un'attenta considerazione. Studi preliminari per stabilire domini funzionali generalmente richiederà la sostituzione di vaste regioni in una prima fase, mentre più piccole sostituzioni di lunghezze variabili sono più adatti a studi dettagliati di una singola regione. Dovrebbe prestare particolare attenzione alla presenza di piccoli motivi conservati all'interno di una famiglia di proteine in questo passaggio, poiché questi sono spesso indicativi di siti funzionali31,32. Esperienza personale indica che più di un giro di design di proteina chimerica può essere necessario per restringere una regione chiave funzionale, con ogni turno che richiedono notevole tempo (settimane o mesi) dalla progettazione iniziale alla prova di analisi funzionale.
Finché esiste una proteina strutturalmente simile alla proteina di interesse, ma che possiedono funzioni biologiche divergenti, il metodo è applicabile a qualsiasi sequenza di interesse, anche se deve essere ottimizzata per ogni gene particolare a causa della sua dipendenza da PCR amplificazione. In particolare, geni che possiedono regioni ricche di GC potrebbero rivelarsi particolarmente ambiziosi obiettivi, poiché questi tipi di sequenze sono conosciuti per ridurre l'efficienza della amplificazione33. Questi problemi di solito possono essere risolto con mezzi diversi, come l'aggiunta di diversi additivi (ad es. betaina) per la reazione, l'uso di buffer specializzati della polimerasi del DNA o la modifica dei parametri ricottura34. Quindi, generalmente richiederà alcuni tentativi ed errori prima di condizioni adeguate per il gene di interesse si trovano.
Il protocollo fornito si basa sul classici degli enzimi di limitazione-metodi basati sulla clonazione, che sono generalmente accessibili ad ogni tipo di laboratorio, ma può essere ulteriormente adattato per sfruttare i vantaggi delle più avanzate tecniche di clonazione. Ad esempio utilizzando gateway clonazione, che facilita l'inserto stesso in diversi vettori diversi (ad esempio se diversi sistemi di espressione devono essere testati in parallelo), la clonazione sarebbe semplicemente richiedono particolare attB siti di ricombinazione in luogo i siti di restrizione dettagliate in questo protocollo35. Altre metodologie di clonazione più recenti possono ignorare la necessità di una seconda reazione di PCR (ad es. utente36 o Gibson Assemblea37) e la legatura (ad es. sequenza e legatura-indipendente clonazione (SLIC)38 o assembly In fusione 39). pur richiedendo diversi reagenti e strategie di progettazione di primer, lettori con accesso a questi metodi sono incoraggiati ad applicarle per accelerare significativamente la generazione di costrutti chimerici dopo aver seguito i principi di progettazione di base dettagliate al punto 1 del presente protocollo.
Nel complesso, l'applicazione di questo metodo può fornire informazioni preziose per quanto riguarda i meccanismi di quale altra proteina funzioni biologiche si svolgono, in particolare con la proteina-proteina o proteina-nucleico interazioni acide e costituiscono un utile strumento per identificare e specificare le relazioni struttura-funzione unica all'interno di una famiglia di proteine6.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dalla società Max Planck e la Schüchtermann-clinica (Bad Rothenfelde, Germania). Parte di questa ricerca è stato originariamente pubblicato nel Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, M. J., Schindler, N., gatto, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Il ciclo di AB e D-elica nel sito di legame III di umano Oncostatin M (OSM) sono necessari per l'attivazione del recettore OSM. J Biol Chem. 2018; 18:7017-7029. © gli autori.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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