Summary
Strukturelt relaterte proteiner utøve ofte forskjellige biologiske funksjoner. Utveksling av tilsvarende områder av disse proteinene vil opprette chimeric proteiner utgjør en innovativ tilnærming for å identifisere kritiske protein områder som er ansvarlig for deres funksjonelle divergens.
Abstract
Målet med denne protokollen omfatter utformingen av chimeric proteiner som atskilte områder av et protein er erstattet med de tilsvarende sekvensene i en samme protein, for å fastslå funksjonelle betydningen av disse regionene. Slike chimeras genereres ved hjelp av en nestede PCR-protokoll overlappende DNA fragmenter og tilstrekkelig utviklet primere, etterfulgt av deres uttrykk innenfor et pattedyr system å sikre opprinnelige sekundære struktur og post-translasjonell modifikasjoner.
Funksjonell rolle en distinkt region angis deretter med tap av aktivitet chimera i riktig avlesning analysen. I følge identifiseres regioner huse en rekke kritiske aminosyrer, som kan bli ytterligere vist av komplementære teknikker (f.eks området-rettet mutagenese) for å øke molekylær oppløsning. Begrenset til saker som et strukturelt relaterte protein med ulike funksjoner kan bli funnet, har chimeric proteiner vært vellykket ansatt å identifisere kritiske bindende områder i proteiner som cytokiner og cytokin reseptorer. Denne metoden er spesielt godt egnet i tilfeller der den protein funksjonelle områder ikke er godt definert, og utgjør en verdifull første skritt i regissert utvikling tilnærminger til å begrense områdene rundt og redusere screening krefter involvert.
Introduction
Flere typer proteiner, inkludert cytokiner og vekstfaktorer, er gruppert i familier hvis medlemmer dele lignende tredimensjonale strukturer, men ofte utøve forskjellige biologiske funksjoner1,2. Dette funksjonelle mangfoldet er vanligvis konsekvensen av små forskjeller i aminosyre komposisjon i molekylets aktive nettsteder3. Identifikasjon av slike nettsteder og funksjonelle determinanter ikke bare tilbyr verdifull evolusjonære innsikt men også utforme mer spesifikke agonister og hemmere4. Men kompliserer mange forskjeller i rester komposisjon ofte funnet mellom strukturelt relaterte proteiner denne oppgaven. Selv om bygge store biblioteker som inneholder hundrevis av mutanter er i dag mulig, vurdere hver enkelt rester Variant kombinasjoner av dem fortsatt en tidkrevende og utfordrende innsats5.
Teknikker vurdere funksjonelle betydningen av store protein regioner er dermed å redusere antall mulig rester til et håndterlig antall6. Avkortet proteiner er den mest brukte måten å håndtere dette problemet. Følgelig regnes områder være funksjonelt relevant hvis funksjonen protein under studien påvirkes av slettingen av en bestemt region7,8,9. En stor begrensning av denne metoden er imidlertid at slettinger kan påvirke protein's sekundære struktur, fører til misfolding, aggregering og manglende evne til å studere den tiltenkte regionen. Et godt eksempel er en avkortet versjon av cytokin oncostatin M (OSM), som studerte en intern sletting større enn 7 rester resulterte i en misfolded mutant som ikke kunne ytterligere10.
Generering av chimeric proteiner utgjør en alternativ og nyskapende tilnærming som tillater analyse av større protein regioner. Målet med denne metoden er å utveksle områder av interesse i et protein av strukturelt relaterte sekvenser i en annen protein, for å vurdere bidrag erstattet delene til bestemte biologiske funksjoner. Mye brukt i feltet signalnettverk reseptorer å identifisere funksjonelle domener11,12, er chimeric proteiner spesielt nyttig å studere protein familier med liten aminosyre identitet men bevarte sekundære struktur. Aktuelle eksempler kan bli funnet i klassen av interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, slik som interleukin-6 og ciliary nevrotropisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hemmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, som den etter protokoll basert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. chimeric Protein Design
- Velg en passende protein (giveren) å utveksle regioner med protein av interesse (mottaker) donor protein bør være samme, ideelt tilhører samme protein familien, men mangler den biologiske aktiviteten som avlesning. Hvis ingen strukturelt relaterte proteiner er kjent, kan potensielle kandidater identifiseres ved hjelp av en automatisert verktøyet som vektor justering Søk verktøyet (store)14,15
- Tilgang til Protein databank (PDB)16 europeiske nettstedet (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), innføre navnet av protein av interesse i søkeboksen øverst til høyre, og klikk 'Søk'. Forutsatt at en krystallstruktur er tilgjengelig, ikke ned PDB identifikatoren (PDB ID; eksempel 1evs for OSM).
Merk: Hvis strukturelle data ikke er tilgjengelig på PDB, homologi modell av proteinet kan genereres av et verktøy som SWISS-modellen17 i stedet bruke tilgjengelige trinnvise protokollene18. - Tilgang til enorme nettstedet (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). I tilfelle en PDB-ID er tilgjengelig, bla ned til 'Hente forhåndsberegnede resultater' delen tilskrive en noe PDB-ID i boksen 'Vis lignende strukturer for', og klikk "Gå". I følgende skjermbilde, klikk på 'Opprinnelige store' og deretter 'Hele kjeden' se en liste over PDB-IDer for potensielle samme kandidater.
- Hvis en PDB-ID ikke er tilgjengelig, men homologi modell ble generert, bla ned til delen "Søk med en ny struktur" og klikk på koblingen "Store søk". Laste opp filen PDB av modellen ved å klikke "Bla gjennom" ved siden av "Send PDB fil", velge filen og klikke "Send".
- Etter PDB-fil lastes, klikk "Start" for å starte store beregningen. Når beregningen blir utført, klikker du på 'Hele kjeden' under domener å se PDB IDer av samme proteiner.
- Vurdere de biologiske funksjonene av interesse (f.eks reseptor aktivisering, enzymatisk aktivitet, transkripsjon faktor aktivitet) av topp kandidater, enten eksperimentelt i avlesning systemet valget eller gjennom en litteratursøk. Velg en donor protein med avvikende funksjon i forhold til protein av interesse.
- Tilgang til Protein databank (PDB)16 europeiske nettstedet (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), innføre navnet av protein av interesse i søkeboksen øverst til høyre, og klikk 'Søk'. Forutsatt at en krystallstruktur er tilgjengelig, ikke ned PDB identifikatoren (PDB ID; eksempel 1evs for OSM).
- Få protein amino acid sekvenser av mottakeren og donor proteiner fra referanse sekvens (RefSeq) databasen19 .
- Tilgang til genet delen i RefSeq nettsiden (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), skriver du inn protein av interesse i søkeboksen og klikk 'Søk'. Klikk på genet navnet ønsket arter i listen.
- Bla ned til delen RefSeq å se alle dokumentert isoformene. Klikk på sekvensidentifikator for isoformen av interesse (starter med NM), bla nedover og klikk på "CD" å markere regionen protein-koding av genet. Nederst til høyre på skjermen, klikk på 'FASTA' og kopiere genet sekvensen.
- Lagre DNA sekvensen ved hjelp av en passende DNA redigering programvare. Når du bruker fritt tilgjengelige ApE20, åpne programmet, lime inn den kopierte sekvensen i den tomme boksen, Velg rekkefølge navnet og klikk "Lagre".
Merk: Gjenta 1.2.1. til 1.2.3. for en eller flere donor proteiner valgt.
- Velg protein regionene skal erstattes i de ulike chimeric konstruksjoner.
- Dele protein sekvensen av interesse i unike strukturelle områder. Ideelt sett vil forskjellige domener for protein aktuelle har blitt beskrevet i litteraturen. Hvis dette ikke er tilfelle, bør eksistensen av forskjellige bevarte strukturfunksjonene (helikser, løkker) vurderes i trinn 1.3.1.1. til 1.3.1.4.
- Laste ned den strukturelle data av protein av interesse fra webområdet PDB (se trinn 1.1.1.). Tilgang til PDB siden for protein og laste ned filen PDB ved å klikke på "Last ned" på høyre side av skjermen.
- Åpne filen PDB i en molekylær visualisering system som PyMOL (https://pymol.org/). PyMOL, vise nukleotid sekvensen (ved å klikke Vis > rekkefølge på), skjule strukturelle standarddata (ved å klikke H ved PDB-ID, og velge "alt") og velg 'tegneserie' tydelig visualisere protein's strukturelle funksjoner (klikke S ved PDB-ID og velge "cartoon").
- Klikk på nukleotid sekvensen øverst på skjermen for å markere ulike deler av molekylet, noterer ned aminosyrer tilsvarer hver karakteristiske strukturelle trekk.
- Kommentere de distinkte strukturelle områdene på DNA sekvensen i ApE. Gjør åpne DNA sekvensen fra trinn 1.2.3., Velg nukleotider koding for aminosyrer i en region, Høyreklikk utvalget, og velg 'Ny ansiktstrekk' å gi det et navn og en farge. Gjenta prosessen for hver strukturelle området identifisert i forrige trinn.
Merk: Nukleotid valget kan bli kontrollert ved ORFs > oversett og deretter klikke OK, for å sikre at de koden for den riktige aminosyresekvens. - Juster rester sekvenser av to proteiner ansette et protein justering verktøy (f.eks Clustal Omega21).
Merk: Siden chimeras produseres i et pattedyr uttrykk system, disse sekvensene skal inneholde proteiner signal peptider.- Få full amino acid sekvenser av giver og reseptor proteiner i ApE, ved å åpne DNA-sekvenser fra trinn 1.2.3., å merke dem og klikke ORFs > oversett.
- Tilgang til Clustal Omega nettsiden (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) og tilskrive en noe amino acid sekvenser av to proteiner, deretter blar du ned og klikk 'Send'. Hver skal fortsatte av en linje med "> ProteinName' identifiseres riktig.
- Hente justering filen ved å klikke kategorien 'Justering nedlastingsfilen' og lagre den. Denne filen kan åpnes av ethvert tekstredigeringsprogram.
- Bruke filen justering som referanse, kommentere tilsvarende strukturelle regionene donor proteinet i sine DNA sekvens (se trinn 1.3.2.).
- Bestemme hvilke protein områder å utveksle på chimeric proteiner og design riktig nukleotid sekvenser for chimeras.
Merk: I fravær av detaljert informasjon om funksjonell betydning fra ulike områder, er det foreslått for å velge store erstatninger som hele løkker eller helikser å vurdere hvilke av dem har en innvirkning på protein-funksjonen. Denne første utforskende eksperimentet kan deretter bli etterfulgt av en ny runde av chimeric protein design, fokusert på mindre endringer i de aktuelle områdene.- Opprett en kopi av kommenterte DNA sekvensen av reseptor protein fra trinn 1.3.2. og gi det som en chimeric protein. Åpne omdøpt DNA sekvensen i ApE, Velg og slett nukleotid sekvens koding for regionen å byttes, og erstatte den med tilsvarende regionen i donor protein (hentes fra kommenterte sekvensen opprettet i trinn 1.3.3.) og deretter lagre endringene.
Merk: Opprette en ny kopi og gjenta dette trinnet for hver annen chimera designet.
- Opprett en kopi av kommenterte DNA sekvensen av reseptor protein fra trinn 1.3.2. og gi det som en chimeric protein. Åpne omdøpt DNA sekvensen i ApE, Velg og slett nukleotid sekvens koding for regionen å byttes, og erstatte den med tilsvarende regionen i donor protein (hentes fra kommenterte sekvensen opprettet i trinn 1.3.3.) og deretter lagre endringene.
- Dele protein sekvensen av interesse i unike strukturelle områder. Ideelt sett vil forskjellige domener for protein aktuelle har blitt beskrevet i litteraturen. Hvis dette ikke er tilfelle, bør eksistensen av forskjellige bevarte strukturfunksjonene (helikser, løkker) vurderes i trinn 1.3.1.1. til 1.3.1.4.
2. forberedelse for molekylær kloning
- Velg en plasmider vektor egnet for uttrykket system av valget. For pattedyr uttrykk anbefales en høy-uttrykk vektor som pCAGGS22 eller pcDNA vektor serien.
- I begrensning enzym-basert kloning demonstrert i denne protokollen, sørge for at webområdene unik begrensning i flere kloning området (MCS) av vektoren er kompatible med protein av interesse. Gjør åpne DNA sekvensen av chimeric sammensetningene med ApE, klikk ' enzymer > enzym velgeren ' og Bekreft at minst to av de begrensning i MCS er fraværende i rekkefølge (viser en null ved navn).
- Utforme terminal primerne bruker en DNA editor ApE.
- Opprette en ny DNA-fil (Fil > ny) og N-terminal primer med en leder sekvens (3-9 ekstra base parene, f.eks AAAGGGAAA), etterfulgt av det første begrensningen stedet valgt i vektoren MCS (6-8 base parene, f.eks TTAATTAA for PacI), en Valgfritt mellomrom (f.eks GCTAGCGCATCGCCACC i pCAGGS vektoren brukt i eksemplet) og første 18-27 base parene av genet av interesse (f.eks ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG for OSM).
- I en ny DNA-fil, C-terminalen primer sekvensen starter med finalen 18-27 base parene av genet av interesse (f.eks CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA for et gen med en 6xHistidine C-terminalen kode), etterfulgt av en valgfri spacer (f.eks TAGCGGCCGC i pCAGGS-vektor), andre begrensning site valgt (f.eks GGCGCGCC for beredskap) og en leder sekvens (f.eks AAAGGGAAA). Merk hele sekvensen, høyreklikk og velg "Reverse-komplement' hente omvendt primer.
- Design primere for hver av grenseområdene i chimeric konstruksjoner.
- Åpne DNA sekvensen av chimera (opprettet i trinn 1.3.4.1.) og markere et 30 base par område i sonen hvor den originale og innsatte sekvenser er kontakt, bestående av 15 base parene av hver. Kopier regionen (Høyreklikk og velg "Kopier") og lim den inn i en ny DNA-fil; denne sekvensen blir fremover primer.
- Lag en kopi av fremover primer generert i forrige trinn, og gi det som omvendt primer. Merk primer sekvensen, høyreklikk og velg "Reverse-komplement' generere omvendt primer sekvensen.
- Gjenta 2.3.1. og 2.3.2. for hver kontakt sone i chimeric DNA sekvensen. Vanligvis er to sett med forover/bakover grunning nødvendig for å generere en chimera, med mindre erstatningen N-terminal eller C-terminalen regioner.
- Bestill terminal og interne primerne fra en leverandør for syntese av oligonucleotide.
Notater: Ved hjelp av svært renset terminal primere (f.eks HPLC-renset) kan ha en positiv effekt i protokollen suksessrate. Avsalte interne primere gir vanligvis gode resultater. - Få mal sekvenser av giver og reseptor gener.
Merk: Ansette plasmider med åpent lesing rammer (ORFs) av disse sekvensene som mal sterkt forenkler prosedyren og anbefales. Komplementære DNA (cDNA) fra en celle linje kjent å uttrykke disse genene kan også brukes som en mal for fremgangsmåten.
3. polymerase kjedereaksjon (PCR) forsterkning av de personlige DNA danner Chimera
- Forbered en personlige PCR reaksjonen blanding for hver av fragmenter komponere chimeric protein. En typisk chimeric protein krever tre individuelle fragmenter: N-terminal delen og regionen settes delen C-terminalen.
Notater: Bruke en høy kvalitet DNA polymerase (f.eks Phusion Hi-Fi DNA Polymerase) for å unngå introdusere mutasjoner i sekvensen. PCR reaksjonen kan settes opp i kveld og kjøre over natten.- Sett en 1,5 mL microfuge rør på is og Pipetter forskjellige reagensene PCR-blandinger i rekkefølgen vist i tabell 1, sikre riktig primere og maler er ansatt for hver PCR reaksjon (se tabell 2).
- Merk to tynne vegger 0,2 mL PCR rør for hver reaksjon, og overføre 20 µL av tilsvarende PCR blandingen i hver retning. Overføre PCR rør til en PCR-thermocycler og starte protokollen i tabell 3.
Merk: annealing temperatur bør være minst 5 grader lavere enn Smeltetemperaturen designet primerne.
- Mens PCR kjører, forberede 100 mL en 1% agarose gel Tris Acetate EDTA (TAE) buffer. For dette formålet, veie 1 g agarose, bland med 100 mL TAE buffer i en glass kolbe og mikrobølgeovn til agarose er fullstendig oppløst, virvlende kolbe enhver 30-40 sekunder. Tillate kjøling til ca 50 ° C, legge til 2-3 µL av ethidium bromide (eller en tilsvarende DNA fargestoff) og hell i en gel brett med ønsket godt kammene.
Forsiktig: ethidium bromide er en kjent mutagen, sikre bruk av riktig verneutstyr. - Når PCR reaksjonen er fullført, kan du legge til 4 µL av 6 x DNA laste buffer i hver retning. Sett 1% agarose gel i en geleelektroforese enhet, dekk med TAE buffer og nøye laste prøvene i gel sammen med en molekylvekt stige.
Merk: på tidspunktet for lasting er det best å la tom baner mellom prøvene å lette DNA etterpå. - Kjøre gel på 80-120 V 20-45 minutter.
Merk: band under 1000 base parene kan vanligvis være electrophoresed i rundt 20 minutter ved 120 V, mens større band vil kreve lengre kjører ganger. - Slå av geleelektroforese enheten, ta ut agarose gel og visualisere forsterket DNA band under UV-lys. Bruker et barberblad kuttet ut personlige DNA fragmenter fra gel, og overføre dem til merket 2 mL microfuge rør.
Merk: Minimere eksponeringstid for UV-lys for å unngå DNA skade. - Bruke en PCR rydde opp kit (se Tabell for materiale) for å rense de ulike DNA-fragmentene.
- Legg til 500 µL NTI bufferen fra settet til hver rør som inneholder en gel-fragment. Overføre til en thermomixer på 50-55 ° C og rister på 1000 rpm til gel er fullstendig oppløst i bufferen.
- Overføre hver løsning til en merket kit kolonne, spinne i en microcentrifuge (30-60-tallet 11.000 x g) og kast flowthrough. Legge til 700 µL av utstyrets NT3 vaskebuffer, sentrifuge igjen under de samme innstillingene og kast flowthrough. Sentrifuge kolonnene for 1-2mins 11.000 x g tørke silica membranen i kolonnen.
- Overføre den kolonnen til et merket 1,5 mL microfuge rør, Pipetter 30 µL av nuclease-fritt vann i kolonnen, la stå i 1 minutt og sentrifuge 30-60-tallet 11.000 x g til elute DNA.
- Kvantifisere mengden DNA av måle absorbansen av utvalget på 260 nm og 340 nm i et spektrofotometer (se Tabell for materiale). DNA konsentrasjonen beregnes ved å trekke 340 nm lesing fra 260 nm figuren, multiplisere resultatet av DNAS utryddelse koeffisient (50 µg/mL)23.
Notater: Flere målinger på 230 nm og 280 nm tillate evaluering av DNA renhet: 260/280 og 260/230 prosenter over 1.8 er generelt ansett som ren for DNA. Protokollen kan pauses etter dette trinnet kan lagre eluted DNA 4 ° C (kortsiktige) eller 20 ° C (sikt).
4. PCR forsterkning generere Chimeric DNA sekvensen
- Angi 50 µL av en PCR reaksjonen å fusjonere separat spesialpreparatets chimera. Følg de samme trinnene i 3.1, ansette N-Terminus og C-terminalen primerne sammen med 10 ng av DNA fragmenter innhentet i trinn 3.7.
Merk: PCR reaksjonen kan settes på kvelden og kjøre over natten. - Gjenta 3.2 til 3,7 gjenopprette og kvantifisere renset DNA fragmentet i 30 µL nuclease uten vann. Denne fragment viser chimeric DNA sekvensen, flankert av begrensning-områder som er inkludert i terminal primerne.
5. innsetting av Chimeric DNA i et uttrykk vektor
- Etiketten to 1,5 mL microfuge rør og Pipetter forskjellige reagenser i rekkefølgen som er angitt i Tabell 4, legge 1 µg av valgte uttrykket vektor i en tube og 1 µg av gjenopprettede DNA fragment i den andre. Inkuber for 1-4 h på 37 ° C til å utføre fordøyelsen med valgt begrensning enzymer.
Notater: Sikre begge begrensning enzymer er kompatible med bufferen ansatt. De krever helt ulike buffere, utføre disse trinnene først med bare en av enzymer og gjenta. Tiden som kreves for fordøyelsen kan variere avhengig av begrensning enzymer valgt: produsentens instruksjoner for detaljert informasjon. - Gjenta 3.2 til 3,7 for å rense og gjenopprette fordøyd DNA fragment og uttrykk vektoren i 30 µL nuclease uten vann. Kvantifisere mengden DNA gjenopprettet som før.
- Beregn mengden av sett inn DNA kreves for 3:1 Sett inn/vektor molar forholdet i ligation reaksjon, ved hjelp av følgende ligning.
Sett inn (ng) = Molar forholdet * vektor (ng) * sette størrelsen (bp) / Vector størrelse (bp)
Merk: Forskjellige sett inn/vektor molar prosenter kan testes, selv om en 3:1-forhold er vanligvis tilstrekkelig for å oppnå tilfredsstillende resultater. - Sette opp 20 µL av en ligatur reaksjon i en 1,5 mL microfuge tube med 40 ng av uttrykket vektor mengden chimeric DNA beregnet i trinn 5.3, buffer og T4 DNA ligase i rekkefølgen angitt i tabell 5og ruge over natten på 16 ° C.
Merk: Ligation effektivitet generelt øker ved å utføre reaksjonen overnatting på 16 ° C, men også reaksjon kan være ruges i 2 timer ved romtemperatur. - Transformering 5-10 µL av hemorroider blandingen i kjemisk kompetent Escherichia coli (E. coli) utarbeidet etter standardprotokoller24 vokse i utvalg plater og plukke enkelt koloniene for ekspansjon og plasmider DNA isolasjon i henhold til etablerte protokoller25.
Merk: E. coli XL1-blå belastningen ble brukt for denne protokollen, men andre E. coli varianter kan også brukes. - Fordøye 1 µg isolert plasmider med passende begrensning enzymer følge instruksjonene i trinn 5.1, og vurdere tilstedeværelsen av en DNA band av en størrelse tilsvarende chimeric sekvensen av geleelektroforese i en agarose gel (se trinn 3.2-3,5).
Merk: Det anbefales at innsatte sekvensen kontrolleres ved hjelp av en DNA sekvensering tjenesten. - Ved vellykket sekvens bekreftelse, kan plasmider være produsert i større mengder og ansatt i et pattedyr uttrykk system av følgende veletablerte protokoller26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruksjon og generering av et chimeric protein (figur 1) vil være eksemplifisert med to medlemmer av interleukin-6 cytokin familien, OSM og LIF, som var gjenstand for en nylig publisert studie6. Figur 2 viser tredimensjonale strukturen av disse proteinene. Begge molekyler vedta karakteristiske sekundære strukturen i klassen jeg cytokiner, med fire helikser (kalt A til D) pakket i en pakke, og sammen med looper28. Justert aminosyre strukturer av menneskelige proteiner kan ses i Figur 3A. I dette eksemplet regionen BC løkke av OSM var ombyttet av tilsvarende LIF sekvensen til å opprette en OSM-LIF-chimera aminosyre sekvens som vist i Figur 3B.
For dette formål, DNA sekvensen av OSM og LIF ble innhentet og koding aminosyre regionen tilsvarer BC loopen ble identifisert for begge cytokiner og erstattet (Figur 4). En 6-histidin kode ble i tillegg innlemmet i C-terminus å lette nedstrøms protein rensing. Deretter en egnet vektor pattedyr uttrykk (pCAGGS) ble valgt og unik begrensning områder innenfor flere kloning området var valgte (PacI og Volunteers) Kontroller at de ikke var i chimeric genet sekvensen (se trinn 2.1.1.).
Primere ble utformet som vist i Tabell 4. N-terminal frem OSM primer inkludert en ledende sekvens av 9 base parene, etterfulgt av webområdet PacI begrensning og en plasmider-spesifikke spacer første 27 base parene av OSM. C-terminalen omvendt primer innlemmet ledende sekvensen etterfulgt av Legambiente begrensning området, et mellomrom og 27 siste base parene av genet, som i dette tilfellet korresponderte til C-terminalen histidin koden. I tillegg var 30-base par primere spenner over knutepunktene av BC loop nødvendig i både forover og bakover orientering.
PCR forsterkning steg besto av tre separate reaksjoner. N-terminal OSM fragmentet, som krevde N-terminal OSM frem og BC start omvendt primere, brukte OSM som mal. Insertion BC loopen ble oppnådd gjennom BC start frem og BC slutten omvendt primere med LIF som mal. C-terminalen OSM fragmentet brukes BC slutten frem og C-terminalen OSM omvendt primere, samt OSM som mal. Disse tre fragmenter med forventede størrelser av 385, 75 og 321 base parene, kan ses i figur 5et etter separasjon i en 1% agarose gel.
Disse renset fragmenter ble da brukt som en mal i andre PCR reaksjonen, sammen med N-terminal OSM frem og C-terminalen OSM reversere primere. Resultatet av denne forsterkning, tilsvarer OSM-LIF BC loop genet sekvens og er vist i figur 5B. Dette trinnet ble etterfulgt av rensing, en 4-timers fordøyelsen av genet fragmentet og valgte plasmider, gel geleelektroforese og rensing, overnatting ligation på 16 ° C, og transformasjon til E. coli XL1-blå. Individuelle plasmider ble isolert og vist av begrensning enzym fordøyelsen for riktig innsetting av DNA fragment (figur 6). Til slutt, positiv treff ble sendt for sekvensering å bekrefte at sekvensen tilsvarte tiltenkte OSM-LIF BC loop chimera før du fortsetter å protein uttrykk, rensing og testing i funksjonelle analyser6.
Figur 1 : Skjematisk fremstilling av chimeric protein generasjon. (A) Chimeric designprosessen: etter utvalg av regionene skal utveksles, rekkefølgen for ønsket chimera og nødvendig primerne er konstruert ved hjelp av DNA redigering programvare. (B) de viktigste trinnene i generasjon chimeric proteiner er avbildet. To trinn PCR forsterkning produserer en chimeric genet rekkefølge, som deretter fordøyd med passende begrensning enzymer og samskrevet i et uttrykk vektor. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Strukturelle likheter mellom OSM og LIF. Representasjon av krystall strukturer OSM29 (PDB: 1EVS) og LIF30 (PDB: 2Q7N), sammen med en omtrentlig representasjon av designet chimera. Disse cytokiner vedta en fire-spiralformede bunt konformasjon av looper. Denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i binding området III av menneskelig Oncostatin M (OSM) kreves for OSM reseptor aktivisering. J. Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © forfattere6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Sammenligning av OSM og LIF amino acid sekvenser. (A) justering av full lengde amino acid sekvenser av menneskelige OSM og LIF, med BC loop regionen uthevet. Stjerner (*) angir fullstendig bevarte rester, kolon (:) tilsvarer aminosyrer sterkt lignende egenskaper og punktum (.) betegne de med svakt tilsvarende funksjoner. (B) aminosyresekvens av OSM BC loop chimera, med BC loop regionen OSM erstattet av LIF tilsvarende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : DNA sekvens av OSM BC loop chimera. Sekvensen av chimeric OSM protein. Regionen fra LIF er markert med oransje. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Forsterkning av OSM BC loop chimera DNA fragmenter. (A) skyldes første PCR forsterkning, med band tilsvarer regionen N-terminal (lane 2), BC loop (lane 3) og C-terminalen regionen (lane 4). (B) skyldes andre PCR forsterkning, der de tre bandene innhentet i første forsterkning kombineres for å generere OSM chimera. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Innsetting av OSM BC loop chimera plasmider vektor. Begrensning enzym fordøyelsen av genererte plasmider, med et lavere band tilstede på ~ 700 base parene som angir riktig innsetting av OSM chimera genet sekvensen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Reagens | Lager konsentrasjon | Volum (i 50 µL) |
| Sterilt vann | til 50 µL | |
| PCR Buffer | 10 X | 5 ΜL |
| dNTPs | 10 mM | 1 ΜL |
| DMSO | 100% | 1,5 ΜL |
| Fremover Primer | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Omvendt Primer | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Malen DNA | Variabel | Nødvendig for 2.5-12,5 ng av plasmider DNA |
| Phusion Hi-Fi DNA Polymerase | 2 enheter/µL | 0,5 ΜL |
Tabell 1: Reagenser kreves for reaksjonsblandingen PCR.
| N-terminal fragment | Chimeric innsetting | C-terminalen fragment | |
| Fremover Primer | N-terminal fremover | Første kryss frem | Andre krysset frem |
| Omvendt Primer | Første kryss omvendt | Andre krysset omvendt | C-terminalen omvendt |
| Malen DNA | Mottakeren | Donor | Mottakeren |
Tabell 2: Primer og maler nødvendig for generering av et standard chimeric protein.
| Syklus trinn | Temperatur | Tid | Antall sykluser |
| Første rødsprit | 98 ºC | 30s | 1 |
| Rødsprit | 98 ºC | 10s | 23-25 |
| Avspenning | 68 ºC * | 25 år | 23-25 |
| Utvidelse | 72 º C | 30s per kilobase | 23-25 |
| Endelig utvidelse | 72 º C | 300S | 1 |
| Hold | 4 ºC | ∞ | 1 |
| * Minst 5 ºC lavere enn primer smelter temperatur | |||
Tabell 3: PCR-protokoll som brukes til å forsterke chimeric fragmenter og full chimeric protein.
| Reagens | Lager konsentrasjon | Volum (i 50 µL) |
| Sterilt vann | til 50 µL | |
| Begrensning enzym Buffer * | 10 X | 5 ΜL |
| Malen DNA | Variabel | Nødvendig for 1 µg DNA |
| Enzym #1 | Variabel | 1 ΜL |
| Enzym #2 | Variabel | 1 ΜL |
| * Sikre begge enzymer er kompatible med bufferen valgt | ||
Tabell 4: Komponenter av begrensning enzym fordøyelsen reaksjonen.
| Reagens | Lager konsentrasjon | Volum (i 20 µL) |
| Sterilt vann | til 20 µL | |
| T4 DNA Ligase Buffer | 10 X | 2 ΜL |
| Vector DNA | Variabel | Nødvendig for 40 ng av DNA |
| Sett inn DNA | Variabel | Nødvendig for en 3:1 molar ratio |
| T4 DNA Ligase | Variabel | 1-2 ΜL |
Tabell 5: Reagenser kreves for hemorroider reaksjonen.
| navn | Primer sekvens |
| N-terminal OSM frem primer (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-terminalen HisTag omvendt primer (ASCII) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| BC loop start frem | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| BC loop starte omvendt | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| BC loop slutten frem | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| BC loop slutt reversere | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Tabell 6: Primere brukes til generering av OSM BC loop chimera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av chimeric proteiner utgjør en allsidig teknikk, hvilke er kjøpedyktig gå utover grensene for avkortet proteiner til adressen spørsmål som modularitet cytokin-reseptor bindende domener13. Utformingen av chimeras er et viktig skritt i denne typen studier, og krever nøye overveielse. Forstudier å etablere funksjonelle domener krever generelt substitusjon av brede områder i en første fase, mens mindre erstatninger med variabel lengde er mer egnet til detaljerte studier av ett. Spesiell oppmerksomhet bør gis til tilstedeværelsen av små bevarte motiver innen en protein i dette trinnet, siden disse er ofte tegn på funksjonelle områder31,32. Erfaring viser at en runde chimeric protein design kan være nødvendig for å begrense en nøkkel funksjonelle region, med hver runde som krever betydelig tid (uker til måneder) fra innledende utforming til funksjonell analyse testing.
Så lenge det finnes et strukturelt ligner protein protein av interesse, men besitter avvikende biologiske funksjoner, er metoden gjelder for enhver rekkefølge av interesse, selv om det må være optimalisert for hver bestemt gen på grunn av sin avhengighet av PCR forsterkning. Spesielt kan gener besitter GC-rike regioner være spesielt utfordrende mål, siden disse typer sekvenser er kjent for å redusere effektiviteten av forsterkning33. Disse problemene kan vanligvis løses ved ulike midler, som tillegg av ulike tilsetningsstoffer (f.eks betaine) reaksjonen, bruk av spesialiserte DNA polymerase buffere eller endring av den annealing parametere34. Derfor vil det vanligvis kreve del prøving og feiling før tilfredsstillende betingelser for genet av interesse er funnet.
Protokollen gitt er basert på klassiske begrensning enzym-basert kloning metoder, som er vanligvis tilgjengelig for alle typer laboratorium, men det kan ytterligere tilpasses for å utnytte mer avansert kloning teknikker. For eksempel bruker gateway kloning, krever som forenkler kloning samme innsatsen i flere forskjellige vektorer (f.eks hvis ulike uttrykk systemer skal testes parallelt) bare bestemt attB rekombinasjon områder på plass av begrensning nettsteder i denne protokollen35. Andre nyere kloning metoder kan omgå behovet for en andre PCR reaksjon (f.eks bruker36 eller Gibson montering37) og ligatur (f.eks sekvens og hemorroider-uavhengig kloning (skive)38 eller i-fusion montering 39). mens krever ulike reagenser og primer design strategier, lesere med tilgang til disse metodene oppfordres til å bruke dem til å vesentlig fremskynde generering av chimeric konstruksjoner etter følgende grunnleggende utformingsprinsippene detaljert i trinn 1 i denne protokollen.
Total, anvendelse av denne metoden kan gi verdifull innsikt om mekanismene som andre protein biologiske funksjoner finner sted, spesielt hvis det involverer protein-protein eller protein-nukleinsyre syre interaksjoner, og utgjør en nyttig verktøyet å identifisere og angi unike struktur-funksjon relasjoner innenfor en protein familie6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i binding området III av menneskelig Oncostatin M (OSM) kreves for OSM reseptor aktivisering. J. Biol. kjemiske 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
