Summary
Strukturellt relaterade proteiner utöva ofta olika biologiska funktioner. Utbyte av motsvarande regioner i dessa proteiner för att skapa chimära proteiner utgör en innovativ metod för att identifiera kritiska protein regioner som ansvarar för deras funktionella skillnader.
Abstract
Målet med detta protokoll omfattar utformningen av chimära proteiner där distinkta regioner av ett protein ersättas med deras motsvarande sekvenser i ett strukturellt likartade protein, för att fastställa funktionella betydelsen av dessa regioner. Sådan chimärer genereras genom ett nästlade PCR-protokoll med hjälp av överlappande DNA-fragment och adekvat primers, följt av deras uttryck inom ett däggdjur system för att säkerställa infödda sekundärt strukturera och post-translationella modifieringar.
Den funktionella rollen för en distinkt region framgår sedan av en förlust av aktivitet av chimera i ett lämpligt avläsning test. Följaktligen identifieras regioner härbärgerat en uppsättning kritiska aminosyror, vilket ytterligare kan kontrolleras med kompletterande tekniker (t.ex. webbplats riktad mutagenes) för att öka molekylär upplösning. Begränsad till fall där ett strukturellt relaterade protein med olika funktioner kan hittas, men chimära proteiner har lyckat använts att identifiera kritiska bindande regioner i proteiner såsom cytokiner och cytokin receptorer. Denna metod är särskilt lämplig i fall där proteinets funktionella regioner inte är väldefinierade och utgör ett värdefullt första steg i riktad evolution metoder att begränsa Regionkommittén sevärdheter och minska den screening ansträngningen inblandade.
Introduction
Flera typer av proteiner, inklusive cytokiner och tillväxtfaktorer, grupperas i familjer vars medlemmar delar liknande tredimensionella strukturer men ofta utöva olika biologiska funktioner1,2. Denna funktionella mångfald är oftast en följd av små skillnader i aminosyra sammansättning inom molekylens aktiva platser3. Identifiering av sådana platser och funktionella bestämningsfaktorer inte bara erbjuder evolutionära insikter utan också att utforma mer specifika agonister och hämmare4. Det stora antalet skillnader i rester sammansättning ofta hittas mellan strukturellt relaterade proteiner komplicerar dock denna uppgift. Även om att konstruera stora bibliotek som innehåller hundratals mutanter är numera möjligt, bedöma varje enskild rester variation och kombinationer av dem fortfarande är en utmanande och tidskrävande insats5.
Tekniker att bedöma funktionella betydelsen av stora protein regioner är således av värde för att minska antalet möjliga rester till en hanterbar nummer6. Trunkerade proteiner har varit den mest använda metoden att tackla denna fråga. Följaktligen är regioner anses vara funktionellt relevanta om funktionen protein under studien påverkas av strykningen av en viss region7,8,9. En stor begränsning med denna metod är dock att strykningar kan påverka proteinets sekundärt strukturera, leder till Skellefteåsjukan, aggregering och oförmågan att studera avsedda regionen. Ett bra exempel är en stympad version av cytokin oncostatin M (OSM), som studerat en inre radering som är större än 7 rester resulterade i en felveckning mutant som inte kunde ytterligare10.
Generering av chimära proteiner utgör ett alternativ och innovativa förhållningssätt som tillåter analys av större protein regioner. Målet med denna metod är att utbyta regioner av intresse i ett protein av strukturellt relaterade sekvenser i ett annat protein, för att kunna bedöma bidraget från de utbytta delarna till specifika biologiska funktioner. Ofta används i fältet för signalering receptorer att identifiera funktionella domäner11,12, är chimär proteiner särskilt användbart för att studera protein familjer med lite aminosyra identitet men bevarade sekundärt strukturera. Lämpliga exempel kan hittas i klassen av interleukin-6 (IL-6) typ cytokiner, såsom interleukin-6 och ciliär neurotrofisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hämmande faktor (LIF) och OSM (20% identitet)6, där den följande protokoll är baserad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. chimära Protein Design
- Välj en lämplig protein (givare) att utbyta regioner med proteinet av intresse (mottagaren) proteinet givare bör vara strukturellt liknande, helst tillhörande proteinfamiljen samma, men saknar den biologiska aktiviteten för att användas som avläsning. Om inga strukturellt relaterade proteiner är kända, kan potentiella kandidater identifieras med hjälp av ett automatiserat verktyg som den vektor Alignment Search Tool (VAST)14,15
- Åtkomst till Protein Data Bank (PDB)16 europeiska webbplatsen (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), införa namnet på proteinet av intresse i sökrutan i övre högra hörnet och klicka på 'Sök'. Förutsatt att det finns en kristallstruktur, inte ner PDB identifieraren (PDB ID; t.ex. 1evs för OSM).
Obs: om strukturella data inte är tillgängliga på det preliminära budgetförslaget, en homologi modell av protein kan genereras av ett verktyg såsom SWISS-modell17 i stället använda tillgängliga stegvisa protokoll18. - Tillgång till den stora webbplatsen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml). Ifall en PDB-ID är tillgängligt, bläddra ner till 'Hämta pre beräknade resultat' avsnittet imput PDB ID i rutan 'Visa liknande strukturer för' och klicka på 'Gå'. I följande skärm, klicka på 'Ursprungliga stora' och sedan 'Hela kedjan' att se en lista över preliminära budgetförslaget IDs för potentiella strukturellt likartade kandidater.
- Om en PDB-ID är tillgängligt men en homologi modell genererades, rulla ned till avsnittet ”Sök med en ny struktur' och klicka på ' stora ' länken. Ladda upp PDB-filen av modellen genom att klicka på 'Sök' bredvid 'Lämna PDB fil', markera filen och klicka 'Skicka'.
- Efter det preliminära budgetförslaget filen är uppladdad, klicka på 'Start'-knappen för att starta stora beräkningen. När beräkningen utförs, klicka på 'Hela kedjan' under domäner att se PDB IDs av strukturellt liknande proteiner.
- Bedöma de biologiska funktionerna av intresse (t.ex. receptor aktiveringen, enzymaktivitet, transkription faktorn aktivitet) av topp kandidaterna, antingen experimentellt i systemet avläsning av val eller genom litteratursökning. Välj en givare protein med avvikande funktion i jämförelse med proteinet av intresse.
- Åtkomst till Protein Data Bank (PDB)16 europeiska webbplatsen (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/), införa namnet på proteinet av intresse i sökrutan i övre högra hörnet och klicka på 'Sök'. Förutsatt att det finns en kristallstruktur, inte ner PDB identifieraren (PDB ID; t.ex. 1evs för OSM).
- Få protein aminosyresekvenser av mottagaren och givaren proteiner från databasen referens sekvens (RefSeq)19 .
- Gå till avsnittet genen i RefSeq webbsida (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene), Skriv namnet på proteinet av intresse i sökrutan och klicka på 'Sök'. Klicka på namnet gen efter önskad arter i den resulterande listan.
- Rulla ned till avsnittet RefSeq att se alla dokumenterade isoformer. Klicka på sekvens-ID för isoformen av intresse (start med NM), rulla ned och klicka på 'CDS' för att markera regionen protein-kodning av genen. Längst ned till höger på skärmen, klicka på 'FASTA' och kopiera gensekvensen.
- Spara DNA-sekvensen med hjälp av en lämplig DNA redigeringsprogram. När du använder den fritt tillgängliga ApE20, öppna programmet, klistra in den Kopiera sekvensen i rutan tom, Välj sekvensnamn och klicka på 'Spara'.
Anm: Upprepa steg 1.2.1. till 1.2.3. för en eller flera givare proteinerna valt.
- Välja protein regionerna att ersättas i de olika chimära konstruktioner.
- Dela upp protein sekvensen av intresse för olika strukturella regioner. Olika domäner för protein i fråga kommer helst har beskrivits i litteraturen. Om detta inte är fallet, bör förekomsten av skilda bevarade strukturella funktioner (spiraler, loopar) utvärderas i steg 1.3.1.1. till 1.3.1.4.
- Hämta den strukturella uppgifter av proteinet av intresse från PDB webbplats (se steg 1.1.1.). Tillgång till PDB sidan för protein och hämta PDB-filen genom att klicka på 'Ladda ner' på höger sida av skärmen.
- Öppna PDB-filen i ett molekylära visualiseringssystem som PyMOL (https://pymol.org/). Visa av nukleotidsekvensen i PyMOL, (genom att klicka på Visa > sekvens på), dölja strukturella standarddata (genom att klicka H bredvid det preliminära budgetförslaget-ID, och välja 'allt') och välj vyn 'tecknad' att tydligt visualisera Proteinets struktur funktioner (S bredvid PDB ID och välja 'tecknad').
- Klicka på av nukleotidsekvensen överst på skärmen för att belysa olika delar av molekylen, anteckna de aminosyror som motsvarar varje strukturella särdrag.
- Kommentera olika strukturella regionerna på DNA-sekvensen i ApE. För att göra det., öppna DNA-sekvensen från steg 1.2.3., Välj de nukleotider som kodar för aminosyrorna i en region, högerklicka på markeringen och välj 'Nyhet' att ge det ett namn och en färg. Upprepa processen för varje strukturell region identifierade i föregående steg.
Obs: Nukleotid valet kan vara dubbelkollade genom att klicka på ORFs > Översätt och sedan klicka på OK, för att säkerställa att de koden för den rätta aminosyrasekvensen. - Justera de rester sekvenserna av de två proteinerna som sysselsätter ett protein justering verktyg (t.ex. Clustal Omega21).
Obs: Eftersom chimärer ska produceras i ett däggdjur uttryck system, dessa sekvenser bör innehålla proteiner signal peptider.- Få de fullständiga aminosyresekvenser givare och receptor protein i ApE, genom att öppna de DNA-sekvenserna från steg 1.2.3., markera dem och klicka ORFs > Översätt.
- Tillgång till webbsidan Clustal Omega (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) och imput de amino syra ordnar av de två proteinerna, bläddra sedan ned och klicka 'Skicka. Varje sekvens bör vara gick av en textrad med ' > ProteinName' identifieras korrekt...
- Hämta filen justering genom att klicka på fliken 'Ladda ner justering fil' och spara den. Denna fil kan öppnas av någon textredigering program.
- Använda filen justering som referens, kommentera motsvarande strukturella regioner av givare protein i sin DNA-sekvens (se punkt 1.3.2.).
- Besluta vilka protein regioner att utbyta i chimära proteiner och utforma de lämpliga nukleotidsekvenser för chimärer.
Obs: I avsaknad av detaljerad information om funktionell betydelse i de olika regionerna, det föreslås för att välja stora ersättningar såsom hela loopar eller spiraler att utvärdera vilka av dem ha en inverkan på proteinfunktion. Detta första förberedande experiment kan sedan följas av en andra omgång chimära protein design, fokuserade på mindre substitutioner inom de berörda regionerna.- Skapa en kopia av den kommenterad DNA-sekvensen av receptorprotein från steg 1.3.2. och döp om den som en chimär protein. Öppna den omdöpta DNA-sekvensen i ApE, markera och ta bort nucleotide sequence kodning för regionen att bytas ut, och ersätta det med motsvarande regionen i givaren proteinet (kopieras från sekvensen kommenterad skapade i steg 1.3.3.) och sedan spara ändringarna.
Obs: Skapa en ny kopia och upprepa detta steg för varje olika chimera utformad.
- Skapa en kopia av den kommenterad DNA-sekvensen av receptorprotein från steg 1.3.2. och döp om den som en chimär protein. Öppna den omdöpta DNA-sekvensen i ApE, markera och ta bort nucleotide sequence kodning för regionen att bytas ut, och ersätta det med motsvarande regionen i givaren proteinet (kopieras från sekvensen kommenterad skapade i steg 1.3.3.) och sedan spara ändringarna.
- Dela upp protein sekvensen av intresse för olika strukturella regioner. Olika domäner för protein i fråga kommer helst har beskrivits i litteraturen. Om detta inte är fallet, bör förekomsten av skilda bevarade strukturella funktioner (spiraler, loopar) utvärderas i steg 1.3.1.1. till 1.3.1.4.
2. förberedelse för molekylär kloning
- Välj en plasmid vektor passar uttrycket systemet för val. För däggdjur uttryck rekommenderas en hög-uttryck vektor som pCAGGS22 eller pcDNA vector serien.
- Restriktionsenzym-baserade kloning visats i detta protokoll, se till att de unika begränsning platserna i flera kloning platsen (MCS) av vektorn är kompatibla med proteinet av intresse. Till gör så, öppna den DNA-sekvensen av chimära konstruktioner med ApE, klicka på ' enzymer > enzym väljaren ' och verifierar att minst två av områdena begränsning i MCS är frånvarande i sekvensen (visar en nolla bredvid deras namn).
- Design terminal primers med en DNA-redigerare såsom ApE.
- Skapa en ny DNA-fil (fil > nytt) och initiera den N-terminala primer med en ledare sekvens (3-9 extra baspar, t.ex. AAAGGGAAA), följt av den första begränsning-platsen som är markerad i vektorn MCS (6-8 baspar, t.ex. TTAATTAA för PacI), en valfria spacer (t.ex. GCTAGCGCATCGCCACC i pCAGGS vektorn används i exemplet) och de ursprungliga 18-27 baspar av genen av intresse (t.ex. ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG för OSM).
- I en ny DNA-fil, C-terminal primer sekvensen börjar med finalen 18-27 baspar av genen av intresse (t.ex. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA för en gen med en 6xHistidine C-terminal tagg), följt av ett valfritt spacer (t.ex. TAGCGGCCGC i pCAGGS vektorn), den andra begränsningen site valt (t.ex. GGCGCGCC för AscI) och en ledare-sekvens (t.ex. AAAGGGAAA). Markera hela sekvensen, högerklicka och välj 'Omvänd-komplement' att få reverse primer.
- Design primers för var och en av gränsregionerna i chimära konstruktioner.
- Öppna den DNA-sekvensen av chimera (skapade i steg 1.3.4.1.) och markera en 30 baspar region i zonen där de ursprungliga och infogade sekvenserna är i kontakt, bestående av 15 baspar i varje sekvens. Kopiera regionen (högerklicka och välj 'Kopia') och klistra in den i en ny DNA-fil. denna sekvens kommer att vidarebefordra primer.
- Göra en kopia av den framtida primer som genereras i föregående steg och döp om den till reverse primer. Markera sekvensen primer, högerklicka och välj 'Omvänd-komplement' att generera sekvensen reverse primer.
- Upprepa steg 2.3.1. och 2.3.2. för varje kontakt zon i chimära DNA-sekvensen. Generellt är två uppsättningar av framåt/bakåt primers skyldiga att generera en chimär, såvida inte ersättning uppstår vid N-terminal eller C-terminal regioner.
- Beställa terminal och interna primers från en oligonukleotid syntes provider.
Anteckningar: Använder mycket renad terminal primers (t.ex. HPLC-renat) kan ha en positiv inverkan i protokollets framgång. Desalted inre primers ge brukar bra resultat. - Hämta mallen sekvenser av givare och receptor gener.
Obs: Anställa plasmider som innehåller öppen läsning ramar (ORFs) av dessa sekvenser som en mall kraftigt underlättar förfarandet och rekommenderas. Kompletterande DNA (cDNA) genereras från en cell fodrar känt att uttrycka dessa gener kan alternativt användas som mall för efterföljande steg.
3. polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning av de individuella DNA-fragment som bildar Chimera
- Förbereda en enskilda PCR-reaktionsblandningen för varje fragment komponera chimära proteinet. En typisk chimära protein kommer att kräva tre enskilda fragment: den N-terminala del, regionen att införas och den C-terminala delen.
Anteckningar: Använd en HiFi-DNA-polymeras (t.ex. Phusion High Fidelity DNA-polymeras) för att undvika att införa mutationer i sekvensen. PCR-reaktionen kan ställa in på kvällen och kör över natten.- Set ett 1,5 mL microfuge tube på is och Pipettera olika reagenser av PCR-blandningarna i den ordning som visas i tabell 1, säkerställa rätt primers och mallar är anställda för varje PCR-reaktion (se tabell 2).
- Märk två tunna 0,2 mL PCR-rören för varje reaktion och överföra 20 µL av PCR-motsvarande blandningen i varje rör. Överför PCR-rören till en PCR termocykler och initiera protokollet beskrivs i tabell 3.
Obs: glödgning temperatur bör vara minst 5 grader lägre än smälttemperatur av designade primers.
- Medan PCR körs, bereda 100 mL av en 1% agarosgel i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffert. För detta ändamål, väger 1 g av agaros, blanda med 100 mL TAE buffert i en glas-kolv och mikrovågsugn tills Agarens är helt upplöst, virvlande kolven var 30-40 sekunder. Tillåta nedkylning till cirka 50 ° C, Lägg 2-3 µL av etidiumbromid (eller en motsvarande DNA-färgämne) och häll i en gel bricka med de önskade väl kammar.
Försiktighet: etidiumbromid är ett känd mutagen, garantera användning av lämplig skyddsutrustning. - Efter PCR-reaktionen är klar, tillsätt 4 µL av 6 x DNA lastning buffert i varje rör. Infoga 1% agarosgel i en elektrofores enhet, täcka med TAE buffert och noggrant läsa in proverna i gelen tillsammans med en molekylvikt stege.
Obs: vid tidpunkten för lastning, det är bättre att lämna tomma gränderna mellan proverna att underlätta DNA återhämtning efteråt. - Kör gelen vid 80-120 V 20-45 minuter.
Obs: band under 1 000 baspar kan oftast vara electrophoresed i cirka 20 minuter på 120 V, medan större band kommer att kräva längre rinnande tider. - Stäng av enheten elektrofores, ta ut agarosgel och visualisera de amplifierade DNA-banden under UV-ljus. Med ett rakblad, skär ut individuella DNA fragment från gelen och överföra dem till märkt 2 mL microfuge rör.
Obs: Minimera exponering för UV-ljus för att undvika DNA-skador. - Använda en PCR-sanering kit (se Tabell för material) för att rena de olika DNA-fragment.
- Tillsätt 500 µL av NTI bufferten som tillhandahålls av satsen för att varje rör innehåller en gel fragment. Överföring till en thermomixer på 50-55 ° C och skaka vid 1000 rpm tills gelen är helt upplöst i bufferten.
- Överföra varje lösning till en märkt kit kolumn, snurra i en mikrocentrifug (30-60-talet, 11 000 x g) och kassera att. Lägga till 700 µL kit's NT3 tvättbuffert, Centrifugera igen under samma inställningar och kassera att. Centrifugera kolumnerna igen för 1-2mins vid 11 000 x g torka kiseldioxid membranet inuti kolumnen.
- Överföra den kolumnen till en märkt 1,5 mL mikrofugrör, Pipettera 30 µL nuclease-fritt vatten till kolonnen, låt stå i 1 minut och centrifugera 30-60s vid 11 000 x g till eluera DNA.
- Kvantifiera mängden DNA återvinns genom att mäta absorbansen av provet vid 260 nm och 340 nm i en spektrofotometer (se Tabell för material). DNA koncentrationen beräknas genom att subtrahera 340 nm läsningen från 260 nm figuren, sedan multiplicera resultatet av DNA: s utrotning koefficient (50 µg/mL)23.
Anteckningar: Ytterligare mätningar på 230 nm och 280 nm möjliggöra utvärdering av DNA renhet: 260/280 och 260/230 nyckeltal ovan 1,8 är allmänt betraktas som ren för DNA. Protokollet kan pausas efter detta steg, lagra eluerade DNA vid 4 ° C (kortvarig) eller -20 ° C (lång sikt).
4. PCR-amplifiering att generera chimära DNA-sekvensen
- Ställa in 50 µL av en PCR-reaktion att säkring chimera separata beståndsdelar. Följ samma steg som beskrivs i 3.1, anställa N-terminal och C-terminal primers tillsammans med 10 ng varje DNA fragment erhålls i steg 3,7.
Obs: PCR-reaktionen kan vara inställd på kvällen och kör över natten. - Upprepa steg 3,2 till 3,7 till återvinna och kvantifiera det renade DNA-fragmentet i 30 µL nuclease-gratis vatten. Detta fragment innehåller chimära DNA-sekvensen, flankerad av begränsning webbplatser ingår i terminal primers.
5. införandet av chimära DNA i ett uttryck vektor
- Etiketten två 1,5 mL microfuge rör och Pipettera olika reagenserna i ordningen som anges i tabell 4, lägga till 1 µg av det markerade uttrycket vektor i en tub och 1 µg av återvunna DNA-fragment i den andra. Inkubera i 1-4 h vid 37 ° C att utföra matsmältningen med de valda restriktionsenzym.
Anteckningar: Säkerställa både restriktionsenzym är förenliga med den bufferten som anställd. Om de kräver helt olika buffertar, utföra dessa steg först med endast ett av enzymerna och upprepa. Den tid som krävs för matsmältningen kan variera beroende på de restriktionsenzym som valts: Se tillverkarens instruktioner för detaljerad information. - Upprepa steg 3,2 till 3,7 rena och återställa den smälta DNA fragment och uttryck vektorn i 30 µL nuclease-gratis vatten. Kvantifiera mängden DNA återhämtat sig som tidigare.
- Beräkna mängden infoga DNA som krävs för en 3:1 Infoga/vector molar förhållandet i ligatur reaktionen, med hjälp av följande ekvation.
Infoga (ng) = Molar förhållandet * vektor (ng) * Infoga storlek (bp) / Vector storlek (bp)
Obs: Olika infoga/vector molar nyckeltal kan testas, även om förhållandet 3:1 är oftast tillräckligt för att erhålla tillfredsställande resultat. - Ställa in 20 µL av en ligatur reaktion i ett 1,5 mL mikrofugrör med 40 ng av uttrycket vektor mängden chimära DNA beräknas i steg 5.3, buffert och T4 DNA-ligase följer den ordning som anges i tabell 5och inkubera över natten vid 16 ° C.
Obs: Ligering effektivitet är generellt ökat genom att utföra reaktionen över natten vid 16 ° C, men alternativt reaktionen kan inkuberas i 2 h i rumstemperatur. - Omforma 5-10 µL av ligering blandningen i kemiskt behöriga Escherichia coli (E. coli) förberett följande standardprotokoll24 växa i urval plattor och plocka enstaka kolonier för expansion och plasmid-DNA isolering enligt fastställda protokoll25.
Obs: E. coli XL1-blå stam var anställd för detta protokoll, men andra E. coli varianter kan också användas. - Smälta 1 µg isolerade plasmidsna med lämplig begränsning enzymer instruktionerna i steg 5.1 och bedöma förekomst av ett DNA-band med en storlek motsvarande chimära sekvensen av elektrofores i en agarosgel (se steg 3,2-3,5).
Obs: Det rekommenderas att den införda sekvensen är verifierad med hjälp av en DNA-sekvensering tjänst. - Vid lyckad sekvens verifiering, kan plasmidsna produceras i större mängder och anställd i en däggdjur uttryck systemet av följande väletablerade protokoll26,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktion och generering av en chimär protein (figur 1) kommer att vara exemplifieras med två medlemmar av familjen interleukin-6 cytokin, OSM och LIF, som var föremål för en nyligen publicerad studie6. Figur 2 visar den tredimensionella strukturen av dessa proteiner. Båda molekyler anta klass jag cytokiner, med fyra spiraler (kallas A-D) förpackade i en bunt och sällskap av loopar28karakteristiska sekundära struktur. De justerade aminosyra strukturerna av mänskliga proteiner kan ses i figur 3A. I det här exemplet regionen BC loop av OSM utbyttes av den motsvarande LIF-sekvensen för att skapa en OSM-LIF chimera med den amino syra ordningen som visas i figur 3B.
För detta ändamål, DNA sekvensen av OSM och LIF erhölls och regionen för kodning aminosyra som motsvarar BC slingan identifierades för båda cytokiner och ersättas (figur 4). En 6-histidin tagg införlivades dessutom C-terminus att underlätta nedströms protein rening. Nästa, en lämplig vektor däggdjur uttryck (pCAGGS) valdes och unik begränsning platser inom sin flera kloning plats var utvalda (PacI och AscI) efter att säkerställa att de inte var närvarande i gensekvensen chimära (se steg 2.1.1.).
Primers var utformade som visas i tabell 4. Den N-terminala framtida OSM primern ingår en ledande sekvens av 9 baspar, följt av webbplatsen PacI begränsning, distanshylsa plasmid-specifika och de inledande 27 baspar av OSM. C-terminal reverse primer ingår ledande sekvensen följt av webbplatsen AscI begränsning, distanshylsa och 27 sista basparen av genen, vilket i detta fall motsvarade C-terminal histidin etiketten. Dessutom krävdes 30-baspar primers spanning knutpunkterna BC slingan i både framåt och bakåt riktlinjer.
Det första PCR-amplifiering steget bestod av tre separata reaktioner. N-terminala OSM fragmentet, vilket krävde N-terminala OSM framåt och BC start omvänd primers, begagnade OSM som mall. LIF BC slingan erhölls genom BC start framåt och BC slutet omvänd grundfärger med LIF som mall. C-terminal OSM fragmentet används BC slutet fram och C-terminal OSM omvänd primers, samt OSM som mall. Dessa tre fragment, med förväntade storlekar av 385, 75 och 321 baspar respektive kan ses i figur 5A efter separation i en 1% agarosgel.
Dessa renas fragment användes sedan som en mall i andra PCR-reaktionen, tillsammans med N-terminala OSM framåt och C-terminal OSM omvänd primers. Resultatet av denna förstärkning, motsvarar den OSM-LIF BC loop gensekvens och visas i figur 5B. Detta steg följdes av rening, en 4-timmars matsmältning av genen fragmentet och valt plasmid, gelelektrofores och rening, övernattning ligering vid 16 ° C, och omvandling till E. coli XL1-blå. Enskilda plasmider var isolerade och screening av restriktionsenzym matsmältning för korrekt isättning av DNA-fragment (figur 6). Slutligen skickades positiva träffar för sekvensering att verifiera att sekvensen motsvarade avsedda OSM-LIF BC loop chimera innan vidare till proteinuttryck, rening och provning i funktionella analyser6.
Figur 1 : Schematisk framställning av chimära protein generation. (A) chimära designprocessen: efter urval av regionerna som skall utbytas, sekvensen av önskad chimera och nödvändiga primers är konstruerade med hjälp av DNA redigeringsprogram. (B) de viktigaste stegen i generation av chimära proteiner är avbildade. Två steg av PCR-amplifiering producera en chimär gensekvens, som sedan smälts med lämplig begränsning enzymer och sammanskrivna i ett uttryck vektor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Strukturella likheter mellan OSM och LIF. Representation av kristall strukturerar av OSM29 (PDB: 1EVS) och LIF30 (PDB: 2Q7N), tillsammans med en ungefärlig representation av designade chimera. Dessa cytokiner anta en fyra-spiralformade bunt konformation sällskap av loopar. Denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB öglan och D-helix i bindningsställe III av mänskliga Oncostatin M (OSM) krävs för OSM receptor aktiveringen. J. Biol Chem 2018. 18:7017-7029. © författarna6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Jämförelse av OSM och LIF aminosyresekvenser. (A) justering av fullängds amino syra sekvenser av mänskliga OSM och LIF, med BC loop regionen markerad. Asterisker (*) indikerar fullt bevarade rester, kolon (:) motsvarar aminosyror med starkt liknande egenskaper och punkter (.) betecknar de med svagt liknande funktioner. (B) Amino syra ordnar av OSM BC loop chimera, med BC loop regionen OSM ersättas med motsvarande LIF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : DNA-sekvens av OSM BC loop chimera. Sekvens av proteinet chimära OSM. Regionen infogas från LIF är markerad i orange. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Förstärkning av OSM BC loop chimera DNA fragment. (A) resultera från den första PCR-amplifieringen, med band som motsvarar den N-terminala regionen (lane 2), BC loop (lane 3) och C-terminal region (lane 4). (B) resultat från den andra PCR-amplifiering, där de tre banden som erhållits i den första förstärkningen kombineras för att generera OSM chimera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : Insättning av OSM BC loop chimera i plasmiden vektor. Restriktionsenzym rötning av de genererade plasmidsna, med ett lägre band som är närvarande vid ~ 700 baspar som anger rätt införandet av gensekvensen i OSM chimera. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Reagens | Beståndet koncentration | Volym (i 50 µL) |
| Sterilt vatten | till 50 µL | |
| PCR-buffert | 009 | 5 ΜL |
| dNTP | 10 mM | 1 ΜL |
| DMSO | 100% | 1,5 ΜL |
| Forward Primer | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Reverse Primer | 10 ΜM | 1 ΜL |
| Templat-DNA | Variabel | Som krävs för 2,5-12,5 ng av plasmid DNA |
| Phusion High Fidelity DNA-polymeras | 2 enheter/µL | 0,5 ΜL |
Tabell 1: Reagenser krävs för PCR-reaktionsblandningen.
| N-terminala fragment | Chimära införande | C-terminal fragment | |
| Forward Primer | N-terminala framåt | Första korsningen framåt | Andra korsningen framåt |
| Reverse Primer | Första korsningen omvänd | Andra korsningen omvänd | C-terminal omvänd |
| Templat-DNA | Mottagare | Givare | Mottagare |
Tabell 2: Primer och mallar som behövs för generering av ett standard chimära protein.
| Cykel steg | Temperatur | Tid | Antal cykler |
| Inledande denaturering | 98 ºC | 30s | 1 |
| Denaturering | 98 ºC | 10s | 23-25 |
| Glödgning | 68 ° C * | 25s | 23-25 |
| Förlängning | 72 ° C | 30s per kilobase | 23-25 |
| Slutliga förlängning | 72 ° C | 300s | 1 |
| Håll | 4 ° C | ∞ | 1 |
| * Minst 5 ° c lägre än primern smälttemperatur | |||
Tabell 3: PCR-protokoll används för att förstärka de chimär fragment och full chimära proteinet.
| Reagens | Beståndet koncentration | Volym (i 50 µL) |
| Sterilt vatten | till 50 µL | |
| Restriktionsenzym buffert * | 10 X | 5 ΜL |
| Templat-DNA | Variabel | Som krävs för 1 µg av DNA |
| Enzymet #1 | Variabel | 1 ΜL |
| Enzymet #2 | Variabel | 1 ΜL |
| * Säkerställa både enzymer är förenliga med den bufferten som valts | ||
Tabell 4: Komponenter av restriktionsenzym matsmältningen reaktionen.
| Reagens | Beståndet koncentration | Volym (i 20 µL) |
| Sterilt vatten | till 20 µL | |
| T4 DNA-Ligase buffert | 009 | 2 ΜL |
| Vector DNA | Variabel | Som krävs för 40 ng DNA |
| Infoga DNA | Variabel | Som krävs för en 3:1 molar förhållandet |
| T4 DNA-Ligase | Variabel | 1-2 ΜL |
Tabell 5: Reagenser krävs för ligering reaktionen.
| Namn | Primer sekvens |
| N-terminala OSM framåt primer (PacI) | AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG |
| C-terminal HisTag reverse primer (AscI) | TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG |
| BC slinga start framåt | AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC |
| BC loop Starta omvänd | GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT |
| BC loop slutet fram | GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC |
| BC loop slutet vända | GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC |
Tabell 6: Primers används i generation av OSM BC loop chimera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av chimära proteiner utgör en mångsidig teknik, vilket kan gå bortom gränserna för trunkerade proteiner att hantera frågor såsom Modulariteten av cytokin-receptor bindande domäner13. Utformningen av chimärer är ett viktigt steg i denna typ av studier och kräver noggrant övervägande. Preliminära studier för att fastställa funktionella domäner kräver generellt substitution av breda regioner i en första fas, medan mindre ersättare av variabla längder är mer lämpade för detaljerade studier av en enda region. Särskild uppmärksamhet bör ägnas förekomsten av små bevarade motiv inom en protein familj i det här steget eftersom dessa är ofta vägledande av funktionella platser31,32. Personliga erfarenheter visar att mer än en omgång chimära protein design kan vara nödvändigt för att begränsa en viktiga funktionella region, med varje omgång som kräver betydande tid (veckor till månader) från inledande design till funktionella test.
Så länge det finns ett strukturellt likartade protein till proteinet av intresse, men som har olika biologiska funktioner, metoden är tillämplig på en sekvens av intresse, även om det har att vara optimerad för varje särskild gen på grund av beroendet av PCR förstärkning. Särskilt, gener som har GC-rika regioner kan visa sig särskilt utmanande mål, eftersom dessa typer av sekvenser är kända för att minska effektiviteten i de förstärkning33. Dessa problem kan oftast lösas på olika sätt, till exempel tillägg av olika tillsatser (t.ex. betain) till reaktion, användning av specialiserade DNA-polymeras buffertar eller ändring av glödgning parametrar34. Därför kommer generellt kräva några försök och misstag innan tillräckliga villkor för gen av intresse finns.
Protokollet som tillhandahålls är baserat på klassiska restriktionsenzym-kloning metoder, som är allmänt tillgängliga för varje typ av laboratorium, men det kan ytterligare anpassas för att kunna utnyttja mer avancerade kloningsteknik. Till exempel använder gateway kloning, skulle vilket underlättar kloning samma vändskär i flera olika vektorer (t.ex. om olika uttryck system ska testas parallellt), bara kräva viss attB rekombination platser på plats begränsning platser beskrivs i detta protokoll35. Andra nyare kloning metoder kan kringgå behovet av en andra PCR-reaktion (t.ex. användaren36 eller Gibson montering37) och ligatur (t.ex. sekvens och ligation-oberoende kloning (SLIC)38 eller i-fusion församling 39). samtidigt kräver olika reagenser och primer designstrategier, läsare med tillgång till dessa metoder uppmuntras att tillämpa dem för att betydligt snabbare generering av chimära konstruktioner efter efter de grundläggande konstruktionsprinciperna detaljerad i steg 1 i detta protokoll.
Sammantaget kan en tillämpning av denna metod leverera värdefull insikt om de mekanismer genom vilka andra protein biologiska funktioner sker, särskilt med protein-protein eller protein-nucleic acid interaktioner, och utgör ett användbart verktyg för att identifiera och ange unika struktur-funktionssamband inom en protein familj6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet och Schüchtermann-kliniken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB öglan och D-helix i bindningsställe III av mänskliga Oncostatin M (OSM) krävs för OSM receptor aktiveringen. J. Biol. Chem. 2018. 18:7017-7029. © författarna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
