Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması

Published: January 8, 2019 doi: 10.3791/58786
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Cardiac Development and Remodelling, Max Planck Institute for Heart and Lung Research, 2Partner site Rhein-Main, German Centre for Cardiovascular Research (DZHK)

Summary

Yapısal olarak ilişkili proteinler sık sık farklı Biyolojik işlevleri uygulamak. Eşdeğer chimeric proteinleri oluşturmak için bu proteinler bölgelerinde alışverişi için onların fonksiyonel sapma sorumludur kritik protein bölgeleri tanımlamak için yenilikçi bir yaklaşım oluşturmaktadır.

Abstract

Bu iletişim kuralının amacı chimeric proteinler içinde ayrı bir protein bölgelerinde yapısal olarak benzer bir protein karşılık gelen onların serilerinde bu bölgeleri işlevsel önemini belirlemek için değiştirilir tasarımını kapsar. Böyle chimeras örtüşen DNA parçalarının kullanan bir iç içe geçmiş PCR protokolü aracılığıyla oluşturulur ve yeterince astar, onların ifade yerli ikincil yapı ve translasyonel modifikasyonlar sağlamak için bir memeli sistemi içinde ardından tasarlanmış.

Farklı bölge işlevsel rolü sonra Chimera uygun okuma tahlil aktivite kaybı simgesiyle gösterilir. Sonuç olarak, hangi daha fazla moleküler çözünürlüğünü artırmak için tamamlayıcı teknikleri tarafından (Örneğin site yönettiği mutagenesis) taranması bölgeleri barındıran kritik amino asitler kümesi tanımlanır. Farklı fonksiyonları ile yapısal olarak ilgili bir protein bulunabilir durumlarda sınırlı olmasına rağmen chimeric proteinler başarıyla proteinler sitokinler ve sitokin reseptörleri gibi bölgelerde kritik bağlama tanımlamak için istihdam edilmiştir. Bu yöntem özellikle protein'ın fonksiyonel bölgeleri iyi tanımlanmış olmayan durumlarda uygundur ve faiz bölgeleri dar ve tarama çaba dahil azaltmak için yönlendirilmiş evrim yaklaşımlar içinde değerli bir ilk adım teşkil etmektedir.

Introduction

Proteinler, sitokinler ve büyüme faktörleri, dahil olmak üzere çeşitli türleri üyeleri benzer üç boyutlu yapılar paylaşmak ama farklı biyolojik fonksiyonlar1,2kez sarfetmek ailelerde gruplandırılır. Bu işlevsel çeşitlilik genellikle amino asit kompozisyonu molekül'ın etkin sitelere3içinde küçük farklılıklar sonucudur. Tür siteler ve fonksiyonel belirleyicileri tanımlaması sadece sağlamıyorsa değerli evrimsel bakış açısı aynı zamanda daha açık agonistleri ve inhibitörleri4tasarlamak için. Ancak, sık sık ilgili Yapısal proteinler arasında bulunan kalıntı kompozisyon farklılıkları çok sayıda bu görevi zorlaştırmaktadır. İçeren büyük kütüphaneler inşa mutantlar yüzlerce günümüzde her tek kalıntı varyasyon değerlendirilmesi mümkün olsa bile ve bunların birleşimleri hala zor ve zaman alıcı çaba5kalır.

Büyük protein bölgeleri işlevsel önemini değerlendirme teknikleri böylece değerli için yönetilebilir numarası6mümkün artıkları sayısını azaltmak için. Kesilmiş proteinler bu sorunu çözmek için en çok kullanılan yaklaşım olmuştur. Buna göre bölgeler altında eğitim protein işlevi belirli bölge7,8,9silme tarafından etkileniyorsa işlevsel olarak ilgili olarak kabul edilir. Ancak, bir büyük bu yöntem silme protein'ın ikincil yapı, misfolding, toplama ve yetersizlik hedeflenen bölge eğitim için giden etkileyebilir kısıtlamasıdır. Sitokin oncostatin M (OSM) bir iç silme 7 artıkları daha fazla olamazdı bir misfolded mutant sonuçlandı daha büyük10okudu, kesilmiş bir sürümü iyi bir örnektir.

Chimeric proteinlerin üretimi daha büyük protein bölgeleri analizine izin veren bir alternatif ve yenilikçi yaklaşım oluşturmaktadır. Bu yöntem, belirli Biyolojik işlevleri yerine bölümlerine katkısını değerlendirmek için başka bir protein, yapısal olarak Ilgili sıralarının tarafından bir protein ilgi bölgelerinde değişimi için hedeftir. Reseptörleri işlevsel etki alanları11,12tanımlamak için sinyal alanında yaygın olarak kullanılan, chimeric proteinler protein aileler küçük amino asit kimlik ama korunmuş ikincil yapısı ile çalışmak özellikle yararlıdır. Uygun örnekler interlökin-6 ve silier nörotrofik faktör (% 6 sıra kimlik)13 ya da lösemi inhibitör faktörü (LIF) ve OSM (% 20 kimlik)6, hangi gibi interlökin-6 (IL-6) türü sitokinler, sınıfta bulunabilir protokol sonrası dayanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. chimeric Protein tasarımı

  1. Uygun protein (donör protein ideal aynı protein ailesine ait, ama okuma kullanılmak üzere biyolojik aktivitesi eksik yapısal olarak benzer olmalıdır faiz (alıcı) protein bölgeleriyle değişimi için donör) seçin. Yapısal olarak ilgili hiçbir proteinler biliniyorsa, potansiyel adaylar bu uçsuz vektör hizalama arama aracı (bucaksız)14,15 gibi otomatik bir araç kullanarak belirlenebilir
    1. Protein veri Bankası (PDB)16 Avrupa Web sitesi (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/) erişmek, protein ilgi sağ üst köşesindeki Arama kutusuna adını tanıtmak ve 'Ara ''yı tıklatın. Koşuluyla bir kristal yapısı kullanılabilir değil PDB tanımlayıcı (PDB kimliği; Örneğin 1evs OSM için).
      Not: PDB yapısal veri yoksa, Homoloji manken protein SWISS-MODEL17 gibi bir aracı tarafından yerine, kullanılabilir adım adım protokolleri18kullanarak oluşturulmuş.
    2. BÜYÜK web sitesi (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/VAST/vast.shtml) erişim. PDB kimliği kullanılabilir olması durumunda, 'önceden hesaplanan sonuçları al' bölümüne, imput 'İçin benzer yapıları göstermek' kutusundaki PDB kimliği gidin ve 'Go' tıklatın. Aaıdaki ekran görüntüsünde, 'Orijinal geniş' ve ardından 'Tüm zinciri' potansiyel yapısal olarak benzer adaylar için PDB kimliklerini görmek için tıklayın.
      1. PDB ID kullanılamaz, ancak bir Homoloji model oluşturulan 'Ara yeni yapısı ile' bölümüne gidin ve "Büyük arama" linkine tıklayın. PDB dosyasını modeli 'Gözat' 'Göndermek PDB dosyasını yanındaki', dosyayı seçerek ve 'Gönder' tıklatarak tarafından upload.
      2. Sonra PDB dosya yüklenir, büyük hesaplama başlatmak için 'Başlat' düğmesini tıklatın. Hesaplama yürütüldükten sonra yapısal olarak benzer proteinlerin PDB kimliklerini görmek için etki altında 'tüm zinciri' tıklayın.
    3. En iyi aday, ya deneysel olarak sistemindeki okuma seçim ya da bir edebiyat arama yoluyla (Örneğin reseptörü harekete geçirmek, enzimatik aktivite, transkripsiyon faktörü etkinlik) ilgi Biyolojik işlevleri değerlendirmek. Bir donör protein ile ilgi protein ile karşılaştırıldığında farklı görev seçin.
  2. Alıcı ve verici proteinler protein amino asit dizisi başvuru sırası (RefSeq) veritabanı19 edinin.
    1. RefSeq Web sayfası (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene) gen bölümünde erişmek, protein ilgi arama kutusuna adını yazın ve 'Ara ''yı tıklatın. Gen adı bulunan listesinde istediğiniz türlere tıklayın.
    2. Tüm belgelenmiş izoformlarının görmek için RefSeq bölümüne gidin. Sıra tanıtıcısı izoformu (NM ile başlayan) ilgi için tıklayın, sayfayı aşağı kaydırın ve 'gen, protein Kodlayıcı bölge vurgulamak için CD'ler üzerinde' tıklatın. Ekranın alt sağda 'FASTA' tıklatın ve gen dizisi kopyalayın.
    3. Düzenleme yazılımı uygun bir DNA'yı kullanarak DNA dizisi kaydedin. Serbestçe kullanılabilir maymun20kullanırken, programı açın, kopyalanan sıra boş kutusuna yapıştırın, sıra adı seçin ve 'Kaydet' seçeneğini tıklatın.
      Not: 1.2.1 adımları yineleyin. 1.2.3 için. Seçili bir veya daha fazla donör proteinler için.
  3. Farklı chimeric yapıları yerine kullanılacak protein bölgeleri seçin.
    1. Faiz farklı yapısal bölgelerde protein dizi bölün. İdeal olarak, söz konusu protein için farklı etki alanları literatürde tarif. Yoksa, ayrı korunmuş yapısal özellikleri (sarmal, döngüler) varlığını adımları 1.3.1.1 değerlendirilmelidir. 1.3.1.4 için.
      1. Yapısal veri ilgi proteinin PDB Web sitesinden indirin (bkz. Adım 1.1.1.). Protein için PDB sayfaya erişmek ve ekranın sağ tarafında 'İndir' tıklatarak PDB dosyasını karşıdan yükleyin.
      2. PyMOL (https://pymol.org/) gibi bir moleküler görselleştirme sisteminde PDB dosyasını açın. PyMOL içinde nükleotid dizisi görüntülemek (görüntü tıklayarak > sıra üzerinde), (H PDB kimliği yanında, tıklatıp 'her şey' seçerek) varsayılan yapısal verileri gizleme ve açıkça protein'ın yapısal görselleştirmek için 'karikatür' görünümü seçin (PDB kimliği yanındaki S tıklatıp 'karikatür') özellikleri.
      3. Nükleotid dizisi her ayırt edici yapısal özelliği için karşılık gelen amino asitler aşağı belirterek molekülü, farklı kısımlarını vurgulamak için ekranın üstündeki tıklayın.
    2. Maymun DNA sırayla farklı yapısal bölgelerde açıklama ekleyin. Bunu yapmak için adım 1.2.3 DNA dizisi açın., bölge amino asitler için kodlama nükleotit seçin, seçimi sağ tıklatın ve 'Yeni şekil' bir ad ve bir renk vermek için seçin. Önceki adımda belirlediğiniz yapısal her bölge için işlemi tekrarlayın.
      Not: Nükleotit seçim ORFs tıklayarak çift > doğru amino asit dizisi için kod sağlamak için Translate, sonra Tamam,'ı tıklatmak.
    3. Bir protein hizalama araç (Örneğin Clustal Omega21) istihdam iki protein kalıntı dizisi hizalayın.
      Not: chimeras memeli ifade sisteminde üretilmesi için olduğundan, bu dizilere proteinler sinyal peptidler içermelidir.
      1. 1.2.3 adımından DNA dizileri açarak ApE, donör ve reseptör proteinler tam amino asit dizisi elde edilir., seçme onları ve ORFs'ı > çevir.
      2. Clustal Omega Web sayfası (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) erişmek ve imput iki protein, amino asit dizisi sonra sayfayı aşağı kaydırın ve 'Gönder' seçeneğini tıklatın. Her sıra proceded içeren bir metin satırı tarafından olmalıdır ' > ProteinName' düzgün tespit edilmesi...
      3. 'Download hizalama dosya' sekmesini tıklatarak hizalamayı dosya almak ve kaydetmek. Bu dosya herhangi bir metin düzenleme programı tarafından açılabilir.
      4. Hizalama dosya bir referans olarak kullanarak açıklama onların DNA dizisi donör protein karşılık gelen yapısal bölgelerinde (bkz. Adım 1.3.2.).
    4. Hangi protein bölgelerine chimeric proteinler arasında döviz ve chimeras uygun nükleotit dizileri tasarım karar.
      Not: farklı bölgelerin fonksiyonel önemi ile ilgili ayrıntılı bilgi yokluğunda, bu tüm döngüler gibi büyük oyuncu değişikliği seçmek için önerilmektedir veya sarmal hangisinin değerlendirmek için protein işlevi üzerinde etkisi. Bu ilk keşif deneme sonra ilgili bölgeleri içinde daha küçük oyuncu değişikliği üzerinde duruldu chimeric protein tasarımının ikinci tur tarafından takip edilebilir.
      1. Reseptör protein ek açıklama eklenen DNA sırasının bir kopya--dan adım 1.3.2 oluşturun. ve bir chimeric protein yeniden adlandırın. Yeniden adlandırılan DNA dizisi maymun içinde açın, seçin ve nükleotid sırası değiştirilebilmesi ve eski yerine koymak o (1.3.3. adımda oluşturduğunuz ek açıklama eklenen sırasından kopyalanır.) donör protein karşılık gelen bölge tarafından daha sonra değişiklikleri kaydetmek bölge için kodlama silin.
        Not: yeni bir kopya oluşturun ve her farklı chimera tasarlanmış için bu adımı yineleyin.

2. moleküler klonlama için hazırlık

  1. Plazmid vektör seçim ifade sistemi için uygun seçin. Memeli ifade için bir yüksek-ifade vektör pCAGGS22 gibi veya pcDNA vektör serisi tavsiye edilir.
    1. Restriksiyon enzimi tabanlı bu protokol için gösterdiği klonlama için benzersiz kısıtlama siteleri birden çok klonlama sitedeki Yöneyin (MCS) mevcut faiz protein ile uyumlu olduğundan emin olun. Bunu yapmak için DNA dizisi chimeric yapıları, maymun ile açın, ' enzimler > enzim Seçici ' ve en az iki MCS kısıtlama sitelerin eksik olduğundan emin olun (adlarının yanında sıfır görüntüleme) sıra.
  2. Maymun gibi bir DNA Düzenleyicisi kullanarak terminal astar tasarım.
    1. Yeni bir DNA dosya oluşturun (Dosya > Yeni) vector öğesinin MCS (6-8 baz çifti, Örneğin TTAATTAA PacI için), seçilen ilk kısıtlama siteyi takip N-terminal astar bir lider sıra (3-9 İlave baz çifti, e.g. AAAGGGAAA), ile başlatmak ve bir isteğe bağlı rondela (Örneğin GCTAGCGCATCGCCACC pCAGGS vektör kullanılmış örnekte) ve faiz (Örneğin ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG için OSM) gen ilk 18-27 baz çifti.
    2. Yeni DNA dosyasında, C-terminal astar sırası ile final 18-27 baz çifti ilginç (e.g. CTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA 6xHistidine C-terminal etiketi ile bir gen için), Gen tarafından isteğe bağlı bir spacer takip başlar (Örneğin TAGCGGCCGC içinde pCAGGS vektör), ikinci kısıtlama site seçilmiş (Örneğin GGCGCGCC AscI için) ve bir lider sıralaması (Örneğin AAAGGGAAA). Tüm sıra vurgulamak, sağ tıklayın ve 'Ters ters astar elde etmek için tamamlama' seçin.
  3. Beher-in chimeric yapıları sınır bölgelerinde tasarım astar.
    1. DNA dizisi Chimera (1.3.4.1. adımda oluşturduğunuz.) açın ve orijinal ve eklenen diziler temas halinde oluşan 15 baz çifti her serisinin nerede bölge 30 baz çifti bölgede vurgulayın. Bölge (sağ tıklayın ve seçin 'Kopya') kopyalayıp yeni bir DNA dosya yapıştırın; Bu dizi ileri astar olacaktır.
    2. Adım ve ters astar yeniden adlandırın önceki oluşturulan ileri astar kopyalayın. Astar sıra vurgulamak, sağ tıklayın ve 'Ters-tamamlayıcı' ters astar sıra oluşturmak için seçin.
    3. 2.3.1 adımları yineleyin. ve 2.3.2. chimeric DNA dizisi her temas bölgesi için. N-terminal veya C-terminal bölgelerde bu değişiklik yapılır sürece genellikle, ileri/geri astar iki kümesi bir chimera oluşturmak için gereklidir.
  4. Terminal ve iç astar bir oligonükleotid sentez sağlayıcısı'ndan sipariş.
    Notlar: Son derece kullanarak saf terminal astar (Örneğin HPLC saf) protokolün başarı oranı olumlu bir etkisi olabilir. Desalted iç astar genellikle iyi sonuçlar sağlar.
  5. Donör ile reseptör gen dizilerinin şablonu edinin.
    Not: bu dizilere açık okuma çerçevesi (ORFs) içeren bir şablon olarak büyük ölçüde plazmid istihdam yordamı kolaylaştırır ve tavsiye edilir. Alternatif olarak, bu genlerin ifade etmek için bilinen bir hücre satırından oluşturulan tamamlayıcı DNA (cDNA) sonraki adımlar için şablon olarak kullanılabilir.

3. polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon Chimera oluşturan bireysel DNA parçalarının

  1. Bireysel bir PCR reaksiyon karışımı her chimeric protein beste parçaları için hazır olun. Tipik bir chimeric protein üç bireysel parçaları gerektirir: N-terminal bölümü, eklenecek bölge ve C-terminal bölümü.
    Notlar: Bir yüksek-sadakat DNA polimeraz (Örneğin Phusion High Fidelity DNA polimeraz) mutasyonlar sıra tanıtımı önlemek için kullanın. PCR reaksiyon akşam ayarlayabilir ve gecede çalıştırın.
    1. 1.5 mL microfuge tüp buz ve damlalıklı Tablo 1' de gösterilen sırayla PCR karışımları farklı reaktifleri kümesi sağlamak doğru astar ve şablonları her PCR reaksiyon için istihdam edilmektedir (bkz. Tablo 2).
    2. İki 0.2 mL ince duvarlı PCR tüpleri her reaksiyon için etiket ve her tüpün içinde karşılık gelen PCR karışımı 20 µL aktarın. PCR tüpleri bir PCR thermocycler transferi ve Tablo 3' te ayrıntılı Protokolü başlatın.
      Not: tavlama sıcaklığı en az 5 derece erime sıcaklığı daha düşük tasarlanmış astar olmalıdır.
  2. PCR çalışırken, 100 mL % 1'özel jel Tris-asetat-EDTA (TAE) arabelleği hazırlayın. Bu amaçla, özel 1 g ağırlığında, TAE arabellekte bir cam şişe 100 mL ile karıştırın ve özel tamamen şişeye 30-40 saniyede dönen eriyene kadar mikrodalga. Yaklaşık 50 ° C'ye soğutma izin ver, 2-3 µL etidyum bromür, (ya da eşdeğer bir DNA boya) ekleyin ve istediğiniz iyi tarak jel tepsiye dökün.
    Dikkat: etidyum bromür bilinen bir alkil, uygun koruyucu ekipman kullanımı sağlamak.
  3. 6 x DNA yükleme arabelleği 4 µL PCR reaksiyon tamamlandıktan sonra her tüpte ekleyin. % 1'özel jel elektroforez biriminde Ekle, TAE arabellek ile kapak ve dikkatle jel ile birlikte bir molekül ağırlığı merdiven içine örnekleri yükleyin.
    Not: yükleme saatinde boş şerit daha sonra DNA kurtarma kolaylaştırmak için örnekleri arasında bırakmak için tercih edilir.
  4. Jel 80-120 V adlı 20-45 dakika çalıştırın.
    Not: daha büyük gruplar daha uzun çalışan kez gerektirirken bantları 1.000 baz çifti altında genellikle yaklaşık 20 dakikada 120 V, electrophoresed.
  5. Elektroforez birim açmak, özel jel almak ve UV ışığı altında güçlendirilmiş DNA bantları görselleştirmek. Bir tıraş bıçağı kullanarak, jel üzerinden bireysel DNA parçalarının kesip ve etiketli 2 mL microfuge tüpler için aktarmak.
    Not: DNA hasarı önlemek için UV ışık pozlama süresini en aza indirmek.
  6. Bir PCR temizlik kullanın (bkz. Tablo reçetesi) farklı DNA parçalarının arındırmak için kit.
    1. Bir jel parçası içeren her tüp seti tarafından sağlanan NTI arabelleği 500 µL ekleyin. Bir thermomixer 50-55 ° c ve jel ara belleğe tamamen eriyene kadar 1000 devir / dakikada sallayarak aktarın.
    2. Her çözüm için etiketli kiti sütun aktarım, bir microcentrifuge (30-60'lar, 11.000 x g) spin ve flowthrough atın. Kit'in NT3 yıkama arabelleği 700 µL ekleyin, tekrar aynı ayarları altında santrifüj kapasitesi ve flowthrough atın. Sütun 1-2mins silis membran sütun içinde kurumaya 11.000 x g de için tekrar santrifüj kapasitesi.
    3. Sütun etiketli 1.5 mL microfuge Tube, damlalıklı 30 µL nükleaz ücretsiz su ve 30-60'ların DNA elute için 11.000 x g, santrifüj kapasitesi 1 dakikalığına stand izin sütun içine aktarın.
  7. DNA örneği 260'absorbans ölçerek kurtarılan miktarını ölçmek nm ve 340 nm bir spektrofotometre ( Tablo malzemelerigörmek). DNA toplama sonucu DNA'ın yok olma katsayısı (50 µg/mL)23tarafından çarparak 260 nm rakam 340 nm okunurken çıkarılarak hesaplanır.
    Notlar: Ek ölçümler at 230 nm ve 280 nm DNA saflık değerlendirilmesi için izin: 260/280 ve 260/1.8 yukarıda 230 oranları genellikle kabul kadar saf DNA örneği almak için. Protokol bu adım 4 ° C (kısa vadeli) veya-20 ° C (uzun dönem) eluted DNA depolamak sonra duraklatılmış.

4. PCR güçlendirme Chimeric DNA dizisi oluşturmak için

  1. Kadar 50 µL PCR reaksiyon chimera ayrı bileşenlerinin sigorta için ayarlayın. 3.1, N-terminal ve C-terminal astar ile birlikte 10 istihdam ayrıntılı aynı adımları izleyin ng her DNA'ın parçaları içinde elde edilen adım 3.7.
    Not: PCR reaksiyon akşam ayarla ve gecede çalıştırın.
  2. 3.2-3.7 yeniden elde etmek ve 30 µL nükleaz ücretsiz su arıtılmış DNA parçası ölçmek için adımları yineleyin. Bu parçası terminal astar dahil kısıtlama siteleri tarafından çevrili chimeric DNA dizisi içerir.

5. Chimeric DNA içine ekleme bir ifade vektör

  1. Etiket iki 1.5 mL microfuge tüpler ve damlalıklı sırayla farklı reaktifleri 1 µg seçili ifade ekleme Tablo 4' te gösterilen bir tüp ve diğer kurtarılan DNA parçasının 1 µg vektör. 1-4 h 37 ° C'de seçilen enzimleri ile sindirim gerçekleştirmek için kuluçkaya.
    Notlar: Her iki enzimleri istihdam arabellek ile uyumlu olduğundan emin olun. -Dibi takdirde onlar tamamen farklı arabellekleri gerektirir, bu adımları ilk enzimler yalnızca birini gerçekleştirmeniz ve tekrarlayın. Sindirim seçili enzimleri bağlı olarak değişebilir için gereken süre: detaylı bilgi için üreticinin yönergelerine başvurun.
  2. Arındırmak ve sindirilmiş DNA parçası ve ifade vektör 30 µL nükleaz ücretsiz su içinde yeniden elde etmek için 3.2 3.7 adımları yineleyin. Daha önce olduğu gibi kurtarılan DNA miktarını ölçmek.
  3. 3:1 Ekle/vektör molar oranı ligasyonu reaksiyon için gerekli Ekle DNA aşağıdaki denklemi kullanarak tutarını hesaplar.

    Ekle (ng) Molar oranı = * vektör (ng) * (bp) boyutu eklemek / vektör boyutu (bp)

    Not: genellikle 3:1 oranında yeterli sonuçları elde etmek yeterli olsa da farklı Ekle/vektör molar oranları, test edilebilir.
  4. Bir 1.5 mL microfuge tüp ligasyonu tepki 20 µL 40 ile kurmak ng ifade chimeric DNA adım 5.3, arabellek ve Tablo 5' te belirtilen sipariş takip T4 DNA ligaz hesaplanan miktarı vektör ve gecede 16 ° C'de kuluçkaya
    Not: Tüp ligasyonu verimliliği genellikle reaksiyon gecede 16 ° C'de gerçekleştirerek artmış ama alternatif olarak tepki için 2 h oda sıcaklığında inkübe.
  5. 5-10 µL kimyasal olarak yetkili Escherichia coli (e.coli) içine tüp ligasyonu karışımı standart protokoller24 Grow seçimi tabak içinde takip hazırlanan ve tek kolonileri genişleme ve plazmid DNA örneği almak için seçin dönüştürme yalıtım göre kurulan iletişim kuralları25.
    Not: E. coli XL1-mavi zorlanma bu iletişim kuralı için istihdam edildi, ancak diğer E. coli türevleri de kullanılabilir.
  6. Adım 5.1 konusunda belirtilen talimatları izleyerek uygun enzimleri ile izole plazmid 1 µg sindirmek ve DNA grubu tarafından bir özel jel elektroforez chimeric dizisine karşılık gelen bir boyutta varlığını değerlendirmek (bkz: adımlar 3.2-3.5).
    Not: Eklenen sıra bir DNA sıralama hizmet aracılığıyla doğrulanır önerilir.
  7. Başarılı sıra doğrulama plazmid daha büyük miktarlarda üretilen ve bir memeli ifade sisteminde aşağıdaki köklü protokolleri26,27tarafından istihdam.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İnşaat ve üretimi chimeric protein (Şekil 1) örneği iki üyesi interlökin-6 sitokin aile ile OSM ve LIF, kısa bir süre önce çalışma6konuydu. Şekil 2 bu proteinler üç boyutlu yapısını gösterir. Her iki molekül ben sitokinler, dört sarmal (A-D olarak adlandırdığı) ile bir paket içinde paketlenmiş ve döngüler28tarafından katıldı sınıfının karakteristik ikincil yapı benimsenmesi. Hizalanmış amino asit yapıları insan proteinlerin Şekil 3' teAgörülebilir. Bu örnekte, OSM BC döngü bölge Şekil 3' teBgösterilen amino asit dizisi ile bir OSM-LIF chimera oluşturmak için karşılık gelen LIF sıra tarafından alışverişinde.

Bunun için amaç, OSM ve LIF DNA dizisi elde edilmiştir ve BC döngü için karşılık gelen kodlama amino asit bölge her iki sitokinler tespit edildi ve (Şekil 4) ile değiştirildi. 6-histidin etiketi ayrıca C-aşağı akım protein arıtma kolaylaştırmak için terminus dahil oldu. Ardından, memeli ifade (pCAGGS) için uygun bir vektör seçildi ve benzersiz kısıtlama siteler içinde birden çok klonlama sitesinde vardı seçilen (PacI ve sivil savunma) onların chimeric gen sırayla mevcut olmadığını kontrol ettikten sonra (bkz. adım 2.1.1.).

Astar gösterildiği gibi tasarlanmıştır Tablo 4. N-terminal ileri OSM astar 9 baz çifti PacI kısıtlama sitesi, plazmid özel ayırıcı ve OSM ilk 27 baz çifti tarafından takip, önde gelen bir dizi dahil. C-terminal ters astar AscI kısıtlama sitesi, ayırıcı ve bu özel durumda denk C-terminal histidin etiketi için gen 27 son baz çifti ardından önde gelen sıra dahil. Buna ek olarak, 30-baz çifti astar BC döngünün birleşim noktaları kapsayan ileriye ve geriye doğru yönler gerekli idi.

İlk PCR güçlendirme adım üç ayrı reaksiyonları oluşuyordu. N-terminal OSM ileri ve BC başlangıç ters astar gerekli, N-terminal OSM parçası, şablon olarak kullanılan OSM. LIF BC döngü BC Başlat ileri ve BC sonunda ters astar LIF şablon olarak kullanıp yoluyla elde edildi. C-terminal OSM parçası BC son ileri ve C-terminal OSM ters astar yanı sıra OSM şablon olarak kullanılır. 385, 75 ve 321 baz çifti beklenen boyutları ile bu üç parçaları sırasıyla, % 1'özel jel ayrılmaya sonra Şekil 5içindeA görülebilir.

Bunlar saf parçaları kullanıldı sonra bir şablon ile birlikte N-terminal OSM ileri ikinci PCR reaksiyon ve C-terminal OSM astar tersine çevirmek gibi. OSM-LIF için karşılık gelen bu amplifikasyon sonucu BC döngü gen dizisi ve Şekil 5' teBgösterilir. Bu adımı arıtma, 4 saatlik sindirim gen parça ve seçilen plazmid, Jel Elektroforez ve arıtma, 16 ° C ve E. coli XL1-mavi dönüşmenin gecede ligasyonu izledi. Bireysel plazmit izole ve Restriksiyon enzimi sindirim için DNA parçasının (Şekil 6) uygun ekleme tarafından tarandı. Son olarak, pozitif sayısı için sıralama sırası protein ifade, arıtma devam ve fonksiyonel deneyleri6' test önce hedeflenen OSM-LIF M.Ö. döngü chimera denk doğrulamak gönderildik.

Figure 1
Resim 1 : Chimeric protein üretimi şematik gösterimi. (A) Chimeric tasarım süreci: değiştirilebilmesi için bölge seçimden sonra istenen chimera ve gerekli astar dizisi DNA düzenleme yazılımı ile inşa edilir. (B) chimeric proteinlerin üretimi önemli adımlar tasvir edilmektedir. PCR güçlendirme iki adımdan sonra uygun enzimleri ile sindirmek ve bir ifade vektör bakmaksızın chimeric gen sırası üretmek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : OSM ve LIF arasındaki yapısal benzerlikler. Kristal yapıları OSM29 gösterimi (PDB: 1EVS) ve LIF30 (PDB: 2Q7N), ile birlikte yaklaşık gösterilişinin tasarlanmış Chimera. Bu sitokinler döngüler tarafından katıldı bir dört-helisel paket biçimi benimsenmesi. Bu araştırmanın ilk biyolojik Kimya Dergisi yayımlandı. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB döngü ve D-helix bağlama site III insan Oncostatin M (OSM) OSM reseptörü harekete geçirmek için gereklidir. J. Biol Kimya 2018; 18:7017-7029. © yazarlar6. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : OSM ve LIF amino asit dizileri karşılaştırılması. (A) insan OSM ve LIF, tam uzunlukta amino asit dizileri ile vurgulanan BC döngü bölge hizalaması. Yıldız işareti (*) belirtmek tamamen korunmuş artıkları, amino asitler şiddetle benzer özelliklere sahip için karşılık iki nokta üst üste (:) ve nokta (.) Bu zayıf benzer özellikleri ile göstermek. LIF muadili tarafından yerine OSM BC döngü bölgesi ile (B) Amino asit dizisi OSM BC döngü Chimera. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : DNA dizisi OSM BC döngü Chimera. Chimeric OSM protein dizisi. LIF eklenen bölge turuncu renkte vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : OSM BC döngü chimera DNA amplifikasyon parçaları. (A) N-terminal bölgesi (lane 2), BC döngü (lane 3) ve C-terminal bölgesi (lane 4) karşılık gelen gruplar ile ilk PCR güçlendirme neden. ((B)) üç grup ilk amplifikasyon elde edilen ikinci PCR güçlendirme sonucunda OSM chimera oluşturmak için birleştirilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Plazmid vektör içine OSM BC döngü Chimera ekleme. OSM chimera gen dizisinin doğru ekleme gösteren ~ 700 baz çifti mevcut bir alt grubu ile oluşturulan plazmid Restriksiyon enzimi sindirim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktif Hisse senedi toplama Hacmindeki (50 µL)
Steril su 50 µL
PCR arabellek 10 X 5 ΜL
dNTPs 10 mM 1 ΜL
DMSO % 100 1,5 ΜL
İleri astar 10 ΜM 1 ΜL
Ters astar 10 ΜM 1 ΜL
Şablon DNA Değişken Plazmid DNA 2.5-12,5 ng için gerektiği gibi
Phusion yüksek sadakat DNA polimeraz 2 adet/µL 0.5 ΜL

Tablo 1: reaktifler PCR reaksiyon karışımı için gerekli.

N-terminal parçası Chimeric ekleme C-terminal parçası
İleri astar N-terminal ileri İlk birleşme ileri İkinci kavşak ileri
Ters astar İlk bağlantı ters İkinci kavşak ters C-terminal ters
Şablon DNA Alıcı Donör Alıcı

Tablo 2: Astar ve şablonları standart chimeric protein üretimi için gerekli.

Döngüsü adım Sıcaklık Zaman Döngü sayısı
İlk denatürasyon 98 ºC 30'lu 1
Denatürasyon 98 ºC 10s 23-25
Tavlama 68 ºC * 25s 23-25
Uzantısı 72 ºC 30'lu kilobaz başına 23-25
Son uzantısı 72 ºC 300s 1
Basılı tutun 4 ºC ∞ 1
* En az 5 ºC sıcaklık erime astar düşük

Tablo 3: PCR chimeric parçaları ve tam chimeric protein yükseltmek için kullanılan iletişim kuralı.

Reaktif Hisse senedi toplama Hacmindeki (50 µL)
Steril su 50 µL
Restriksiyon enzimi arabellek * 10 X 5 ΜL
Şablon DNA Değişken DNA'ın 1 µg için gerektiği gibi
Enzim #1 Değişken 1 ΜL
Enzim #2 Değişken 1 ΜL
* Her iki enzim seçili arabellek ile uyumlu olduğundan emin olun

Tablo 4: Bileşenleri Restriksiyon enzimi sindirim tepki.

Reaktif Hisse senedi toplama Hacmindeki (20 µL)
Steril su 20 µL
T4 DNA ligaz arabellek 10 X 2 ΜL
Vektör DNA Değişken 40 için gerektiği gibi DNA'ın ng
DNA Ekle Değişken 3:1 molar oranı için gerektiği gibi
T4 DNA ligaz Değişken 1-2 ΜL

Tablo 5: birleştirmesini reaksiyon için gerekli reaktifler.

Adı Astar sıra
N-terminal OSM ileri astar (PacI) AAAGGGAAA-TTAATTAA-GCTAGCGCATCGCCACC-ATGGGGGTACTGCTCACACAGAGGACG
C-terminal HisTag ters astar (sivil savunma) TTTCCCTTT-GGCGCGCC-GCGGCCGCTA-TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAG
BC döngü başlangıç ileri AACATCACCCGGGACTTAGAGCAGCGCCTC
BC döngü başlangıç ters GAGGCGCTGCTCTAAGTCCCGGGTGATGTT
BC döngü sonunda ileri GACTTGGAGAAGCTGAACGCCACCGCCGAC
BC döngü sonunda ters GTCGGCGGTGGCGTTCAGCTTCTCCAAGTC

Tablo 6: Astar OSM BC döngü chimera üretiminde kullanılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Chimeric proteinlerin üretimi sitokin reseptör bağlayıcı etki alanları13modüler gibi adres sorular için kesilmiş proteinler sınırları ötesine gitmek mümkün olan bir çok yönlü teknik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Chimeras tasarım çalışmaları bu tür önemli bir adımdır ve dikkatli bir değerlendirme gerektirir. Daha küçük değişiklik, değişken uzunlukta tek bir bölgeye ayrıntılı çalışmalar için daha uygun olmakla birlikte işlevsel etki alanları kurmak için ön çalışmalar genellikle geniş bölgeleri ikame ilk aşamasında, gerektirir. Bunlar kez fonksiyonel siteleri31,32tanesi göstergesidir bu yana özel ilgi bu adımda bir protein ailesi içinde küçük korunmuş motifleri varlığı verilmesi gerekir. Kişisel deneyim gösterir chimeric protein tasarım birden fazla yuvarlak-ebilmek var olmak gerekli bir anahtar fonksiyonel bölge daraltmak için her turda önemli gerektiren ile (ay hafta) ilk tasarım işlevsel tahlil test için zaman.

Sürece faiz protein yapısal olarak benzer bir protein var, ancak PCR üzerindeki güven nedeniyle belirli her gen için optimize edilmiş olsa çeşitlenen biyolojik fonksiyonları sahip, faiz, herhangi bir serisine uygulanan yöntemdir amplifikasyon. Özellikle, bu tür dizileri amplifikasyon33verimliliğini azaltmak için bilinen bu yana GC-zengin bölgeleri sahip genlerin özellikle zor hedefler, kanıtlamak olabilir. Bu sorunlar genellikle farklı katkı maddeleri (Örneğin betan) tepki, özel DNA polimeraz arabellekleri kullanımı veya tavlama parametreleri34değiştirilmesi için eklenmesi gibi farklı bir yöntemle çözülebilir. Gen için yeterli koşulları ilgi bulmadan önce bu nedenle, genellikle bazı deneme ve hata gerektirecektir.

Gelen doğrulama genellikle laboratuvar her türü için erişilebilir olan klasik Restriksiyon enzimi tabanlı klonlama yöntemlerde, dayanır ama bunu daha fazla yararlanmak için daha gelişmiş teknikleri klonlama adapte edilebilir. Örneğin ağ geçidi klonlama kullanarak, hangi birkaç farklı vektörü (Eğer farklı ifade sistemleri paralel olarak test edilmesi içinÖrneğin ), aynı INSERT klonlama kolaylaştırır sadece gerektirecektir belirli attB rekombinasyon siteleri yerde Bu ayrıntılı kısıtlama sitelerin35protokol. Diğer yeni klonlama yöntemlerden bir ikinci PCR reaksiyon (Örneğin Kullanıcı36 veya Gibson derleme37) ve ligasyon (Örneğin sıra ve ligasyonu bağımsız (dilim) klonlama38 veya füzyon derleme ihtiyacını atlayabilir 39). astar tasarım stratejileri ve farklı reaktifler gerektiren, okuyucular bu yöntemler ulaşabilen onları temel tasarım ilkeleri aşağıdaki sonra chimeric yapıları, üretimi önemli ölçüde hızlandırmak için başvuru için teşvik edilir 1. adımda bu protokol ayrıntılı.

Genel olarak, bu yöntem uygulama hangi diğer protein tarafından biyolojik fonksiyonları özellikle protein-protein veya protein nükleik asit arasındaki etkileşimleri içeren gerçekleşecek ve yararlı bir araç teşkil mekanizmaları ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilir tanımlamak ve bir protein aile6içindeki benzersiz yapı-fonksiyon ilişkileri belirtin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Max Planck toplum ve Schüchtermann klinik (Bad Rothenfelde, Almanya) tarafından desteklenmiştir. Bu araştırmanın bir parçası ilk biyolojik Kimya Dergisi yayımlandı. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB döngü ve D-helix bağlama site III insan Oncostatin M (OSM) OSM reseptörü harekete geçirmek için gereklidir. J. Biol. kimyasalları 2018; 18:7017-7029. © yazarlar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Labcycler thermocycler Sensoquest 011-103 Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-2000C  DNA quantification
GeneRuler 100 bp DNA ladder ThermoFisher Scientific SM0241
GeneRuler DNA Ladder Mix ThermoFisher Scientific SM0331
AscI restriction enzyme New England Biolabs R0558
PacI restriction enzyme New England Biolabs R0547
Phusion Hot Start II DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F-549S
dNTP set (100 mM) Invitrogen 10297018
T4 DNA ligase Promega M1804
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit Macherey-Nagel 740609
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock ThermoFisher Scientific MHS6278-202857165
LE agarose Biozym 840004
Primers Sigma-Aldrich Custom order
Human Oncostatin M cDNA Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) 
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
  2. Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
  3. Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
  4. Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
  5. Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
  6. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
  7. Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
  8. Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
  9. Kim, K. -W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
  10. Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
  11. Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. Biochemistry. 42 (18), 5244-5252 (2003).
  12. Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
  13. Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
  14. Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
  15. Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, Database issue 297-303 (2014).
  16. Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
  17. Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, Web Server issue 252-258 (2014).
  18. Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
  19. Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI's LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
  20. Davis, M. W. ApE, A Plasmid Editor. , Available from: http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ (2018).
  21. Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
  24. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  25. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  26. Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
  27. Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
  28. Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
  29. Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
  30. Huyton, T., Zhang, J. -G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
  31. Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
  32. Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
  33. McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
  34. Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
  35. Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
  36. Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
  37. Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  38. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
  39. Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).

Tags

Biyokimya sayı 143 Chimeric proteinler yapısal benzerlik moleküler biyoloji üst üste PCR yapı-fonksiyon analiz protein etki alanları protein-protein etkileşimleri protein bağlama özellikleri
Fonksiyonel Protein bölgeleri Chimeric Protein inşaat aracılığıyla tanımlaması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Adrian-Segarra, J. M.,… More

Adrian-Segarra, J. M., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction. J. Vis. Exp. (143), e58786, doi:10.3791/58786 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter