Summary
左心房狭窄 (las) 是一种新的外科技术, 用于研究2组肺动脉高压 (ph) 和肺静脉动脉化的机制。在这里, 我们提出了一个协议, 以限制左心房使用钛夹, 导致肺静脉动脉化和中度 ph 在大鼠。
Abstract
二尖瓣狭窄引起的肺静脉动脉化和2组肺动脉高压 (ph) 的发病机制尚不清楚。由于二尖瓣狭窄 (ms), 2 组 ph 没有啮齿类动物模型, 有助于疾病机制和潜在治疗策略的研究。本文提出了一种新的大鼠肺静脉充血致肺静脉动脉化和2组 ph 值由左心房狭窄 (las) 引起的模型。las 是通过使用半封闭的钛夹收缩左心房来实现的。las 手术后, 超声心动图中经二尖瓣流入速度大于或等于 2.0 mx 的大鼠模型在8至10周的时间内逐渐形成肺静脉动脉化和第2组 ph 值。在本协议中, 我们提供了如何执行 las 手术的分步过程。提出的 las 大鼠模型类似于人类的 ms, 可用于研究肺静脉动脉化的潜在分子机制和临床前评估2例 ph 的治疗方法。
Introduction
本文的目的是演示如何在大鼠中执行 las 手术的分步过程。手术诱导的 las 在人类中密切模仿 ms 和 cortriatrium, 这涉及到在左心房1产生机械阻塞。左心室 (lv) 流入的阻塞往往导致肺静脉循环充血, 患者逐渐发展为 ph 值。世界卫生组织将左心脏病引起的 ph 分为第2组, 这是最普遍的 ph2、3、4组。左心脏病患者的 ph 值诊断与1年标准化死亡率4的七倍以上的增长有关.目前, 除了治疗潜在的左心疾病 (例如, 手术更换狭窄的二尖瓣) 外, 第2 ph 组还没有经过批准的治疗方法。然而, 即使是有效的二尖瓣置换术, 也不能完全解决mitral患者中 ph 值的问题。这种持续的 ph 值是由于不利的肺血管重塑, 这是很不清楚的。因此, 动物模型对于提高我们对2例 ph 值不利肺血管重塑的潜在分子机制的认识是非常重要的。
2之二一组有几种动物模型, 冠状动脉结扎6、7 和横向主动脉带8,9, 10 是最常用的2之二组 ph 动物模型。这些模型的主要缺点是 lv 的参与, 这使得第2组 ph 研究的结果难以解释。相比之下, lv 在 las 模型中保持不变。此外, las 模型在临床上具有相关性, 因为它导致 ph 值在10周期间的缓慢和逐步发展, 为期10周。在人类中, 如果经二尖瓣多普勒流速大于 2.0mms11,ms 被认为是显著的, 我们也使用这个数字作为一个截止点, 以确定 las 手术是否产生了明显的狭窄。此外, 虽然 las 模型产生轻度或中度 ph 值, 但它表现出典型的组织学变化, 类似于人类患者, 即肺内静脉动脉化11的发展。las 大鼠模型是一种新的临床相关的2组 ph 模型, 具有保留 lv 功能。它适用于研究持续性肺血管重构的病理生理学, 确定分子靶点, 并测试2例 ph 的新疗法。
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Protocol
las 实验协议已获得吉基大学医学院动物护理委员会和大学研究与伦理委员会的批准 (议定书 #2015-118)。
1. 术前准备
- 到达动物设施后, 提供5周大的雄性 sprague dawley 大鼠150至200克, 1周前适应新家。
- 在手术前通过高压灭菌准备以下设备: 1) 小动物呼吸器, (2) 麻醉机, 3) 插管套件 (由一对止血钳、舌头去压器和18g 血管测量仪组成), 4) 手术器械 (其中包括一对弯曲的钳子、一对直钳、一个针头驱动器、一个胸部牵引器、一把剪刀、一个5-0 单丝线、一个夹子施药器、一个中型夹子和一个 23 g 胸管)。
- 有无菌 q 提示和纱布准备处理出血。
- 在手术过程中, 使用加热垫保持动物体温在37°c 左右。
2. 麻醉和气管插管
- 将大鼠置入诱导室, 将5% 异氟醚与 2 lmmin 室内空气混合。
- 插管前, 用剃须刀剃光老鼠的胸毛, 用脱毛霜去除细毛。
- 在插管前检查踏板反射以确认麻醉成功。
- 用绳子钩住门牙, 用两个别针固定绳子。
- 用止血钳打开老鼠的嘴, 将舌头抑制剂插入嘴里。
- 提起舌头抑制器, 使声带显示出来。
注: 它是有帮助的发光在老鼠的头部区域, 以帮助可视化的声带。 - 将 18 g 血管导管作为气管内管插入气管, 然后快速将导管连接到呼吸器。
- 将潮汐体积设置为每克 10μl, 呼吸速率为100呼吸分钟。
- 保持麻醉与2% 异氟醚混合 2 l/min 房间空气。
3. 手术地点的准备
- 准备手术部位与交替擦洗氯己定和酒精 x3。
- 皮下注射丁丙诺非 0.01 mg/kg。
- 用无菌悬垂覆盖老鼠。
- 检查踏板反射, 以确认麻醉的成功插管和维护。
4. 左心房狭窄手术
- 用规则在老鼠左腋窝下方2厘米处标记切口处。
- 用剪刀做一个2厘米的左外侧胸壁切口。
- 用直的和弯曲的钳子将四和第五肋骨之间的肋间肌肉分开, 直到进入胸腔。
- 将胸腔牵引器插入胸腔。继续使用直和弯曲的钳子分离肋间肌肉, 以获得胸腺和心脏的直接可视化。
- 用一对直钳提起胸腺。用剪刀取出覆盖心脏的胸腺。避免切割或戳进任何主要血管。
- 小心地通过一个5-0 单丝缝合通过左心室的表面, 右下角的左心房附属物。避免通过主要冠状动脉的针头。
- 缝合到位后, 没有明显出血, 打结松动。
- 向上和向前拉缝合线, 将心脏从胸部抬出来。
- 一旦心脏从胸部抬出来, 迅速将一个中等大小的夹子涂在左心房, 就在二尖瓣上方。
注: 剪辑是中途关闭, 与剪辑的尖端捏左心房, 导致左心房狭窄。 - 快把心脏放回胸腔里。确保心脏不在胸部外的时间超过30秒。
- 取下用于抬起心脏的停留缝合线。
- 用5-0 单丝缝合, 用简单的中断图案缝合胸部。
- 将连接在10毫升注射器上的 23 g 胸管插入胸部, 然后用简单的中断缝合线关闭胸壁肌肉和皮肤。
- 通过插入的胸管,使用连接的 10 cc 注射器, 取出任何空气、血液和胸腔积液, 然后拉动导管。
- 用5-0 单丝缝合关闭皮肤层, 使用简单的中断图案。
- 皮下注射丁丙诺非 0.01 mg/kg。
- 关闭异氟醚。
- 观察到自发呼吸后, 断开呼吸机。
- 保持老鼠插管, 让它在加热垫上恢复, 直到它醒来。
- 在观察到以下一个或多个体征后, 安全地排出大鼠: 大鼠开始移动其四肢, 恢复其对其正确的反射, 它恢复其口吃反射, 或表现自发排空。
5. 术后护理
- 每 8-12小时, 皮下注射丁丙诺非 0.01 mg/kg。carprofen 5 mg kg 每天皮下注射 2天, 然后, 根据需要, 如果老鼠不能很好地移动, 看起来很痛苦。
- 手术后立即给出5毫升正常生理盐水, 因为大鼠可能难以饮用水刺, 术后立即服用。
6. 超声心动图证实左心房狭窄成功
- 手术后2周进行经胸超声心动图检查, 以确定 lv 流入速度。
- 按照第1节中概述的步骤对大鼠进行麻醉。
- 麻醉诱导后, 使用与2% 异氟醚混合 2 lmmin 室内空气的鼻锥保持麻醉。
- 用剃须刀刮掉老鼠的胸壁, 用脱毛霜去除剩余的头发。
- 将超声波探头放置在心脏的顶端, 即胸部左侧的第五个肋间空间。在这个区域移动探头, 直到获得良好的四室视图。
- 利用二尖瓣环上方的脉冲波多普勒模式测量 lv 流入速度。
- 在 las 手术后8-10周内, 中度肺动脉高压的发展需要大于 2.0 m 的 lv 流入速度。
7. 浅层操作
- 除了应用剪辑 (步骤 4.9) 外, 请执行上述所有步骤, 以创建与年龄匹配的假操作控制 (soc) 大鼠。
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Representative Results
las 的有效性是确认使用超声心动图, 2周的术后。lv 流入速度大于 2.0 m2 的大鼠, 用四室视图测量, 被认为出现了明显的狭窄 (图 1), 并可靠地发展为中度 ph 和肺静脉动脉化8-10周后 las 手术后。
las 手术后十周, las 组的大鼠表现为左心房增大 (图 2E)、肺充血 (图 2e)、右心室 (rv) 压力超载 (图 2E) 及肺静脉流量增加 (图 2f,g) 与 soc 组中的大鼠相比 (图 2a-e).las 组的 rv 收缩压也增加, 而 soc组的 rv 收缩压也增加 (图 3)。对弹性-范吉森 (evg) 染色的肺横截面进行组织学检查后发现, 与 soc 组相比, 肺动脉 (pa) 和肺静脉 (pv) 内侧厚度增加, las 组的 pv 尺寸增加 ( 图 4 a)-d)。此外, α-平滑肌肌动蛋白 (αsma) 免疫染色显示, 与对照大鼠相比, pa 和 las 组的 pv 平滑肌细胞数量增加 (图 4e, f)。因此, las 模型增加了 las 大鼠的 pa 和 pv 的肌肉化。
表 1总结了操作参数, 将 soc 组与 las 组进行了比较。具体而言, 与 soc 组相比, las 组的 rv-体重比和肺-体重比显著增加. 与 soc 组相比, las 组的血流动力学参数, 包括 rv 收缩压、rv 终切舒张压和估计 la 压力, 显著增加 (表 1)。
图 1: 代表性超声心动图比较假手术控制 (soc) 左心室流入速度相对于左心房狭窄 (las) 大鼠.(a) soc 大鼠的四室视图和相应的彩色多普勒回波。(b) las 大鼠的四室流入速度和相应的彩色多普勒回波。(c) soc 大鼠的左心室流入速度峰值 (0.94 m)与(d) las 大鼠 (2.12 毫米) 的左心室流入速度。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 在假手术控制 (soc) 中具有代表性的宏观和超声心动图检查结果相对于左心房狭窄 (las) 大鼠手术后 10周.(a) 从 soc 大鼠与 (b) las 大鼠的心脏的宏观发现, 显示左心房扩张。黑色标度条代表1厘米 (c) 宏观上的发现肺从 soc 大鼠与 (d) 肺从 las 大鼠, 显示肺充血。(e) 超声心动图对 soc 大鼠与 las 大鼠的超声心动图, 显示室间隔扁平, 右心室游离壁厚度增加。(g) soc大鼠的肺静脉流量与 las大鼠的肺静脉流动, 其 pv 流入量增加。这一数字是由藤本等人转载和修改的。1 1号经允许。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 有代表性的血流动力学记录的洗发水操作 (soc) 大鼠相对于左心房狭窄 (las) 大鼠, 左心室 (lv) 压力无差异, 但在 las 大鼠的右心室 (rv) 压力增加.该数字由藤本等人转载和修改。1 1号经允许。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 洗发水操作控制 (soc) 的代表性组织学变化相对于左心房狭窄 (las) 大鼠, 手术后 10周.用弹性-范吉森 (eva) 染色的肺横截面显示(a-b ) 增加肺动脉 (pa) 和 (c-d ) 肺静脉 (pv) 厚度和增加的尺寸的光伏在 las 组. α-平滑肌肌动蛋白 (αsma) 免疫染色显示, 在 las 组中, (e-f ) pa 和 ( g-h ) pv 血管壁中阳性染色细胞的数量增加。刻度条代表100μm。这一数字是由藤本等人转载和修改的。11有权限请点击这里查看这个数字的更大版本.
| 操作参数 | soc 组 (n 5) | 第1列 | las 集团 (n= 5) | 第2列 | 第3列 |
| 平均 | iqr | 平均 | iqr | p 值 | |
| bw 操作 (g) | 195 | 190-205 | 194 | 190-208 | 0.98 |
| bw 牺牲 (g) | 416 | 410-420 | 452 | 390-505 | 0.65 |
| rv 重量/bw | 0.39 | 0.38-0.43 | 0.54 | 0.50-0.59 | & lt;0.01 |
| lv 重量/bw | 1.91 | 1.85-1.95 | 1.98 | 1.78-2.20 | 0.69 |
| rv 重量 | 0。2 | 0.19-0.22 | 0.27 | 0.27-0.28 | & lt;0.01 |
| 肺重量/bw | 0.37 | 0.36-0.41 | 0.47 | 0.42-0.51 | & lt;0.01 |
| 心脏导管插入术 | |||||
| rvsp (毫米汞柱) | 18 | 16-20 | 40。6 | 30-50 | & lt;0.01 |
| rvedp (mmhg) | 1。6 | 1.0-2。0 | 3。4 | 3.0-4。0 | & lt;0.01 |
| lvsp (毫米汞柱) | 84 | 60-80 | 77。6 | 70-80 | 0.72 |
| lvevp (mmhg) | 2。8 | 2.0-3。0 | 7。8 | 7.0-8。0 | 0.013 |
| rvsp/lvsp | 0.22 | 0.15-0.27 | 0.52 | 0.54-0.54 | 0.021 |
| 估计 la 压力 (毫米汞柱) | 8。9 | 6.8-8。4 | 28。1 | 22.8-27。0 | & lt;0.01 |
表 1: 洗发水控制组和左心房狭窄组的手术和心导管插入参数及估计的左心房压力.缩写: soc = 洗发水操作控制;las = 左心房狭窄;iqr = 四分位数范围;bw = 体重;rvsp = 右心室收缩压;rvevdp = 右心室终末期舒张压;lvsp = 左心室收缩压;lvevp = 左心室终末期舒张压;la = 左心房。此表转载并修改了藤本等人的报告.1 1号经允许。
补充图 1: 用于夹放置和夹子闭合的密封性的地标.(a) 夹子的一端位于肺动脉底部旁边。(b) 夹子的另一端正好位于冠状窦上方, 在左心室的半侧。(c) 剪辑应半途而废, 因此两端只需相互触摸即可。请点击此处下载此图.
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Discussion
las 大鼠是一种新的第2组 ph 模型, 已经受到了该领域 12、13 的研究人员的极大兴趣。与现有的两组2型模型相比, 即肺静脉狭窄 (pvs) 模型14, 使用仔猪, 和冠状动脉上带 (sab) 大鼠模型8,9, 10, las 大鼠模型有几个优势。与 pvs 仔猪模型相比, las 大鼠模型的生成成本较低, 大鼠的手术过程比仔猪复杂。与最常用的 2 ph 组动物模型 sab 大鼠模型相比, las 模型中2例 ph 的病理生理比 sab 模型复杂, 因为主动脉带首先导致肺发育前的左心室衰竭拥堵和 ph 值。在啮齿类动物中, las 和 sab 模型很可能是更好地了解2型 ph 的病因的补充工具。
las 手术中最关键的两个步骤是固定缝合和金属夹子的应用。对于保持缝合线的位置, 选择缝合是至关重要的。避免用切割针缝合。使用单丝缝合, 因为它产生较少的阻力和摩擦, 当通过左心室。关于金属夹的应用, 确定表面地标很重要。夹子的一端理想地放置在肺干的底部旁边, 另一端正好位于冠状窦上方, 穿过 lv 的一半 (补充图 1)。剪辑应该是半封闭的, 所以两端只需相互接触 (补充图 1c)。
las 大鼠模型有几个局限性。首先, las 模型只能产生中等 ph 值与 pasp约40 毫米汞柱11。我们已经探讨了使用更紧的心房夹, 但手术死亡率显著上升, 因此。其次, 快速跳动的心脏很难准确地将剪辑放置在所需的地标上。因此, 由于带松或剪辑放置不正确, 成功率在50% 左右。带塞子的改进后的夹子贴片机将提高夹子紧固性的一致性。第三, 利用现有技术, 在大鼠模型中, 仍很难获得直接肺动脉压和肺毛细血管楔形压力测量。最后, 大鼠 ph 模型中分子机制对人的 ph 值的保真度仍然值得怀疑, 这仍然是一个积极研究的领域。
尽管存在这些局限性, las 大鼠是一种临床相关、经济且可重复的小型动物模型, 适用于研究 2 ph 和肺静脉动脉化的病理生理学和分子机制。它还可以作为治疗第2组 ph 的新疗法的临床前试验的工作场所。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢米塔克斯-日本科学促进会 (jsps) 暑期课程。在 Mitacs-JSPS 暑期项目的资助下, ping yu xiong 参观了 jikei 大学医学院。minamisawa 博士得到了日本教育、文化、体育、科学和技术部 (s. m.) 的部分支持, 该部是由教育部支持的私立大学战略研究基金会项目, 即汽车赛车纪念基金会 (s. m.) 和 jikei 大学研究生研究基金 (s. m.), 为该项目提供财政支助。archer 博士得到美国国立卫生研究院 (nih) 的部分支持, 这些机构授予 nih 1r01hl1113001-01a1 (s. l. a.) 和 nih 2r01hl071115-08 (s. l. a.), 加拿大创新基金会, 一级加拿大线粒体动力学和转化学主席医学 (s. l. a.)、威廉·亨德森基金会、加拿大血管网络和女王心肺单位 (qcpu)。
提交人感谢吉基大学医学院学术信息中心摄影服务主任 tadashi kokubo 先生拍摄了这段视频。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-0 Prolene Suture | Johnson & Johnson - Ethicon | 8725H | Polypropylene suture with HEMO-SEAL Technology |
| Anaesthesia Machine | Wakenyaku Co., Ltd. | BRTK-100A | Air pump and anaethesia machine |
| Angiocatheter guidewire | Self-made | 10 cm guidewire glued to a 1 cc syringe | |
| Chest retractor | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | F-2 | |
| Chest tube 23G | Self-made | 10 cc syringe attached to a 23G needle plus plastic tube | |
| Curved forceps | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | A-14 | |
| Heating pad | Vivaria | MP-916-NV | Keep body temperature at 37 degree celsius |
| Horizon Ligating Clips | Teleflex | REF 003200 | Size Medium-Large |
| Horizon Manual-Load Ligating Clip Applier For Medium-Large Size Horizon | Teleflex | REF 337085 | Ligation Clips Angled Jaw, (20cm) |
| Needle holder | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | MC-40 | |
| Rodent Respirator | CWE Inc | SAR-830/P | Small animal ventilator |
| Scissors | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | B-12 | Straight scissors ideally with round tips |
| Straight forceps | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | A-7 | |
| Tongue depressor | Uchida Yoko Co., Ltd. | 8-615-2417 | Use the wide end |
References
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