Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Virkningerne af Blast-induceret Neurotrauma på trykisoleret gnaver midt cerebrale arterier

Published: April 1, 2019 doi: 10.3791/58792
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Charles R. Allen Research Laboratories, Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch, 2The Moody Project for Translational Traumatic Brain Injury Research, University of Texas Medical Branch

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive metoder for ex vivo vaskulære reaktivitet bestemmelse efter en primær blast traumatisk hjerneskade (bTBI) ved hjælp af isolerede, trykisoleret, gnaver midterste cerebral arteriel (MCA) segmenter. bTBI induktion er udført ved hjælp af et stød rør, også kendt som en avanceret Blast Simulator (ABS) enhed.

Abstract

Selvom der har været undersøgelser på de histopatologiske og adfærdsmæssige konsekvenser af blast eksponering, har færre været dedikeret til blast's cerebrale vaskulære effekter. Effekt (dvs., ikke-blast) traumatisk hjerneskade (TBI) er kendt for at nedsætte trykket autoregulation i cerebral Vaskulaturen i både mennesker og forsøgsdyr. Den hypotese, at blast-induceret traumatisk hjerneskade (bTBI), som påvirker TBI, resulterer i nedsat cerebrale vaskulære reaktivitet blev testet ved at måle myogenic forhalende svar til reduceret intravaskulær tryk i gnavere midterste cerebral arteriel (MCA) segmenter fra rotter udsat for mild bTBI ved hjælp af en avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør. Voksen, mandlige Sprague-Dawley rotter var anesthetized, intuberet, ventileret og forberedt til Sham bTBI (identisk manipulation og anæstesi med undtagelse af blast skade) eller mild bTBI. Rotter blev randomiseret til at modtage Sham bTBI eller mild bTBI efterfulgt af offer 30 eller 60 min. efter skade. Umiddelbart efter bTBI, oprettende refleks (RR) undertrykkelse gange blev vurderet, eutanasi på tid point efter skaden var afsluttet, hjernen blev høstet og de enkelte MCA segmenter var indsamlet, monteret og tryk. Som intraluminal presset perfunderet via de arterielle segmenter blev reduceret i 20 mmHg intervaller fra 100 til 20 mmHg, blev MCA diametre måles og registreres. Med faldende intraluminal pres, MCA diametre støt steget betydeligt over baseline i Sham bTBI grupper, mens MCA dilator svar blev reduceret betydeligt (p < 0,05) i begge bTBI grupper som det fremgår af de synshæmmede, mindre MCA diametre registreres for bTBI grupperne. Derudover RR undertrykkelse i bTBI-grupperne var væsentligt (p < 0,05) højere end i Sham bTBI grupper. MCA er indsamlet fra Sham bTBI grupper udstillede typiske vasodepressivt egenskaber at falder i intraluminal pres mens MCAS indsamlet efter bTBI udstillet betydeligt forringet myogenic vasodepressivt svar til reduceret tryk, varet i mindst 60 min efter bTBI.

Introduction

Ligner der følger af effekt (dvs., ikke-blast) TBI, blast-induceret traumatisk hjerneskade (bTBI) har været forbundet med cerebrale vaskulære skade1 og forringet cerebrale vaskulære kompenserende svar til forekomster indkvartering ændringer i delvis pres af kuldioxid (PaCO2)2,3,4 og ilt (PaO2)5. Derudover har blast eksponering forårsaget cerebral arteriel vasospasme i dyr6 og bTBI patienter7,8. Mens kliniske TBI9 og væske-percussion skade (FPI)10,11,12 er forbundet med nedsat cerebral vascular responses til ændringer i arterielt blodtryk (dvs., pres autoregulation)9,10,11,12, fortsat usikkerhed med hensyn til virkningerne af bTBI på cerebral blodkartryk autoregulation kapacitet.

Den cerebrale cirkulation reagerer på variationer i systemisk arterietryk med hensigten at opretholde en kontinuerlig ilt og næringsstoffer levering leveret til metabolisk aktive hjernen13,14,15, 16. En unik type homøostase, autoregulation17,18,19 opstår, når "en orgel opretholder en konstant blodgennemstrømning trods ændringer i blodtryk (perfusion) eller andre fysiologiske eller patologiske stimuli" 20. cerebrale arterier snøre eller spile som reaktion på variationer i blodtryk, nitrogenoxid (NO), blod viskositet, PaCO2 og PaO2etc.4,11,16, 21. arteriel myogenic svar henviser til sådanne sammentrækninger eller dilations. Den myogenic vaskulære reaktion, første gang beskrevet af Bayliss22 og en større mekanisme bidrager til autoregulation af CBF, er karakteriseret ved vasokonstriktion hvis perfusion trykket stiger og vasodilatation, hvis perfusion trykket falder 14 , 17. denne vaskulære svar er kontraktive væv (såsom vaskulære glatte muskelceller, VSMC'S) iboende evne til at reagere på stræk og/eller ændringer i lumen og/eller væg spændinger23,24, 25,26,27,28,29. Når arterierne er strakt (f.eks., under intravaskulær pres stiger), VSMCS snøre24,25,26,28.

Undersøgelser, der undersøger modstand fartøjer ex vivo har almindeligvis ansat en af to metoder til test af farmakologiske, fysiologiske egenskaber af isolerede modstand fartøjer: metoden ring-monteret og den kanylerede, tryk metode. Ring-monteret fartøj forberedelse metode indebærer to ledninger bestået intraluminally gennem fartøj segment, som holder segmentet på plads. Måle mængden af kraft på isometrisk vedvarende ledningerne gauges stimulering af VSMC. Dog, denne teknik bærer med sig visse forbehold, især, den uundgåelige skader påført i endothelial lag af lumen, som ledningerne er passeret gennem det30 og den varierende grad af stretching påført den isoleret segment som igen fører til fartøj væg udspiling, der i sidste ende påvirker fartøjets følsomhed over for farmakologiske stoffer31. Kanylerede, trykisoleret fartøj forberedelse metode udnytter en arteriograph består af to separate kamre, der hver hus placeringen af en midterste cerebral arteriel (MCA) høstet fra en enkelt dyr. En mikropipette indsættes i hver ende af segmentet, den proksimale ende af segmentet er fastgjort til mikropipette med suturer og lumen er sagte perfunderet med en fysiologisk saltopløsning (PSS) for at fjerne blod og andre stoffer. Den distale ende er sikret med suturer. Transmural eller luminale pres indstilles ved at hæve de to reservoirer knyttet til hver pipette til en passende højde over hvert segment, men i forskellige højder med hensyn til de andre32,33,34,35 ,36. Tryktransducere placeret langs reservoirer og Mikropipetter giver perfusion pres målinger, mens skibe er forstørrede ved hjælp af en omvendt mikroskop udstyret med skærm, video kamera og scaler giver mulighed for måling af eksterne MCA diametre. Selvom begge metoder er værdifulde, kanylerede, trykisoleret fartøj forberedelse metode bedre efterligner og tilladelser til fartøjer undersøgt for at være tættere på deres i vivo betingelser32,37.

Effekterne af forskellige typer af virkninger (dvs., ikke-blast) TBI på cerebrale vaskulære svar er tidligere blevet undersøgt i cerebral arteriel segmenter21,35,36,38. Hjælp af en lignende ex vivo MCA protokol for fartøjet samling, montering og perfusion som beskrevet i den aktuelle undersøgelse, opnået tidligere undersøgelser succes med deres respektive undersøgelser i de tilhørende mekanismer af cerebral Vaskulaturen dysfunktion følgende TBI. Golding et al.34 undersøgt endotel-medieret dilations i voksen, mandlige Long-Evans rotte MCAS efter svær TBI gennem kontrolleret kortikale indvirkning (CCI) skade. I en anden undersøgelse, Golding et al.36 undersøgt cerebrovaskulær reaktivitet hypotension eller CO2 efter høst MCAS fra rotter, der har lidt en mild CCI. Yu et al.38 analyseres om peroxynitrite skyllevæsker forbedret forhalende svar til reduceret intravaskulær pres i voksen, mandlige Sprague-Dawley rotte MCA segmenter udsat for FPI mens Mathew et al.21 studerede myogenic svar til hypotension i MCA er høstet efter moderat, centrale FPI.

For at bedre undersøge hypotesen at bTBI, som ikke-blast TBI, resulterer i nedsat cerebrale vaskulære reaktivitet, vi testede en mekanisme bidrager til kompromitteret autoregulation ved at måle myogenic forhalende svar til reduceret intravaskulær tryk ex vivo i isolerede, trykisoleret gnaver MCA segmenter (figur 1) indsamlet fra rotter udsat for mild bTBI ved hjælp af en avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør model (figur 2 og figur 3) (Se Rodriguez et al.39 Tabel 1) der bruger trykluft leveres direkte til en driver kammer til at generere Freidlander-lignende40 over og under low-pressure bølger (Se Rodriguez et al.39figur 1A).

Figure 1
Figur 1 : Placering af midt cerebrale arterier (MCA). Ventrale visning af rotte hjernen fremhæve placering af MCA i forhold til den posteriore cerebrale arterier (PCA), interne carotis arterierne (ICA), eksterne carotis arterierne (ECA), basilar arterie (BA) og fælles carotis arterier (CCA). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør enhed. ABS anvendes til at fremstille primære blast skade i alle undersøgelse dyr. 1 = driver kammer; 2 = ekspansion kammer;  3 = modellen kammer; 4 = reflekteret bølge suppressor; gul stjerne = modellen bakke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Texas Medical gren, en forening for vurdering og godkendelse af laboratoriet dyrs pleje (AAALAC) akkrediteret facilitet.

1. animalsk forberedelse til ABS Blast skade

  1. Tænd mekaniske gnaver volumen ventilator og indstille åndedræt sats mellem 40-45 vejrtrækninger pr. min.
  2. Switch indstillet kontrolleret opvarmning tæppe ON og tape en blå pude over det.
  3. Tillægge ventilator ventilator slange.
  4. Samle endotracheal intubation slæden, laryngoscope, længe pickup pincet, stylet, endotrakealtube, og en vatpind vædet med 0,05 mL 1% lidocain HCl. Organiser på den blå pad.
  5. Bekræfte at gnaver bedøvelsesmiddel "boble" kammer, ventilator, luftkammer og isofluran kammer slanger er sikkert forbundet og knyttet til deres respektive stik eller socket. Den bedøvende boble kammer klemme bør være åbent; ventilator klemme skal lukkes.
  6. Luftkammeret, angive knop for rumluft 2 L/min og knop for ilt til 1 L/min.
  7. Tænd for isofluran og Indstil knop til 4% af volumen blanding.
  8. Starter en timer og placere en ung voksen (≈3 måneder gammel), mandlige Sprague-Dawley rotte (350-400 g) i den bedøvende boble kammer for 4-6 min.
  9. Veje rotte på 2 min mark.
  10. Bekræfte rotte er fuldt bedøvede af forsigtigt klemme bagben pote tæer. Hvis ingen pote tilbagetrækning er observeret, reducere rumluften og angive knop til 1 L/min, ilt til 0,4 L/min og isofluran til 2% af volumen blanding.
  11. Drej på rektal telethermometer temperatur dataskærm.
  12. ÅBNE klemmen til ventilator og lukke klemme til bedøvelsesmiddel boble kammer.
  13. Fjerne rotte fra bedøvelsesmiddel boble kammer og position på endotracheal intubation slæde.
  14. Intubate rotte. Placer laryngoscope i dyrets mund, bruge længe pickup pincet for at placere tungen ud af den måde vatpind lidocain-gennemblødt bomuld vatpind tip langs indersiden af halsen og forsigtigt indsætte stylet indeholdende den endotrakealtube i rottens luftrøret.
  15. Når intuberet, Sæt enden af ventilator slangen til ydersiden slutningen af endotrakealtube og observere og bekræfte rotten er at trække vejret støt og uden besvær.
  16. Binde endotrakealtube i sted at tage sig at tungen er gratis fra knude.
  17. Gælde rektal telethermometer sonde hvid Vaselin og indsætte direkte under halen.
  18. Fjern ABS modellen bakke fra modellen kammer og placere under varmelampe til opvarmning før rotte placering på bakken.
  19. Barbere toppen af rottens hovedbunden starter over øjnene og ned til mellem ørerne.
  20. Skær en standard-størrelse skum øre plug i identiske halvdele med en saks. Start i midten af bunden af stikket og skære lige op til den afrundet spids. Indsæt en halveret stykke i hvert øre tip først langs den øre kanal, indtil kontakt er lavet med trommehinden.
  21. Overvåge rektal temperatur. Når en temperatur på 37 ° C er nået, er rotten klar til at blive indlæst i ABS modellen bakke.
  22. Sikre rat på ABS modellen bakken. Fjern ventilator slange fra den endotrakealtube og hurtigt men blidt skub rotten i den øverste ende af bakken, forsigtigt at lede hoved gennem hoved holder åbning og gummi krave. Genindsætte ventilator slangen tilbage i endotrakealtube, kontrollere gummi krave for at sikre det er sikkert, men ikke stramt om halsen og kontrollere, at rotten er udlægningen i en tværgående liggende stilling (figur 3).
  23. Slå isofluran og fjerne ventilator slange fra den endotrakealtube.
  24. Låse og sikre bakken ABS modellen indeholder den bedøvede rotte i ABS modellen kammer.
  25. Forsigtigt knivspids hind paw tæer ved hjælp af lange pincet hver 3 s indtil en tilbagetrækning refleks reaktion fremkaldt.

2. ABS Blast enhed forberedelse og Blast-TBI induktion

Bemærk: Protokollen trin 2.1-2.10 er typisk udført på samme tid som trin 1.1-1,22 så ABS er klar til blast skade administration ret efter rotten er indlæst og sikrede ind i prøve salen.

  1. Løsne hydraulisk hånd pumpe (figur 4A) knop for at muliggøre eventuelle resterende fanget luft at undslippe fra driver kammer (fig. 4B) og at løsne kammer fra sin segl.
  2. Løsne cap nødder (fig. 4C) fra all-tråd stænger (figur 4D) omkring driver kammer og skub salen til venstre og fra ekspansion kammer (figur 4E).
  3. Helt fjerne de to all-tråd, stænger og deres tilsvarende cap nødder beliggende på toppen af driver kammer for at give mulighed for placering af mylar ark i mellem føreren og ekspansionsbeholder.
  4. Stakken og tape sammen langs den øverste kant fire pre cut og foropmålt (30 cm længde, 20 cm bredde, 0.004 i. tyk) mylar ark (danner en mylar ' membran') ved hjælp af en 2,54 cm stykke malertape. Bruge et andet stykke tape, sikkert tape den øverste kant af mylar membran til toppen af ekspansion kammer og over midten af åbningen mellem driver og ekspansion kamrene (fig. 4F).
  5. Sikre driver salen mod mylar membran ved at erstatte de to all-tråd stænger på toppen af kammeret og hånd-stramme alle cap nødder omkring kammeret.
  6. Placere tilbehør stålblok mod hydraulisk hånd pumpe blok og driver salen indtil sikkert passe.
  7. Stramme hydraulisk hånd pumpe knop og bekræfter driver salen fortsat er under tryk med ingen lækager ved at observere et konstant pres tærskel på den hydrauliske gauge.
  8. Åbn filen udløser erhvervelse, der registrerer ABS blast enhed pres spor på ABS blast enhed computer.
  9. Løsne trykluft tank (figur 4G) vigtigste knop nok til lidt åbne luftvejene.
  10. Operere de hydrauliske håndpumpe, indtil indikatoren måler når den røde pil, der angiver en ønskede kammeret pres niveau af ≈5, 000 psi.
  11. Sikre og placere de bedøvede dyr på ABS modellen bakken (figur 4H) i en tværgående liggende stilling (figur 3) og låse modellen bakke i ABS modellen kammer (figur 4jeg).
  12. Forsigtigt Knib en hind pote ved hjælp af lange pincet hver 3 s indtil en tilbagetrækning refleks reaktion fremkaldt.
  13. Klik på Start på siden åbnede erhvervelse på ABS blast enhed computer.
  14. Når vinduet 'Acquisitioning' vises på skærmen, udløse tryk og hold ned ABS blast enhed indtil blast slukker, sprænges mylar membran og administration af ABS blast skade (20,9 psi ±1.14, 138 kPa ±7.9) til rotten. Lige efter eksplosionen detonerer, start en anden timer for at holde styr på hvor meget tid (i min og s) er gået efter skade.
  15. Fjerne rotten fra ABS modellen bakke og vende tilbage til den blå pad og opvarmning tæppe, hvilket placerer ham fuldt på hans ryg for vurdering af oprettende refleks undertrykkelse.
  16. Registrere tid for tilbagelevering af den oprettende refleks. Observere den anden tidtager, dokument i min og s længden af tid efter skade det tager for rotten hen til rulle fra ryggen til maven tre successive gange. Returnere rotten til bedøvelsesmiddel boble kammer.
  17. Løsne hydraulisk hånd pumpe knop for at muliggøre driver kammer løsne og bevægelse.
  18. Stramme trykluft tank vigtigste knop for at lukke luftvejene.

Figure 3
Figur 3 : Rotte placering på ABS modellen bakke og inde ABS. Retning og orientering af undersøgelse dyret inde ABS. Når de placeres i ABS, er dyret i en tværgående liggende position den dorsale flade af hovedet vinkelret trykbølge (røde pile). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Avanceret Blast Simulator (ABS) stød rør enhed skematisk. De vigtigste bestanddele af ABS. A = hydraulisk håndpumpe; B = driver kammer; C = cap nødder; D = all-tråd stænger;  E = ekspansion kammer; F = placering af mylar membran placering; G = komprimeret luft cylindre; H = modellen bakke; Jeg = modellen kammer.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

3. forberedelse af gnaver MCA PSS løsning

Bemærk: Protokollen trin 3.1-3.3 er typisk udført på samme tid som trin 1.1-1,22 PSS løsning er klar til brug.

  1. Forberede og bland en 1.000 mL fysiologisk saltopløsning (PSS) af følgende sammensætning og koncentrationer: 130 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 1.17 mM MgSO4∙7H2O; 5 mM glucose; 1,5 mM CaCl2; 15 mM NaHCO3.
  2. Reagensglasset PSS med en gasblanding af 21% O2 og 5% CO2 i en balance mellem N2. Løsningen er klar, når pH lyder 7.4.
    Bemærk: Alle gasser er fremstillet af trykgasflasker i de ovenfor nævnte koncentrationer.
  3. Fylde reservoir flasker og slanger med rede PSS løsning og chill den resterende løsning.

4. udvinding af gnaver MCA segmenter

  1. Efter at dokumentere varigheden af den oprettende refleks, returnere rotten til bedøvelsesmiddel boble kammer. Luk klemme til ventilator, og åbne klemmen til salen. Drej isofluran til 4% af volumen blandingen og holde rotten i salen for 2-3 min. indtil dybt bedøvede.
  2. Når rotten er bedøvede, åbne klemmen til ventilator og lukke klemme til bedøvelsesmiddel boble kammer. Reducere isofluran til 2% af volumen blanding, og fjerne ham fra den boble kammer. Placere ham på maven på opvarmning tæppe og Sæt enden af ventilator slangen til ydersiden slutningen af endotrakealtube.
  3. Vedligeholde mekanisk ventilation i en ånde tempo mellem 40-45 vejrtrækninger pr. min. og anæstesi på 2% af volumen blanding i enten 30 eller 60 min. straks post-bTBI skade.
  4. Efter afslutningen af enten 30 eller 60 min overlevelsestid, øge isofluran til 4% af volumen blanding, og dybt bedøver for 5-6 min. straks aflive ved halshugning ved hjælp af en gnaver-specifikke guillotinen.
    Bemærk: I disse eksperimenter holdt vi dyr bedøvede og mekanisk ventilerede efter tilbagelevering af oprettende refleks indtil halshugning.  Hvis undersøgelsen kræver længere overlevelse timepoints, bør analgetika administreres til dyr før fremkomsten fra anæstesi.
  5. Forsigtigt fjerne hjernen fra kraniet. Brug en #10 skalpel blade til at foretage en central, 1,5 tommer lodret, knogle-dybe indsnit fra toppen af glatbarberet hovedbunden ned til den occipital kondyl.
  6. Brug små ben rongeurs til at åbne og adskille hovedbund huden fra kraniet knogle.
  7. Brug stor knogle rongeurs til at skære og udtrække occipital, interparietal og nederste halvdel af de frontale knogler omslutter hjernen.
  8. Brug en kirurgisk spatel til at omhyggeligt udgrave hjernen ud af kraniet, når hjernen er gratis i den omgivende knogle.
    Bemærk: Tage ekstrem forsigtighed, når adskiller hjernen fra kraniet så som ikke at unødigt slæbebåd, jerk eller trække den sarte MCA segmenter fra kranie væggen.
  9. Deponere den høstede hjernen i kølet PSS løsning indeholdt i et lille glas petriskål, som hviler direkte oven på en solid isblok.
  10. Fjern forsigtigt både venstre og højre MCA begyndelsen på kredsen af Willis. Fortsætte med at fjerne segmentet lateralt og dorsalt for ca. 4 – 5 mm.
  11. Forsigtigt rense de indsamlede MCA segmenter af ca 4-5 mm i længden af enhver bindevæv, ved hjælp af microforceps.
  12. Montere MCA på arteriograph. Kanyleres den proksimale ende af hvert segment med det første glas mikropipette (diameter ≈70 µm) og fastgør med en 10-0 nylon sutur.
  13. Sagte perfuse lumina med PSS at fjerne enhver resterende blod og andet indhold fra lumen.
  14. Kanyleres den distale ende af hvert segment med den anden mikropipette uden at strække MCA segment og fastgør med en 10-0 nylon sutur.
  15. Efter vellykket montering af MCA-segmentet, sted i salen på toppen af en inverteret mikroskop scenen for forstørrelse af fartøjer. Mikroskop er udstyret med en video kamera, monitor og en video scaler kalibreret med en optisk mikrometer for arteriel diameter målinger.
  16. Fyld hvert segment og de omkringliggende arteriograph bad med løbende cirkulerede PSS varmede fra stuetemperatur til 37 ° C og ekvilibreres med gasblandingen af 21% O2 og 5% CO2 i en balance mellem N2.
  17. Reagensglasset MCA segmenter ved et tryk på 50 mmHg for 60 min. ved at hæve reservoir flasker tilsluttet Mikropipetter til en passende højde over segmenterne. Tryktransducere placeret mellem Mikropipetter og reservoir flasker vil vurdere transmural pres inden for MCA segment der angiver, hvornår det ønskede 50 mmHg tryk er opnået.
  18. Efter afslutningen af perioden ækvilibrering, øge intravaskulær presset til 100 mmHg ved at indstille reservoir flasker i forskellige højder.
  19. Levere 30 mM K+ (for bekræftelse af fartøjet sammentrækning) via den luminale perfusate og foranstaltning arteriel diametre. Ca. 10 min. senere levere 10-5 M Ach (for fartøjet dilatation) og måle arteriel diametre.
  20. Undersøge fartøj forhalende svar. Lavere reservoir flasker til at reducere det intravaskulære pres fra 100 mmHg til 80 mmHg. Tillad MCA segmenter til blandingen henstår i 10 min. foranstaltning arteriel diametre.
  21. Reducere det intravaskulære pres fra 80 mmHg til 60 mmHg. Tillad MCA segmenter til blandingen henstår i 10 min. foranstaltning arteriel diametre.
  22. Reducere det intravaskulære pres fra 60 mmHg til 40 mmHg. Tillad MCA segmenter til blandingen henstår i 10 min. foranstaltning arteriel diametre.
  23. Reducere det intravaskulære pres fra 40 mmHg til 20 mmHg. Tillad MCA segmenter til blandingen henstår i 10 min. foranstaltning arteriel diametre.

Representative Results

Gennemsnitlig bTBI overtryk for alle undersøgelse dyr var 20,9 psi ±1.14 (138 kPa ±7.9). Den gennemsnitlige varighed af oprettende refleks (RR) undertrykkelse for rotter udsat for ABS bTBI shockwave eksponering (5,37 min ±2.1) var ikke væsentlig længere (p = 0,36, bTBI vs. sham) end i gruppen fingeret (5.10 min ±1.6).

I både 30 og 60 min. sham grupper øget MCA diametre over baseline som intraluminal pres blev reduceret fra 100 til 20 mmHg. Sammenlignet med deres tilsvarende sham grupper, MCA forhalende svar til den løbende pålagt reduktion i intravaskulær pres i de observerede 30 min (p = 0,01, bTBI vs. sham) og 60 min (p = 0.02, bTBI vs. sham) ABS bTBI grupper var væsentligt reduceret efter blast eksponering (figur 5). For en mere detaljeret diskussion af disse resultater, se Rodriguez et al.39.

Disse undersøgelser viste, at milde bTBI væsentligt svækket cerebral kompenserende dilator svar til reduceret intravaskulær tryk i MCA segmenter 30 og 60 min. efter mild bTBI mens de milde trykbølge niveauer anvendes i disse undersøgelser resulterede i varigheder af undertrykkelse af RR (< 30 s) ligner dem i sham-såret rotter.

Statistiske analyser blev udført med software. Den myogenic reaktion på ændringer i intravaskulær pres blev vurderet ved beregning af procentvis ændring fra baseline (100 mmHg) for hvert niveau af intraluminal pres (80, 60, 40 og 20 mmHg). Uparret Student's t-test blev anvendt til at vurdere forskelle mellem bTBI og sham gruppe basislinjer. Forskelle i MCA dilator svar mellem bTBI og sham grupper blev vurderet ved hjælp af en gentagen envejs variansanalyse (ANOVA) Dunnett flere sammenligninger test og en Bartlett's test for ens varians.

På grund af reduktion i statistiske effekt, at resultaterne fra gentagne afprøvning, sammenligninger på hver bestemt pres i MCA eksperimenter (f.eks., mellem 100 og 80 mmHg eller mellem 60 og 40 mmHg, etc.) blev ikke gennemført. Betydning blev accepteret på p ≤ 0,05 niveau. Alle data i tekst, der henvises til tabel og figur udtrykkes som middel ± standardfejl af midler (SEM).

Figure 5
Figur 5 : Effekter af bTBI på midterste cerebral arteriel (MCA) svar til reduceret intravaskulær tryk. Dilator svar til progressiv reduktion af intravaskulære pres udstillet nedsat vasodepressivt svar og blev reduceret betydeligt i 30 min (p = 0,01, bTBI vs. sham) og 60 min (p = 0.02, bTBI vs. sham) bTBI grupper (n = 6/gruppe) efter blast eksponering i forhold til både Sham grupper (n = 12). I både 30 og 60 min. sham grupper øget MCA diametre over baseline som intraluminal pres blev reduceret fra 100 til 20 mmHg. Værdierne er afbildet som middel ± SEM. *p < 0,05 vs humbug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Som med alle protokoller og instruktioner, er det bydende nødvendigt, at visse skridt for protokollen i denne særlige undersøgelse følges så præcist og så præcist som muligt. Efter den indledende intubation af rotte er det vigtigt at bekræfte, at det vejrtrækning støt og uden besvær. Fejlagtigt indlagde den endotrakealtube i spiserøret i stedet for luftrøret vil resultere i raspende, vanskelige vejrtrækninger, blødning og den efterfølgende rousing af rotte på grund af mangelfuld bedøvelsesmiddel levering til lungerne.

Når taping mylar membran plader over midten af åbningen mellem de driver og udvidelse kammer, er det bydende nødvendigt, at arkene er centreret og dækker hele åbning39,41. Misaligning arkene over åbningen vil resultere i luften lækage fra driver kammer, en dråbe i kræves trykket til membranen burst-potentiale og benægtelse af administration af blast skade. Korrekt placere og sikkert montering tilbehør stålblok mod den hydrauliske håndpumpe blok og driver kammer er også afgørende, som er ved at stramme hydraulisk hånd pumpe knop og bekræfter driver kammer forbliver trykisoleret uden utætheder. Korrekt placering af stålblok tillader driveren kammeret tæt lukke mod ekspansion kammer, således at der skabes den obligatoriske seal kræves over kammer åbning af Mylar membran ark og mellem den driver og udvidelse kammer.

Under forberedelserne før MCA fartøj ekstraktioner, gasning PSS med den nødvendige blanding af 21% O2 og 5% CO2 i en balance mellem N2 afbalancerer løsningen og letter necessitated neutral fysiologisk pH behov for en arbejder PSS løsning21,33,34.

Equilibrating segmenter på et konstant pres for 60 min.21,32,33,34 er yderst obligatorisk som dette trin tillader segmenter til at snøre følgende en maksimal dilatation vises under deres første primære opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet. Denne begivenhed viser forekomsten af spontan tone, en ejendom tyder på en sund arterie32,33,34. Selvom assorterede pres niveauer for segment ækvilibrering har været udnyttet i andre undersøgelser33,34,42, denne undersøgelse og de af Mathew et al.21, Golding et al.35 og Golding et al.43 ekvilibreres segmenter på 50 mmHg. Mens equilibrating indsamlet segmenter overalt mellem 40 mmHg – 100 mmHg32 , der giver mulighed for nogle fleksibilitet og ændring til trinnet i protokollen, en timer ækvilibrering periode inden for disse parametre, pres i sidste ende bekræfter sund arterier behov for fortsættelse af eksperimentet.

At tage ekstrem forsigtighed, når du fjerner hjernen fra kraniet og de venstre og højre MCA segmenter fra kredsen af Willis samtidig med disse fartøjer intakt er måske den mest afgørende skridt i den hele protokol. Punktering hjernen med knogle rongeurs, vil rive eller svær udspænding af segmenter under fjernelse eller ved et uheld trække fartøjer med den kirurgiske spatel når udgravning hjernen ud af kraniet i sidste ende resultere i ødelæggelse af de høstede MCA, forårsager ubrugelig segmenter og ophørte brugen af sæt af arterierne, i sidste ende tømme hele eksperimentet for dette dyr.

Om måling af cerebrale vaskulære svar til forhalende eller constrictory stimuli i MCA segmenter ex vivo indsamlet efter indflydelse eller blast TBI in vivo har givet succes, er metoden ikke uden sine vanskeligheder og/eller begrænsninger. Måske en af de mere mærkbare kompleksiteten forbundet med undersøge konsekvenserne af TBI på omsætning af cerebral Vaskulaturen afmontering udtrykkeligt virkningerne af TBI på fartøjer fra de implicitte virkninger som følge af de forskellige materialer og elementer genereret af skadede hjernen44. Denne tænkeligt rådvildhed kan potentielt blive omgået ved at analysere ex vivo vasoconstrictory og vasodepressivt reaktioner høstet, perfunderet og/eller tryk MCA'S. I et forsøg på at reducere varigheden af tid, cerebrale arterier in vivo er udsat for lokalt udledes parenkymalt vasoaktive materiale forud for døden, samling af den cerebrale arterier direkte efter TBI kan mindske graden af sådanne langvarig eksponering effekter. Ex vivo undersøgelser på isolerede MCA desuden præsentere udsigten til analysere mekanismerne for traumatisk vaskulære skade ved hjælp af særlige receptor agonister og antagonister eller ansete køretøjer af vaskulære skade, der ikke yder kontrol som effektivt eller som diskriminerende i vivo. Efterfølgende, kan dette ex vivo metode kombineres med ex vivo eksponering for stoffer til at teste resulterende myogenic svar (vasokonstriktion eller dilatation af fartøjet segment som følge af intravaskulær eller ekstravaskulære stof eksponering).

Andre begrænsninger omfatter groft eller utålmodigt at fjerne MCA fra høstede hjernen, hvilket kan resultere i for tidlig rivning af fartøjer, dermed tømme deres brug. Derudover kan at lade mere end et par minutter mellem eutanasi af dyret, samling af fartøjerne og deres placering i den forberedte PSS løsning også negere deres levedygtighed. Når korrekt udført og fulgt kan de metoder, der beskrives i denne protokol til test myogenic svar af MCAS efter bTBI tager det flere timer fra start til slut og forsøger på forkorte længden af tid, der kræves for succes resultere i eksperimentel fiasko. Men denne metode er gjort in vitro- og udnytter betydeligt mere omkostningseffektive instrumentering og udstyr end in vivo høj opløsning magnetisk resonans (MR) imaging45,46 eller konventionel Doppler Sonografi / velocimetric teknikker47,48,49 som er også ansat til fartøj undersøgelser.

Disse resultater, mild bTBI skade er forbundet med nedsat cerebral forhalende svar til reduceret intravaskulær tryk kunne potentielt være en funktion af vasospasme6,7 og VSMC hyperconstriction50 tidligere rapporteret efter blast eksponering i sidste ende fører til begivenheder såsom reduceret relative cerebral perfusion. Derudover kunne blast-induceret skade hæmmer normal forhalende reaktioner af cerebral Vaskulaturen eventuelt fremme yderligere reduktioner i cerebral perfusion når kombineret med arteriel hypotension, en hyppig forekomst under kampoperationer.

Disse resultater viser, at bTBI resulterer i en ændring til de mekanismer, der letter arteriel vaskulære kontrol. Selv om akut-fase cerebrale vaskulære værdiforringelse af arteriel myogenic svar til reduktioner i intravaskulær pres for mindst en time efter skade blev bemærkede, stadig der mangler i oplysninger, der omgiver den akutte fase efter bTBI. Betydningen af at identificere hvilke fysiske og biokemiske mangler skader på de cerebrale kar og hjerne eksponering for bTBI årsager kunne støtte ved fastsættelsen af terapeutiske og/eller rehabiliterende succes forholdsvis umiddelbart efter skaden.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Undersøgelser blev udført som en del af et team, der støttes af The Moody projekt for Translationel traumatisk hjerne skade forskning og award W81XWH-08-2-0132 fra den amerikanske hær medicinalforskning og materiale kommando - Department of Defense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced Blast Simulator (ABS) Dyn-FX Consulting, Ltd. and ORA, Inc. N/A Blast-simulating shock tube used to induce primary blast injuries 
Adult, male, Sprague-Dawley rats  Charles River Laboratories N/A Experimental animals
Arteriograph Living Systems Instrumentation, Inc. Arteriograph Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter 
Bone rongeurs, large FST Fine Science Tools Friedman Rongeur Brain extraction from skull
Bone rongeurs, small FST Fine Science Tools Boynton Rongeur Brain extraction from skull
CaCl2  Sigma Calcium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Ear plugs 3M Foam Ear Plugs 1100 Class AL  Prevent injury of ear tympanic membrane when in the blast machine 
Glucose Sigma D-[+]-Glucose Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Isoflurane  Piramal Enterprises Limited  Isoflurane, USP Anesthetic
KCl Sigma Potassium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
MgSO4•7H2O  Sigma Magnesium sulfate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Microforceps Buxton Biomedical Inc. Micro Tying Fcps, 180mm Brain extraction from skull
Mylar sheets Texas Art Supply Mylar Membrane used for compressed air build-up during blasting
NaCl Sigma Sodium chloride Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
NaHCO3 Sigma Sodium bicarbonate Preparation of rodent middle cerebral arterial physiological salt solution (PSS)
Nylon suture Ethicon 10-0 Ethilon nylon suture black monofilament 5" (13 cm) Mounting of harvested arteries and measurement of lumen diameter      
Scalpel blade #10 Bard-Parker 10 Stainless Steel Surgical Blade Brain extraction from skull
Surgical spatula Delmaks Surgico Cement Spatula  Brain extraction from skull
Thermometer  Physitemp Instruments, Inc.,  Thermalert Monitoring Thermometer Monitoring of experimental animal's core body temperature 
Volume ventilator  Harvard Apparatus, Inc. Small Animal Ventilator Constant and steading breathing of the intubated experimental animal
Water blanket Gaymar Industries, Inc.  Mul-T-Pad Temperature Therapy Pad Maintenance of experimental animal's body temperature 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Blast-induced brain injury and posttraumatic hypotension and hypoxemia. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 877-887 (2009).
  2. Overgaard, J., Tweed, W. A. Cerebral circulation after head injury. Part 1: CBF and its regulation after closed head injury with emphasis on clinical correlations. Journal of Neurosurgery. 41 (5), 531-541 (1974).
  3. Wei, E. P., Dietrich, W. D., Povlishock, J. T., Navari, R. M., Kontos, H. A. Functional, morphological, and metabolic abnormalities of the cerebral microcirculation after concussive brain injury in cats. Circulation Research. 46 (1), 37-47 (1980).
  4. Wei, E. P., Kontos, H. A., Patterson, J. L. Dependence of pial arteriolar response to hypercapnia on vessel size. The American Journal of Physiology. 238 (5), 697-703 (1980).
  5. Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Effects of experimental fluid percussion injury of the brain on cerebrovascular reactivity of hypoxia and to hypercapnia. Journal of Neurosurgery. 56 (3), 332-338 (1982).
  6. Bauman, R. A., et al. An introductory characterization of a combat-casualty-care relevant swine model of closed head injury resulting from exposure to explosive blast. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 841-860 (2009).
  7. Armonda, R. A., et al. Wartime traumatic cerebral vasospasm: recent review of combat casualties. Neurosurgery. 59 (6), 1215-1225 (2006).
  8. Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. Explosive blast neurotrauma. Journal of Neurotrauma. 26 (6), 815-825 (2009).
  9. Bouma, G. J., Muizelaar, J. P. Relationship between cardiac output and cerebral blood flow in patients with intact and with impaired autoregulation. Journal of Neurosurgery. 73 (3), 368-374 (1990).
  10. Lewelt, W., Jenkins, L. W., Miller, J. D. Autoregulation of cerebral blood flow after experimental fluid percussion injury of the brain. Journal of Neurosurgery. 53 (4), 500-511 (1980).
  11. DeWitt, D. S., et al. Effects of fluid-percussion brain injury on regional cerebral blood flow and pial arteriolar diameter. Journal of Neurosurgery. 64 (5), 787-794 (1986).
  12. Engelborghs, K., et al. Impaired autoregulation of cerebral blood flow in an experimental model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 17 (8), 667-677 (2000).
  13. Mchedlishvili, G. Physiological mechanisms controlling cerebral blood flow. Stroke. 11 (3), 240-248 (1980).
  14. Kontos, H. A. Regulation of the cerebral circulation. Annual Review of Physiology. 43, 397-407 (1981).
  15. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr The consequences of traumatic brain injury on cerebral blood flow and autoregulation: a review. Clinical and Experimental Hypertension. 21 (4), 299-332 (1999).
  16. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Traumatic cerebral vascular injury: the effects of concussive brain injury on the cerebral vasculature. Journal of Neurotrauma. 20 (9), 795-825 (2003).
  17. Paulson, O. B., Strandgaard, S., Edvinsson, L. Cerebral autoregulation. Cerebrovascular and Brain Metabolism Reviews. 2 (2), 161-192 (1990).
  18. Lang, E. W., Diehl, R. R., Mehdorn, M. Cerebral autoregulation testing after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: the phase relationship between arterial blood pressure and cerebral blood flow velocity. Critical Care Medicine. 29 (1), 158-163 (2001).
  19. Soehle, M., Czosnyka, M., Pickard, J. D., Kirkpatrick, P. J. Continuous assessment of cerebral autoregulation in subarachnoid hemorrhage. Anesthesia and Analgesia. 98 (4), 1133-1139 (2004).
  20. Roy, C. S., Sherrington, M. B. On the regulation of the blood-supply of the brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
  21. Mathew, B. P., DeWitt, D. S., Bryan, R. M., Bukoski, R. D., Prough, D. S. Traumatic brain injury reduces myogenic responses in pressurized rodent middle cerebral arteries. Journal of Neurotrauma. 16 (12), 177-186 (1999).
  22. Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
  23. Johnson, P. C., Henrich, H. A. Metabolic and myogenic factors in local regulation of the microcirculation. Federation Proceedings. 34 (11), 2020-2024 (1975).
  24. Johnson, P. C. The myogenic response and the microcirculation. Microvascular Research. 13 (1), 1-18 (1977).
  25. Atkinson, C. L., et al. Opposing effects of shear-mediated dilation and myogenic constriction on artery diameter in response to handgrip exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 119 (8), 858-864 (1985).
  26. Johnson, P. C. The myogenic response in the microcirculation and its interaction with other control systems. Journal of Hypertension. 7 (4), Supplement 33-39 (1989).
  27. Allen, S. P., Wade, S. S., Prewitt, R. L. Myogenic tone attenuates pressure-induced gene expression in isolated small arteries. Hypertension. 30 (2), Pt 1 203-208 (1997).
  28. Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
  29. Ahn, D. S., et al. Enhanced stretch-induced myogenic tone in the basilar artery of spontaneously hypertensive rats. Journal of Vascular Research. 44 (3), 182-191 (2007).
  30. Demay, J. G., Gray, S. D. Endothelium-dependent reactivity in resistance vessels. Progress in Applied Microcirculation. 8, 181-187 (1985).
  31. Nilsson, H., Sjöblom, N. Distension-dependent changes in noradrenaline sensitivity in small arteries from the rat. Acta Physiologica Scandinavica. 125, 429-435 (1985).
  32. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  33. Bryan, R. M., et al. Stimulation of α2 adrenoreceptors dilates the rat middle cerebral artery. Anesthesiology. 85, 82-90 (1996).
  34. Golding, E. M., et al. Endothelial-mediated dilations following severe controlled cortical impact injury in the rat middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (8), 635-644 (1998).
  35. Golding, E. M., Contant, C. F., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Temporal effect of severe controlled cortical impact injury in the rat on the myogenic response of the middle cerebral artery. Journal of Neurotrauma. 15 (11), 973-984 (1998).
  36. Golding, E. M., et al. Cerebrovascular reactivity to CO(2) and hypotension after mild cortical impact injury. The American Journal of Physiology. 277 (4), Pt 2 1457-1466 (1999).
  37. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  38. Yu, G. X., et al. Traumatic brain injury in vivo. and in vitro. contributes to cerebral vascular dysfunction through impaired gap junction communication between vascular smooth muscle cells. Journal of Neurotrauma. 31 (8), 739-748 (2014).
  39. Rodriguez, U. A., et al. Effects of mild blast traumatic brain injury on cerebral vascular, histopathological and behavioral outcomes in rats. Journal of Neurotrauma. 35 (2), 375-395 (2018).
  40. Friedlander, F. G. The diffraction of sound pulses; diffraction by a semi-infinite plane. Proceedings of the Royal Society of London. Series A, Mathematical and Physical Sciences. 186 (1006), 322-344 (1946).
  41. Tompkins, P., et al. Brain injury: neuro-inflammation, cognitive deficit and magnetic resonance imaging in a model of blast induced traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30 (22), 1888-1897 (2013).
  42. Cipolla, M. J., Vitullo, L., McKinnon, J. Cerebral artery reactivity changes during pregnancy and the postpartum period: a role in eclampsia. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2127-2132 (2004).
  43. Golding, E. M., Robertson, C. S., Bryan, R. M. Jr Comparison of the myogenic response in rat cerebral arteries of different calibers. Brain Research. 785 (2), 293-298 (1998).
  44. DeWitt, D. S., Prough, D. S. Assessment of cerebral vascular dysfunction after traumatic brain injury. Animal Models of Acute Neurological Injuries II: Injury and Mechanistic Assessments. , Humana Press. New York. (2012).
  45. Degnan, A. J., et al. MR angiography and imaging for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic disease. American Journal of Neuroradiology. 33 (8), 1427-1435 (2012).
  46. Liu, Q., et al. Comparison of high-resolution MRI and CT angiography and digital subtraction angiography for the evaluation of middle cerebral artery atherosclerotic steno-occlusive disease. The International Journal of Cardiovascular Imaging. 29 (7), 1491-1498 (2013).
  47. Newell, D. W., Winn, H. R. Transcranial Doppler in cerebral vasospasm. Neurosurgery Clinics of North America. 1 (2), 319-328 (1990).
  48. Schenone, M. H., Mari, G. The MCA Doppler and its role in the evaluation of fetal anemia and fetal growth restriction. Clinics in Perinatolgy. 38 (1), 83-102 (2011).
  49. Morris, R. K., Say, R., Robson, S. C., Kleijnen, J., Khan, K. S. Systemic review and meta-analysis of middle cerebral artery Doppler to predict perinatal wellbeing. European Journal of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology. 165 (2), 141-155 (2012).
  50. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12705-12710 (2011).

Tags

Neurovidenskab spørgsmålet 146 TBI blast-induceret traumatisk hjerne skade (bTBI) blast-induceret neurotrauma primære blast skade cerebrale vaskulære reaktivitet midt cerebrale arterier (MCA) myogenic svar
Virkningerne af Blast-induceret Neurotrauma på trykisoleret gnaver midt cerebrale arterier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, … More

Rodriguez, U. A., Zeng, Y., Parsley, M. A., Hawkins, B. E., Prough, D. S., DeWitt, D. S. Effects of Blast-induced Neurotrauma on Pressurized Rodent Middle Cerebral Arteries. J. Vis. Exp. (146), e58792, doi:10.3791/58792 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter