Summary
Понимание биологического состава окружающей среды частиц имеет важное значение для изучения его значительного воздействия на здоровье человека и распространения болезней. Здесь мы использовали три типа методов выборки Биоаэрозоль и биологического анализа по воздуху микробов лучше изучить бортовых микробных сообществ в различных экологических условиях.
Abstract
Переменной микроорганизмов в твердых частицах (ТЧ) в различных экологических условиях могут иметь существенное воздействие на здоровье человека. В этом исследовании, мы описали протокол для несколько анализа биологической композиции в экологической PM. пять экспериментов представлены: (1) вечера количество мониторинга с помощью лазерный счетчик частиц; (2) пп коллекции с помощью пробоотборника циклонической аэрозоля; (3) пп коллекции с помощью пробоотборника воздуха большого объема с фильтрами; (4) culturable микробы коллекции, сборники шестиступенчатого Андерсен; и последовательности (5) Определение биологического состава окружающей среды PM бактериальный 16SrDNA и грибковых ее региона. Мы выбрали туманных дней и животноводческие фермы, как два типичных примера приложения в настоящем Протоколе. В это исследование, эти два методы выборки, циклонные аэрозоля сборники и фильтр сэмплер показали эффективность различных проб. Сборники циклонической аэрозоля выполняться гораздо лучше с точки зрения сбора бактерий, в то время как эти два метода показан такой же эффективностью в сбора грибов. Пробоотборники фильтр может работать в условиях низких температур хотя циклонической аэрозолей-пробоотборники проб ограничения температуры. Пробоотборника твердых влияющих, например сборники шестиступенчатого Андерсен, может использоваться для выборки биоаэрозоли непосредственно в среде культуры, который увеличивает выживаемость culturable микроорганизмов. Однако этот метод главным образом опирается на культуру, в то время как более чем на 99% микробов не культивировали. ДНК, извлеченные из culturable бактерий, собранные Андерсен шестиступенчатого сборники и образцы, собранные циклонической аэрозоля сборники и фильтр сборники были обнаружены бактериальных 16S рДНК и грибковых последовательности ее региона. Все вышеуказанные методы могут иметь широкое применение во многих областях исследования, такие, как экологический мониторинг и обнаружение бортовых патогена. Из этих результатов мы можем заключить, что эти методы могут быть использованы в различных условиях и может помочь исследователям изучить воздействие на здоровье человека экологических биоаэрозоли.
Introduction
В природных условиях различные виды микроорганизмов существуют в биоаэрозоли, включая грибков, бактерий, вирусов и других микроорганизмов1. Воздухе микроорганизмов, которые могут поступать из некоторые виды деятельности человека в таких операциях по кормлению в животноводческих хозяйствах, являются важной содержание атмосферной среды2. Эти микроорганизмы могут не только играют важную роль в атмосферной среды, но также оказывают значительное воздействие на здоровье человека и распространения заболеваний.
Как важный способ распространения заболеваний микробной аэрозолей привлекли широкое внимание во всем мире. В недавних исследованиях многих болезней человека были найдены ассоциироваться с состав сложных экологических твердых частиц (ТЧ) в различных местах, таких как химические заводы, животноводческих ферм и задымленные городов3,4. Состав биологических пп может способствовать достижению некоторых респираторных и сердечно-сосудистых заболеваний в5вечера облученных людей. Различные тела регионах, таких как слизистая оболочка, кожи, пищеварительного тракта и дыхательных путей, могут быть потенциальными целями микробов, придает PM6,7. Повышенный риск рака легких может быть вызвана увеличиваемой подвержения к PM2.58.
Были обследованы бактерий в различных местах в нескольких странах мира, в том числе в метро, ветеринарные больницы, скотобоен, компостирование удобства кожевенных заводов, молочный, угольных шахт, стоматологические клиники и закрытых средах9,10,11,12,13,14,,1516,17, генерации большое количество сообщений о биологических аэрозолей. Людных местах связанные с кампусов, животноводческих ферм и крупных городов в туманные дни являются три особенно важных общественных условия, для которых нам нужно изучать взаимосвязи между здоровьем человека и потенциальные последствия воздействия вечера. Кроме того во время зимних дней в северных городах Китая, высокие значения2,5 м могут повлиять на здоровье человека. Хотя, направляя дыхательной поверхности и растворяясь в крови18PM2.5 может генерировать токсические эффекты, это еще не ясно ли и как микробы, придает PM2.5 может повлиять на здоровье человека19 ,20. Животноводческие фермы являются одним из основных источников ТЧ и аэрозолей микроорганизмов в воздухе. Большое количество патогенов, таких как вирус гриппа и melitensis бруцеллы, которые проносятся аэрозолей в полях вокруг животноводческих ферм являются важными факторами, вызывая респираторные заболевания скота и птицы работников.
В этом исследовании мы исследовали несколько видов анализов биоаэрозоли, включая вечера количество мониторинга, Биоаэрозоль сбора и анализа биологического состава. Пробы воздуха были собраны сборники циклонической аэрозоля, пробоотборник большого объема воздуха с фильтрами и сборники шестиступенчатого Андерсен. Затем были проанализированы образцы, собранные в этих трех проб биологического анализа, включая бактериальные 16S рДНК и грибковых ее последовательности для определения их биологической композиции. Здесь мы покажем представитель результаты от Биоаэрозоль образцы, собранные в ходе Пекинской туманных дней и животноводческих ферм, указав, что биоаэрозоли может иметь большое воздействие на здоровье человека и животных. Сравнение между жидкости и фильтров, методы выборки были изучены также в этом исследовании, главным образом на основе данных из 16S ДНК и грибковых его последовательности.
Protocol
1. вечера количество мониторинга
- Использование бортовых лазерных частиц счетчик (см. Таблицу материалы) для определения общего числа вечера. Соберите PM порт проб воздуха на вершине бортовой лазерный счетчик частиц.
Примечание: Этот счетчик частиц — оборудование автоматизации, и он может работать независимо, когда программа включая время выборки, интервал, коллекция раз, и т.д. были установлены на его сенсорный экран.- Оборудовать инструмент с датчиков для мониторинга температуры и относительной влажности воздуха. Измерьте и запишите данные температуры и относительной влажности воздуха одновременно каждые 5 мин.
- В общей сложности, измерить и записать 6 различных частиц размер классов (0,3-0,5 мкм, 0,5-0,7 мкм, 0,7-2,5 мкм, мкм 2,5-5, 5-10 мкм и > 10 мкм) одновременно каждые 5 мин измеряют 4 другие классы размер частиц (0,3-0,5 мкм, 0.5-1 мкм, 1-3 мкм и ≥ 3 мкм).
- Сбор проб воздуха хотя выборки отверстие на вершине сэмплер и использовать тест модулей внутри сэмплер для измерения размера частиц каждого вечера. Затем данные сохраняются автоматически. Все выше процессы могут быть выполнены автоматически после относительной параметров, включая время выборки и подсчета диапазона, хотя установлены мини сенсорный дисплей бортового лазерный счетчик частиц.
Примечание: Этот счетчик частиц — оборудование автоматизации и имеет тестирования модулей, которые подсчитать количество ПП различных частиц размер классов.
- Для оценки экспериментальных стандартная ошибка, убедитесь, что различные частицы размера классов учитываются с по крайней мере 15 репликаций. Убедитесь, что показания хранятся во внутренней памяти инструмента и впоследствии проанализированы.
- Убедитесь, что анализ первичных данных включает вечера номер концентрации, теста ANOVA и процент вечера в каждом классе размер. Например, как показано на рисунке 1A, номер концентрации ТЧ в декабре (237.6 частиц/см3) были значительно выше, чем в октябре (средний: 110.2 частиц/см3) (ANOVA; P-value < 0,05). Рисунок 1B показывает, что количество частиц меньше, чем 3 мкм, приходилось более чем 99% от общего числа.
- Лазерный счетчик частиц позволяет контролировать число концентраций ТЧ и хранить данные автоматически. Используйте USB флэш-диск для экспорта данных в компьютере и выполнять теста ANOVA.
2. вечера Коллекция циклонической аэрозолей-пробоотборники
- Выполните пп выборки в открытой местности без каких-либо близлежащие крупные источники загрязнения на ∼2 м над землей.
- Запись позиции сайта выборки. Например, в городке Пекинского института технологии заключается в следующем: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Использование пробоотборника циклонической аэрозоля для сбора проб воздуха. Используйте Пробоотборник потока 323 Л/мин и время коллекция 6 ч.
Примечание: Скорость потока пробоотборник является фиксированной и не может быть изменен. Время сбора управляется вручную сроков как есть только кнопка запуска и остановки на этом сборники.- Используйте стерильную воду для мытья внутри сборники циклонической аэрозоля 3 раза до сбора и использовать функцию автоматической очистки 3 раза нажав непрерывно собирать 3 раза.
- Нажмите кнопку собрать для начала выборки и нажимайте кнопку насоса, чтобы остановить выборки. Положите сборники на полке или на полу с никто не удерживая ее на месте.
- Сохранить все образцы в темноте при температуре-20 ° C до последующего анализа.
3. вечера Коллекция фильтров
- Выполните пп выборки в открытой местности без каких-либо близлежащие крупные источники загрязнения на ∼2 м над землей.
- Запись позиции сайта выборки. Например, в городке Пекинского института технологии является следующим: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Сбор образцов ПП на 20.32 × 25,4 см2 фильтров (см. Таблицу материалы) с использованием пробоотборника воздуха большого объема (см. Таблицу материалы) на скорости потока 1000 Л/мин установить время потока скорость и коллекции относительной auto программирование.
- Сохранить все выбранные фильтры в темноте при температуре-20 ° C до последующего анализа.
4. биологического состава анализ
- Для анализа биологического состава, используйте каждого жидкого образца из образца циклонической аэрозоля сэмплер или фильтр для извлечения ДНК многоисточниковых экстракции ДНК Kit (см. Таблицу материалы) по данным производителя протоколы.
- Для образцов из пробоотборник большого объема воздуха с фильтрами используйте 1/8 каждого образца фильтра для экстракции ДНК. Установите фильтр в 50 мл трубки с лицом внутрь образца и обратно, обращенной к стенке трубки. Добавьте 10 бусин в центральных сайтов в сторону фильтр, содержащий образец.
- Вихрь трубки для 15 мин при комнатной температуре. Пипетка жидкости в трубе в чистой 50 мл пластиковых пробирок для продолжения процесса экстракции ДНК.
- Экстракт ДНК из образца процессы следующим образом.
- Центрифуга бактерии образца в 2000 x g 5 минут, удалить супернатант и приостановить бактерий в 2 мл стерильного PBS буфера.
- Собирать подвеска бактерий в 2-мл пробирку центрифуги и затем центрифуги на 2000 x g за 5 мин до надосадочную.
- Добавьте 350 мкл стерильных PBS буфера, содержащий взвешенных бактерий в решение.
- Добавление 0,8 мл РНКазы а.
- Добавить 150 мкл буфера CL и 8 мкл протеиназы K и сразу смешать, вихря, покачивая за 1 мин. После краткого центрифугирования в 1000 g x 30 (нет остатков на стене), поставил центробежные трубки в 56 ° C воды за 10 мин.
- В 12 000 x g добавьте 350 мкл буфера PD, и смесь для 30 s, а затем центрифуги для 10 мин.
- Поместите трубки подготовки ДНК в 2-мл пробирку центрифуги и передача смеси сделаны в шаге 4.2.6 для подготовки труб. Затем, центрифуги за 1 мин на 12000 x g.
- Отменить фильтрата, положил обратно содержимое тюбика подготовки в оригинальной 2 мл пластиковых пробирок и добавьте 50 мкл буфера W1. Центрифуга смесь 1 мин на 12000 x g.
- Отменить фильтрата, положил обратно содержимое тюбика подготовки в оригинальной 2 мл пластиковых пробирок и добавить 700 мкл буфера W2. Центрифуга смеси за 1 мин на 12000 x g. Повторите этот шаг для снова помойте с 700 мкл буфера W2.
- Отказаться от жидких отходов и положил обратно содержимое тюбика подготовки в оригинальной 2 мл пластиковых пробирок. Центрифуга смесь 1 мин на 12000 x g.
- Поместить содержимое тюбика подготовки ДНК в другой чистый 1,5 мл пластиковых пробирок и добавить 100 мкл элюента или обессоленной воды в середине мембраны в подготовке трубки (деионизированную воду или элюента был нагрет до 65 ° C). Разрешить смесь стоять при комнатной температуре в течение 1 мин и центрифуги смесь 1 мин на 12000 x g.
- Выполняйте количественные реального времени полимеразной цепной реакции (Q-RT-PCR) для количественного определения относительного обилия бактерий и грибков на фильтры забора проб.
- Используйте грунтовки следующим: для бактериальных 16S рДНК, 515F (5'-GTG ОСО GCM GCC ГКГ GTA А-3') и 806R (5'-GGA CTA CHV GGG ЛБВ CTA AT-3'); и для грибковых СТС, ITS1 (5'-TCC GTA GGT ГАА CCT ГКГ G-3') и ITS1 (5'-GCT ГКГ TTC TTC УВД Гат GC-3').
- Запустить Q-ПЦР-анализов в системе PCR реального времени (см. Таблицу материалы). RT-PCR условие: predegeneration, 95 ° C, 10 мин; вырождение, 95 ° C, 15 s; отжиг и расширение, 60 ° C, 1 мин; 40 циклов от дегенерации для отжига и расширение.
- Для анализа структуры бактериальных и грибковых сообщества усиливают регионе V1 – V3 бактериальных 16S рДНК и ее региона грибковых рРНК Оперон методом ПЦР.
- Используйте праймеры следующим: для бактерий, V1-9F (5′-CCT УВД КХЦ TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG АГТ TTG УВД MTG GCT ЦАГ-3′) и V3-541R (5 ′ ОСО TCT CAT КХЦ ТГК GTG TCT CCG акт ЦАГ-штрих-ACW TTA CCG КЭУ КТГ КТГ G-3′); и для грибов, СТС 3Ф (5'-CCT УВД КХЦ TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC УВД Гат ГАА ГАА CGC AGC-3') и СТС 4R (5'-ОСО TCT CAT КХЦ ТГК GTG TCT CCG акт ЦАГ-штрих-GCT CCT CCG CTT ATT Гат ATG C-3').
- Убедитесь, что смесь 20 мкл ГКДЗ включены 2 мкл дНТФ 2,5 мм, 4 мкл 5 × FastPfu буфера, 0,8 мкл каждого праймера (5 мкм), 0,4 мкл FastPfu полимеразы и 10 ng шаблона ДНК (см. Таблицу материалы).
- Используйте программу PCR следующим: 94 ° C за 5 мин; После 10 циклов 94 ° C за 30 s, 55-60 ° C для 45 s и 72 ° C для 90 s; 20 циклов 94 ° C за 30 сек, 55 ° C для 45 s и 72 ° C для 90 s; и окончательное расширение при 72 ° C за 5 мин.
- Выполнение очистки ДНК, ДНК квантификации и пиросеквенирования как описано в предыдущем исследовании 21.
5. Биоаэрозоль выборки и выращивания
- Использование международных стандартных сборники шестиступенчатого Андерсен (см. Таблицу материалы) для образца culturable бактерий и грибов при скорости потока 28,3 Л/мин использование выборки время 35 минут поставил пластину культуры на каждом этапе сэмплер. Недостаточно лечить сборники с 75% этилового спирта после каждой выборки.
Примечание: Скорость потока пробоотборник является фиксированной и время сбора управляется вручную сроков.- Образец шесть этапов с Андерсен шестиступенчатого сэмплер, который определяется аэродинамический диаметр частиц в воздухе, включая этап VI (0,65 – 1,1 мкм), этап V (1.1 – 2,1 мкм), этап IV (2,1 – 3,3 мкм), этап III (3,3 – 4,7 мкм), этап II (4,7-7.0 мкм) и этап I (≥7.0 мкм).
- Сбор частиц бактериального и депозит на пластину культуры на каждом этапе, содержащих агар дайджест сои-казеина (см. Таблицу материалы). Существует контейнер с многими воздухозаборники на вершине в каждом этапе сэмплер.
- Культуры бактерий коллекции пластины при 37 ° C в течение 24-48 ч; затем Подсчет чисел колонии бактерий на блюдо образца для каждого этапа.
- Чтобы предотвратить частицы, собранные сборники шестиступенчатого Андерсен из перекрывающихся, исправьте количество колоний на каждом уровне сборники по следующей формуле:
где Pr: Исправлено количество колоний на каждом уровне,
N: количество выборки отверстий сборники на всех уровнях (400), и
r: фактическое количество колоний. - Рассчитайте единицу колоний на3 м воздуха следующим образом:
где C: концентрация (CFU/м3),
N1-N6: Исправлена количество колоний на каждом уровне,
T: выборки время (мин), и
F: потока дискретизации (28,3 Л/мин). - Используйте методы из шагов 5.1 - 5.3 для изучения Биоаэрозоль в животноводческие фермы, включая четыре типа свинарников.
Примечание: Животноводческие фермы расположен в Чанчунь, Китай. Центральное положение 2 м над поверхностью земли в каждом свинарник был выбран в качестве выборки место.) После культуры бактерий лечить всех колоний в тарелки, как описано в шагах 6.1 - 6.2.
6. Идентификация Culturable бактерий
- После 48 часов или 72 ч культивирования поместите бактерии в 2-мл пробирку центрифуги. Извлечь ДНК этих бактерий или грибов с помощью многоисточниковых экстракции ДНК Kit (см. Таблицу материалы). Процесс извлечения ДНК описан в разделе 4.2.
- Используйте образец экстракции ДНК 200 мкл для секвенирования 16S рДНК . Используйте те же самые процессы, как описано в шагах 4.2, 4.3 и 4.4 на анализа биологического состава.
Representative Results
В этом исследовании мы провели оценку общего распределения вечера и всесторонний анализ биоаэрозоли в молочной ферме с сентября по декабрь. Многие экологические факторы распределения частиц аэрозоля. Мы изучили концентрации и размер дистрибутивов вечера в доме корова, используя лазерный счетчик частиц TSI. Как показано на рисунке 1A, концентрация частиц аэрозоля был самым высоким в декабре и самые низкие в октябре, которое может быть вызвано изменениями в температуре и влажности (Таблица 1). Концентрация ингаляции аэрозолей (0,3-3,0 мкм) приходилось более чем 99% концентрации всего частиц (рис. 1B), и частицы в этом диапазоне может достичь глубокого дыхательных путей, вызывая серьезные опасности для людей и животных.
Анализ образцов биологического состава может осуществляться извлечения ДНК, бактериальный 16SrDNA и грибковых ее региона последовательности вместо культуры микроорганизмов. Из биологического анализа Биоаэрозоль образцы, собранные с помощью пробоотборника циклонической аэрозоля или пробоотборник большого объема воздуха с фильтрами мы предварительно можно сравнить эффективность этих двух методов в сборе бактерий и грибков. На рисунке 2 показан результаты анализа образцов Биоаэрозоль, собранных в ходе Пекинской туманных дней в кампусе Пекинского института технологии в 20 декабря 2016. Для коллекции бактерий результаты показали, что сборники циклонической аэрозоля собрал много больше родов, чем пробоотборник большого объема воздуха с фильтрами (рисунок 2A). Для сбора грибов эти пробоотборников показали равной эффективности и почти же род распространённость (рис. 2B). Результаты представлены на рисунке 2мы смогли измерить различные коллекции эффективности этих двух методов для бактерий и грибков. Для бактерий коллекции сборники циклонической аэрозоля выполняются намного лучше, чем высокий объем воздуха сборники с фильтрами, потому что образцы из бывшей показал выше род изобилия (рисунок 2A). Однако анализ грибковых последовательности двух выборок из методов выборки показал почти идентичные общинных структур (рис. 2B).
Мы изучили culturable бактерий, используя семплер шестиступенчатого Андерсен. Как показано на рисунке 3, было сокращено число колонии culturable бактерий для частиц VI этап. Этап I частиц (величина частиц > 8.2 µm) имел наибольшее количество колоний culturable бактерий. Процент этап I колонии в четырех различных видов свинарники, включая опороса дом дом, беременных свиноматок, откорма дом и отлучения дом было 33%, 30%, 26% и 34%, соответственно. Доля этап II колоний в четырех различных видов свинарники составила 20%, 22%, 19% и 20% соответственно. Процент этап III колоний в четырех различных видов свинарники сделано 18%, 18%, 18% и 19% соответственно. Доля этап IV колоний в четырех различных видов свинарники составила 17%, 16%, 16% и 16% соответственно. Процент этап V колоний в четырех различных видов свинарники было 10%, 10%, 14% и 6% соответственно. Этап VI частиц (частиц размер < 1.0 µm) имели низкие числа колонии culturable бактерий. Процент этапа VI колоний в четырех различных видов свинарники был 3%, 5%, 6% и 5%, соответственно.
Пробы воздуха были собраны в четырех различных видов свинарники, используя семплер шестиступенчатого Андерсен и затем культивировали при подходящих условиях. Целом геном ДНК culturable бактерий, собранные из каждой стадии частиц извлечено и обнаружены бактериальных 16S рДНК и грибковых последовательности ее региона. В culturable бактерий в свинарники, были определены в общей сложности 91 родов и 158 видов бактерий. Culturable бактерии общинных структур в четырех различных видов свинарники, включая опороса дом, беременные сеять дом, откорма дом и отлучения дом показано на рисунке 4 с данными из стадии я к этапу VI . Содержание различных преобладающим бактериальных родов среди различных свинарники не одинакова.
Рисунок 1: концентрация и размер распределение вечера в четырех различных месяцев. (A) Boxplot вечера числа в течение периода исследования. Каждый boxplot включает в себя максимум, минимум, медиана, две квартили и аномальные значения базы данных. (B) средний размер карты распределения ТЧ. Было восемьдесят коров в доме с сентября по декабрь. Процент вечера (≥ 3 мкм) в четыре месяца (Сентябрь, Октябрь, Ноябрь и декабрь) был 0,005, 0,005, 0,002 и 0,002 соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: биологические анализ образцов Биоаэрозоль собранные двух пробоотборников. (A) и (B) показывают распространённость бактериальной или грибковой родов в Биоаэрозоль проб, полученных с различных коллекции методов. Пробоотборник воздуха смачиваются стенки представляет собой сборники циклонической аэрозоля. Фильтры кварцевые представляет пробоотборник большого объема воздуха с фильтрами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: средняя карты иерархического распределения culturable бактерий в четырех типах свинарники. Четыре типа свинарники опороса дом дом, беременных свиноматок, откорма дом и отлучение дом. S1 для S6 представляют этапы шесть частиц (I-VI) собраны сборники шестиступенчатого Андерсен. Были определены этапы аэродинамический диаметр частиц в воздухе, включая этап VI (0,65-1,1 мкм), этап V (1.1-2,1 мкм), этап IV (2.1-3,3 мкм), III (3,3-4,7 мкм) этап, этап II (4,7-7.0 мкм) и этап I (7.0 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: бактериальные общинных структур с различными распространённость в пробах воздуха. Пробы воздуха были собраны в четырех различных видов свинарники, используя семплер шестиступенчатого Андерсен и затем культивировали при подходящих условиях. ДНК всего генома culturable бактерий в каждом этапе частиц собраны сборники шестиступенчатого Андерсен было извлечено и определяется последовательность бактериальной 16S рДНК . Цифры от 1 до 6 в каждом типе свинарник представляют частиц этапов I – VI измеряется в сборники шестиступенчатого Андерсен. Текст на правой стороне включает в себя научное название для каждой бактерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
В этом исследовании мы предоставили некоторые представитель результаты, которые были получены в туманные дни и в животноводческих ферм. Результаты от Биоаэрозоль проб, взятых в Пекине туманные дни способствует более глубокого понимания биологической композиции биологического состава вечера без вечера во время Пекин туманных дней. Результаты проб, взятых из животноводческих ферм также будет предоставлять базовые данные для окружающей среды воздуха quality control в свинарники и теоретические основы и техническую поддержку для разведения здоровой и безопасной продукции в животноводческих ферм. Многие экологические факторы, такие как температура, влажность и скорость ветра, могли бы способствовать распределению аэрозольных частиц в дом коровы (рис. 1). Предыдущие исследования показали, что вечера в животноводческих ферм главным образом исходит от корма, фекалии, мех и перо, которое может быть связано с животного деятельности. Экологических факторов может повлиять не только животного деятельности, но также агрегации и диффузии вечера в доме относительно закрытый корова. Таким образом мы обнаруживаем различной концентрации и распределением размера ТЧ в четырех различных месяцев. Кроме того санитарное состояние, кормления метод и животное деятельности отличались между четырьмя типами свинарники, которые также могут повлиять на структуру их сообщества culturable бактерий в воздухе (рис. 4).
Однако в этом исследовании, мы главным образом сосредоточена на доступные методы, которые мы могли бы использовать для изучения состава и распределения биоаэрозоли в различных экологических условиях. По сравнению с другими микробиологических образцов, те воздухе микроорганизмов имеют очень низкие концентрации и смешиваются с большим количеством примесей, таких как пыль неорганических частиц, которые ввести определенные трудности во время сбора и обнаружение такие микроорганизмы21. Таким образом надлежащие методы сбора и определения должны быть выбраны для микробной аэрозолей. Микробные аэрозольных проб обычно выполняется с помощью метода осадков или специализированного оборудования для сбора микроорганизмов в жидкость, полутвердой или твердых проб средний22,23,24 . Затем некоторые соответствующие технические лечение и конкретных тестирования и анализа впоследствии совершили25. Средних проб должны держать нетронутыми уменьшить ошибки, связанной с выявления и анализа26микроорганизмов. Однако пробоотборники различных аэрозолей микроорганизмов имеют различное влияние на целостность образцов из-за их принципы различных проб и средства массовой информации. Люди разработали много видов Биоаэрозоль проб, которые используют различные выборки принципы, такие как инерционного сдавление, сопротивление фильтрации и электростатическое осаждение27.
Влияющих пробоотборники может подтолкнуть воздухе вечера в средних проб на высокой скорости с помощью извлечения оборудования. Существует два типа влияющих пробоотборники: твердых и жидких. Твердых, влияющих пробоотборники может использоваться для выборки биоаэрозоли в низкой концентрации и может быть почти непроницаемой для воздушного потока28. Можно предварительно проверку аэрозольных частиц различных размеров, и микробов можно заказать непосредственно в питательной среды, который увеличивает выживаемость culturable микроорганизмов10. За счет инерционных воздействия микробной аэрозольные частицы легко столкнуться в том же месте, и колоний могут перекрываться легко после культуры. В настоящее время наиболее распространенных твердых влияющих сборники является сборники микробной аэрозоля Андерсен-6. В этом исследовании мы использовали Андерсен шестиступенчатого сборники для изучения culturable бактерий, распределенных в воздухе ТЧ разных размеров.
Циклонической аэрозолей-пробоотборники использовать циклоны спираль воздуха на высокой скорости в цилиндр или конус. Биоаэрозоль частицы могут быть разделены от воздуха центробежной силы, которая означает, что микробы могут наткнуться на внутренней стенке пробоотборника и затем собираться в буфере выборки. Этот метод является удобным и может использоваться для долго выборки раз в большой поток и выборочное операций. Однако этот метод не может осуществляться при низких температурах, поскольку операции зависит от жидкости. Сборники циклонической аэрозоля, используемые в данном исследовании является циклоническая смачиваются стенки аэрозоля сэмплер, который может извлекать и передавать бортовых патогенов и частиц из пробы воздуха в небольшой объем воды для анализа29.
Пробоотборники фильтр может работать в условиях низких температур и могут отведать частиц выше определенного размера. Однако они имеют большое влияние на микробную активность и подвержены повреждениям, которые окажут большое влияние последующего исследования выборки деятельности. В этом исследовании были собраны пробы Биоаэрозоль из Пекина туманных дней с помощью пробоотборника воздуха большого объема с фильтрами и сборники циклонической аэрозоля. Цель этого эксперимента заключалась в анализирует состав биологических вечера без разделения и культивирование микробов в воздухе. Таким образом эти два метода выборки были пригодны для этого исследования. Для метода сборники циклонической аэрозоля переносимых по воздуху микробов в низкой концентрации могут быть легко извлечены в идущий буфер и затем могут быть проанализированы удобно без дополнительного лечения, который обычно используется для фильтрации образцов. В это исследование, эти два методы выборки, циклонные аэрозоля сборники и фильтр сэмплер показали эффективность различных проб. Дополнительное лечение, которое обычно используется для фильтрации образцов, таких как восстановление образец из фильтра, является одним из основных различий между этими двумя методами. Кроме того пробы воздуха были собраны непосредственно в идущий буфер сборники циклонической аэрозоля в то время как другой метод пробы на фильтры. Характеристики различных типов метода выборки может способствовать эффективности этой выборки. Мы можем предположить, что сборники циклонической аэрозолей является лучшим выбором для коллекции микроорганизмов, и это предположение необходимо дальнейшее подтверждение.
В этом исследовании бактериальных 16S рДНК и грибковых последовательности ее региона были использованы для выполнения биологического анализа биоаэрозоли. 16SrDNA последовательности является определение сегментов 16S рДНК в микробных геномов30. 16S рДНК широко существует в прокариотах с высокой природоохранной и специфике, что делает его полезным для идентификации видов микроорганизмов31. Целом-генома требует только добыча геномной ДНК и последующих последовательности. В дополнение к производству большое количество данных, этот процесс также позволяет более всесторонний анализ структуры микробных сообществ. Кроме того метагеномики может также использоваться в этой области исследования, предоставляя больше информации в будущем. Handelsman et al. впервые предложил концепцию metagenome в 1998 году документе на микробы в почве32. В последующие исследования концепция metagenome постепенно была принята, и было проведено много исследований на микробы, включены в человеческий кишечник, океан и почвы33,34,35. При поддержке высокопроизводительного секвенирования технология, метагеномики быстро развивается, и она играет все более важную роль в изучении обнаружения патогена. Традиционные микробиологические методы исследования главным образом полагаться на культуру для разделения и очистки. Однако многие исследования не могут осуществляться, поскольку более 99% микробов не культивировали. В отличие от традиционных методов метагеномики может занять генетической информации о всех микробов в окружающей среде в целом, без необходимости для разделения отдельных организмов36. Всесторонний анализ всех результате микроорганизмов может проводиться непосредственно.
В целом это исследование показало, несколько обнаружения, отбор проб и методы анализа, которые могут быть использованы для исследований по вопросам биологического состава окружающей среды вечера, включая вечера мониторинга; PM проб сборники шестиступенчатого Андерсен, пробоотборник большого объема воздуха с фильтрами или сборники циклонической аэрозоля; и последующего анализа биологической основе секвенирования ДНК. На практике эти методы могут использоваться в различных экологических условиях, таких как много видов животноводческих ферм. Другие исследователи во всем мире, изучить воздействие грибковых и бактериальных биоаэрозоли в окружающей среде на здоровье могут помочь наши протоколы и результаты.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Финансовая поддержка этого исследования пришли из Фонда национального естественных наук Китая (№ 41775148). Спонсоры имел никакой роли в дизайн исследования, сбор данных и анализ, решение опубликовать или подготовка рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
- Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
- Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
- Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
- Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
- Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
- Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
- Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
- Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
- Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
- Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
- Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
- Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
- Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
- Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
- Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
- Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
- Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
- Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
- Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
- Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
- Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
- Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
- Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
- Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
- Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
- Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
- Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
- Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
- Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
- Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
- Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
- Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
- Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).
