Summary
Förstå den biologiska sammansättningen av miljömässiga partiklar är viktigt för studien av dess betydande effekter på människors hälsa och sjukdom som sprids. Här använde vi tre typer av bioaerosol provtagningsmetoder och en biologisk analys av luftburna mikrober för att utforska luftburna mikrobiella samhällen under olika miljöförhållanden.
Abstract
Variabel mikroorganismer i partiklar (PM) under olika miljöförhållanden kan ha betydande påverkan på människors hälsa. I denna studie beskrev vi ett protokoll för flera analyser av biologiska kompositioner i miljömässiga PM. fem experiment presenteras: (1) PM nummer övervakning med hjälp av en laser partikelräknare; (2) PM samling genom att använda en cykloniska aerosol sampler; (3) PM samling genom att använda en hög volym air sampler med filter; (4) odlingsbara mikrober samling av Andersen sex-stegs sampler; och (5) upptäckt av biologiska sammansättning av miljömässiga PM av bakteriell 16SrDNA och svamp ITS regionen sekvensering. Vi valde dimmiga dagar och en boskap gård som två typiska exempel av ansökan i detta protokoll. I denna studie, dessa två provtagningsmetoder, cyklonisk aerosol sampler och filter sampler, visade olika provtagning effektivitet. Cykloniska aerosol sampler presterade mycket bättre när det gäller att samla bakterier, medan dessa två metoder visade samma effektivitet i att samla svampar. Filter provtagare kan fungera under låg temperatur medan cykloniska aerosol provtagare har en provtagning begränsning för temperatur. En solid påverkar sampler, såsom en Andersen sex-stegs sampler, kan användas till exempel bioaerosoler direkt i odlingsmediet, vilket ökar överlevnaden av odlingsbara mikroorganismer. Den här metoden kräver dock främst kultur medan mer än 99% av mikrober inte kan vara odlade. DNA extraheras från de odlingsbara bakterier som samlas in av Andersen sex-stegs sampler och prover som samlats in av cykloniska aerosol sampler och filter sampler upptäcktes av bakteriell 16S rDNA och svamp ITS regionen sekvensering. Alla metoderna ovan kan ha bred tillämpning i många ämnesområden, till exempel miljöövervakning och upptäckt av airborne patogen. Från dessa resultat kan vi konstatera att dessa metoder kan användas under olika förhållanden och kan hjälpa andra forskare ytterligare utforska miljön bioaerosoler hälsoeffekter.
Introduction
I naturliga miljöer finns olika typer av mikroorganismer i bioaerosoler, inklusive svampar, bakterier, virus och andra mikroorganismer1. Luftburna mikroorganismer som kan avges från vissa mänskliga aktiviteter såsom djurens utfodring operationer på gårdar med husdjursskötsel, är viktiga innehållet i den stämningsfulla miljö2. Dessa mikroorganismer kan inte bara spela viktiga roller i den stämningsfulla miljön men också har betydande påverkan på människors hälsa och sjukdomar sprids.
Som ett viktigt sätt för spridning av sjukdomar, har mikrobiella aerosoler uppmärksammats stort i hela världen. I färska studier befanns många sjukdomar vara associerade med den komplexa sammansättningen av miljömässiga partiklar (PM) på olika platser, såsom kemiska fabriker, djurgårdar och avgasfyllda städer3,4. PM biologiska sammansättning kan bidra till vissa respiratoriska och kardiovaskulära sjukdomar i PM-exponerade människor5. Olika organ regioner, såsom slemhinnor, hud, mag-tarmkanalen och luftvägarna, kan vara potentiella mål av mikrober som bifogas PM6,7. En ökad risk för lungcancer kan orsakas av långvarig exponering för PM2.58.
Luftburna bakterier har besiktigats på olika platser i flera länder runt om i världen, inklusive tunnelbanestationer, veterinärmedicinska sjukhus, slakterier, kompostering faciliteter, garverier, mjölk-och-eller bearbetningsanläggningar, kolgruvor, tandvårdskliniker och inomhusmiljöer9,10,11,12,13,14,15,16,17, generera en stort antal rapporter om biologiska aerosoler. Trånga platser associerade med campus, boskap gårdar och stora städer under dimmiga dagar är tre särskilt viktiga allmänna villkor som vi behöver undersöka kopplingarna mellan människors hälsa och de potentiella effekterna av PM exponering. Dessutom under vinterdagar i de norra städerna i Kina, kan höga PM2.5 värden påverka människors hälsa. Även om PM2.5 kan generera toxiska effekter genom att rikta andnings ytor och upplösning i blod18, är det fortfarande inte klart om och hur mikroberna bifogas PM2.5 potentiellt kan påverka människors hälsa19 ,20. Djurgårdar är en av de viktigaste källorna till PM och mikrobiella aerosoler i luften. Det stora antalet patogener, såsom influensavirus och Brucella melitensis, som bärs av aerosoler i fälten runt djurgårdar är viktiga faktorer orsakar luftvägssjukdomar i både boskap och fjäderfä arbetstagare.
I denna studie utforskade vi flera typer av analyser av bioaerosoler, inklusive PM nummer övervakning, bioaerosol insamling och biologiska sammansättning analys. Luftprover samlades in genom en cykloniska aerosol sampler, en hög volym air sampler med filter och en Andersen sex-stegs sampler. Sedan analyserades proverna samlas in av dessa tre provtagare av biologisk analys inklusive bakteriell 16S rDNA och svamp ITS sekvensering att bestämma deras biologiska kompositioner. Häri, visar vi representativa resultat från bioaerosol proven uppsamlade under Beijing dimmiga dagar och djurgårdar som anger att bioaerosoler kan ha stor inverkan på människors och djurs hälsa. Jämförelsen mellan vätska och filter provtagningsmetoder undersöktes också i denna studie främst baserat på data från 16S DNA och svamp ITS sekvensering.
Protocol
1. PM nummer övervakning
- Använda en luftburna laser partikel counter (se Tabell för material) för att avgöra det totala antalet PM. Samla in PM av luft provtagning port på toppen av den luftburna laser partikelräknare.
Obs: Denna partikelräknare är en automationsutrustning och det kan arbeta självständigt när programmet inklusive provtagningstiden, intervall, samling gånger, etc. har ställts in på dess pekskärm.- Förse instrumentet med en sensor för att övervaka temperatur och relativ fuktighet. Mäta och registrera temperatur och relativ fuktighet data samtidigt var 5 minut.
- Totalt, mät och anteckna 6 olika partikel storleksklasser (0,3-0,5 μm, 0,5-0,7 μm, 0,7-2,5 μm, 2,5-5 μm, 5-10 μm och > 10 μm) samtidigt varje 5 min. mäta 4 andra partikel storleksklasser (0,3-0,5 μm, 0,5-1 μm, 1-3 μm och ≥ 3 μm).
- Samla luftprover dock provtagning hålet ovanpå sampler och använda modulerna test inuti sampler för att mäta varje PM partikelstorlek. Sedan lagras data automatiskt. Alla ovanstående processer kan utföras automatiskt efter de relativa parametrar, inklusive provtagningstid och räknar utbud, ställs dock den mini touch displayer av den luftburna laser partikelräknare.
Obs: Denna partikelräknare är en automationsutrustning och har test moduler som räknar antalet PM av olika partikel storleksklasser.
- För att bedöma experimentell standardfel, säkerställa att olika partikel storleksklasser räknas med minst 15 replikeringar. Säkerställa att mätvärden lagras i det interna minnet av instrumentet och därefter analyseras.
- Säkerställa att analys av primära data innehåller PM nummer koncentration, ANOVA testet och procentandelen av PM i varje storleksklass. Till exempel som visas i figur 1A, PM nummer halterna i December (237,6 partiklar/cm3) var signifikant högre än dem i oktober (genomsnittliga: 110,2 partiklar cm3) (ANOVA; P-Value < 0,05). Figur 1B visar att antalet partiklar mindre än 3 μm stod för mer än 99% av det totala antalet.
- Använd den laser partikelräknare att övervaka PM nummer koncentrationerna och lagra data automatiskt. Använda en USB-flashdisk för att exportera data i datorn och utföra det ANOVA-testet.
2. PM samling av cykloniska Aerosol provtagare
- Utföra PM provtagning i ett öppet område utan någon närliggande större föroreningskällor ∼2 m över marken.
- Spela in positionen för webbplatsen för provtagning. Campus i Beijing Institute of Technology är exempelvis följande: 39 ° 57' 51,0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Använda en cykloniska aerosol sampler för att samla luftprover. Använd en sampler flödet av 323 L/min och en upphämtning av 6 h.
Obs: Sampler flödet är fast och kan inte ändras. Upphämtningstid styrs av manuell tidsangivning som det finns endast en Start och stopp knapp på denna sampler.- Använd sterilt vatten för att tvätta insidan av den cykloniska aerosol sampler 3 gånger innan samling, och funktionen för automatisk rengöring 3 gånger med kontinuerligt samla in knappen 3 gånger.
- Tryck på knappen samla att starta provtagning och tryck på pumpen för att stoppa provtagning. Sätta på färgprovet på en hylla eller golv med ingen håller det på plats.
- Bevara alla prover i mörker vid-20 ° C tills de efterföljande analyserna.
3. PM samling av filter
- Utföra PM provtagning i ett öppet område utan någon närliggande större föroreningskällor ∼2 m över marken.
- Spela in positionen för webbplatsen för provtagning. Campus i Beijing Institute of Technology är exempelvis följande: 39 ° 57' 51,0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Samla in PM proverna på 20.32 x 25,4 cm2 filter (se Tabell för material) med hjälp av en hög volym air sampler (se Tabell för material) med en flödeshastighet av 1000 L/min. Ange flödet klassar och samling tid genom relativa auto-programmering.
- Bevara alla samplade filter i mörker vid-20 ° C tills de efterföljande analyserna.
4. biologiska sammansättning analys
- För biologiska sammansättning analys, använda varje flytande prov från cykloniska aerosol sampler eller filtrera provet för DNA-extraktion av en flerkällig DNA-extraktion Kit (se Tabell för material) enligt tillverkarens protokollen.
- För prover från hög volym air sampler med filter, Använd 1/8 av varje filter prov för DNA-extraktion. Att sätta filtret i en 50 mL tub med provet inåt och baksidan vänd mot rörväggen. Lägga till 10 pärlor i centrala platser mot sidan av filtret med provet.
- Vortex röret under 15 minuter vid rumstemperatur. Pipettera över vätskan i röret till en ren 50 mL centrifugrör att fortsätta DNA extraktionsprocessen.
- Extrahera DNA från provet genom processerna som följer.
- Centrifugera provet bakterier vid 2000 x g i 5 min, avlägsna supernatanten och avbryta bakterier i 2 mL steril PBS-bufferten.
- Samla upphävandet av bakterier i en 2 mL centrifugrör och sedan Centrifugera vid 2000 x g i 5 min att Kassera supernatanten.
- Tillsätt 350 μL av sterila PBS-bufferten innehållande suspenderade bakterierna till lösningen.
- Tillsätt 0,8 mL RNase A.
- Tillsätt 150 μl buffert cl och 8 μL av proteinas K, och blanda omedelbart av virvel skakar för 1 min. Efter kort centrifugering vid 1 000 x g i 30 s (inga rester på väggen), sätta centrifugal röret i 56 ° C vatten i ca 10 min.
- Tillsätt 350 μL buffert PD, och blanda i 30 s och sedan Centrifugera i 10 min vid 12 000 x g.
- Placera DNA förberedelse röret i en 2 mL centrifugrör och överför blandningen gjorde i steg 4.2.6 till förberedelse röret. Sedan Centrifugera i 1 minut vid 12 000 x g.
- Kassera filtratet, sätta tillbaka innehållet i förberedelse röret i det ursprungliga 2 mL centrifugröret och tillsätt 50 μL buffert W1. Centrifugera blandningen för 1 min på 12 000 x g.
- Kassera filtratet, sätta tillbaka innehållet i förberedelse röret i det ursprungliga 2 mL centrifugröret och tillsätt 700 μL buffert W2. Centrifugera blandningen i 1 min på 12.000 x g. Upprepa detta steg att tvätta igen med 700 μL buffert W2.
- Kassera avfall vätskan, och sätta tillbaka innehållet i förberedelse röret i det ursprungliga 2 mL centrifugröret. Centrifugera blandningen för 1 min på 12 000 x g.
- Placera innehållet i DNA förberedelse röret i en annan ren 1,5 mL centrifugrör och tillsätt 100 μL av eluenten eller avjoniserat vatten till mitten av membranet i förberedelse röret (avjoniserat vatten eller eluenten värmdes till 65 ° C). Låt blandningen stå i rumstemperatur i 1 min och centrifugera blandningen för 1 min på 12 000 x g.
- Utföra kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (Q-RT-PCR) för att kvantifiera de relativa förekomsten av bakterier och svampar på provtagningsfiltren.
- Använd grundfärg enligt följande: för bakteriell 16S rDNA, 515F (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') och 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); och för svamp ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') och ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC-GAT GC-3').
- Köra de Q-RT-PCR-analyserna på en Real-Time PCR-System (se Tabell för material). RT-PCR skick: predegeneration, 95 ° C, 10 min; degeneration, 95 ° C, 15 s; glödga och förlängning, 60 ° C, 1 min; 40 cykler från degeneration att glödga och förlängning.
- För bakteriell och fungal gemenskapens strukturanalys, förstärka regionen V1 – V3 i den bakteriella 16S rDNA och regionen ITS i den svamp rRNA operon med PCR.
- Använda primers som följer: för bakterier, V1-9F (5′-CCT ATC-CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC-MTG GCT CAG-3′) och V3-541R (5′-CCA TCT katt CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-streckkod-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3′); och för svampar, ITS-3F (5'-CCT ATC-CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC-GAT GAA GAA CGC AGC-3') och ITS-4R (5'-CCA TCT katt CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-streckkod-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C-3').
- Se till att 20 μL blandningen av primärvården ingår 2 μL av 2,5 mM dNTP, 4 μL av 5 × FastPfu buffert, 0.8 μL av varje grundfärg (5 μM), 0,4 μL FastPfu polymeras, och 10 ng av DNA (se Tabell för material).
- Använda programmet PCR enligt följande: 94 ° C i 5 min; följt av 10 cykler av 94 ° C för 30 s, 55-60 ° C för 45 s, och 72 ° C för 90 s; 20 cykler av 94 ° C för 30 s, 55 ° C för 45 s och 72 ° C för 90 s; och en sista förlängning vid 72 ° C i 5 min.
- Utföra DNA rening, DNA kvantifiering och pyrosekvensering som beskrivs i en tidigare studie 21.
5. Bioaerosol provtagning och odling
- Använder en internationell standard Andersen sex-stegs sampler (se Tabell för material) för att prova odlingsbara luftburna bakterier och svampar med en flödeshastighet av 28,3 L/min. Använd en provtagning tid 35 min. satte kultur plattan i varje skede av sampler. Tillräckligt desinficera sampler med 75% etylalkohol efter varje provtagning.
Obs: Sampler flödet är fast och samling tiden styrs av manuell tidsangivning.- Prov i sex etapper med Andersen sex-stegs sampler, som definieras som de aerodynamiska diametrarna av luftburna partiklar, inklusive arrangerar VI (0,65 – 1,1 μm), stage V (1.1 – 2.1 μm), stage IV (2.1 – 3.3 μm), etapp III (3,3 – 4,7 μm), steg II (4,7 – 7,0 μm) och steg I (≥7.0 μm).
- Samla de bakteriella partiklarna och insättning på kultur plattan i varje etapp som innehåller sojabönor-kasein Digest Agar (se Tabell för material). Det finns en behållare med många luftintag högst upp i varje skede av sampler.
- Kultur luftburna bakterier samling plattorna vid 37 ° C under 24-48 h. sedan räkna kolonin antalet bakterier på prov skålen för varje etapp.
- För att förhindra de partiklar som samlas in av Andersen sex-stegs sampler från överlappande, korrigera antalet kolonier på varje sampler nivå genom följande formel:
där Pr: korrigeras antalet kolonier på varje nivå,
N: antal stickprov hål av provtagaren på alla nivåer (400), och
r: det faktiska antalet kolonier. - Beräkna enheten av kolonier per m3 luft enligt följande:
där C: koncentration (CFU/m3),
N1-N6: korrigerade antalet kolonier på varje nivå,
T: provtagning tid (min), och
F: provtagning flödeshastighet (28,3 L/min). - Använda metoder från steg 5.1 - 5.3 att studera bioaerosol i boskap gård, inklusive fyra typer av svinhus.
Obs: Boskap gården ligger i Changchun, Kina. Mittläget 2 m över marken i varje griserier valdes som provtagning läge.) Efter kultur av bakterier, behandla alla kolonier i plattorna som beskrivs i steg 6.1 - 6.2.
6. identifiering av odlingsbara bakterier
- Efter 48 h eller 72 h av odling, placera bakterierna i en 2 mL centrifugrör. Extrahera DNA av dessa bakterier eller svampar med hjälp av en flerkällig DNA-extraktion Kit (se Tabell för material). DNA extraktionsprocessen beskrivs i avsnitt 4.2.
- Använda 200 μL DNA extraktion-prov för 16S rDNA sekvenser. Använda samma processer som beskrivs i steg 4.2, 4.3 och 4.4 på biologiska sammansättning analys.
Representative Results
I denna studie genomfört vi en utvärdering av den övergripande PM distributionen och en omfattande analys av bioaerosoler i ett mejeri från September till December. Många miljöfaktorer bidra till fördelningen av aerosolpartiklar. Vi studerade de koncentration och storlek distributionerna av PM i ett ko-hus med hjälp av en TSD laser partikelräknare. Som visas i figur 1A, var koncentrationen av aerosolpartiklar högst i December och lägst i oktober, vilket kan orsakas av förändringar i temperatur och luftfuktighet (tabell 1). Koncentrationen av inandningsbar aerosolpartiklar (0,3-3,0 µm) stod för mer än 99% av den totala partikel koncentrationen (figur 1B) och partiklar i detta intervall kunde nå de djupa luftvägarna, orsakar allvarliga faror för människor och djur.
Biologiska sammansättning analys av prover kan utföras av DNA-extraktion, bakteriell 16SrDNA och svamp ITS regionen sekvensering istället för mikroorganism kultur. Från den biologiska analysen av bioaerosol prover samlas in med hjälp av en cykloniska aerosol sampler eller en hög volym air sampler med filter, kan vi preliminärt jämföra effektivitetsvinsterna av dessa två metoder att samla in bakterier och svampar. Figur 2 visade analysresultaten av de bioaerosol prover som samlats in under Beijing dimmiga dagarna i campus i Beijing Institute of Technology i 20 December 2016. För insamling av bakterier indikerade resultaten att den cykloniska aerosol sampler samlat in många fler släkten än hög volym air sampler med filter (figur 2A). För insamling av svampar visade dessa provtagare lika samling effektivitetsvinster och nästan de samma släkte sammansättning (figur 2B). Från de resultat som presenteras i figur 2, kunde vi mäta de olika samling effektivitetsvinsterna av dessa två metoder för bakterier och svampar. För insamling av bakterier, cyklonisk aerosol sampler utförs mycket bättre än den hög volymen air sampler med filter eftersom proverna från den tidigare visade en högre släkte överflöd (figur 2A). Svamp sekvensering analysen av de två proverna från olika provtagningsmetoder visade dock nästan identiska gemenskapens strukturer (figur 2B).
Vi studerade luftburna odlingsbara bakterier med hjälp av en Andersen sex-stegs sampler. I figur 3visas kolonin numrerar av odlingsbara bakterier för stadium I-VI partiklar reducerades. Steg I partiklar (partikel storlek > 8,2 µm) hade flest odlingsbara bakterier kolonier. Andelen steg I kolonier i fyra olika typer av svinhus inklusive grisning hus, gravid sugga hus, hus som gödning och avvänjning hus var 33%, 30%, 26% 34%, respektive. Procentandelen av etapp II kolonier i fyra olika typer av svinhus var 20%, 22%, 19% och 20% respektive. Procentandelen av etapp III kolonier i fyra olika typer av svinhus var 18%, 18%, 18% och 19% respektive. Procentandelen av stadium IV kolonier i fyra olika typer av svinhus var 17%, 16%, 16% och 16% respektive. Procentandelen av scenen V kolonier i fyra olika typer av svinhus var 10%, 10%, 14% och 6% respektive. Scenen VI partiklar (partikel storlek < 1,0 µm) hade det lägsta antalet odlingsbara bakterier kolonier. Procentandelen av scenen VI kolonier i fyra olika typer av svinhus var 3%, 5%, 6% och 5%, respektive.
Luftprover samlades i fyra olika typer av svinhus med hjälp av en Andersen sex-stegs sampler och odlade sedan under lämpliga betingelser. Helgenom-DNA av odlingsbara bakterierna samlas in från varje partikel etapp var utdraget och upptäcks av bakteriell 16S rDNA och svamp ITS regionen sekvensering. Totalt 91 släkten och 158 arter av bakterier identifierades i odlingsbara bakterierna i svinhus. Odlingsbara bakterier gemenskapens strukturer i fyra olika typer av svinhus, inklusive grisning hus, gravid sugga hus, gödning hus och avvänjning hus visas i figur 4 med data från scenen jag till scenen VI. Innehållet i olika dominerande bakteriell släkten är inte samma bland olika svinhus.
Figur 1: koncentration och storlek distribution av PM i fyra olika månader. (A) Boxplot PM antal under studietiden. Varje lådagram inkluderar maximalt, minimum, median, två kvartiler och onormal värdet av databasen. (B) genomsnittliga storlek distribution kartor över PM. Det fanns åttio kor i huset från September till December. Procentandelen av PM (≥ 3 µm) i fyra månader (September, oktober, November och December) var 0,005, 0,005, 0,002 0,002 respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: biologiska analys av bioaerosol prover som samlats in av två provtagare. (A) och (B) Visa på förekomsten av bakterie- eller svampinfektioner släkten i bioaerosol produktproverna med olika insamlingsmetoder. Befuktas-Wall Air Sampler representerar den cykloniska aerosol sampler. Quartz-filter representerar hög volym air sampler med filter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: genomsnittlig hierarkisk utbredningskartor odlingsbara bakterier i fyra typer av svinhus. Fyra typer av svinhus grisning hus, gravid sugga hus, gödning hus och avvänjning hus. S1 till S6 representerar sex partikel faser (I-VI) samlas in av Andersen sex-stegs sampler. Arrangerar definierades som de aerodynamiska diametrarna av luftburna partiklar, inklusive scenen VI (0,65-1,1 µm), stage V (1.1-2.1 µm), stage IV (2.1-3.3 µm), etapp III (3.3-4,7 µm), steg II (4,7-7.0 µm) och steg I (7,0 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bakteriell gemenskapens strukturer med olika sammansättning i luftprover. Luftprover samlades i fyra olika typer av svinhus med hjälp av en Andersen sex-stegs sampler och odlade sedan under lämpliga betingelser. Helgenom-DNA av odlingsbara bakterier i varje partikel etapp insamlade av Andersen sex-stegs sampler var utdraget och upptäcks av bakteriell 16S rDNA sekvenser. Siffrorna 1 till 6 i varje typ av griserier representerar partikel faser I till VI mätt av Andersen sex-stegs sampler. Släktnamnet för varje bakterie innehåller texten på höger sida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
I denna studie gett vi några representativa resultat som erhölls under dimmiga dagar och på gårdar med husdjursskötsel. Resultaten från bioaerosol Prover tagna under Beijing dimmiga dagar underlättat en bättre förståelse av de biologiska kompositionerna av biologiska sammansättningen av PM utan PM närvarande under Beijing dimmiga dagar. Resultaten från prover tagna från djurgårdar ska också ge grundläggande data för ventilationsutrymmen quality control i svinhus och en teoretisk grund och teknisk support för sund avel och säker produktion på gårdar med husdjursskötsel. Många miljömässiga faktorer, såsom temperatur, fuktighet och vindhastighet, kan bidra till fördelningen av aerosolpartiklar i Ko huset (figur 1). Tidigare studier har visat att PM på gårdar med husdjursskötsel kommer främst från foder, avföring, päls och fjäder, som kan vara relaterade till djurens verksamhet. Miljöfaktorer kan påverka inte bara djurens aktiviteter, men också aggregering och diffusion av PM i en relativt sluten kostallet. Därför, vi upptäcker olika koncentrationer och storlek distributioner av PM i fyra olika månader. Dessutom var det sanitära villkoret, utfodring metod och djurens aktivitet olika mellan fyra typer av svinhus, som också kan påverka deras gemenskapens struktur av odlingsbara bakterier i luften (figur 4).
Men i denna studie fokuserat vi främst på de tillgängliga metoderna som vi kunde använda för att studera komposition och distribution av bioaerosoler under olika miljöförhållanden. Jämfört med andra mikrobiella prover, de av luftburna mikroorganismer har mycket låga koncentrationer och blandas med ett stort antal föroreningar, såsom oorganiska dammpartiklar, som inför vissa svårigheter under insamling och identifiering av sådana mikroorganismer21. Lämpliga metoder för insamling och identifiering bör därför väljas för mikrobiella aerosoler. Mikrobiella aerosoler provtagning utförs vanligtvis med hjälp av nederbörd metod eller specialutrustning för att samla mikroorganismerna i fast, halvfasta eller flytande provtagning medium22,23,24 . Sedan, några motsvarande teknisk behandling och specifik provning och analys därefter genomförs25. Provtagning medium bör hålla mikroorganismer intakt att minska felet är associerad med detektion och analys26. Men har olika aerosol mikroorganism provtagare olika effekter på integriteten i prover på grund av deras olika provtagning principer och media. Människor har designat många sorters bioaerosol provtagare som använder olika provtagning principer, såsom tröghetsbaserad impaktion, filtrering motstånd och elektrostatisk utfällning27.
Påverkar provtagare kan driva luftburna PM till provtagning medium i hög hastighet med hjälp av utvinning utrustning. Det finns två typer av påverkar provtagare: fasta och flytande. Fast påverkar provtagare kan användas för att provet bioaerosoler vid låga koncentrationer och kan vara nästan ogenomtränglig för air flow28. Aerosolpartiklar i olika storlekar kan undersökas preliminärt, och mikrober kan avnjutas direkt i odlingsmediet, vilket ökar överlevnaden av odlingsbara mikroorganismer10. På grund av tröga inverkan, mikrobiell aerosolpartiklar kolliderar enkelt på samma plats, och kolonier kan överlappa enkelt efter kultur. För närvarande är den vanligaste solida påverkar sampler Andersen-6 mikrobiella aerosoler sampler. I denna studie använde vi en Andersen sex-stegs sampler för att studera odlingsbara bakterierna distribueras i luftburna PM av olika storlekar.
Cykloniska aerosol provtagare använda cykloner till spiral luft med hög hastighet in i en cylinder eller en kon. Bioaerosol partiklar kan skiljas från luftflödet genom centrifugalkraften, vilket innebär att mikrober kan stöta på den inre väggen av provtagaren och sedan samlas in genom provtagning bufferten. Denna metod är bekvämt och kan användas för provtagning långa tider i stort flöde och provtagning verksamhet. Dock inte kan denna metod genomföras vid låga temperaturer eftersom operationen är beroende av vätska. Den cykloniska aerosol sampler används i denna studie är en cykloniska befuktas-vägg aerosol sampler som kan extrahera och överföra luftburna patogener och partiklar från samplade luften i en liten volym vatten för analys29.
Filter provtagare kan arbeta under låg temperatur och kan prova partiklar över en viss storlek. Men de har en stor inverkan på mikrobiell aktivitet och är benägna att skada, som kommer att kraftigt påverka efterföljande studier på provtagning aktivitet. I denna studie samlades bioaerosol prover från Beijing dimmiga dagar in med hjälp av både en hög volym air sampler med filter och en cykloniska aerosol sampler. Syftet med detta experiment var att analyserar PM utan avskiljandet biologiska sammansättning och odling av luftburna mikrober. Dessa två provtagningsmetoder var därför lämplig för denna studie. Cykloniska aerosol sampler metoden, luftburna mikrober vid låga koncentrationer kan extraheras enkelt in i rinnande bufferten och sedan kan analyseras bekvämt utan ytterligare behandling som ofta används för filterprov. I denna studie, dessa två provtagningsmetoder, cyklonisk aerosol sampler och filter sampler, visade olika provtagning effektivitet. Ytterligare behandling som ofta används för filter prover, såsom återhämtar sig provet från filtret, är en av de viktigaste skillnaderna mellan dessa två metoder. Dessutom samlades luftprover direkt in i rinnande bufferten av cykloniska aerosol sampler medan den andra metoden samlade prover på filter. Egenskaperna hos olika typer av provtagningsmetod kan bidra till denna olika provtagning effektivitet. Vi kan anta att den cykloniska aerosol provtagaren är ett bättre val för mikroorganism samling, och detta antagande måste ytterligare bekräftelse.
I denna studie användes bakteriell 16S rDNA och svamp ITS regionen sekvensering att utföra den biologiska analysen av bioaerosoler. 16SrDNA -sekvensering är bestämning av 16S rDNA segment i mikrobiell genomet30. 16s rDNA finns allmänt i prokaryoter med höga naturvärden och specificitet, vilket gör det användbart för identifiering av mikrobiell Art31. Helgenom-sekvensering kräver bara utvinning av genomisk DNA och efterföljande sekvensering. Förutom att producera en stor mängd data, kan denna process också för en mer omfattande analys av mikrobiell gemenskapens struktur. Förutom, metagenomik kan också användas inom detta ämnesområde genom att tillhandahålla mer information i framtiden. Handelsman et al. först föreslog begreppet metagenome i 1998 papper på mikrober i jord32. Begreppet metagenome accepterades gradvis i efterföljande studier och mycket forskning utfördes på de bakterier som ingår i den mänskliga tarmen, hav och jord33,34,35. Med stöd av hög genomströmning sekvensering teknik, metagenomik har utvecklats snabbt och den spelar en allt viktigare roll i studiet av upptäckt av patogen. Traditionella mikrobiell forskningsmetoder är främst beroende av kultur för separation och rening. Många studier inte kan dock utföras eftersom mer än 99% av mikrober inte kan vara odlade. I motsats till traditionella metoder, kan metagenomik ta den genetiska informationen för alla mikrober i miljön som helhet utan att behöva separera enskilda organismer36. En omfattande analys av alla de resulterande mikroorganismerna kan utföras direkt.
Sammanfattningsvis visade denna studie flera detektering, provtagning och analysmetoder som kan användas för studier av biologiska sammansättningen av miljömässiga PM, inklusive PM övervakning. PM provtagning av en Andersen sex-stegs sampler, en hög volym air sampler med filter eller cykloniska aerosol sampler; och efterföljande biologisk analys baserad på DNA-sekvensering. I praktiken kan dessa metoder användas under olika miljöförhållanden, såsom många typer av djurgårdar. Våra protokoll och resultaten kan hjälpa andra forskare över hela världen ytterligare undersöka hälsoeffekter av svamp och bakteriella bioaerosoler i miljön.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Ekonomiskt stöd till denna studie kom från National Natural Science Foundation i Kina (nr. 41775148). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut om att offentliggöra eller beredning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
- Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
- Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
- Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
- Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
- Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
- Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
- Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
- Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
- Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
- Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
- Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
- Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
- Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
- Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
- Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
- Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
- Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
- Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
- Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
- Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
- Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
- Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
- Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
- Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
- Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
- Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
- Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
- Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
- Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
- Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
- Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
- Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
- Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).
