Summary
הבנת ההרכב הביולוגי של חלקיקי סביבתי חשוב לחקר שלה השפעות משמעותיות על בריאות האדם ואת התפשטות המחלה. . היינו שלושה סוגים של שיטות דגימה bioaerosol, ניתוח הביולוגי של חיידקים באוויר כדאי לחקור את קהילות חיידקים באוויר בתנאים סביבתיים שונים.
Abstract
מיקרואורגניזמים משתנה בחלקיקים (PM) תחת תנאים סביבתיים שונים ייתכן יש השפעות משמעותיות על בריאות האדם. במחקר זה, אנו המתואר פרוטוקול עבור ניתוחים מרובים של קומפוזיציות ביולוגי בניסויים בחמש אחה"צ סביבתיים מוצגים: (1) PM מספר ניטור באמצעות לייזר מונה חלקיקים; (2) PM אוסף באמצעות דוגמאות ציקלונית תרסיס; (3) PM אוסף באמצעות דוגמאות אוויר בנפח גבוה עם מסננים; (4) אוסף חיידקים culturable על ידי הדוגם בשלב שש אנדרסן; (5) זיהוי של הרכב הביולוגי של הסביבה PM על ידי חיידקי 16SrDNA ורצף פטרייתי ITS באזור. בחרנו ימים מעורפל, משק בעלי חיים כמו שתי דוגמאות טיפוסיות של היישום בפרוטוקול זה. מחקר זה, אלה שתי שיטות הדגימה, תרסיס ציקלונית סמפלר, מסנן סמפלר, הראה יעילות דגימה שונים. הדוגם תרסיס ציקלונית לבצע הרבה יותר טוב מבחינת איסוף חיידקים, בעוד שתי שיטות אלו הראו יעילות זהה איסוף פטריות. דוגמי מסנן יכול לעבוד בתנאי טמפרטורה נמוכה בעוד תרסיס ציקלונית דוגמי יש מגבלה הדגימה על טמפרטורת. דוגמאות והשפעתן מוצק, כגון סמפלר שש-שלב אנדרסן, יכול לשמש כדי מדגם bioaerosols ישירות לתוך המדיום תרבות, אשר מגביר את שיעור ההישרדות של מיקרואורגניזמים culturable. עם זאת, שיטה זו בעיקר מסתמך על תרבות בעוד יותר מ 99% של חיידקים לא יכולים להיות תרבותי. DNA שחולצו מן החיידקים culturable שנאספו על ידי אנדרסן בשלב שש דוגמאות ודוגמאות שנאספו על ידי תרסיס ציקלונית סמפלר, סמפלר מסנן אותרו על ידי חיידקי מטוסי אף-16 rDNA ורצף אזור פטרייתי ITS . כל השיטות לעיל ייתכן שימוש נרחב בתחומים רבים של מחקר, כגון ניטור סביבתי וזיהוי גורם למחלה. תוצאות אלה, אנחנו יכולים להסיק כי שיטות אלה ניתן להשתמש בתנאים שונים, עשוי לסייע לחוקרים אחרים להמשיך לחקור את ההשפעות הבריאותיות של הסביבה bioaerosols.
Introduction
בסביבה הטבעית, קיימים סוגים שונים של מיקרואורגניזמים bioaerosols, כולל פטריות, חיידקים, וירוסים, מיקרואורגניזמים אחרים1. מיקרואורגניזמים באוויר, אשר יכול להיות הנפלטים כמה פעילויות אנושיות כגון פעולות הזנה בבעלי חיים בחוות חיות משק, הן התוכן החשוב של האטמוספירה הסביבה2. אלה מיקרואורגניזמים עשוי לא רק לשחק תפקידים חשובים בסביבה אטמוספרית אך יש גם השפעות משמעותיות על בריאות האדם ומחלות להתפשט.
כמו דרך חשובה של הפצת מחלות, חיידקים אירוסולים משכו תשומת לב רחב ברחבי העולם. מחקרים שנעשו לאחרונה, נמצאו למחלות רבות להיות מזוהה עם ההרכב מורכב של הסביבה חלקיקים (PM) במיקומים שונים, כגון מפעלים כימיים, חוות חיות משק, ערים האוויר שם3,4. ההרכב הביולוגי של PM עשוי לתרום כמה מחלות מערכת הנשימה, הלב וכלי הדם PM-חשופים בני5. אזורי גוף שונים, כגון רירית, העור, מערכת העיכול, מערכת הנשימה, יכול להיות מטרות אפשריות של חיידקים המצורפת PM6,7. סיכון מוגבר של סרטן ריאות עלול להיגרם על ידי חשיפה ממושכת ל- PM2.58.
לוחמה חיידקים יש נסקרו במקומות שונים במספר מדינות ברחבי העולם, כולל תחנות רכבת תחתית, בבתי חולים וטרינריים, משחטות, אקולוגיים מתקנים וגללים, מתקני עיבוד החלב, מכרות פחם, מרפאות שיניים יצירת סביבות מקורה9,10,11,12,13,14,15,16,17, מספר גדול של דוחות אודות אירוסולים ביולוגי. במקומות צפופים המשויך קמפוסים, משק-החי בחוות והם ערים גדולות בימי מעורפל שלושה תנאים ציבורי חשוב במיוחד ולכן אנו זקוקים לחקור את הקשרים בין בריאות האדם לבין על ההשפעות האפשריות של חשיפה PM. יתר על כן, במהלך ימי חורף בערים הצפוני של סין, ערכים גבוהים של2.5 PM עשוי להשפיע על בריאות האדם. למרות PM2.5 ניתן להפיק את ההשפעות הרעילות על ידי מיקוד משטחים הנשימה מלהתמוסס לתוך הדם18, זה עדיין לא ברור אם וכיצד החיידקים קשורה PM2.5 שעלולות להשפיע על בריאות האדם19 ,20. חוות משק-החי הם אחד המקורות העיקריים של PM ומרססים חיידקים באוויר. מספרם של פתוגנים, כגון וירוס שפעת ו- Brucella melitensis, זה מתבצעות על ידי אירוסולים בשדות סביב חוות משק-החי הם גורמים חשובים גורמות למחלות בדרכי הנשימה משק-החי והן עופות עובדים.
במחקר זה, אנחנו בחנו מספר סוגים של ניתוחים של bioaerosols, כולל PM מספר מעקב, bioaerosol איסוף וניתוח הקומפוזיציה ביולוגי. האוויר דוגמאות נאספו על ידי דוגמאות תרסיס ציקלוניים, דוגמאות אוויר בנפח גבוה עם מסננים סמפלר שש-שלב של אנדרסן. לאחר מכן, הדגימות שנאספו על ידי אלו דוגמיות שלושה נותחו על ידי ניתוח הביולוגי כולל חיידקי מטוסי אף-16 rDNA ורצף ITS פטרייתי כדי לקבוע את היצירות הביולוגי שלהם. במסמך זה, אנו מראים תוצאות נציג בין דגימות bioaerosol שנאספו במהלך ימים מעורפל של בייג'ינג ו מחוות חיות משק, המציינת כי ייתכן bioaerosols יש השפעות נהדר על בריאות האדם ושל בעלי החיים. ההשוואה בין נוזלי מסנן דגימה בשיטות היו גם בחנו במחקר זה בעיקר בהתבסס על הנתונים של מטוסי אף-16 DNA ורצף ITS פטרייתי.
Protocol
1. PM מספר מעקב
- השתמש של חלקיקים לייזר מוטס מונה (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבוע את המספר הכולל של PM. לאסוף את רה מ בנמל הדגימה האוויר על הדלפק חלקיקים לייזר מוטס.
הערה: מונה חלקיקים זה הוא ציוד אוטומציה, זה יכול לעבוד באופן עצמאי כאשר התוכנית כולל זמן הדגימה, מרווח, אוסף פעמים, וכו הוגדר במסך המגע שלה.- לצייד את המכשיר עם חיישן לעקוב אחר הטמפרטורה והלחות היחסית. למדוד, הרשומה הטמפרטורות והלחות היחסית נתונים בו-זמנית בכל 5 דקות.
- בסך הכל, למדוד ולהקליט 6 כיתות גודל חלקיקים שונים (0.3-0.5 μm, 0.5-0.7 μm, 0.7-2.5 μm, μm 2.5-5, 5-10 μm ו- > 10 μm) בו זמנית כל 5 דק למדוד 4 מעמדות גודל חלקיקים אחרים (0.3-0.5 μm, 0.5-1 μm, 1-3 μm ו ≥ 3 μm).
- לאסוף דגימות אוויר. אבל החור דגימה בראש הדוגם ולהשתמש המודולים מבחן פנימה הדוגם כדי למדוד את גודל החלקיקים של כל PM. ואז הנתונים מאוחסן באופן אוטומטי. כל התהליכים הנ ל יכול להתבצע באופן אוטומטי לאחר הפרמטרים יחסית, כולל דגימה זמן וספירת טווח, מוגדרים אף את displayer מגע מיני של מונה חלקיקים לייזר מוטס.
הערה: מונה חלקיקים זה ציוד אוטומציה, ויש לה מודולים מבחן זה לספור את מספר PM של מחלקות גודל חלקיקים שונים.
- כדי להעריך את שגיאת התקן נסיוני, להבטיח שיעורים גודל חלקיקים שונים ייספרו עם שכפולי לפחות 15. ודא כי קריאות הם מאוחסנים בזיכרון הפנימי של המכשיר ולא לאחר מכן נותחו.
- ודא כי ניתוח של הנתונים הראשי כולל ריכוז מספר PM, הבדיקה ANOVA, האחוז של PM בכל גודל כיתה. לדוגמה, כפי שמוצג באיור 1A, ריכוז מספר PM בדצמבר (חלקיקים 237.6/ס מ3) היו גבוהות באופן משמעותי מאלה באוקטובר (ממוצע: 110.2 חלקיקים/ס מ3) (ANOVA; P-value < 0.05). איור 1B מראה כי מספר חלקיקים קטנים יותר μm 3 היוו יותר מ 99% של המספר הכולל.
- השתמש הדלפק חלקיקים לייזר כדי לפקח ריכוז מספר PM, לאחסן את הנתונים באופן אוטומטי. שימוש בדיסק הבזק USB כדי לייצא נתונים במחשב ולבצע את הבדיקה ANOVA.
2. אוסף PM על ידי דוגמי תרסיס ציקלוניים
- לבצע רה מ דגימה בשטח פתוח מבלי המרכזיים הסמוכים למקורות זיהום בגובה ∼2 מ' מעל פני הקרקע.
- להקליט את המיקום של האתר הדגימה. לדוגמה, הקמפוס של המכון הטכנולוגי של בייג'ינג הוא הדברים הבאים: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19'38.5 '' אי
- השתמש בתרסיס ציקלונית דוגמאות לאסוף דגימות אוויר. השתמש זרם סמפלר של 323 L/min, זמן אוסף של 6 שעות.
הערה: קצב הזרימה סמפלר הוא קבוע ולא ניתן לשנותה. הפעם אוסף נשלטת על ידי שמירת הזמן ידני כפי יש רק כפתור התחל והפסק על דוגמת זה.- להשתמש במים סטריליים כדי לשטוף מבפנים הדוגם תרסיס ציקלונית 3 פעמים לפני אוסף, ולהשתמש בפונקציה ניקוי אוטומטי 3 פעמים על-ידי ברציפות לחיצה על כפתור לאסוף 3 פעמים.
- לחץ על לחצן לאסוף כדי להתחיל דגימה ולחץ על כפתור המשאבה כדי לעצור את הדגימה. שים את הדוגם על מדף או קומה עם אף-אחד לא מחזיק אותו במקום.
- לשמר את כל הדגימות בחושך ב-20 ° C עד הבדיקות עוקבות.
3. אוסף PM על ידי מסננים
- לבצע רה מ דגימה בשטח פתוח מבלי המרכזיים הסמוכים למקורות זיהום בגובה ∼2 מ' מעל פני הקרקע.
- להקליט את המיקום של האתר הדגימה. לדוגמה, הקמפוס של המכון הטכנולוגי של בייג'ינג הוא כדלקמן: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19'38.5 '' אי
- לאסוף דגימות PM-20.32 × 25.4 ס"מ2 מסננים (ראה טבלה של חומרים) באמצעות דוגמאות אוויר בנפח גבוה (ראה טבלה של חומרים) בספיקה של 1,000 L לדקה להגדיר זרימת הזמן קצב ואיסוף על-ידי תיכנות אוטומטי היחסי.
- לשמר כל שנדגמו מסננים בחושך ב-20 ° C עד הבדיקות עוקבות.
4. אנליזת הרכב ביולוגי
- אנליזת הרכב ביולוגי, לשימוש כל דגימה נוזלית מדגם דוגמת או סינון ציקלונית תרסיס להפקת DNA הפקת דנ א למקורות מרובים אינו קיט (ראה טבלה של חומרים) על פי הפרוטוקולים של היצרן.
- דגימות הדוגם אוויר בנפח גבוה עם מסננים, להשתמש 1/8 של כל מדגם מסנן להפקת DNA. מכניסים את המסנן שפופרת 50 מ עם הדגימה פונה כלפי פנים, הפונה לכיוון הקיר צינור הגב. להוסיף חרוזים 10 האתרים המרכזית לכיוון הצד של המסנן המכיל את הדגימה.
- מערבולת הצינור למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. Pipette את הנוזל בצינור לתוך שפופרת צנטרפוגה נקי 50 מ ל כדי להמשיך בתהליך הפקת דנ א.
- לחלץ את ה-DNA מדגם התהליכים כדלקמן.
- Centrifuge המדגם חיידקים ב g 2,000 x במשך 5 דקות, להסיר את תגובת שיקוע, וכן להשעות חיידקים ב 2 מ של מאגר PBS סטרילי.
- לאסוף את התליה של חיידקים בתוך שפופרת צנטרפוגה 2 מ"ל, ואז צנטריפוגה-g x 2,000 עבור 5 דקות למחוק את הפתרון supernatant.
- הוסף μL 350 סטרילי PBS מאגר המכיל חיידקים מושעה לפתרון.
- להוסיף 0.8 מ ל RNase א
- להוסיף 150 μL של המאגר קלרנית ו 8 μL של proteinase K ומערבבים מיד על ידי מערבולת רועד עבור 1 דקות. לאחר צנטריפוגה קצרה ב g x 1,000 ל 30 s (ללא שאריות על הקיר), שמכניסים את נקז צנטריפוגלי במים 56 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להוסיף 350 μL של מאגר PD, ואת תערובת עבור 30 s ולאחר מכן צנטריפוגה 10 דקות ב 12,000 x g.
- למקם את הצינור הכנה DNA שפופרת צנטרפוגה 2 מ"ל, ולהעביר את התערובת שבוצעו בשלב 4.2.6 הצינור הכנה. צנטריפוגה ואז עבור 1 דקות ב- 12,000 x g.
- למחוק את פילטרט של, תחזיר את התוכן של הצינור הכנה לתוך הצינור המקורי צנטריפוגה 2 מ"ל ולהוסיף 50 μL של המאגר W1. Centrifuge את התערובת במשך 1 דקה ב 12,000 x g.
- למחוק את פילטרט של, תחזיר את התוכן של הצינור הכנה לתוך הצינור המקורי צנטריפוגה 2 מ"ל ולהוסיף μL 700 של מאגר W2. צנטריפוגה התערובת למשך דקות 1-ג x 12,000 חזור על שלב זה כדי לשטוף שוב עם 700 μL של המאגר W2.
- למחוק את הנוזל פסולת, תחזיר את התוכן של הצינור הכנה לתוך הצינור צנטריפוגה 2 mL המקורי. Centrifuge את התערובת במשך 1 דקה ב 12,000 x g.
- מכניסים את התוכן של הצינור הכנה DNA עוד צינור צנטריפוגה mL 1.5 נקי, ולהוסיף μL 100 eluent או מים יונים באמצע של הקרום בצינור הכנה (מים יונים או eluent היה מחומם עד 65 מעלות צלזיוס). לאפשר את התערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 1 דקות, Centrifuge את התערובת במשך 1 דקה ב 12,000 x g.
- ביצוע כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (Q-RT-PCR) לכמת את abundances היחסית של חיידקים ופטריות על מסנני הדגימה.
- השתמש תחל כדלקמן: על חיידקי rDNA מטוסי אף-16, 515F (5'-חברתנו המרכז לאמנות עכשווית GCM GCC gcg ב GTA A-3'), 806R (5'-לשממ יניינעל ילבולגה דרשמה CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); ועבור את פטרייתי ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT גה CCT gcg ב G-3'), ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC גת GC-3').
- הפעל את מבחני קיו-RT-PCR על מערכת ה-PCR בזמן אמת (ראה טבלה של חומרים). RT-PCR תנאי: predegeneration, 95 ° C, 10 דקות; ניוון, 95 ° C, 15 s; anneal, וסיומת 60 ° C, 1 דקות; מחזורים 40 מ ניוון כדי anneal וסיומת.
- לניתוח מבנה הקהילה חיידקים ופטריות, להגביר את האזור V1-V3 של חיידקי מטוסי אף-16 rDNA והן את האזור ITS אופרון rRNA פטרייתי על ידי ה-PCR.
- השתמש תחל את כדלקמן: חיידקים, V1-דירה 9-אף (יונקות-CCT ATC CCC TGT חברתנו CCT TGG חטיבתי TCT חטיבתי ACG של AGT TTG ATC mtg ב GCT חטיבתי-3′) ו V3-541R (יונקות-המרכז לאמנות עכשווית TCT החתול CCC TGC חברתנו TCT CCG מעשה חטיבתי-ברקוד-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3′); עבור פטריות, ITS-3F (5'-CCT ATC CCC TGT חברתנו CCT TGG חטיבתי TCT חטיבתי CAC ATC גת גה גה CGC AGC-3'), ITS-4R (5'-המרכז לאמנות עכשווית TCT החתול CCC TGC חברתנו TCT CCG מעשה חטיבתי-ברקוד-GCT CCT CCG CTT ATT גת ATG C-3').
- להבטיח כי תערובת 20 μL של מותני כולל 2 μL של 2.5 מ מ dNTPs, 4 μL של 5 × FastPfu מאגר, 0.8 μL של כל פריימר (5 μM), μL 0.4 של פולימראז FastPfu, ו- 10 ng של תבנית ה-DNA (ראה טבלה של חומרים).
- השתמש בתוכנית ה-PCR כדלקמן: 94 ° C עבור 5 דקות; ואחריו 10 מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 55-60 מעלות צלזיוס במשך 45 s, ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s; 20 מחזורים של 94 ° C ל 30 s, 55 מעלות צלזיוס במשך 45 s ו- 72 מעלות צלזיוס במשך 90 s; ועם סיומת הסופי ב-72 מעלות במשך 5 דקות.
- לבצע טיהור DNA, כימות דנ א, pyrosequencing כפי שמתואר במחקר הקודם 21.
5. Bioaerosol הדגימה והטיפוח -תרגול
- שימוש בינלאומי סטנדרטי אנדרסן בשלב שש סמפלר (ראה טבלה של חומרים) כדי לטעום culturable לוחמה חיידקים ופטריות בספיקה של 28.3 L/הגבלת שימוש זמן הדגימה של מינימום 35 לשים. את הצלחת תרבות בכל שלב הדוגם. מספיק לחטא את הדוגם עם 75% אתיל אלכוהול לאחר כל דגימה.
הערה: קצב הזרימה סמפלר הוא קבוע, הפעם אוסף נשלטת על ידי שמירת הזמן ידנית.- בשלבים מדגם שש עם סמפלר שש-שלב אנדרסן, אשר מוגדר על ידי הקוטר אווירודינמי של החלקיקים באוויר, לרבות שלב VI (0.65 – 1.1 μm), שלב V (1.1 – 2.1 μm), שלב IV (2.1 – 3.3 μm), שלב III (3.3 – 4.7 μm), שלב II (4.7-7.0 μm), שלב I (≥7.0 μm).
- לאסוף את החלקיקים חיידקי, להפקיד לצלחת תרבות בכל שלב המכילה אגר תקציר סויה-קזאין (ראה טבלה של חומרים). יש מיכל עם intakes אוויר רבים על גבי בכל שלב הדוגם.
- תרבות האוסף לוחמה חיידקים צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות; לאחר מכן, ספירת המספרים מושבה של חיידקים על המנה מדגם עבור כל שלב.
- כדי למנוע את החלקיקים שנאספו על ידי הדוגם בשלב שש אנדרסן חופפים, לתקן את מספר מושבות בכל רמה סמפלר על-ידי הנוסחה הבאה:
איפה יחסי ציבור: תוקן מספר מושבות בכל רמה,
N: מספר דגימה חורים של הדוגם בכל הרמות (400), ו
r: את הספירה בפועל של המושבות. - לחשב יחידת של מושבות לכל m3 של אוויר כדלקמן:
איפה c: ריכוז (CFU/ז3),
N1-N6: מספר מושבות בכל רמה, המתוקן
T: דגימה הזמן (דקות), ו
F: קצב זרימה הדגימה (28.3 L/דקה). - השתמש בשיטות מן השלבים 5.1 - 5.3 ללמוד את bioaerosol בחוות משק-החי, כולל ארבעה סוגים של piggeries.
הערה: משק החווה ממוקם בסין, צ'אנגצ'ון. המיקום המרכזי 2 מ' מעל פני הקרקע בכל piggery נבחר מיקום הדגימה.) לאחר התרבות של חיידקים, התייחס מושבות כל הלוחות כפי שמתואר צעדים 6.1 - 6.2.
6. זיהוי של חיידקים Culturable
- לאחר 48 שעות או 72 h של culturing, מקם את החיידקים לתוך שפופרת צנטרפוגה 2 מ"ל. לחלץ את ה-DNA של חיידקים או פטריות אלה באמצעות מיצוי DNA למקורות מרובים אינו של קיט (ראה טבלה של חומרים). תהליך הפקת דנ א המתוארת בסעיף 4.2.
- השתמש 200 μL הפקת דנ א עבור מטוסי אף-16 rDNA רצף. השתמש התהליכים כמתואר ב- 4.2 שלבים, 4.3 ו- 4.4 ניתוח הרכב ביולוגי.
Representative Results
במחקר זה, אנחנו הופיעה הערכה של ההתפלגות PM הכולל ניתוח מקיף של bioaerosols של משק חלב בחודשים ספטמבר עד דצמבר. גורמים סביבתיים רבים לתרום ההפצה של חלקיקי אירוסול. למדנו את ריכוז וגודל הפצות PM בבית פרה באמצעות מונה חלקיקים לייזר TSI. כפי שמוצג באיור 1A, הריכוז של חלקיקי אירוסול היה הגבוה ביותר בחודש דצמבר, הנמוך ביותר בחודש אוקטובר, אשר עלול להיגרם על ידי שינויי טמפרטורה ולחות (טבלה 1). הריכוז של חלקיקים נשימים תרסיס (0.3-3.0 מיקרומטר) היוו יותר מ 99% ריכוז החלקיקים הכולל (איור 1B), החלקיקים בטווח זה יכול להגיע דרכי הנשימה עמוק, גרימת מפגעים רציני עבור בני אדם, בעלי חיים.
אנליזת הרכב הביולוגי של דגימות יכול להתבצע על ידי ה-DNA החילוץ, חיידקי 16SrDNA ITS פטרייתי באזור רצף במקום מיקרואורגניזם תרבות. מניתוח הביולוגי של דגימות bioaerosol שנאספים באמצעות דוגמאות ציקלונית תרסיס או דוגמאות אוויר בנפח גבוה עם מסננים, אנחנו יכולים preliminarily השווה את היעילות של שתי השיטות באיסוף חיידקים ופטריות. איור 2 הראו תוצאות ניתוח דגימות bioaerosol שנאספו במהלך ימים מעורפל בייג'ינג בקמפוס של המכון הטכנולוגי של בייג'ינג ב 20 דצמבר 2016. אוסף חיידקים, התוצאות הראו הדוגם ציקלונית אירוסול הנאספים סוגים רבים יותר מאשר הדוגם אוויר בנפח גבוה עם מסננים (איור 2 א). אוסף פטריות, אלו דוגמיות הראה יעילות אוסף שווה כמעט את אותו סוג abundances (איור 2B). את התוצאות המוצג באיור2, היינו יכולים למדוד את היעילות אוסף שונים של שתי שיטות אלו עבור חיידקים ופטריות. אוסף חיידקים, הדוגם תרסיס ציקלונית לבצע הרבה יותר בנפח הגבוה אוויר סמפלר עם מסננים כי דגימות מן לשעבר של שפע סוג גבוה יותר (איור 2 א). עם זאת, ניתוח רצף פטרייתי של הדגימות שתי שיטות דגימה שונים הראו מבני הקהילה כמעט זהה (איור 2B).
למדנו לוחמה חיידקים culturable באמצעות דוגם שש-שלב של אנדרסן. כפי שמוצג באיור3, המספרים מושבה של חיידקים culturable עבור חלקיקים-VI הבמה צומצם. שלב I חלקיקים (חלקיקים בגודל > 8.2 מיקרומטר) היה את המספרים הגבוהים ביותר של מושבות חיידקים culturable. האחוז של שלב I מושבות ארבעה סוגים שונים של piggeries כולל החזירונים הבית החזירה בבית, בהריון, משמין הבית והבית הגמילה היה 33%, 30%, 26% ו- 34%, בהתאמה. האחוז של שלב II מושבות ארבעה סוגים שונים של piggeries היה 20%, 22%, 19% ו-20% בהתאמה. האחוז של שלב III מושבות ארבעה סוגים שונים של piggeries היה 18%, 18%, 18% ו- 19% בהתאמה. האחוז של השלב הרביעי מושבות ארבעה סוגים שונים של piggeries היה 17%, 16%, 16% ו- 16% בהתאמה. האחוז של שלב V מושבות ארבעה סוגים שונים של piggeries היה 10%, 10%, 14% ו-6% בהתאמה. שלב VI חלקיקים (חלקיקים בגודל < 1.0 מיקרומטר) היו המספרים הנמוך של מושבות חיידקים culturable. האחוז של השלב השישי מושבות ארבעה סוגים שונים של piggeries היה 3%, 5%, 6% ו-5%, בהתאמה.
הדגימות האוויר היו שנאספו ארבעה סוגים שונים של piggeries באמצעות דוגם שש-שלב של אנדרסן, ואז תרבותי בתנאים מתאימים. ה-DNA של כל הגנום של חיידקים culturable שנאסף בכל שלב של חלקיקים הייתה חילוץ, זוהה על ידי חיידקי מטוסי אף-16 rDNA ורצף פטרייתי ITS באזור. סך של סוגים 91, 158 מינים של חיידקים אותרו בהחיידק culturable ב piggeries. מבני הקהילה חיידקים culturable ארבעה סוגים שונים של piggeries, כולל החזירונים הבית, בהריון לזרוע הבית, משמין הבית והבית ואיחולי מוצגים באיור 4 עם נתונים משלב אני לשלב השישי. התוכן של סוגים שונים חיידקי הדומיננטית אינה זהה בין piggeries שונים.
איור 1: התפלגות ריכוז וגודל PM ב 4 חודשים שונה. (א) Boxplot של מספר PM במהלך תקופת המחקר. כל boxplot כולל את המקסימום, מינימום, חציון, שני רביעונים וערך נורמלי של מסד הנתונים. גודל ממוצע (B) מפות תפוצה של PM. היו שמונים פרות בבית בחודשים ספטמבר עד דצמבר. האחוז של PM (≥ 3 מיקרומטר) ב 4 חודשים (ספטמבר, אוקטובר, נובמבר ודצמבר) היה 0.005, 0.005, 0.002 ו 0.002 בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: ניתוח הביולוגי של דגימות bioaerosol שנאספו על ידי שני דוגמי. (א) ו (ב) להראות את abundances של חיידקי או פטרייתי סוגים בדגימות bioaerosol שהושג עם שיטות ליקוט שונים. קיר שנרטבו בהקפאה מייצג את הדוגם ציקלונית תרסיס. קוורץ מסננים מייצג את הדוגם אוויר בנפח גבוה עם מסננים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ממוצע מפות תפוצה הירארכי של חיידקים culturable ארבעה סוגים של piggeries. ארבעת סוגי piggeries החזירונים הבית החזירה בבית, בהריון, משמין הבית, הגמילה בבית. ו- S1 S6 לייצג את החלקיקים שישה השלבים (I השישי) שנאספו על ידי הדוגם בשלב שש אנדרסן. השלבים הוגדרו על-ידי הקוטר אווירודינמי של החלקיקים באוויר, כולל בשלב השישי (0.65-1.1 מיקרומטר), שלב V (1.1-2.1 מיקרומטר), שלב IV (2.1-3.3 מיקרומטר), שלב III (3.3-4.7 מיקרומטר), שלב II (4.7-7.0 מיקרומטר), שלב I (7.0 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מבני הקהילה חיידקי עם abundances שונים בדגימות אוויר. הדגימות האוויר היו שנאספו ארבעה סוגים שונים של piggeries באמצעות דוגם שש-שלב של אנדרסן, ואז תרבותי בתנאים מתאימים. ה-DNA של כל הגנום של חיידקים culturable בכל שלב של חלקיקים שנאסף על ידי הדוגם בשלב שש אנדרסן היה חילוץ, זוהה על ידי חיידקי מטוסי אף-16 rDNA רצף. המספרים 1 עד 6 בכל אחד מסוגי piggery לייצג שלבים חלקיקים השישי מדדתי על ידי הדוגם בשלב שש אנדרסן. הטקסט בצד ימין כולל את שם סוג עבור כל חיידק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
במחקר זה, סיפקנו כמה תוצאות נציג זה התקבלו במהלך ימים מעורפל, בחוות חיות משק. התוצאות של bioaerosol דגימות שנלקחו במהלך ימי מעורפל בייג'ינג הקלה הבנה טובה יותר של קומפוזיציות הביולוגי של ההרכב הביולוגי של PM ללא PM נוכח במהלך ימים מעורפל של בייג'ינג. התוצאות של דגימות שנלקחו מן החוות משק-החי גם תספק נתונים בסיסיים עבור אוויר סביבתי quality control ב piggeries ו קרן תיאורטית לתמיכה הטכנית לגידול בריא והפקה בטוח בחוות חיות משק. גורמים סביבתיים רבים, כגון: טמפרטורה, לחות, מהירות הרוח, עשוי לתרום ההפצה של חלקיקי אירוסול בבית פרה (איור 1). מחקרים קודמים חשפו כי ראש הממשלה בחוות משק-החי בעיקר בא מספוא, צואה, פרווה, נוצות, אשר עשויים להיות קשורים לפעילות בעלי חיים. הגורמים הסביבתיים יכול להשפיע לא רק בעלי חיים, אבל גם הצבירה ופעילויות דיפוזיית PM בתוך בית סגור יחסית פרה. לכן, אנו מזהים ריכוזים שונים, גודל הפצות PM ב 4 חודשים שונים. חוץ מזה, התנאי הסניטריים, האכלה שיטת ופעילות בבעלי חיים היו שונים בין ארבעת סוגי piggeries, אשר עשויה להשפיע גם על מבנה הקהילה שלהם של חיידקים culturable באוויר (איור 4).
עם זאת, במחקר זה, בעיקר התמקדנו על שיטות זמינות שנוכל להשתמש בו כדי ללמוד את ההרכב ואת ההפצה של bioaerosols בתנאים סביבתיים שונים. לעומת דגימות חיידקים אחרים, אלה של מיקרואורגניזמים באוויר יש ריכוזים נמוכים מאוד, מעורבבים עם מספר גדול של זיהומים, כמו חלקיקי אבק אי-אורגנית, אשר מציגים קשיים מסוימים במהלך זיהוי ואוסף כזה מיקרואורגניזמים21. לכן, כדאי לבחור שיטות המתאימות של אוסף וזיהוי אירוסולים מיקרוביאלי. האוסף של דוגמאות תרסיס חיידקים מתבצע בדרך כלל באמצעות השיטה משקעים או ציוד מיוחד כדי לאסוף את המיקרואורגניזמים דגימה נוזלי, מוצק למחצה או מלא בינוני22,23,24 . לאחר מכן, כמה טיפול טכני המתאים ולא ספציפי בדיקות וניתוח לאחר מכן מבוצעות25. המדיום דגימה כדאי לשמור מיקרואורגניזמים שלם כדי להפחית את השגיאה המשויכים זיהוי, ניתוח26. אולם, תרסיס שונים מיקרואורגניזם דוגמי יש השפעות שונות על השלמות של דגימות בשל דגימה אחרת העקרונות שלהם מדיה. אנשים עיצבו סוגים רבים של דוגמי bioaerosol המשתמשות עקרונות דגימה שונים, כגון פקק אינרציאלית, סינון ההתנגדות למשקעים27.
להשפיע על דוגמי יכול לדחוף PM באוויר לתוך האמצעי דגימה במהירות גבוהה באמצעות ציוד חילוץ. ישנם שני סוגים של להשפיע דוגמי: הנוזלית. מוצק להשפיע דוגמי יכול לשמש כדי מדגם bioaerosols-ריכוז נמוך, יכולים להיות כמעט אטום לאוויר לזרום28. יכול להיות מוקרן preliminarily תרסיס חלקיקים בגדלים שונים, ניתן לטעום חיידקים ישירות לתוך המדיום תרבות, אשר מגביר את שיעור ההישרדות של מיקרואורגניזמים culturable10. בשל ההשפעה אינרציאלית, תרסיס חיידקים החלקיקים מתנגשים בקלות באותו אתר, מושבות לחפוף בקלות אחרי תרבות. כיום, הדוגם והשפעתן מוצק הנפוץ ביותר הוא הדוגם תרסיס חיידקים אנדרסן-6. במחקר זה, השתמשנו סמפלר שש-שלב של אנדרסן ללמוד את החיידקים culturable מופץ ב- PM מוטס בגדלים שונים.
תרסיס ציקלונית דוגמי להשתמש הציקלונים ספירלה לאוויר במהירות גבוהה לתוך גליל או חרוט. ניתן להפריד בין חלקיקים Bioaerosol של זרימת האוויר על ידי כוח צנטריפוגלי, מה שאומר כי חיידקים יכולים להיתקל בקיר הפנימי של הדוגם, ואז להיות שנאספו על ידי המאגר הדגימה. בשיטה זו הוא נוח והוא יכול לשמש עבור זמן דגימה פעמים בזרימה גדול ולדגום פעולות. עם זאת, שיטה זו אינה ניתנת למימוש בטמפרטורות נמוכות כי הפעולה אינה תלויה נוזלי. הדוגם תרסיס ציקלונית השתמשו במחקר זה הוא דוגמאות ציקלונית קיר שנרטבו תרסיס זה יכול לחלץ ולהעביר פתוגנים באוויר חלקיקים מהאוויר שנדגמו לאמצעי אחסון קטן של מים עבור ניתוח29.
דוגמי מסנן יכול לעבוד בתנאי טמפרטורה נמוכה, תוכלו לטעום חלקיקים מעל גודל מסוים. עם זאת, השפעה רבה על פעילות מיקרוביאלית והם נוטים לגרום נזק, אשר תשפיע באופן משמעותי מחקרים מאוחרים יותר על דגימה פעילות. במחקר זה, bioaerosol דוגמאות מהימים מעורפל בייג'ינג נאספו באמצעות דוגמאות אוויר בנפח גבוה עם מסננים והן דוגמאות ציקלונית תרסיס. מטרת ניסוי זה היה מנתח את ההרכב הביולוגי של PM ללא ההפרדה, culturing של חיידקים באוויר. לכן, שתי שיטות הדגימה אלו היו מתאימים למחקר זה. שיטת סמפלר תרסיס ציקלוניים, חיידקים באוויר-ריכוז נמוך ניתן לחלץ בקלות לתוך המאגר המצטבר, אז יכול להיות מנותח בנוחות ללא טיפול נוסף המשמש בדרך כלל עבור מסנן דגימות. מחקר זה, אלה שתי שיטות הדגימה, תרסיס ציקלונית סמפלר, מסנן סמפלר, הראה יעילות דגימה שונים. הטיפול נוסף המשמש בדרך כלל עבור מסנן במדגמים, כגון שחזור הדגימה המסנן, הוא אחד ההבדלים העיקריים בין שתי השיטות. . חוץ מזה, דגימות אוויר נאספו ישירות לתוך המאגר פועל באמצעות תרסיס ציקלונית סמפלר בעוד השיטה אחרים אספו דגימות על מסננים. מאפייני סוג שונה של שיטת הדגימה עלולה לתרום זה יעילות דגימה שונים. אנחנו יכולים להניח הדוגם תרסיס ציקלונית הוא בחירה טובה יותר עבור אוסף מיקרואורגניזם, הנחה זו צריך אישור נוסף.
במחקר זה, שימשו חיידקי מטוסי אף-16 rDNA ורצף פטרייתי ITS האזור לשם ביצוע הניתוח הביולוגי של bioaerosols. רצף 16SrDNA היא הקביעה של מטוסי אף-16 rDNA מקטעים בתוך הגנום מיקרוביאלי30. מטוסי אף-16 rDNA קיימת באופן נרחב אאוקריוטים עם שימור גבוהה וספציפיות, מה שהופך את זה שימושי עבור זיהוי מינים מיקרוביאלי31. רצף הגנום השלם דורש רק הפקת דנ א גנומי ורצף עוקבות. בנוסף לייצור כמות גדולה של נתונים, תהליך זה מאפשר גם ניתוח מקיף יותר של מבנה הקהילה מיקרוביאלי. חוץ מזה, metagenomics יכול לשמש גם בתחום זה של מחקר על-ידי מתן מידע נוסף בעתיד. הנדלסמן. ואח הציע לראשונה את המושג metagenome עבודה 1998 על חיידקים ב אדמה32. מחקרים מאוחרים יותר, המושג metagenome התקבל בהדרגה, מחקרים רבים בוצעה על החיידקים כללו את האדם בטן, האוקיינוס ואת אדמת33,34,35. עם התמיכה של תפוקה גבוהה רצף טכנולוגיה, metagenomics פיתחה במהירות, זה ממלא תפקיד חשוב יותר ויותר במחקר של זיהוי הפתוגן. שיטות מחקר מיקרוביאלי מסורתי להסתמך בעיקר על תרבות הפרדה וטיהור. עם זאת, מחקרים רבים לא יכול להתבצע כי לא יכול להיות תרבותי יותר מ 99% של חיידקים. לעומת שיטות מסורתיות, metagenomics יכול לקחת את המידע הגנטי של כל החיידקים הסביבה בכללותה ללא צורך להפריד בין אורגניזמים נפרדים36. ניתוח מקיף של כל מיקרואורגניזמים וכתוצאה מכך יכול להתבצע ישירות.
לסיכום, במחקר זה הראו מספר זיהוי, דגימה ושיטות ניתוח שיכול לשמש עבור מחקרים על ההרכב הביולוגי של הסביבה PM, כולל ניטור; PM PM מדגם על ידי סמפלר שש-שלב של אנדרסן, דוגמאות אוויר בנפח גבוה עם מסננים או תרסיס ציקלונית סמפלר; לאחר מכן ניתוח ביולוגי המבוסס על רצפי DNA. בפועל, ניתן להשתמש בשיטות אלה תחת תנאים סביבתיים שונים, כגון סוגים רבים של חוות חיות משק. פרוטוקולים ותוצאות שלנו עשוי לסייע לחוקרים אחרים בכל רחבי העולם להמשיך לחקור את ההשפעות הבריאותיות של bioaerosols פטריות, חיידקים בסביבה.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
תמיכה כספית למחקר הזה הגיע מסין נבחרת מדעי הטבע קרן של (מספר 41775148) התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
- Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
- Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
- Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
- Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
- Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
- Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
- Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
- Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
- Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
- Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
- Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
- Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
- Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
- Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
- Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
- Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
- Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
- Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
- Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
- Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
- Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
- Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
- Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
- Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
- Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
- Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
- Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
- Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
- Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
- Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
- Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
- Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
- Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).
