Summary
環境の粒子状物質の生物学的組成を理解することは、その人間の健康や病気の広がりの重要な影響の研究にとって重要です。ここでは、異なる環境条件下における浮遊微生物をよりよく調べるバイオエアロゾル サンプリング方法の 3 種類と浮遊真菌の生物学的解析を使用しました。
Abstract
異なる環境条件下における粒子状物質 (PM) の変数の微生物は、人間の健康に影響があります。本研究では、プロトコル我々 説明環境午後 5 つの実験生物学的組成の複数の解析が表示されます: レーザー パーティクル カウンターを使用して、(1) 午後数監視(低気圧性エアロゾル サンプラー; を使用して、2) 午後コレクション(大容量空気サンプラーを使ってフィルター; 午後 3) コレクション(アンダーセンサンプラー 6 段 4) 培養微生物コレクション16SrDNA細菌と真菌のITS領域シーケンス環境時の生物学的構成の (5) の検出。このプロトコルでアプリケーションの 2 つの典型的な例として、ぼんやりとした日、家畜ファームを選択しました。今回、これら 2 つのサンプリング方法、低気圧性エアロゾル サンプラー、フィルター サンプラー、サンプリング効率を示した。低気圧性エアロゾル サンプラーは、これら 2 つのメソッドは、菌類の収集に同じ効率を示した細菌を収集の観点でより良い実行されます。フィルターのサンプラーは、低気圧性エアロゾルのサンプラー サンプリング制限温度を持っている間低温条件下で作業できます。6 段アンダーセンサンプラーなどの固体の影響を及ぼすサンプラーは、培養微生物の生存率が向上する培養液に直接サンプル バイオエアロゾルを使用できます。ただし、このメソッドは微生物の 99% 以上を培養することはできませんしながら文化に主に頼る。低気圧性エアロゾル サンプラーによるアンダーセンサンプラー 6 段とサンプルが収集した培養細菌から抽出した DNA を収集し、フィルター サンプラーは細菌の16S rDNAと真菌のITS領域シーケンスによって検出されました。上記すべての方法多くの環境モニタリングおよび空輸の病原体検出などの研究分野で幅広い用途があります。これらの結果からは、これらのメソッドが異なる条件下で使用することができます、さらに環境バイオエアロゾルの健康への影響を探る他の研究者を助けるかもしれないと考えられます。
Introduction
自然環境で様々 な種類の微生物は、バイオエアロゾル、菌類、細菌、ウイルス、その他の微生物の1を含むに存在します。畜産農家における家畜の飼養操作などいくつかの人間の活動から放出することができます、空気中の微生物は、大気環境2の重要な内容です。これらの微生物がありますだけでなく大気の環境で重要な役割を果たしてもが人間の健康と病気の広がりに大きな影響を与えます。
病気の広がりの重要な方法として微生物エアロゾルは、世界中で注目を集めています。最近の研究で、化学工場、畜産農家やスモッグ都市3,4など、別の場所で環境の粒子状物質 (PM) の複雑な組成に関連する多くの人間の病気が見つかりました。午後の生物学的組成午後公開人間5でいくつかの呼吸と心血管疾患に貢献するかもしれない。粘膜、皮膚、消化管、呼吸器などの異なったボディ地域は午後6,7に接続されている微生物の潜在的なターゲットをすることができます。肺癌のリスクの増加は、PM2.58への長期暴露によって引き起こされる可能性があります。
浮遊細菌は地下鉄、動物病院と畜場、堆肥化施設、なめし、牛乳処理設備、石炭鉱山を含む世界中の国々 で様々 な場所で調査されている歯科診療所11,12,13,14,15,16,17,,室内環境9,10を生成して、多数の生物学的エアロゾルについてレポートします。混雑した場所に関連付けキャンパス、家畜農場とぼんやりとした日中に大都市が人間の健康と PM 暴露の潜在的な影響との間の接続を探る必要があります 3 つの特に重要な公共の条件。さらに、冬の日中の中国北部の都市で、高い PM2.5値人体に影響可能性があります。かどうか、どのように PM2.5に接続されている微生物影響を及ぼす可能性人間の健康19 PM2.5は、呼吸器の表面を標的とする血18に溶解毒性を生成できますが、それはまだ明確ではないです。 ,20。畜産農家、午後の主な情報源の 1 つと微生物、大気汚染。家畜農場周辺におけるエアロゾルによって運ばれるブルセラ melitensis、インフルエンザ ウイルスなどの病原菌の多数が労働者の家畜や家禽の呼吸器疾患を引き起こす重要な要因です。
本研究で我々 は複数の種類のバイオエアロゾル、午後番号監視、バイオエアロゾル コレクションと生物学的組成分析などの解析を探った。低気圧性エアロゾル サンプラー、フィルターで高ボリュームの空気サンプラー アンダーセンサンプラー 6 段、空気を採取しました。その後、これらの 3 つのサンプラーによって採集された標本は、細菌16S rdna 塩基とその生物学的組成を決定する真菌のITS配列を含む生物学的解析によって分析されました。ここで、北京のぼんやりとした日中に収集されたサンプルのバイオエアロゾルから畜産バイオエアロゾル人間と動物の健康上大きな影響あるかもしれないことを示す代表的な結果を示す.液とフィルターのサンプリング方法の比較 16S DNA と真菌の ITS 配列からのデータに基づいて主にこの研究についても。
Protocol
1. 午後数監視
- 空中レーザー粒子を使用 (材料の表を参照) をカウンター総時数を決定します。空中レーザー パーティクル カウンターの上に空気のサンプリング ポートで PM を収集します。
注: このパーティクル カウンターは、オートメーション機器と、それすることができます独立して作業サンプリング時間、間隔、コレクションの実行時間を含むプログラム、等は、そのタッチ スクリーン上に設定されている場合。- 温度と湿度を監視するためのセンサーを計測器を装備します。測定し、同時に 5 分ごとの温度・湿度データを記録します。
- 合計では、測定し、記録 6 異なるパーティクル サイズ クラス (0.3 0.5 0.5 0.7 μ m 0.7 2.5 μ m μ m、2.5-5 μ m、5-10 μ m、> 10 μ m) 同時に 5 分ごとに測定 4 の他の粒子サイズのクラス (0.3 0.5 μ m、0.5-1 μ m、1-3 μ m と ≥ 3 μ m)。
- サンプラーの上にサンプリング穴も空気のサンプルを収集し、サンプラー内のテスト モジュールを使用して、各 PM の粒子サイズを測定します。その後、データは自動的に格納されます。上記すべてのプロセスは相対パラメーターとサンプリング時間と範囲のカウントの後自動的に実行できる、空中レーザー粒子カウンターの表示ミニ タッチ機能」が設定されます。
注: このパーティクル カウンターは、オートメーション機器、異なる粒子サイズ クラスの午後の数をカウント テスト モジュールです。
- 実験誤差を評価するために、異なる粒子サイズ クラスに少なくとも 15 のレプリケーションとカウントされているを確認します。測定値が計測器の内蔵メモリに格納され、その後分析を確認します。
- プライマリ ・ データの解析で午後数濃度、分散テスト、午後の割合が各サイズ クラスに含まれることを確認します。たとえば、図 1 aのように、12 月 (237.6 粒子/cm3) で PM 個数濃度だった 10 月のそれらよりも有意に高い (平均: 110.2 粒子/cm3) (分散分析;P-value < 0.05)。図 1 bは、粒子の数は、合計数の 99% 以上を占めている 3 μ m より小さいを示しています。
- 午後数濃度を監視し、自動的にデータを格納するレーザー パーティクル カウンターを使用します。ANOVA テストを行い、コンピューターでデータをエクスポートするには、USB フラッシュ ディスクを使用します。
2 低気圧性エアロゾルのサンプラーで PM コレクション
- 午後なしすべての近くの主要なオープン エリアで ∼2 m、地上で汚染源をサンプリングを実行します。
- サンプリング サイトの位置を記録します。たとえば、北京工業大学のキャンパスは次: 39 ° 57'51.0 ' N。116 ° 19'38.5 ' E.
- 空気のサンプルを収集するために低気圧性エアロゾル サンプラーを使用します。323 L/min のサンプラーの流れと 6 h のコレクションの時間を使用します。
注: サンプラー流量固定されて、変更することはできません。コレクションの時間は、このサンプラーにのみを開始および停止ボタンがあるので、手動計時によって制御されます。- 滅菌水を使用して、コレクション前に 3 回低気圧性エアロゾル サンプラーの内側を洗浄して 3 回連続 3 回収集ボタンを押すことで自動クリーニング機能を使用します。
- サンプリングを開始しサンプリングを停止するポンプのボタンを押して収集ボタンを押します。1 つの場所にそれを保持、棚や床にサンプラーを置きます。
- 以降の解析まで、-20 ° C で暗闇の中ですべてのサンプルを保持します。
3 フィルターで PM コレクション
- 午後なしすべての近くの主要なオープン エリアで ∼2 m、地上で汚染源をサンプリングを実行します。
- サンプリング サイトの位置を記録します。たとえば、北京工業大学のキャンパスは次のように: 39 ° 57'51.0 ' N。116 ° 19'38.5 ' E.
- 大容量空気サンプラーを使用して 20.32 × 25.4 cm2フィルター (材料の表を参照してください) に PM を採取 (材料の表を参照してください) 1,000 L/分の流量で相対自動プログラミング フロー速度と収集時間を設定します。
- 以降の解析まで、-20 ° C で暗闇の中ですべてのサンプルのフィルターを保持します。
4. 生物学的組成分析
- 生物学的組成分析、マルチソース DNA 抽出キットによる DNA 抽出の低気圧性エアロゾルのサンプラーやフィルターのサンプルから各液体サンプルを使用 (材料表参照) 製造元のプロトコルによると。
- フィルターを使用した大容量の空気サンプラーからサンプル、DNA の抽出の各フィルターのサンプルの 1/8 を使用します。50 mL のチューブに内側に直面するサンプルと管壁の方を向いてバック フィルターを置きます。サンプルを含むフィルターの側に向かって中央のサイトで 10 玉を追加します。
- 渦管室温で 15 分間。DNA の抽出を続行するクリーン 50 mL 遠心チューブにチューブ内の液体をピペットします。
- サンプルからの DNA をプロセスによって次のように抽出します。
- 5 分 2,000 x g で細菌のサンプルを遠心、上清を除去、2 mL の滅菌 PBS バッファー内の細菌を中断します。
- 2 mL の遠心管中の細菌懸濁液を収集し、上澄み液を捨てに 5 分間、2,000 × g で遠心分離します。
- ソリューションに浮遊菌を含む滅菌 PBS バッファーの 350 μ L を追加します。
- Rnase a. 0.8 mL を追加します。
- バッファー CL の 150 μ L とプロティナーゼ K の 8 μ L を加えて 1分間振動渦によってすぐにミックスします。30 1,000 x g で簡単なの遠心分離後 s (壁上の残渣) は、56 ° C で 10 分間水に遠心管を入れて。
- 12,000 × g でバッファー PD と 30 s のミックスし、10 分間遠心する 350 μ L を追加します。
- 2 mL の遠心管中 DNA 調製チューブを置き、手順 4.2.6 準備チューブに混合物を転送します。その後、12,000 × g で 1 分間遠心します。
- 濾液を破棄、元の 2 mL の遠心管に準備管の内容を戻すバッファー W1 の 50 μ L を追加します。12,000 × g で 1 分の混合物を遠心分離機します。
- 濾液を破棄、元の 2 mL の遠心管に準備管の内容を戻すバッファー W2 の 700 μ L を追加します。12,000 x g に 1 分間遠心する混合物は、再びバッファー W2 の 700 μ L での洗浄にこの手順を繰り返します。
- 廃液を破棄し、元の 2 mL の遠心管に準備管の内容を戻します。12,000 × g で 1 分の混合物を遠心分離機します。
- 別のきれいな 1.5 mL 遠心チューブに DNA の準備の管の内容を入れ、準備管内膜の中央に溶離液の脱イオン水 100 μ L を追加 (脱イオン水や溶離液は 65 ° C に加熱した)。1 分間室温で放置する混合物を許可し、12,000 × g で 1 分の混合物を遠心分離機します。
- 量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応 (Q-RT-PCR) 細菌や菌のサンプリング フィルターの相対的な存在量を定量化するを実行します。
- プライマーを使用して、次のように: 細菌16S rdna 塩基515F に (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') と 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3');真菌用ITS, its 1 領 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT: gcg-G-3') および its 1 領 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 3')。
- リアルタイム PCR システムの Q-RT-PCR の試金を実行 (材料の表を参照してください)。RT-PCR 条件: predegeneration、95 ° C、10 分;変性、95 ° C、15 s;アニールと拡張子で 60 ° C、1 分。アニール変性と拡張子から 40 のサイクル。
- 細菌、真菌群集構造解析、細菌の16S rDNAの V1-V3 領域と pcr 法による真菌の rRNA オペロンのITS領域を増幅します。
- プライマーを使用して、次のように: 細菌, V1 9F (5 'CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ') と V3 541R (5' CCA TCT 猫 CCC TGC GTG TCT CCG 法 CAG-バーコード-ACW TTA CCG CGG CTG CTG G-3 ');菌類、ITS 3F (5'-CCT ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA シージーシー AGC-3') とその 4 r (5'-CCA TCT 猫 CCC TGC GTG TCT CCG 法 CAG-バーコード-GCT CCT CCG CTT ATT GAT ATG C 3')。
- Pcr 法の 20 μ L 混合物に、2.5 mM の dNTPs の 2 μ L、5 × 0.8 μ L 各のプライマー (5 μ M)、FastPfu ポリメラーゼの 0.4 μ L の FastPfu バッファーの 4 μ L が含まれていることを確認し、10 テンプレート DNA の ng (材料の表を参照してください)。
- PCR プログラムを使用して、次のように: 94 ° C、5 分。30 94 ° C の 10 サイクルに続いて s、55-60 ° C、45 s、および 90 のための 72 ° C s;20 サイクル 94 ° C の 30 s、55 ° C、45 s および 90 のための 72 ° C s;72 ° C、5 分で最後の拡張。
- DNA 精製、DNA の定量化とパイロシークエンス以前研究21に記載を実行します。
5. バイオエアロゾル サンプリングと栽培
- 国際標準的な 6 段アンダーセンサンプラーを使用 (参照材料表) サンプル浮遊細菌の培養と流量 28.3 L/min 使用 35 分のサンプリング時間で菌をサンプラーの各段階で培養プレートを置きます。各サンプリング後 75% エチルアルコールとサンプラーを十分に消毒します。
注: サンプラー流量は固定され、収集時間が手動計時によって制御されます。- 浮遊粒子の空気力学的直径によって定義される、アンデルセン 6 段サンプラー サンプル 6 段階を含む VI をステージ (0.65 – 1.1 μ m)、V (1.1-2.1 μ m) のステージ、ステージ IV (2.1 – 3.3 μ m)、ステージ III (3.3-4.7 μ m)、ステージ II (4.7-7.0 μ m)、I 期(≥7.0 μ m)。
- 細菌粒子を収集し、大豆カゼイン ダイジェスト寒天を含む各段階の培養プレート上に入金 (材料の表を参照してください)。サンプラーの各段階で上の多くの空気取り入れ口が付いている容器があります。
- 24-48 h; 37 ° C で浮遊細菌のコレクション版を文化します。次に、各ステージのサンプル皿の上の細菌のコロニー数をカウントします。
- 重複から 6 段アンダーセンサンプラーによって収集された粒子を防ぐためには、次の式によって各サンプラー レベルでコロニー数を修正します。
どこ Pr: 各レベルでコロニーの数を修正
N: 数のすべてのレベル (400) でサンプラーの穴をサンプリングし、
r: 植民地の実際の数。 - 空気の m3当たりの植民地単位を次のように計算します。
場所 c: 濃度 (CFU/m3)
N1-N6: 各レベルでコロニー数の修正
T: サンプリング時間 (分) と
F: サンプリング流量 (28.3 L/分)。 - 手順 5.1 - 畜産、畜舎の 4 種類を含むバイオエアロゾルを勉強する 5.3 からのメソッドを使用します。
注: 家畜ファームは長春、中国であります。各豚舎で地上 2 m の中央の位置に選ばれたサンプリング場所。)細菌の文化後、板の手順 6.1 - 6.2 で説明したようにすべての植民地を扱います。
6. 培養細菌の同定
- 48 時間、72 時間培養の後、2 mL の遠心管に細菌を配置します。マルチソース DNA 抽出キットを使用して、これらの細菌や真菌の DNA を抽出 (材料の表を参照してください)。DNA 抽出プロセスは、セクション 4.2 で説明です。
- 16S rdna 塩基配列に 200 μ L の DNA 抽出のサンプルを使用します。手順 4.2、4.3、4.4 生物組成解析.で説明されているように同じプロセスを使用します。
Representative Results
本研究では我々 に対して全体的な午後分布の評価および酪農場のバイオエアロゾルの包括的な分析 9 月から 12 月。多くの環境要因は、エアロゾル粒子の分布。TSI レーザー パーティクル カウンターを使用して牛の家で午後の濃度と粒径分布を調べた。図 1 aのように、エアロゾル粒子の濃度は 12 月で最高, 最低温度と湿度 (表 1) の変化によって引き起こされる可能性があります月でした。吸入エアロゾル粒子の濃度 (0.3 3.0 μ m) 合計粒子濃度 (図 1 b) の 99% 以上を占めているし、この範囲内の粒子が人間のため、深刻な問題を引き起こしている、深い上気道に達する可能性があると動物。
サンプルの生物学的組成分析は、DNA 抽出、細菌16SrDNAおよび微生物文化ではなく真菌のITS領域シーケンスで実行できます。フィルターと低気圧性エアロゾル サンプラーまたは高ボリュームの空気サンプラーを使用して収集されたサンプルのバイオエアロゾルの生物学的解析から細菌や菌類の収集にこれらの 2 つの方法の効率性予め比較できます。2016 年 12 月 20 日に北京工科大学キャンパスにおける北京もやのかかった日の間に収集されたサンプルのバイオエアロゾルの解析結果を図 2に示しました。細菌のコレクションの結果は低気圧性エアロゾル サンプラーが (図 2 a) フィルターを使用した大容量空気サンプラーより多くより多くの属を収集します。菌類コレクション、これらのサンプラーを示した同じコレクションの効率性とほぼ同じ属元素 (図 2 b)。図2 の結果から我々 は細菌やカビのためのこれらの 2 つの方法の別のコレクションの効率を測定することができた。細菌コレクションの低気圧性エアロゾル サンプラーは高ボリュームは、前者からサンプルを示した (図 2 a) 高い属豊富なのでフィルターとサンプラーを空気よりもはるかに実行されます。しかし、サンプリング方法が異なるから 2 つのサンプルの真菌のシーケンス解析は、ほぼ同一の群集構造 (図 2 b) を示した。
6 段アンダーセンサンプラーを用いた浮遊培養細菌を調べた。図 3に示すとおり、ステージ - VI 粒子の培養の細菌のコロニー数が減少しました。ステージ I の粒子 (粒子サイズ > 8.2 μ m) 培養細菌コロニーの最高の数字を持っていた。割合はステージ I 分娩、妊娠中の雌豚の家を含む畜舎の 4 種類の植民地、肥育ハウスとハウスの離乳は 33%、30%、26%、34%、それぞれ。畜舎の 4 種類でステージ II 植民地の割合は 20%、22%、19% と 20% であった。畜舎の 4 種類でステージ III 植民地の割合は 18%、18%、18%、19% であった。畜舎の 4 種類のステージ IV 植民地の割合は 17%, 16%, 16%, 16% であった。畜舎の 4 種類でステージ V 植民地の割合は 10%、10%、14%、6% であった。VI 期粒子 (粒子サイズ < 1.0 μ m) は、最低培養細菌コロニー数を持っていた。畜舎の 4 種類でステージ VI 植民地の割合は 3%、5%、6%、5% であった。
大気試料 6 段アンダーセンサンプラーを用いた畜舎の 4 種類の採集し、適切な条件で培養しました。各粒子の段階から収集した培養の細菌の全ゲノム DNA は抽出され、細菌16S rdna 塩基および真菌のITS領域シーケンスで検出します。91 属と細菌の 158 種の合計は、畜舎の培養菌の同定されました。畜舎、ハウス、妊娠分娩を含む 4 種類の培養の細菌群集構造の家の種をまく、肥育ハウスとハウスの離乳は、図 4に示す段階からデータを私 VI のステージに。優勢な細菌属の内容は異なる畜舎の中で同じではありません。
図 1: 別の 4 ヶ月分の濃度と粒径分布。(A) 調査期間中午後数箱型図。各箱型図には、最大値、最小値、中央値、2 つの四分位数とデータベースの異常値が含まれています。(B) 午後の平均サイズの分布マップ。9 月から 12 月に家で 80 の牛があった。午後の割合 (≥ 3 μ m) の 4 ヶ月 (9 月、10 月、11 月、12 月) は、0.002 0.002 0.005 0.005 それぞれ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 2 つのサンプラーによって収集されたバイオエアロゾル サンプルの生物学的解析します。(A) と (B) 別のコレクション メソッド バイオエアロゾル試料の細菌や菌類の属元素を表示します。濡れ壁空気サンプラーは、低気圧性エアロゾル サンプラーを表します。水晶フィルターは、フィルターの高ボリュームの空気サンプラーを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 畜舎の 4 種類の培養菌の階層的分布を平均します。畜舎の 4 つのタイプは、分娩、妊娠中の雌豚の家、家を肥育と家を離乳します。S6 に S1 は、アンダーセンサンプラー 6 段によって収集された 6 粒子段階 (I vi) を表します。ステージはステージ VI を含む浮遊粒子の空気力学的直径によって定義された (0.65 1.1 μ m)、V (1.1 2.1 μ m) のステージ、ステージ IV (2.1 3.3 μ m)、stage III (3.3 から 4.7 μ m)、II (4.7-7.0 μ m) のステージ、ステージ I (7.0 μ m)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 大気試料中の別の分布と微生物群集構造。大気試料 6 段アンダーセンサンプラーを用いた畜舎の 4 種類の採集し、適切な条件で培養しました。アンダーセンサンプラー 6 段によって収集される各粒子段階で培養の細菌の全ゲノム DNA は抽出され、細菌16S rdna 塩基配列によって検出されました。豚舎の種類ごとに 6 を 1 の数字は、6 段アンダーセンサンプラーによる粒子段階 VI に私は測定を表します。右側のテキストは、各菌の属名を含まれます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
本研究で我々 は畜産農家でぼんやりとした日中に得られたいくつかの代表的な結果を提供しました。北京ぼんやりとした日中バイオエアロゾル検体からの結果は、午後北京ぼんやりとした日中に存在せず午後の生物学的組成物の生物学的組成物のよりよい理解を促進しました。畜産農家から採取したサンプルから結果も併せると理論的基礎と健康な繁殖の技術サポートの環境空気資材、畜産農場で安全生産の基本的なデータを提供します。多くの環境要因は、温度、湿度、風速など牛の家 (図 1) のエアロゾル粒子の分布に貢献するかもしれない。以前の研究は、畜産農家で午後が飼料、糞便、毛皮、羽毛、動物の活動に関連する可能性がありますから主に来ることを明らかにしました。環境要因が動物の活動だけでなく、集計や比較的閉じた牛の家で午後の拡散の影響を与えます。したがって、4 つの異なる月で異なる濃度と PM の粒径分布を検出します。衛生状態、授乳法と動物の活動のほか、畜舎は、空気 (図 4) で培養の細菌のコミュニティ構造にも影響を与える可能性がありますの 4 つのタイプの間で異なるあった。
ただし、この研究では、組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布を研究に使用できる利用可能な方法に主に焦点を。微生物の他のサンプルと比較して、これらの浮遊微生物濃度は非常に低い濃度を持っているし、多数のコレクションとの検出中に一定の困難を紹介する無機の粉塵などの不純物を混ぜていますこのような微生物の21。したがって、微生物のエアロゾルのコレクションと検出の適切なメソッドを選択する必要があります。微生物における大気エアロゾルのコレクションは通常、液体、半固体または固体サンプリング媒体22,23,24 で微生物を収集する沈殿法や特殊な機器を使用して行われます.その後、いくつかの対応する技術的な治療法と特定のテスト ・分析その後遂行される25。サンプリング媒体を微生物の検出と解析26に関連付けられているエラーを減らすためにそのまま保つ必要があります。ただし、別エアロゾル微生物のサンプラーは、彼らの異なるサンプリング原則とメディアのためのサンプルの整合性に異なる効果を持ちます。人々 は、集じん27濾過抵抗、慣性宿便など、異なるサンプリング原則を使用して、バイオエアロゾル サンプラーの多くの種類を設計しています。
サンプラーに影響を与える、浮遊時高速でサンプリング媒体に抽出装置を用いたプッシュできます。サンプラーに影響を与える 2 つのタイプがある: 固体・液体。サンプラーに影響を与える固体低濃度サンプル バイオエアロゾルに使え、空気にほとんど浸透することができます28の流れ。異なるサイズのエアロゾル粒子の予め上映することができますや、微生物培養微生物10の生存率が向上する培養液に直接サンプリングすることができます。慣性衝撃による微生物エアロゾル粒子が同じサイトで簡単に衝突してコロニーは、培養後簡単に重なる可能性があります。現時点では、最も一般的な固体影響を与えるサンプラーはアンデルセン 6 微生物エアロゾル サンプラーです。この研究では、異なるサイズの浮遊時の分散培養細菌を研究するのにアンダーセンサンプラー 6 段を使用しました。
低気圧性エアロゾルのサンプラーは、円柱または円錐に高速でスパイラル空気にサイクロンを使用します。バイオエアロゾル粒子は微生物、サンプラーの内側の壁にぶつかることができるサンプリング バッファーによって収集し、その遠心力によって気流から分離することができます。このメソッドは、便利で大流量の時間が長いとかサンプリング処理に使用できます。ただし、このメソッドは操作が液体に依存しているために、低温で実装できません。本研究で使用される低気圧性エアロゾル サンプラーは抽出および分析29のための水の小さなボリュームにサンプリングした空気から空輸の病原体や粒子を転送できる低気圧性の接壁エアロゾル サンプラーです。
フィルター サンプラーは低温条件下で動作することができます、特定のサイズ以上の粒子をサンプルすることができます。ただし、それら微生物の活動に大きな影響を与える、傷つくために傾向サンプリング活動に関するその後の研究に影響を大きく与える。本研究ではバイオエアロゾル北京ぼんやりとした日から採取したフィルターを使用した大容量の空気サンプラーと低気圧性エアロゾルのサンプラーを使用して.この実験の目的は、分離することがなく午後の生物学的組成と浮遊真菌の培養分析します。したがって、これらの 2 つのサンプリングの方法は本研究には適していた。低気圧性エアロゾル サンプラー方法で、低濃度で浮遊真菌実行バッファーに容易に抽出することができ、フィルターのサンプルで用いられる追加治療なし便利な分析することができます。今回、これら 2 つのサンプリング方法、低気圧性エアロゾル サンプラー、フィルター サンプラー、サンプリング効率を示した。フィルターのサンプル、フィルターからサンプルの回復などで用いられる追加の治療は、これらの 2 つの方法の主な違いの 1 つです。その上、空気サンプルを収集実行バッファーに直接低気圧サンプラーによって他のメソッドをフィルターに採取しながら。サンプリング メソッドの異なるタイプの特性別のサンプリング効率に貢献するかもしれない。低気圧性エアロゾル サンプラーは微生物コレクションに適して、この仮定は、さらに確認を必要がありますと仮定することができます。
本研究では細菌の16S rDNAと真菌のITS領域シーケンスはバイオエアロゾルの生物学的解析を実行する使用されました。16SrDNAシーケンス微生物ゲノム30の16S rDNAセグメントの決定であります。16S rdna 塩基は、高い保存性、特異性微生物種31の識別のために便利になると原核生物に広く存在します。全ゲノム シーケンスは、ゲノム DNA および後続のシーケンスの抽出のみを必要とします。大量のデータに加え、このプロセスは、微生物群集構造のより包括的な解析もできます。ほか、メタゲノムは、将来のより多くの情報を提供することによってこの分野の研究にも使用できます。Handelsmanらはまず土32微生物の 1998 年の論文のメタゲノムの概念を提案しました。その後の研究で、メタゲノムの概念徐々 に受け入れられ、人間の腸と海と土33,34,35に含まれる微生物の多くの研究を行った。高スループット シーケンスのサポート メタゲノミクス技術が急速に発展、病原体検出の研究でますます重要な役割を果たしています。伝統的な微生物研究手法は主に分離・精製するためのカルチャに依存します。ただし、多くの研究は微生物の 99% 以上が培養できないため実行できません。従来の方法と対照をなしてメタゲノミクスは、個々 の生物36を分離することがなく全体として環境ですべての微生物の遺伝情報を実行できます。すべての結果として得られる微生物の網羅的解析を直接行うことが。
要約すると、この研究を示したいくつかの検出、サンプリング、監視; 午後を含む環境日の生物学的組成に関する研究に使用できる解析手法午後アンダーセンサンプラー 6 段、フィルターで高ボリュームの空気サンプラーや低気圧サンプラー; によってサンプリングDNA 塩基配列に基づくその後の生物学的解析。実習では、畜産農家の多くの種類など、さまざまな環境条件の下でこれらのメソッドを使用することができます。私たちのプロトコルおよび結果は、さらに環境における真菌や細菌のバイオエアロゾルの健康への影響を探る世界中に他の研究者を助けるかもしれない。
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究のための財政支援は、中国の国家自然科学基金 (第 41775148) から来た。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
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