Summary
Entender la composición biológica del material particulado ambiental es importante para el estudio de sus impactos significativos en la salud y la diseminación de la enfermedad. Aquí, utilizamos tres tipos de métodos de muestreo de bioaerosol y un análisis biológico de microbios aéreos para explorar mejor las comunidades microbianas aerotransportadas bajo diferentes condiciones ambientales.
Abstract
Variable microorganismos en materia particulada (PM) bajo diferentes condiciones ambientales pueden tener impactos significativos sobre la salud humana. En este estudio, hemos descrito un protocolo de múltiples análisis de las composiciones biológicas en ambiental h. cinco experimentos se presentan: (1) PM número de monitoreo mediante el uso de un contador de partículas láser; (2) PM colección utilizando un muestreador ciclónico del aerosol; (3) PM colección utilizando un muestreador de alto volumen de aire con filtros; (4) colección de microbios cultivable por el muestreador Andersen de seis etapas; y (5) detección de composición biológica del PM ambiental bacteriana 16SrDNA y hongos su región ordenando. Se seleccionaron días nebulosos y una explotación ganadera como dos ejemplos típicos de la aplicación de este protocolo. En este estudio, estos dos métodos de muestreo, dechado ciclónico del aerosol y muestreador de filtro, demostró la eficacia de muestreo diferentes. El dechado ciclónico del aerosol se realiza mucho mejor en cuanto a la recolección de las bacterias, mientras que estos dos métodos mostraron la misma eficacia en la recolección de hongos. Muestreadores de filtro pueden trabajar bajo condiciones de baja temperatura mientras que muestreadores ciclónicos aerosol tienen una limitación de muestreo para la temperatura. Un sampler impacto sólido, como un muestreador Andersen de seis etapas, puede utilizarse para bioaerosoles de muestra directamente en el medio de cultivo, lo que aumenta la tasa de supervivencia de microorganismos cultivables. Sin embargo, este método se basa principalmente en cultura mientras que más del 99% de microbios no cultivado. ADN extraído de las bacterias cultivables recopiladas por el muestreador de seis etapas de Andersen y las muestras recogidas por dechado ciclónico del aerosol y se detectaron muestreador de filtro bacteriano 16S rDNA y hongos su región ordenando. Todos los métodos anteriores pueden tener amplia aplicación en muchos campos de estudio, tales como monitoreo ambiental y detección de patógenos aerotransportados. De estos resultados, podemos concluir que estos métodos se pueden utilizar bajo diferentes condiciones y pueden ayudar a otros investigadores a profundizar en los impactos de la salud de bioaerosoles ambiental.
Introduction
En ambientes naturales, varios tipos de microorganismos existen en bioaerosoles, incluyendo hongos, bacterias, virus y otros microorganismos1. Microorganismos aerotransportados, que pueden ser emitidas por algunas actividades humanas como las operaciones de alimentación animal en las fincas ganaderas, son los contenidos importantes del medio ambiente atmosférico2. Estos microorganismos pueden no sólo desempeñan un papel importante en el medio ambiente atmosférico sino también tener impactos significativos en la salud y enfermedades transmitidas.
Como una forma importante de propagación de enfermedades, aerosoles microbianos han atraído gran atención en todo el mundo. En estudios recientes, muchas enfermedades humanas fueron encontradas para ser asociados con la composición compleja de materia particulada ambiental (PM) en diferentes lugares, tales como fábricas químicas, explotaciones ganaderas y smog de las ciudades3,4. La composición biológica del PM puede contribuir a algunas enfermedades respiratorias y cardiovasculares en seres humanos expuestos al PM5. Diversas regiones del cuerpo, como la mucosa, piel, tracto digestivo y vías respiratorias, pueden ser blancos potenciales de los microbios atados PM6,7. Un mayor riesgo de cáncer de pulmón ocasionado por la exposición prolongada a PM2.58.
Bacterias aerotransportadas han sido estudiadas en varios lugares en varios países alrededor del mundo, incluyendo en las estaciones de metro, hospitales veterinarios, mataderos, curtiembres, procesadoras de leche, instalaciones, minas de carbón, de compostaje clínicas dentales y la generación de ambientes de interior9,10,11,12,13,14,15,16,17, un gran número de informes sobre aerosoles biológicos. Lugares asociados con campus, ganado granjas y ciudades grandes durante días nebulosos son tres condiciones públicas particularmente importantes para los que tenemos que explorar las conexiones entre la salud humana y los efectos potenciales de la exposición de PM. Además, durante los días de invierno en las ciudades del norte de China, PM2.5 valores altos pueden afectar la salud humana. Aunque PM2.5 puede generar efectos tóxicos apuntando a las superficies respiratorias y disolviéndose en la sangre18, todavía no está claro si y cómo los microbios atados PM2,5 podrían potencialmente afectar la salud humana19 ,20. Explotaciones ganaderas son una de las principales fuentes de PM y aerosoles microbianos en el aire. El gran número de patógenos, como virus de la influenza y Brucella melitensis, que son llevadas por aerosoles en los campos alrededor de las granjas es factores importantes que causan enfermedades respiratorias en ganado y aves de corral los trabajadores.
En este estudio, exploramos varios tipos de análisis de bioaerosoles, incluyendo colección de bioaerosol de monitoreo, número de PM y análisis de la composición biológica. Se recolectaron muestras de aire por un muestreador ciclónico del aerosol, un muestreador de alto volumen de aire con filtros y un muestreador de seis etapas de Andersen. Luego, las muestras recogidas por estas tres muestras se analizaron por análisis biológicos, incluyendo bacteriano 16S rDNA y hongos su secuenciación para determinar sus composiciones biológicas. Aquí, mostramos resultados representativos de las muestras de bioaerosol recolectadas durante días nebulosos de Beijing y de explotaciones ganaderas indicando que bioaerosoles podrían tener gran impacto en la salud humana y animal. La comparación entre el líquido y el filtro de muestreo métodos también fueron exploradas en este estudio se basa principalmente en los datos de la DNA 16S y hongos su secuencia.
Protocol
1. PM número monitoreo
- Use una partícula láser aerotransportado contador (véase Tabla de materiales) para determinar el número total de PM. Recoger la PM por el puerto de muestreo de aire en la parte superior del contador de partículas láser aerotransportado.
Nota: Este contador de partículas es un equipo de automatización y puede trabajar independientemente cuando el programa entre tiempo de muestreo, intervalos, tiempos de colección, etc. se ha establecido en su pantalla táctil.- Equipar el instrumento con un sensor para monitorear la temperatura y humedad relativa. Medir y registrar datos de temperatura y humedad relativa simultáneamente cada 5 min.
- En total, miden y registran 6 clases de tamaño de partícula diferente (0.3-0.5 μm, 0.5-0.7 μm, 0.7-2.5 μm, 2.5-5 μm, μm 5-10 y > 10 μm) cada 5 min medir simultáneamente 4 otras clases de tamaño de partícula (0.3-0.5 μm, 0.5-1 μm, 1-3 μm y ≥ 3 μm).
- Recolectar las muestras de aire aunque el agujero de toma de muestras en la parte superior de la muestra y utilizar los módulos de prueba dentro de la muestra para medir el tamaño de partícula de cada PM. Entonces los datos se almacenan automáticamente. Todos los procesos anteriores se puede realizar automáticamente después de los parámetros relativos, incluyendo el tiempo de muestreo y contando la gama, se fija aunque el displayer mini touch del contador de partículas láser aerotransportado.
Nota: Este contador de partículas es un equipo de automatización y tiene módulos de prueba que cuentan el número de horas de clases de tamaño de partícula diferente.
- Para determinar el error experimental estándar, asegúrese de que clases de tamaño de partícula diferente cuentan con por lo menos 15 repeticiones. Asegúrese de que lecturas son almacenadas en la memoria interna del instrumento y posteriormente analizadas.
- Asegúrese de que análisis de los datos de concentración número de PM, la prueba ANOVA y el porcentaje de PM en cada clase de tamaño. Por ejemplo, como se muestra en la figura 1A, la concentración de número de PM en diciembre (237.6 partículas/cm3) fueron significativamente superior a los de octubre (promedio: 110.2 partículas/cm3) (ANOVA; P-Value < 0.05). Figura 1B se muestra el número de partículas menor de 3 μm representaron más del 99% del total.
- Utilice el contador de partículas láser para monitorear las concentraciones de PM número y almacenar automáticamente los datos. Utilice un disco flash USB para exportar los datos en el ordenador y realizar la prueba ANOVA.
2. PM colección Samplers ciclónico del Aerosol
- Realizar el PM de muestreo en un área abierta sin cualquier cerca principales fuentes de contaminación en ∼2 m sobre el suelo.
- Registro de la posición del sitio de muestreo. Por ejemplo, el campus del Instituto de tecnología de Beijing es la siguiente: 39 ° 57' 51,0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Utilizar un muestreador ciclónico del aerosol para recoger muestras de aire. Utilizar un flujo de sampler de 323 L/min y un tiempo de colección de 6 h.
Nota: La tasa de flujo del muestreador es fijo y no se puede cambiar. El tiempo de colección es controlado por el manual de mantenimiento de tiempo ya que hay sólo un botón de arranque y parada en este sampler.- Utilizar agua estéril para lavar el interior del muestreador ciclónico del aerosol 3 veces antes y utilizar la función automática de limpieza 3 veces por continuamente el botón cobrar 3 veces.
- Presione el botón cobrar para comenzar el muestreo y presione el botón de la bomba para detener la toma de muestras. Poner el sampler en un estante o un piso sin que nadie sostiene en su lugar.
- Conservar las muestras en la oscuridad a-20 ° C hasta el análisis posterior.
3. PM colección de filtros
- Realizar el PM de muestreo en un área abierta sin cualquier cerca principales fuentes de contaminación en ∼2 m sobre el suelo.
- Registro de la posición del sitio de muestreo. Por ejemplo, el campus del Instituto de tecnología de Beijing es la siguiente: 39 ° 57' 51,0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Recolectar las muestras de PM en 20,32 x 25.4 cm2 los filtros (véase Tabla de materiales) mediante el uso de un muestreador de aire de alto volumen (véase Tabla de materiales) con un caudal de 1.000 L/min fijar el tiempo de tarifa y recogida de flujo relativa programación de auto.
- Conservar los filtros todos muestreados en la oscuridad a-20 ° C hasta el análisis posterior.
4. Análisis de la composición biológica
- Para el análisis de la composición biológica, utilizar cada muestra de líquido de la muestra de sampler o filtro ciclónico del aerosol para la extracción de ADN por una extracción de ADN multisource Kit (véase Tabla de materiales) según protocolos del fabricante.
- Para las muestras de muestreador de alto volumen de aire con filtros, usar 1/8 de cada muestra de filtro para la extracción de ADN. Coloque el filtro en un tubo de 50 mL con la muestra hacia adentro y la espalda hacia la pared del tubo. Agregar 10 cuentas en los sitios central hacia el lado del filtro que contiene la muestra.
- Vórtice el tubo por 15 min a temperatura ambiente. Pipeta el líquido en el tubo en un tubo de centrífuga de 50 mL limpio para continuar con el proceso de extracción de ADN.
- Extraer el ADN de la muestra por los procesos siguientes.
- Centrifugue la muestra de las bacterias a 2.000 x g durante 5 min, retirar el sobrenadante y suspender las bacterias en 2 mL de tampón PBS estéril.
- Recoge la suspensión de bacterias en un tubo de centrífuga de 2 mL y luego centrifugar a 2.000 x g durante 5 min eliminar la solución sobrenadante.
- Añadir 350 μL de tampón de PBS estéril que contiene las bacterias suspendidas en la solución.
- Agregar 0,8 mL de Rnasa A.
- Añadir 150 μL de tampón de CL y 8 μL de proteinasa K y mezclar inmediatamente por vortex por 1 minuto. Después de la breve centrifugación a 1.000 x g durante 30 s (sin residuos en la pared), poner el tubo de centrífugo de agua de 56 ° C durante 10 minutos.
- Añadir 350 μL de tampón de PD y mezcla por 30 s y luego centrifugar por 10 min a 12.000 x g.
- Coloque el tubo de la preparación de ADN en un tubo de centrífuga de 2 mL y transferir la mezcla hecha en el paso 4.2.6 para el tubo de la preparación. Luego centrifugar por 1 min a 12.000 x g.
- Deseche el filtrado, vuelva a colocar el contenido del tubo de preparación en el tubo de centrífuga 2 mL original y añadir 50 μL de tampón de W1. Centrifugue la mezcla durante 1 min a 12.000 x g.
- Deseche el filtrado, vuelva a colocar el contenido del tubo de preparación en el tubo de centrífuga 2 mL original y añadir 700 μL de Buffer W2. Centrifugue la mezcla durante 1 min a 12.000 x g. Repita este paso para lavar otra vez con 700 μL de Buffer W2.
- Elimine el líquido de desecho y vuelva a colocar el contenido del tubo de preparación en el tubo de centrífuga 2 mL original. Centrifugue la mezcla durante 1 min a 12.000 x g.
- Colocar el contenido del tubo de preparación del ADN en otro tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL y añadir 100 μL de agua desionizada o eluyente a la mitad de la membrana en el tubo de la preparación (agua desionizada o eluyente fue calentado a 65 ° C). Permite la mezcla a temperatura ambiente durante 1 min y Centrifugue la mezcla durante 1 min a 12.000 x g.
- Realizar la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (Q-RT-PCR) para cuantificar la abundancia relativa de bacterias y hongos en los filtros de muestreo.
- Utilizar cebadores como sigue: para bacteriano 16S rDNA, 515F (GTG de 5'-CCA GCM GCC GCG GTA A-3') y 806R (GGA 5' CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); y para los hongos ITS, ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3') y ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3').
- Ejecutar los ensayos de RT-Q-PCR en un sistema de PCR en tiempo real (véase Tabla de materiales). Condición de RT-PCR: predegeneration, 95 ° C, 10 minutos; degeneración, 95 ° C, 15 s; recocido y extensión, 60 ° C, 1 min; 40 ciclos de degeneración a recocer y extensión.
- Para el análisis de estructura de comunidad bacteriana y fúngica, amplificar la región V1 – V3 de bacteriano 16S rDNA y la región ITS del fungicida operon rRNA por PCR.
- Utilizar los iniciadores como sigue: para las bacterias, V1-9F (5′-AAC ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′) y V3-541R (5′-CCA TCT gato CCC TGC GTG TCT CCG ley CAG-código de barras-ACW TTA CCG CGG cardiotocografía CTG G '-3 '); y para hongos, ITS-3F (5'-AAC ATC CCC TGT GTG CCT TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3') y su-4R (5'-CCA TCT gato CCC TGC GTG TCT CCG ley CAG-código de barras-GCT CCG CCT CTT ATT GAT ATG C-3').
- Asegurar que la mezcla de 20 μL de PCR incluye 2 μL de dNTPs 2,5 mM, 4 μL de 5 × FastPfu Buffer, 0,8 μL de cada cebador (5 μM), 0.4 μL de FastPfu polimerasa y 10 ng de ADN de plantilla (véase Tabla de materiales).
- Utilizar el programa PCR como sigue: 94 ° C por 5 min; seguido de 10 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55-60 ° C por 45 s y 72 ° C durante 90 s; 20 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 45 s y 72 ° C durante 90 s; y una extensión final a 72 ° C durante 5 minutos.
- Realizar la purificación de DNA, cuantificación de ADN y pirosecuenciación como se describe en un anterior estudio 21.
5. Bioaerosol muestreo y cultivo
- Utilizar un muestreador de seis etapas Andersen norma internacional (véase Tabla de materiales) bacterias aerotransportadas cultivables y hongos con un caudal de 28,3 L/min uso un tiempo de muestreo de 35 minutos pone la placa de cultivo en cada etapa del sampler. Suficientemente desinfectar el dechado con 75% de alcohol etílico después de cada muestreo.
Nota: La tasa de flujo del muestreador es fijo y el tiempo de colección es controlado por el manual de mantenimiento de tiempo.- Muestra los seis etapas con el sampler de seis etapas de Andersen, que se define por el diámetro aerodinámico de las partículas aerotransportadas, incluyendo etapa VI (0.65-1.1 μm), de la etapa V (1.1 – 2.1 μm), etapa IV (2.1-3.3 μm), fase III (3.3-4.7 μm), etapa II (4.7 – 7.0 μm) y etapa I (≥7.0 μm).
- Recoger las partículas bacterianas y depositar en la placa de cultivo en cada etapa que contiene caseína soja Digest Agar (véase Tabla de materiales). Hay un contenedor con muchas tomas de aire en la parte superior en cada etapa del sampler.
- Cultura la colección de bacterias aerotransportadas las placas a 37 ° C durante 24-48 h; Luego, cuente el número de la colonia de bacterias en el plato de muestra para cada etapa.
- Para evitar que las partículas recogidas por muestreador Andersen seis etapas de superposición, corregir el número de colonias en cada nivel de muestras mediante la siguiente fórmula:
donde Pr: corrige número de colonias en cada nivel,
N: número de agujeros del sampler en todos los niveles (400), de muestreo y
r: el actual recuento de colonias. - Calcular la unidad de colonias por m3 de aire como sigue:
donde C: concentración (UFC/m3),
N1-N6: el número corregido de colonias en cada nivel,
T: tiempo (min), de muestreo y
F: flujo de muestreo (28,3 L/min). - Utilizar métodos de pasos 5.1 - 5.3 estudio de bioaerosol en explotación ganadera, incluyendo cuatro tipos de criaderos.
Nota: La explotación ganadera se encuentra en Changchun, China. La posición central de 2 m por encima del suelo en cada pocilga fue seleccionada como ubicación de muestreo). Después de la cultura de las bacterias, tratar todas las colonias en las placas como se describe en pasos 6.1 - 6.2.
6. identificación de bacterias cultivables
- Después de 48 h o 72 h de cultivo, colocar las bacterias en un tubo de centrífuga de 2 mL. Extraer el ADN de estas bacterias u hongos usando una Kit de la extracción de ADN multisource (véase Tabla de materiales). El proceso de extracción de ADN se describe en la sección 4.2.
- Uso de muestra de extracción de ADN de 200 μL para la secuenciación del 16S rDNA . Use los mismos procesos como se describe en pasos 4.2, 4.3 y 4.4 en el análisis de la composición biológica.
Representative Results
En este estudio, realizamos una evaluación de la distribución general de la PM y un análisis exhaustivo de los bioaerosoles en una granja lechera de septiembre a diciembre. Muchos factores ambientales contribuyen a la distribución de partículas de aerosol. Se estudió la distribución de tamaño y concentración de PM en una casa de vaca utilizando un contador de partículas láser TSI. Como se muestra en la figura 1A, la concentración de partículas de aerosol fue mayor en diciembre y menor en octubre, que pueda ser causado por cambios de temperatura y humedad (tabla 1). La concentración de partículas de aerosol inhalable (0.3-3.0 μm) representaron más del 99% de la concentración de partículas totales (figura 1B), y las partículas en este rango podrían llegar a las vías respiratorias profundas, causando serios riesgos para los seres humanos y animales.
Análisis de la composición biológica de las muestras pueden realizarse por la extracción de ADN, bacteriana 16SrDNA y hongos su secuenciación de región en lugar de cultivo de microorganismos. Partir del análisis biológico de bioaerosol muestras recogidas mediante un muestreador ciclónico del aerosol o un muestreador de alto volumen de aire con filtros, preliminarmente podemos comparar las eficacias de estos dos métodos en la recolección de las bacterias y hongos. Figura 2 mostró los resultados del análisis de las muestras de bioaerosol recogidos durante días nebulosos de Beijing en el campus del Instituto de tecnología de Beijing en 20 de diciembre de 2016. Para la recolección de las bacterias, los resultados indicaron que el dechado ciclónico del aerosol había recogido muchos más géneros que el muestreador de alto volumen de aire con filtros (figura 2A). Para la recolección de hongos, estos samplers mostraron eficiencias de colección igual y casi del mismo género la abundancia (figura 2B). De los resultados presentados en la figura 2, hemos sido capaces de medir la eficiencia de colección diferente de estos dos métodos para bacterias y hongos. Para la colección de bacterias, el dechado ciclónico del aerosol se realiza mucho mejor que el gran volumen muestreador de aire con filtros debido a que las muestras del primero mostraron una mayor abundancia de género (figura 2A). Sin embargo, el análisis de hongos de la secuencia de las dos muestras de métodos de muestreo diferentes demostró las estructuras comunitarias casi idéntico (figura 2B).
Estudiamos aerotransportadas bacterias cultivables mediante el uso de un muestreador de seis etapas de Andersen. Como se muestra en la figura 3, se redujo el número de la colonia de bacterias cultivables de las partículas de-VI etapa. Etapa I partículas (tamaño de partícula > 8.2 μm) tuvo el mayor número de colonias de bacterias cultivables. El porcentaje de la etapa I colonias en cuatro diferentes tipos de criaderos como parto de la cerda de casa, embarazada casa, casa de engorde y destete fue de 33%, 30%, 26% y 34%, respectivamente. El porcentaje de colonias II etapa en cuatro diferentes tipos de criaderos fue 20%, 22%, 19% y 20% respectivamente. El porcentaje de colonias III etapa en cuatro diferentes tipos de criaderos fue 18%, 18%, 18% y 19% respectivamente. El porcentaje de colonias de etapa IV en cuatro diferentes tipos de criaderos fue 17%, 16%, 16% y 16% respectivamente. El porcentaje de colonias de V etapa en cuatro diferentes tipos de criaderos fue 10%, 10%, 14% y 6% respectivamente. Las partículas de la fase VI (partícula tamaño < 1.0 μm) tenían el más bajo número de colonias de bacterias cultivables. El porcentaje de colonias de VI etapa en los cuatro diferentes tipos de criaderos fue 3%, 5%, 6% y 5%, respectivamente.
Las muestras de aire fueron recogidas en cuatro diferentes tipos de criaderos mediante el uso de un muestreador de seis etapas de Andersen y luego cultivan bajo condiciones convenientes. El ADN de todo el genoma de las bacterias cultivables de cada etapa de la partícula fue extraído y detectado por bacteriano 16S rDNA y hongos su secuenciación de región. Se identificó un total de 91 géneros y 158 especies de bacterias en las bacterias cultivables en criaderos. Las estructuras de la comunidad de bacterias cultivables en cuatro diferentes tipos de criaderos, incluyendo casa, embarazada de parto siembran casa, casa de engorde y destete se muestran en la figura 4 con datos de la etapa I a etapa VI. El contenido de diferentes géneros bacterianos predominantes no es lo mismo entre los diferentes criaderos.
Figura 1: la distribución de tamaño y concentración de PM en cuatro meses diferentes. (A) Boxplot de número PM durante el periodo de estudio. Cada boxplot incluye el máximo, mínimo, mediana, dos cuartiles y valor anormal de la base de datos. (B) promedio de mapas de distribución de tamaño de PM. Había ochenta vacas en la casa de septiembre a diciembre. El porcentaje de PM (≥ 3 μm) en cuatro meses (septiembre, octubre, noviembre y diciembre) fue de 0,005 y 0.005, 0.002 0.002 respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: análisis biológico de bioaerosol muestras recogidas por dos muestreadores. (A) y (B) Mostrar la abundancia de géneros bacterianos o fúngicos en muestras de bioaerosol obtenidas con métodos de recolección diferentes. Muestreador de aire de pared mojada representa el dechado ciclónico del aerosol. Filtros de cuarzo representa el muestreador de alto volumen de aire con filtros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: mapas de distribución jerárquica de bacterias cultivables en cuatro tipos de criaderos de medio. Los cuatro tipos de criaderos son parto puerca embarazada, casa casa, casa de engorde y destete casa. S1 a S6 representan las etapas de seis partículas (I a VI) recopiladas por el muestreador de seis etapas de Andersen. Las fases fueron definidas por el diámetro aerodinámico de las partículas aerotransportadas, incluyendo etapa VI (0.65-1.1 μm), etapa V (1.1-2.1 μm), etapa IV (2.1-3.3 μm), fase III (3.3-4.7 μm), etapa II (4.7 7.0 μm) y de la etapa I (7.0 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: estructuras de la comunidad bacteriana con abundancias diferentes en las muestras de aire. Las muestras de aire fueron recogidas en cuatro diferentes tipos de criaderos mediante el uso de un muestreador de seis etapas de Andersen y luego cultivan bajo condiciones convenientes. El ADN de todo el genoma de las bacterias cultivables en cada etapa de la partícula recogida por el muestreador de seis etapas de Andersen fue extraído y detectado por secuenciación bacteriano 16S rDNA . Los números 1 a 6 en cada tipo de granja representan etapas de partícula a VI medido por el muestreador de seis etapas de Andersen. El texto a la derecha incluye el nombre de cada bacteria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
En este estudio, nos proporciona algunos resultados representativos obtenidos durante días nebulosos y en las fincas ganaderas. Los resultados de muestras de bioaerosol durante días nebulosos Beijing facilitan una mejor comprensión de las composiciones biológicas de la composición biológica de PM sin PM presente durante días nebulosos de Beijing. Los resultados de las muestras tomadas de explotaciones ganaderas también proporcionará los datos básicos para aire ambiental quality control en criaderos y una fundamentación teórica y asistencia técnica para la crianza saludable y segura producción en explotaciones ganaderas. Muchos factores ambientales, como temperatura, humedad y velocidad del viento, podrían contribuir a la distribución de partículas de aerosol en la casa de la vaca (figura 1). Estudios anteriores han revelado que la PM en las fincas ganaderas principalmente proviene de las forrajeras, heces, piel y plumas, que pueden estar relacionadas con las actividades animales. Los factores ambientales pueden afectar no sólo actividades animales, pero también la agregación y difusión de la PM en una casa de vaca relativamente cerrado. Por lo tanto, detectamos diferentes concentraciones y distribuciones de tamaño de PM en cuatro meses diferentes. Además, la condición sanitaria, alimentación animal actividad y método eran diferentes entre los cuatro tipos de criaderos, que también podrían afectar a su estructura de la comunidad de bacterias cultivables en el aire (figura 4).
Sin embargo, en este estudio, centra principalmente en los métodos disponibles que podríamos usar para estudiar la composición y distribución de bioaerosoles bajo diferentes condiciones ambientales. En comparación con otras muestras microbianas, los microorganismos aerotransportados tienen concentraciones muy bajas y se mezclan con una gran cantidad de impurezas, tales como partículas de polvo inorgánico, que introducen ciertas dificultades durante la colección y la detección de tales microorganismos21. Por lo tanto, deben seleccionarse los métodos adecuados de recogida y detección de aerosoles microbianos. La recogida de muestras de aerosoles microbianos generalmente se realiza mediante el método de precipitación o equipo especializado para recoger los microorganismos en muestras líquidas, semisólidas o sólidas mediana22,23,24 . Entonces, un tratamiento técnico correspondiente y pruebas específicas y análisis posteriormente llevan a cabo25. El medio de muestreo tenga microorganismos intactos para reducir el error asociado a la detección y análisis26. Sin embargo, muestreadores de aerosol diferentes microorganismo tienen diferentes efectos sobre la integridad de las muestras debido a su muestreo diferentes principios y medios de comunicación. Personas han diseñado muchos tipos de muestreadores bioaerosol que utilizan principios de muestreo diferentes, como la impactación inercial, resistencia de filtración y precipitación electrostática27.
Muestreadores de impacto puede empujar aire PM en el medio de muestreo de alta velocidad mediante el uso de equipos de extracción. Hay dos tipos de muestreadores de impacto: sólidos y líquidos. Sólidos, muestreadores de impacto puede utilizarse para bioaerosoles de la muestra en una baja concentración y puede ser casi impermeable al aire fluir28. Partículas de aerosol de diferentes tamaños pueden ser examinadas preliminarmente, y microbios se pueden degustar directamente en el medio de cultivo, lo que aumenta la tasa de supervivencia de microorganismos cultivables10. Por impacto inercial, partículas del aerosol microbiano chocan fácilmente en el mismo sitio, y las colonias pueden solaparse fácilmente después de la cultura. En la actualidad, el dechado impactante sólido más común es muestreador Andersen 6 aerosoles microbianos. En este estudio, se utilizó un muestreador de seis etapas de Andersen para el estudio de las bacterias cultivables distribuidas en aire PM de diferentes tamaños.
Muestreadores de aerosol ciclónica utilizan ciclones al aire espiral a gran velocidad en un cilindro o cono. Las partículas del bioaerosol pueden separar de la circulación de aire por la fuerza centrífuga, lo que significa que los microbios pueden chocar con la pared interna del sampler y luego recopilados por el buffer de muestreo. Este método es conveniente y puede utilizarse para el muestreo largo momentos de gran flujo y las operaciones de muestreo. Sin embargo, este método no puede aplicarse a bajas temperaturas porque la operación depende del líquido. El dechado ciclónico del aerosol utilizado en este estudio es un dechado ciclónico pared mojada de aerosol que puede extraer y transferir patógenos aerotransportados y las partículas de aire muestreado en un pequeño volumen de agua para análisis29.
Muestreadores de filtro pueden trabajar bajo condiciones de baja temperatura y pueden muestra partículas de cierto tamaño. Sin embargo, ellos tienen un gran impacto en la actividad microbiana y son propensos a dañar, que mucho influirá en posteriores estudios sobre la actividad de muestreo. En este estudio, se recolectaron muestras de bioaerosol de nebulosos días de Beijing mediante un muestreador de alto volumen de aire con filtros y un muestreador ciclónico del aerosol. El objetivo de este experimento fue analiza la composición biológica de PM sin la separación y cultivo de microbios aéreos. Por lo tanto, estos dos métodos de muestreo fueron adecuados para este estudio. El método del muestreador ciclónico del aerosol, microbios aerotransportados a una concentración baja pueden ser fácilmente extraídos en el búfer de ejecución y luego pueden ser analizadas convenientemente sin el tratamiento adicional que se utiliza comúnmente para las muestras de filtro. En este estudio, estos dos métodos de muestreo, dechado ciclónico del aerosol y muestreador de filtro, demostró la eficacia de muestreo diferentes. El tratamiento adicional que se utiliza comúnmente para las muestras de filtro, tales como recuperación de la muestra del filtro, es una de las principales diferencias entre estos dos métodos. Además, el aire se recolectaron muestras directamente en el búfer de ejecución por dechado ciclónico del aerosol mientras que el otro método recogido muestras en los filtros. Las características de un tipo diferente de método de muestreo pueden contribuir a esta eficiencia de muestreo diferentes. Podemos suponer que el dechado ciclónico del aerosol es la mejor opción para la colección de microorganismos, y que esta hipótesis necesita más confirmación.
En este estudio, se utilizaron bacteriano 16S rDNA y hongos su secuenciación de región para realizar el análisis biológico de bioaerosoles. Secuencia del 16SrDNA es la determinación de los segmentos de ADNr 16S en el genoma microbiano30. 16S rDNA ampliamente existe en procariotas con conservación y especificidad, lo que lo hace útil para la identificación de especies microbianas31. Secuenciación de genoma completo requiere sólo la extracción de ADN genómico y posterior secuenciación. Además de producir una gran cantidad de datos, este proceso también permite un análisis más exhaustivo de la estructura de la comunidad microbiana. Además, metagenómica puede ser utilizado también en este campo de estudio, proporcionando más información en el futuro. Handelsman et al. primero propuso el concepto del metagenoma en un documento de 1998 sobre microbios en el suelo32. En posteriores estudios, el concepto del metagenoma gradualmente fue aceptado, y se llevó a cabo mucha investigación sobre los microbios en el humano gut, el océano y el suelo33,34,35. Con el apoyo de secuenciación de alto rendimiento tecnología de metagenómica, se ha desarrollado rápidamente, y desempeña un papel cada vez más importante en el estudio de detección de patógenos. Métodos tradicionales de investigación microbiana principalmente dependen de la cultura de separación y purificación. Sin embargo, muchos estudios no se puede realizar porque más del 99% de microbios no cultivado. En contraste con los métodos tradicionales, metagenómica puede tomar la información genética de los microbios en el ambiente como un todo sin la necesidad de separar organismos individuales36. Un análisis exhaustivo de todos los microorganismos que pueden llevarse a cabo directamente.
En Resumen, este estudio mostró varios detección, muestreo y métodos de análisis que podrían ser utilizados para estudios sobre la composición biológica del PM ambiental, incluyendo PM monitoreo; PM toma de muestras por un muestreador de seis etapas de Andersen, un muestreador de alto volumen de aire con filtros o dechado ciclónico del aerosol; y posterior análisis biológico basados en secuenciación de ADN. En la práctica, estos métodos pueden utilizarse bajo diferentes condiciones ambientales, tales como muchos tipos de explotaciones ganaderas. Nuestros protocolos y resultados pueden ayudar a otros investigadores en todo el mundo a explorar más a fondo los impactos de la salud de bioaerosoles hongos y bacterias en el ambiente.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Apoyo financiero para este estudio provino de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 41775148). Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
- Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
- Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
- Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
- Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
- Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
- Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
- Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
- Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
- Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
- Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
- Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
- Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
- Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
- Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
- Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
- Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
- Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
- Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
- Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
- Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
- Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
- Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
- Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
- Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
- Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
- Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
- Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
- Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
- Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
- Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
- Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
- Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
- Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).
