Summary
Çevre partiküler madde biyolojik kompozisyon anlama hastalığı yaymak ve insan sağlığı üzerinde önemli etkileri çalışma için önemlidir. Burada, biz üç tür bioaerosol örnekleme yöntemleri ve havada mikrop biyolojik bir analizini farklı çevresel koşullar altında hava mikrobiyal topluluklar daha iyi keşfetmek için kullanılır.
Abstract
Değişken mikroorganizmaların partiküler madde (PM) farklı çevresel koşullar altında insan sağlığı üzerinde önemli etkileri olabilir. Çevre PM. beş deneylerde biyolojik bestelerinden birden çok analizleri sunulmaktadır için bu çalışmada, bir protokol açıkladığımız: (1) PM numara bir lazer partikül sayaç; kullanarak izleme (2) PM siklonik aerosol örnekleyiciyi kullanarak toplama; (3) yüksek hacimli hava örnekleyici ile filtreleri kullanarak PM koleksiyonu; (4) culturable mikrop toplama Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından; ve (5) hafiye-in bakteri 16SrDNA ve mantar ITS bölge sıralamanın tarafından çevre de biyolojik bileşimi. Sisli gün ve bir hayvan çiftliği bu protokolü uygulamada iki tipik örnekleri olarak seçildi. Bu çalışmada, bu iki örnekleme yöntemi, siklonik aerosol örnekleyici ve filtre örnekleyici ', farklı örnekleme verimliliği gösterdi. Siklonik aerosol örnekleyici çok daha iyi bakteri, mantar toplama konusunda bu iki yöntem aynı verimliliği gösterdi ise toplama açısından gerçekleştirilen. Siklonik aerosol numune sıcaklık için bir örnekleme sınırlama varken filtre numune düşük sıcaklık koşullarında çalışabilirsiniz. Bir katı etkileyen örnekleyici, Andersen altı aşamalı örnekleyici gibi doğrudan kültür culturable mikroorganizmalar survival oranı artar orta, örnek bioaerosols için kullanılabilir. Ancak, mikroplar fazla % 99 kültürlü iken bu yöntem özellikle kültür üzerinde dayanır. DNA örnekleri ve Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından toplanan culturable bakteri çıkarılan siklonik aerosol örnekleyici tarafından toplanan ve filtre örnekleyici bakteriyel 16S rDNA ve mantar ITS bölge sıralamanın tarafından algılandı. Tüm Yöntem yukarıda geniş uygulama eğitim, çevre izleme ve hava patojen algılama gibi birçok alanlarda olabilir. Bu sonuçlar, bu yöntemler farklı koşullar altında kullanılabilir ve diğer araştırmacılar daha fazla çevresel bioaerosols sağlık etkileri keşfetmek yardımcı olabilir sonucuna varabiliriz.
Introduction
Doğal ortamlarda, mantar, bakteri, virüs ve diğer mikroorganizmalar1de dahil olmak üzere bioaerosols içinde çeşitli mikroorganizmalar var. Hayvancılık çiftliklerinde hayvan besleme işlemleri gibi bazı insan faaliyetlerinden yayılan, hava mikroorganizmaların atmosferik ortam2önemli içeriğe sahiptir. Bu mikroorganizmalar sadece atmosferik ortamda önemli rol oynarlar ama aynı zamanda insan sağlığı ve Hastalıkları yaymak üzerinde önemli etkilere sahip.
Hastalıkların yayılmasında önemli bir yolu mikrobiyal aerosoller dünya çapında geniş dikkat çekmiştir. Son çalışmalarda, birçok insan hastalıkları çevre partiküler madde (PM), Kimyasal fabrikalar, hayvan çiftlikleri ve smoggy şehirler3,4gibi farklı konumlarda karmaşık bileşimi ile ilişkili bulunmuştur. PM biyolojik bileşimi PM günese maruz kalan insanlar5bazı solunum ve kalp-damar hastalıkları için katkıda bulunabilir. Mukoza, cilt, sindirim ve solunum yolu, gibi farklı vücut bölgeleri potansiyel PM6,7' ye bağlı mikroplar olabilir. Akciğer kanseri riski uzun süre maruz kalmak PM2.58neden olabilir.
Metro istasyonları, veteriner hastaneler, mezbahalarda, kompost tesisleri, Tabakhane, süt işleme tesisleri, kömür madenlerinde, dahil olmak üzere dünyada birçok ülkede çeşitli yerlerinde ankete havadaki bakteri Diş Klinikleri ve kapalı ortamlarda9,10,11,12,13,14,15,16,17, üreten bir biyolojik aerosoller hakkında raporlar çok sayıda. Kalabalık yerleri kampüsleri ile hayvan çiftlikleri ilişkili ve sisli gün boyunca büyük şehirler için insan sağlığı ve PM pozlama potansiyel etkileri bağlantıları keşfetmek gereken üç özellikle önemli ortak koşullardır. Ayrıca, Çin'in Kuzey şehirlerde kış günlerinde yüksek PM2.5 değerleri insan sağlığını etkileyebilir. Her ne kadar PM2.5 -ebilmek oluşturmak toksik etkileri solunum yüzeyler hedefleyerek ve kan18eriterek, bunu isteyip istemediğinizi ve nasıl am2.5 bağlı mikropların potansiyel olarak insan sağlığına19 etkileyebilecek hala belli değil ,20. Hayvan çiftlikleri vardır PM ana kaynaklarından biri olan ve mikrobiyal aerosoller havada. Aerosoller alanları etrafında hayvan çiftlikleri tarafından yapılan patojenler, grip virüsü ve brusella melitensis, gibi çok sayıda solunum yolu hastalıkları hayvancılık ve Tavukçuluk işçiler neden önemli faktörlerdir.
Bu çalışmada, analiz bioaerosols PM sayı izleme, bioaerosol toplama ve biyolojik kompozisyon analizi de dahil olmak üzere, birden çok türde keşfettik. Hava örnekleri siklonik aerosol örnekleyiciyi, yüksek hacimli hava örnekleyici ile filtreler ve Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından toplanmıştır. O zaman, bu üç numune tarafından toplanan örnekleri bakteriyel 16S rDNA ve biyolojik kendi besteleri belirlemek için mantar ITS sıralama dahil olmak üzere biyolojik analiz tarafından analiz edildi. Burada, Beijing sisli gün boyunca toplanan bioaerosol örnekleri ve bioaerosols insan ve hayvan sağlığı üzerinde büyük etkileri olabilir gösteren hayvan çiftlikleri temsilcisi sonuçları göster. Sıvı ve filtre örnekleme yöntemleri arasında karşılaştırma da 16S DNA ve mantar ITS sıralama veri üzerinde ağırlıklı olarak bu çalışmada keşfedilmeyi.
Protocol
1. PM numarası izleme
- Bir hava lazer partikül kullanın (bkz. Tablo reçetesi) Toplam PM numarasını belirlemek için counter. Hava örnekleme Limanı hava lazer partikül counter üst tarafından PM toplamak.
Not: Bu parçacık sayaç otomasyon ekipmanları ve örnekleme süresi, aralığı, koleksiyon zamanlarda da dahil olmak üzere programın vb dokunmatik ekran üzerinde ayarlandığında bağımsız olarak çalışabilirsiniz.- Araç sıcaklık ve bağıl nem izlemek için bir sensör ile donatmak. Ölçmek ve sıcaklık ve bağıl nem verileri aynı anda her 5 dk kayıt.
- Toplamda, ölçmek ve 6 farklı parçacık boyutu sınıflar kayıt (0.3-0.5 mikron, 0.5-0.7 mikron, 0,7-2,5 mikron, 2.5-5 mikron, 5-10 mikron ve > 10 mikron) aynı anda her 5 dk. 4 parçacık boyutu sınıfları ölçmek (0.3-0.5 mikron, 0.5-1 mikron, 1-3 mikron ve ≥ 3 mikron).
- Hava örnekleri olsa da örnekleyici üst örnekleme delik toplamak ve her PM parçacık boyutunu ölçmek için test modülü içinde örnekleyici kullanın. Daha sonra verileri otomatik olarak depolanır. Yukarıdaki tüm işlemler örnekleme ve sayma aralığı içeren göreli parametreleri sonra otomatik olarak yapılabilir, ama hava lazer partikül sayacın mini dokunmatik displayer ayarlanır.
Not: Bu parçacık sayaç otomasyon ekipmanları ve PM farklı parçacık boyutu sınıfların saymak test modülü vardır.
- Deneysel standart hata değerlendirmek için farklı parçacık boyutu sınıfları ile en az 15 çoğaltmalar sayılır olun. Okuma enstrümanın dahili bellekte depolanan ve daha sonra analiz emin olun.
- Birincil veri analizi PM numara konsantrasyon, ANOVA testi ve PM yüzdesi her boyutu sınıfta içerdiğinden emin olun. Örneğin, Şekil 1Aile gösterildiği gibi (237.6 parçacıklar/cm3) Aralık PM numara konsantrasyonlarda önemli ölçüde bu Ekim ayında daha yüksekti (ortalama: 110.2 parçacıklar/cm3) (ANOVA; P-Value < 0,05). Şekil 1B bu parçacıkları sayısını 3 mikron toplam fazla % 99 muhasebesi daha küçük gösterir.
- Lazer parçacık sayaç PM numara konsantrasyonları izlemek ve otomatik olarak verileri depolamak için kullanın. USB birden parlamak yuvarlak yüzey içinde belgili tanımlık bilgisayar verileri verme ve ANOVA testi gerçekleştirmek için kullanın.
2. PM toplama siklonik Aerosol numune tarafından
- Başbakanın yakın herhangi bir büyük olmadan açık bir alanda kirlilik kaynakları ∼2 m yerden örnekleme gerçekleştirir.
- Örnekleme sitenin konumunu kaydeder. Örneğin, Pekin Teknik Üniversitesi Kampüs şudur: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Siklonik aerosol örnekleyiciyi hava örnekleri toplamak için kullanın. 323 L/min bir örnekleyici akışı ve 6 h bir koleksiyon zaman kullanın.
Not: Sampler akış hızı sabittir ve değiştirilemez. Bu örneği yalnızca bir başlatma ve durdurma düğmesi gibi toplama süre el ile zaman tutma tarafından kontrol edilir.- Steril su toplama önce 3 kez siklonik aerosol örnekleyici içini yıkamak için kullanın ve sürekli olarak 3 kez toplamak düğmesine basarak 3 kez otomatik temizleme fonksiyonunu kullanın.
- Örnekleme başlatmak ve örnekleme durdurmak için pompa düğmesine basın için toplamak düğmesine basın. Örnekleyiciyi kimse yerine onu tutarak bir raf veya kat koymak.
- -20 ° C'de karanlıkta tüm örnekleri kadar sonraki analizleri korumak.
3. PM toplama filtreleri tarafından
- Başbakanın yakın herhangi bir büyük olmadan açık bir alanda kirlilik kaynakları ∼2 m yerden örnekleme gerçekleştirir.
- Örnekleme sitenin konumunu kaydeder. Pekin Teknoloji Enstitüsü'nde kampüs Örneğin, aşağıdaki gibidir: 39 ° 57'51.0 '' N; 116 ° 19' 38,5 '' E.
- Yüksek hacimli hava örnekleyici kullanarak 20,32 × 25,4 cm2 filtreler (bkz. Tablo reçetesi) PM örnekler toplamak ( Tablo malzemelerigörmek) 1000 L/dak debi akış hızı ve toplama süresi göreli otomatik programlama tarafından ayarla.
- -20 ° C'de karanlıkta tüm örneklenen filtreleri kadar sonraki analizleri korumak.
4. biyolojik kompozisyon analizi
- DNA ekstraksiyon çok kaynaklı bir DNA ekstraksiyon kiti tarafından sıvı örnekleri siklonik aerosol örnekleyici veya filtre örnekten biyolojik kompozisyon analizi için kullanın (bkz. Tablo reçetesi) göre üreticinin iletişim kuralları.
- Yüksek hacimli hava örnekleyici filtreleri ile örnekleri için 1/8 her filtre örneği DNA ekstraksiyon için kullanın. Filtre içe dönük örnek ve tüp duvara doğru bakan arka 50 mL tüp içine koymak. 10 boncuk örnek içeren filtre tarafına doğru merkezi siteleri ekleyin.
- Girdap tüp 15 dakika oda sıcaklığında. Sıvı tüp içinde DNA ekstraksiyon işlemine devam etmek için bir temiz 50 mL santrifüj tüpüne pipette.
- DNA örneği aşağıdaki gibi işlemler tarafından ayıklayın.
- Bakteri örneği 5 min için 2.000 x g'santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 2 mL steril PBS arabelleği bakterilerde askıya alma.
- 2 mL santrifüj tüpü bakterilerde süspansiyon toplamak ve süpernatant çözüm atmak 5 min için 2.000 x g, santrifüj kapasitesi.
- Çözüm için askıya alınan bakteri içeren steril PBS arabelleği 350 μL ekleyin.
- RNase A. 0.8 mL ekleyin
- 150 μL arabellek CL ve İndinavir K 8 μL ekleyip 1 dakika sallayarak girdap tarafından hemen karıştırın. 1000 x g 30 için de kısa aralıklarla sonra s (duvardaki yok artıkları), 56 ° C su 10 dk santrifüj tüpü koymak.
- Arabellek PD ve 30 s için karışımı ve daha sonra 10 dk santrifüj 350 μL de 12.000 x g ekleyin.
- DNA hazırlık tüp bir 2 mL santrifüj tüpü yerleştirin ve adım 4.2.6 hazırlık tüp için yapılan karışımı aktarın. Sonra 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Filtrate atmak, hazırlık tüp içeriğini orijinal 2 mL santrifüj tüpüne koy ve arabellek W1 50 μL ekleyin. Karışım için 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Filtrate atmak, hazırlık tüp içeriğini orijinal 2 mL santrifüj tüpüne koy ve arabellek W2 700 μL ekleyin. Santrifüj karışımı 12.000 x g., 1 dk. için tekrar arabellek W2 700 μL ile yıkamak için bu adımı yineleyin.
- Atık sıvı atın ve hazırlık tüp içeriğini orijinal 2 mL santrifüj tüpüne koy. Karışım için 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi.
- DNA hazırlık tüp içeriğini başka bir temiz 1.5 mL santrifüj tüpüne koyun ve membran hazırlık tüp ortasında eluent veya deiyonize su 100 μL ekleyin (deiyonize suyla veya eluent ısıtmalı 65 ° C). Oda sıcaklığında 1 dakika durmak karışım izin verin ve karışım için 12.000 x g, 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Nicel gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Q-RT-bakteri ve mantarlar örnekleme filtreleriyle ilgili göreli zenginliği ölçmek için PCR) gerçekleştirin.
- Astar aşağıdaki gibi kullanın: bakteriyel 16S rDNA, 515F için (5'-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3') ve 806R (5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'); ve mantar ITS, ITS1 için (5'-TCC GTA GGT GAA SKK GCG G-3') ve ITS1 (5'-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3').
- Q-RT-PCR deneyleri bir gerçek zamanlı PCR sistemi çalıştırmak ( Tablo malzemelerigörmek). RT-PCR durumu: predegeneration, 95 ° C, 10 min; dejenerasyon, 95 ° C, 15 s; tavlama ve uzantısı, 60 ° C, 1 dk; tavlama dejenerasyon ve uzantısı 40 geçer.
- Bakteri ve mantar toplum yapısı analiz için bakteriyel 16S rDNA V1-V3 bölgesinin ve mantar rRNA operon tarafından PCR ITS bölgenin yükseltmek.
- Astar aşağıdaki gibi kullanın: bakteriler, V1-9F için (5 '-SKK ATC CCC TGT GTG SKK TGG CAG TCT CAG ACG AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3 ') ve V3-541R (5 '-CCA TCT kedi CCC TGC GTG TCT MOLDOVA'da Yasası CAG-barkod-ACW TTA MOLDOVA'da CGG CTG CTG G-3 '); ve mantarlar, ITS-3F (5'-SKK ATC CCC TGT GTG SKK TGG CAG TCT CAG CAC ATC GAT GAA GAA CGC AGC-3') ve ITS-4R (5'-CCA TCT kedi CCC TGC GTG TCT MOLDOVA'da Yasası CAG-barkod-GCT SKK MOLDOVA'da CTT ATT GAT ATG C-3').
- PCR 20 μL karışımı 2.5 mM dNTPs 2 μL, 5 × FastPfu arabellek, her astar (5 mikron), FastPfu polimeraz, 0.4 μL 0.8 μL 4 μL dahil olun ve 10 ng şablonunun DNA ( Tablo malzemelerigörmek).
- PCR programı aşağıdaki gibi kullanın: 94 ° C 5 dakika; 10 94 ° C devredir 30 ardından s, 55-60 ° C 45 için s ve 72 ° C için 90 s; 20 94 ° C devredir 30 s, 55 ° C 45 için s ve 72 ° C için 90 s; ve 5 min için 72 ° C'de son bir uzantısı.
- DNA arıtma, DNA miktar ve bir önceki çalışma 21' açıklandığı gibi pyrosequencing gerçekleştirin.
5. Bioaerosol örnekleme ve yetiştirme
- Uluslararası bir standart Andersen altı aşamalı örnekleyici kullanın (örnek culturable havadaki bakteri ve mantarlar 28,3 L/dak kullanımı 35 dakika bir örnekleme zaman akış hızında için Malzemeler tablobkz:) örnekleyiciyi her aşamasında kültür plaka koymak. Yeterince her örnekleme sonra örnekleyici % 75 etil alkol ile dezenfekte.
Not: Sampler akış hızı sabit ve toplama süre el ile zaman tutma tarafından kontrol edilir.- Örnek altı aşamalarında hava parçacıkları aerodinamik çapları tarafından tanımlanır, Andersen altı aşamalı örnekleyici ile VI sahne de dahil olmak üzere (0.65-1.1 mikron), V (1.1-2.1 mikron) sahne, IV (2.1-3.3 mikron) sahne, Evre III (3.3-4.7 mikron), II (4,7 – 7.0 mikron) aşama ve evre ı (≥7.0 mikron).
- Bakteriyel parçacıkları toplamak ve mevduat kültür tabağa soya-kazein Özet Agar içeren her aşamasında ( Tablo malzemelerigörmek). Örnekleyiciyi her aşamasında bir kapsayıcı üst birçok hava girişleri ile vardır.
- Kültür havadaki bakteri koleksiyonu için 24-48 h 37 ° C'de tabaklar; o zaman, örnek çanak bakteri koloni sayısı her aşaması için sayılır.
- Üst üste gelen Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından toplanan parçacıklar önlemek için koloniler, her örnekleyici düzey sayısını aşağıdaki formülle düzeltin:
nerede Pr: kolonileri her düzeyde sayısı düzeltildi
N: sayısı her düzeyde (400), örnekleyici delik örnekleme ve
r: gerçek sayım kolonileri. - Koloni başına m3 hava birimi aşağıdaki gibi hesaplar:
nerede C: konsantrasyonu (CFU/m3),
N1-N6: her düzeyde kolonileri düzeltilmiş sayısı
T: süresi (dk), örnekleme ve
F: örnekleme akış hızı (28,3 L/dak). - Adımları 5.1 - 5,3 bioaerosol Hayvancılık çiftliğinde, piggeries dört türü de dahil olmak üzere çalışma yöntemleri kullanın.
Not: Hayvan çiftliği Changchun, Çin'de bulunur. Merkezi konumu her sebeb toprağa yukarıda 2 m konum örnekleme olarak seçilmiştir.) Sonra kültür bakterilerin tüm adımları 6.1 - 6,2 açıklandığı gibi plakaları kolonilerde tedavi.
6. Culturable bakteri tanımlanması
- 48 h veya kültür ve 72 h sonra bakteri 2 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. DNA'sı bu bakteri ve mantarlar çok kaynaklı bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak ayıklayın ( Tablo malzemelerigörmek). DNA ekstraksiyon işlemi 4.2 bölümünde açıklanmıştır.
- 200 μL DNA ekstraksiyon örneği 16S rDNA sıralama için kullanın. Adımları 4.2, 4.3 ve biyolojik kompozisyon analizi. 4.4 açıklandığı gibi aynı işlemleri kullandıkları
Representative Results
Bu çalışmada, biz genel PM dağıtım değerlendirilmesi ve bir mandıra bioaerosols kapsamlı bir analizini Eylül ayından Aralık için gerçekleştirilen. Pek çok çevresel faktörler aerosol parçacıkları dağıtımına katkıda bulunur. Biz PM konsantrasyon ve boyutu dağıtımları bir inek evde TSI lazer partikül sayaç kullanarak okudu. Şekil 1Aile gösterildiği gibi aerosol parçacıkları konsantrasyonu Aralık ayında en yüksek ve en düşük sıcaklık ve nem (Tablo 1) değişikliklere neden olabilir Ekim ayında. İnhalable aerosol parçacıkları konsantrasyonu (0.3-3.0 µm) toplam parçacık konsantrasyonu (Şekil 1B) fazla % 99 oluşturuyor ve bu aralıktaki parçacıklar insanlar için ciddi tehlikeler neden derin solunum yolu ulaşabilir ve hayvanlar.
Biyolojik kompozisyon analiz örnekleri DNA ekstraksiyon, bakteriyel 16SrDNA ve mantar ITS bölge sıralama yerine mikroorganizma kültür tarafından gerçekleştirilebilir. Biyolojik analiz siklonik aerosol örnekleyiciyi veya bir yüksek hacimli hava örnekleyici ile filtreleri kullanarak toplanan bioaerosol örnekleri, birime bakteri ve mantar toplamak bu iki yöntem verimliliği karşılaştırabilirsiniz. Şekil 2 Pekin Teknik Üniversitesi kampus içinde Beijing 20 Aralık 2016 sisli gün boyunca toplanan bioaerosol örnekleri analiz sonuçlarını gösterdi. Bakteri toplamalarında siklonik aerosol örnekleyici filtreleriyle (Şekil 2A) birçok daha fazla cins daha yüksek hacimli hava örnekleyici toplanan sonuçları gösterilir. Mantar toplama için bu numune eşit toplama verimliliği ve hemen hemen aynı cins zenginliği (Şekil 2B) gösterdi. Şekil 2' de sunulan test sonuçlarına göre bakteri ve mantar için bu iki yöntem farklı koleksiyon verimliliği ölçmek başardık. Bakteri koleksiyonu için çok daha yüksek hacimli hava örnekleyici filtreleriyle eski örneklerinden daha yüksek cins bereket (Şekil 2A) gösterdi çünkü siklonik aerosol örnekleyici gerçekleştirilen. Ancak, iki örnek farklı örnekleme yöntemleri mantar sıralama Analizi hemen hemen aynı toplum yapıları (Şekil 2B) gösterdi.
Havadaki culturable bakteri Andersen altı aşamalı örnekleyici kullanarak okudu. Şekil 3' te gösterildiği gibi aşama ı-VI parçacıklar için culturable bakteri koloni sayısı azaldı. Evre ı parçacıklar (parçacık boyutu > 8.2 µm) culturable bakteri kolonileri en yüksek sayıda vardı. Yüzdesini evre ı piggeries konut, hamile ekmek evi farrowing de dahil olmak üzere dört farklı türde kolonilerde, besi house ve sütten house % 33, % 30, % 26 ve % 34, anılan sıraya göre. Aşama II koloniler halinde piggeries dört farklı türde yüzdesi % 20, % 22, % 19 ve % 20 sırasıyla yapıldı. Aşama III koloniler halinde piggeries dört farklı türde yüzdesi % 18, % 18, % 18 ve % 19 sırasıyla yapıldı. Piggeries dört farklı türde sahne IV kolonilerde yüzdesi % 17, % 16 ve %16 %16 sırasıyla yapıldı. Aşama V piggeries dört farklı türde kolonilerde yüzdesi % 10, % 10, % 14 ve % 6 sırasıyla yapıldı. Sahne VI parçacıklar (Parçacık boyut < 1.0 µm) culturable bakteri kolonileri en düşük numaraları vardı. Sahne VI piggeries dört farklı türde kolonilerde yüzdesi % 3, % 5, % 6 ve % 5, sırasıyla yapıldı.
Hava örnekleri piggeries dört farklı türde bir Andersen altı aşamalı örnekleyici kullanılarak toplanmıştır ve uygun koşullarda kültürlü. Her parçacık Sahne Alanı'ndan toplanan culturable bakterilerin tüm genomu DNA çıkarılan ve bakteriyel 16S rDNA ve mantar ITS bölge sıralamanın tarafından algılandı. Toplam 91 cins ve bakteri 158 türleri piggeries culturable bakterilerde tespit edildi. Piggeries, ev, hamile farrowing de dahil olmak üzere dört farklı türde culturable bakteri topluluğu yapılarda eve ekmek, besi ev ve sütten ev are göstermek Şekil 4 ' te sahne gelen verilerle ben sahneye VI. Farklı baskın bakteriyel cins içeriği arasında farklı piggeries aynı şey değil.
Şekil 1: PM dört farklı aylarda konsantrasyon ve boyut dağılımı. (A) çalışma süresi boyunca PM sayının kutu çizimi. Her kutu çizimi maksimum, minimum, medyan, iki Dörttebirlikler ve veritabanı anormal değeri içerir. (B) ortalama boyutu dağılımı haritaları PM. Aralık Eylül evinde seksen inek vardı. PM yüzdesi (≥ 3 µm) dört ay içinde (Eylül, Ekim, Kasım ve Aralık) 0.005, 0.005, 0,002 ve 0,002 sırasıyla yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: biyolojik analiz bioaerosol örnekleri toplanan tarafından iki numune. (A) ve (B) farklı toplama yöntemleri ile elde edilen bioaerosol örnekleri bakteriyel veya mantar cins zenginliği göstermek. Sualtındaki-duvar hava örnekleyici siklonik aerosol örnekleyici temsil eder. Kuvars filtreler filtreler ile yüksek hacimli hava örnekleyici temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: ortalama hiyerarşik dağıtım haritalar culturable piggeries dört tür bakteri. Piggeries dört tip konut, hamile ekmek evi farrowing, ev besi ve ev sütten kesmek. S6 için S1 Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından toplanan altı parçacık aşamaları (I VI) temsil eder. Belgili tanımlık sahne sahne VI dahil olmak üzere hava parçacıkları, aerodinamik çapları tarafından tanımlanmış olan (0.65-1.1 µm), V (1.1-2.1 µm) sahne, IV (2.1-3.3 µm) sahne, III (3.3-4.7 µm) sahne, II (4.7-7.0 µm) aşama ve evre ı (7.0 µm). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: bakteriyel toplum yapıları ile hava örneklerinde farklı zenginliği. Hava örnekleri piggeries dört farklı türde bir Andersen altı aşamalı örnekleyici kullanılarak toplanmıştır ve uygun koşullarda kültürlü. Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından toplanan her parçacık aşamasında culturable bakterilerin tüm genomu DNA çıkarılan ve bakteriyel 16S rDNA sıralama tarafından algılandı. Sayılar 1-6 sebeb her tür ben VI için ölçülen parçacık aşamaları Andersen altı aşamalı örnekleyici tarafından temsil eder. Metni sağ tarafında her bakteri cins adı içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu çalışmada, sisli gün boyunca ve hayvancılık çiftliklerinde elde edilmiştir temsilcisi bazı sonuçlar sağladı. Beijing sisli günlerde alınan bioaerosol örnekler sonuçlarından am am Beijing sisli gün boyunca mevcut olmadan biyolojik bileşimi biyolojik besteleri daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırdı. Hayvancılık çiftliklerden alınan örnekler sonuçlarından da çevresel hava quality control piggeries ve teorik temeli ve sağlıklı doğurmak için teknik destek ve hayvancılık çiftliklerinde güvenli üretimi için temel veri sağlar. Sıcaklık, nem, Rüzgar hızı, gibi pek çok çevresel faktörler İnek barınağı (Şekil 1) aerosol parçacıkları dağıtımıyla katkıda. Önceki çalışmalarda hayvancılık çiftliklerinde PM esas olarak yem, dışkı, kürk ve tüy, hayvan faaliyetleri ile ilgili nereden geldiğini ortaya koymuştur. Çevresel faktörler sadece hayvan faaliyetleri, ama aynı zamanda toplama ve PM difüzyon nispeten kapalı inek evde etkileyebilir. Bu nedenle, biz farklı konsantrasyonları ve PM dağılımları boyutu dört farklı aylarda algılar. Ayrıca, besleme yöntemi ve hayvan etkinlik sıhhi koşulu da onların toplum yapısı (Şekil 4) havada culturable bakteri etkileyebilir piggeries dört tür arasında farklı.
Ancak, bu çalışmada, esas olarak kompozisyon ve bioaerosols farklı çevresel koşullar altında dağılımı çalışmaya kullanabiliriz kullanılabilir yöntemleri üzerinde duruldu. Mikrobiyal diğer örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu hava mikroorganizmaların çok düşük konsantrasyonlarda var ve çok sayıda toplama ve tespiti sırasında bazı zorluklar tanıtmak inorganik toz parçacıkları gibi yabancı maddeleri ile karışık Bu tür mikroorganizmalar21. Bu nedenle, uygun yöntemler koleksiyonu ve algılama mikrobiyal aerosoller için seçilmesi gerekir. Mikrobiyal aerosol örnekleri topluluğu genellikle mikroorganizmalar, yarı katı, sıvı veya katı örnekleme orta22,23,24 yılında toplamak için yağış yöntemi veya özel ekipman kullanarak gerçekleştirilir . Sonra bazı ilgili teknik tedavi ve belirli test ve analiz daha sonra25taşıdı. Örnekleme orta mikroorganizmaların algılama ve Analizi26ile ilişkili hata azaltmak için sağlam tutmak. Ancak, farklı aerosol mikroorganizma numune örnekleri farklı örnekleme ilkeleri ve ortam nedeniyle bütünlüğünü üzerinde farklı etkileri vardır. İnsanlar pek çok farklı örnekleme ilkeleri, atalet sıkışması, filtrasyon direnci ve elektrostatik yağış27gibi kullanın bioaerosol numune tasarladık.
Numune etkileyen hava indirme PM örnekleme orta yüksek hızda içine özütleme donanımları kullanarak zorlayabilir. Numune etkileyen iki türü vardır: katı ve sıvı. Katı numune etkileyen örnek bioaerosols adlı bir düşük konsantrasyon için kullanılabilir ve hava için açabileceğinizi olabilir28akışı. Aerosol parçacıkları farklı boyutlarda birime taranması ve mikroplar doğrudan kültür culturable mikroorganizmalar10survival oranı artar orta, tatmak mümkündür. Eylemsizlik etkisi nedeniyle mikrobiyal aerosol parçacıkları kolayca aynı sitede çarpışır ve koloniler kolayca kültür sonra çakışabilir. Şu anda en yaygın katı etkileyen örnekleyici Andersen-6 mikrobiyal aerosol örnekleyici var. Bu çalışmada, biz bir Andersen altı aşamalı örnekleyici farklı boyutlarda hava indirme PM içinde dağıtılmış culturable bakteri çalışırdım.
Siklonik aerosol numune siklonlar spiral hava için yüksek hızda bir silindir veya koni içine kullanın. Bioaerosol parçacıklar hava akımı mikroplar örnekleyiciyi iç duvar bump ve o zaman örnekleme arabellek tarafından toplanan anlamına gelir merkezkaç kuvveti tarafından ayrılabilir. Bu yöntem uygundur ve uzun kez büyük akışı örnekleme ve örnekleme işlemleri için kullanılabilir. Ancak, işlem sıvı bağlı olduğundan bu yöntem düşük ısılarda uygulanması olamaz. Bu çalışmada kullanılan siklonik aerosol örnekleyici çıkaran ve hava patojenler ve parçacıklar örneklenen havadan su analiz29için küçük bir hacim içine transfer siklonik sualtındaki-duvar aerosol örnekleyiciyi var.
Filtre numune düşük sıcaklık koşullarında çalışabilir ve parçacıklar belirli bir boyutu üzerinde tadabilirsiniz. Ancak, onlar mikrobiyal aktiviteyi üzerinde büyük bir etkiye sahip ve zarar eğilimli olduğunu hangi etkinlik örnekleme üzerinde sonraki çalışmalar büyük ölçüde etkileyecektir. Bu çalışmada, bir yüksek hacimli hava örnekleyici ile filtreler ve siklonik aerosol örnekleyiciyi kullanarak Beijing sisli gün bioaerosol örnekleri toplanmıştır. Bu denemenin amacı inceliyor PM ayrımı olmadan biyolojik bileşimi ve hava mikroplar kültür için yapıldı. Bu nedenle, bu iki örnekleme Yöntem bu çalışma için uygun. Siklonik aerosol örnekleyici yönteminde düşük konsantrasyon, havadan mikropların kolayca çalışan arabelleğine elde edilebilir ve sonra uygun filtre örnekleri için yaygın olarak kullanılan ek tedavi olmadan çözümlenebilir. Bu çalışmada, bu iki örnekleme yöntemi, siklonik aerosol örnekleyici ve filtre örnekleyici ', farklı örnekleme verimliliği gösterdi. Filtre örnekleri, örnek filtresinden kurtarma gibi için yaygın olarak kullanılır ek tedavi bu iki yöntem arasındaki temel farklılıklar biridir. Ayrıca, diğer yöntem örnekleri filtreler toplanan ise hava örnekleri çalışan arabelleğine doğrudan siklonik aerosol örnekleyici tarafından toplanan. Farklı türde bir örnekleme yöntemi özellikleri bu farklı örnekleme verimliliğine katkıda. Siklonik aerosol örnekleyici mikroorganizma koleksiyonu için daha iyi bir seçim ve bu varsayım doğrulanmadı gerekir varsayabiliriz.
Bu çalışmada, bakteriyel 16S rDNA ve mantar ITS bölge sıralamanın bioaerosols biyolojik çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan. 16SrDNA sıralama mikrobiyal genom30segmentlerinde 16S rDNA belirlenmesidir. 16s rDNA prokaryot yüksek koruma ve mikrobiyal türler31tanımlanması için kullanışlıdır özgüllük ile yaygın olarak bulunmaktadır. Bütün-genom sıralama yalnızca ayıklama genomik DNA ve sonraki sıralama gerektirir. Büyük miktarda veri üreten ek olarak, bu işlem için daha kapsamlı bir analiz mikrobiyal toplum yapısının da sağlar. Ayrıca, metagenomics de çalışmanın bu alanda gelecekte daha fazla bilgi sağlayarak kullanılabilir. Handelsman ve ark. 1998 kağıt üzerinde toprak32mikroplar metagenome kavramı ilk evlenme teklif etti. Sonraki çalışmalarda metagenome kavramı yavaş yavaş kabul edildi ve çok araştırma insan gut, okyanus ve toprak33,34,35dahil mikroplar gerçekleştirilmiştir. Yüksek işlem hacmi sıralama desteği ile teknoloji, metagenomics hızla geliştirmiştir ve patojen algılama çalışmada giderek önemli bir rol oynar. Geleneksel mikrobiyal araştırma yöntemleri esas olarak kültür ayrımı ve arıtma için güveniyor. Mikroplar fazla % 99 kültürlü çünkü ancak, birçok çalışma uygulanmaz. Geleneksel yöntemler aksine metagenomics ortamında bireysel organizmaların36ayrı gerek olmadan bir bütün olarak tüm mikroplar genetik bilgi alabilir. Elde edilen mikroorganizmalar kapsamlı bir analizini doğrudan yapılabilir.
Özet olarak, bu çalışmada çeşitli algılama, örnekleme ve çalışmalar çevre am, am izleme dahil olmak üzere biyolojik bileşimi için kullanılabilecek analiz yöntemleri gösterdi; PM örnekleme tarafından bir Andersen altı aşamalı sampler, yüksek hacimli hava örnekleyici ile filtreler veya siklonik aerosol örnekleyici; ve DNA üzerinde daha sonraki biyolojik analiz dayandırılmış. Uygulamada, bu yöntemlerin adl tip-in hayvan çiftlikleri gibi farklı çevresel koşullar altında kullanılabilir. Bizim iletişim kuralları ve sonuçları daha da mantar ve bakteri bioaerosols çevre sağlık etkileri keşfetmek diğer araştırmacılar dünyanın her yerinden yardımcı olabilir.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu çalışma için finansal destek Ulusal Doğal Bilim Vakfı, Çin'den (No. 41775148) geldi. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| airborne laser particle counter | TSI Inc, MN, USA | model 9306 | |
| Andersen six-stage sampler | Tisch Inc, USA | TE-20-600 | |
| AxyPrep multisource DNA Miniprep Kit | Axygen, NY, USA | AP-MN-MIS-GDNA-50G | |
| FastPfu Polymerase | TransGen Inc., Beijing, China | AP221-01 | |
| High-volume air sampler | Beijing HuaRui HeAn Technology Co., Ltd., China | HH02-LS120 | |
| Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific, USA | Applied Biosystems® 7500 | |
| Soybean-Casein Digest Agar | Becton, Dickinson and company, MD, USA | 211043 | |
| Tissuquartz filters | Pall, NY, USA | 7204 | |
| Wetted-Wall Air Sampler | Research International, Inc. 17161 Beaton Road SE Monroe, Washington 98272-1034 USA |
SASS 2300 |
References
- Jones, A. M., Harrison, R. M. The effects of meteorological factors on atmospheric bioaerosol concentrations--a review. The Science of the total environment. 326 (1-3), 151-180 (2004).
- Ko, G., et al. Investigation of bioaerosols released from swine farms using conventional and alternative waste treatment and management technologies. Environmental science & technology. 42 (23), 8849-8857 (2008).
- Seagrave, J., et al. Lung toxicity of ambient particulate matter from southeastern U.S. sites with different contributing sources: relationships between composition and effects. Environmental health perspectives. 114 (9), 1387-1393 (2006).
- Janssen, N. A., et al. Black carbon as an additional indicator of the adverse health effects of airborne particles compared with PM10 and PM2.5. Environmental health perspectives. 119 (12), 1691-1699 (2011).
- Langrish, J. P., et al. Reducing personal exposure to particulate air pollution improves cardiovascular health in patients with coronary heart disease. Environmental health perspectives. 120 (3), 367-372 (2012).
- Haas, D., et al. The concentrations of culturable microorganisms in relation to particulate matter in urban air. Atmospheric Environment. 65 (Supplement C), 215-222 (2013).
- Stahlhofen, W., Gebhart, J., Heyder, J. Experimental determination of the regional deposition of aerosol particles in the human respiratory tract. American Industrial Hygiene Association. 41 (6), 385-398 (1980).
- Abba, E. J., Unnikrishnan, S., Kumar, R., Yeole, B., Chowdhury, Z. Fine aerosol and PAH carcinogenicity estimation in outdoor environment of Mumbai City, India. International journal of environmental health research. 22 (2), 134-149 (2012).
- Dybwad, M., Skogan, G., Martha Blatny, J. Temporal Variability of the Bioaerosol Background at a Subway Station. Concentration Level, Size Distribution, and Diversity of Airborne Bacteria. 80, (2013).
- Harper, T. A., et al. Bioaerosol sampling for airborne bacteria in a small animal veterinary teaching hospital. Infection ecology & epidemiology. 3, (2013).
- Hall, R. J., et al. Metagenomic detection of viruses in aerosol samples from workers in animal slaughterhouses. PloS one. 8 (8), e72226 (2013).
- Wery, N. Bioaerosols from composting facilities--a review. Frontiers in cellular and infection microbiology. 4, 42 (2014).
- Skora, J., Gutarowska, B., Stepien, L., Otlewska, A., Pielech-Przybylska, K. The evaluation of microbial contamination in the working environment of tanneries. Medycyna pracy. 65 (1), 15-32 (2014).
- Brandl, H., et al. Distribution and identification of culturable airborne microorganisms in a Swiss milk processing facility. Journal of dairy science. 97 (1), 240-246 (2014).
- Wei, M., Yu, Z., Zhang, H. Molecular characterization of microbial communities in bioaerosols of a coal mine by 454 pyrosequencing and real-time PCR. Journal of environmental sciences. 30, 241-251 (2015).
- Polednik, B. Aerosol and bioaerosol particles in a dental office. Environmental research. 134, 405-409 (2014).
- Veillette, M., et al. Microbial contents of vacuum cleaner bag dust and emitted bioaerosols and their implications for human exposure indoors. Applied and environmental microbiology. 79 (20), 6331-6336 (2013).
- Cao, C., et al. Inhalable microorganisms in Beijing's PM2.5 and PM10 pollutants during a severe smog event. Environmental science & technology. 48 (3), 1499-1507 (2014).
- Lippmann, M., Chen, L. C. Health effects of concentrated ambient air particulate matter (CAPs) and its components. Critical reviews in toxicology. 39 (10), 865-913 (2009).
- Kunzli, N., et al. Comparison of oxidative properties, light absorbance, total and elemental mass concentration of ambient PM2.5 collected at 20 European sites. Environmental health perspectives. 114 (5), 684-690 (2006).
- Wei, K., et al. Ambient bioaerosol particle dynamics observed during haze and sunny days in Beijing. The Science of the total environment. 550, 751-759 (2016).
- Nehme, B., Letourneau, V., Forster, R. J., Veillette, M., Duchaine, C. Culture-independent approach of the bacterial bioaerosol diversity in the standard swine confinement buildings, and assessment of the seasonal effect. Environmental microbiology. 10 (3), 665-675 (2008).
- Riemenschneider, L., et al. Characterization of reaerosolization from impingers in an effort to improve airborne virus sampling. Journal of applied microbiology. 108 (1), 315-324 (2010).
- Mehta, S. K., Bell-Robinson, D. M., Groves, T. O., Stetzenbach, L. D., Pierson, D. L. Evaluation of portable air samplers for monitoring airborne culturable bacteria. AIHAJ : a journal for the science of occupational and environmental health and safety. 61 (6), 850-854 (2000).
- Sun, Z., Mu, Y., Liu, Y., Shao, L. A comparison study on airborne particles during haze days and non-haze days in Beijing. The Science of the total environment. , 1-8 (2013).
- Lednicky, J., et al. Highly efficient collection of infectious pandemic Influenza H1N1 virus (2009) through laminar-flow water based condensation. 50, (2016).
- Verreault, D., Moineau, S., Duchaine, C. Methods for sampling of airborne viruses. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 72 (3), 413-444 (2008).
- Dybwad, M., Skogan, G., Blatny, J. M. Temporal variability of the bioaerosol background at a subway station: concentration level, size distribution, and diversity of airborne bacteria. Applied and environmental microbiology. 80 (1), 257-270 (2014).
- Hietala, S. K., Hullinger, P. J., Crossley, B. M., Kinde, H., Ardans, A. A. Environmental air sampling to detect exotic Newcastle disease virus in two California commercial poultry flocks. Journal of veterinary diagnostic investigation: official publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 17 (2), 198-200 (2005).
- Logares, R., et al. Metagenomic 16S rDNA Illumina tags are a powerful alternative to amplicon sequencing to explore diversity and structure of microbial communities. Environmental microbiology. 16 (9), 2659-2671 (2014).
- Kogawa, M., Hosokawa, M., Nishikawa, Y., Mori, K., Takeyama, H. Obtaining high-quality draft genomes- from uncultured microbes by cleaning and co-assembly of single-cell amplified genomes. Scientific reports. 8 (1), 2059 (2018).
- Handelsman, J., Rondon, M. R., Brady, S. F., Clardy, J., Goodman, R. M. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes: a new frontier for natural products. Chemistry & biology. 5 (10), R245-R249 (1998).
- Moon, C. D., Young, W. Metagenomic insights into the roles of Proteobacteria in the gastrointestinal microbiomes of healthy dogs and cats. MicrobiologyOpen. , e00677 (2018).
- Ribicic, D., et al. Microbial community and metagenome dynamics during biodegradation of dispersed oil reveals potential key-players in cold Norwegian seawater. Marine pollution bulletin. 129 (1), 370-378 (2018).
- Vera-Gargallo, B., Navarro-Sampedro, L., Carballo, M., Ventosa, A. Metagenome Sequencing of Prokaryotic Microbiota from Two Hypersaline Soils of the Odiel Salt Marshes in Huelva, Southwestern Spain. Genome announcements. 6 (9), (2018).
- Lloyd-Price, J., et al. Strains, functions and dynamics in the expanded Human Microbiome Project. Nature. 550 (7674), 61-66 (2017).
