Summary
Ce protocole décrit le processus d’immunocoloration des biopsies d’aspiration rectale pour la calrétinine, la protéine de 9,5 et le produit du gène protéique. Cette nouvelle méthode de diagnostic adjuvant pour la maladie de Hirschspiral a des taux de sensibilité et de spécificité préférables.
Abstract
La maladie de hirschspiral (MH) est une maladie intestinale congénitale qui est cliniquement manifestée comme une incapacité à passer le méconium chez les nourrissons ou en tant que constipation à long terme chez les enfants. La biopsie d’aspiration rectale (RSB) pour déterminer l’absence de cellules ganglionnaires et l’hypertrophie neuronale est le test le plus précis pour le diagnostic de la MH à l’heure actuelle. La coloration traditionnelle de l’hématoxyline-éosine manque de sensibilité et de spécificité. La coloration de l’acétylcholinestérase ne peut pas être largement utilisée en raison de son processus complexe. Notre protocole novateur d’immunocoloration pour la calrétinine, la protéine et le produit du gène protéine 9,5 (PGP 9.5), que nous avons réalisé sur les rsbs, présente des taux de sensibilité et de spécificité élevés de 96,49% (intervalle de confiance de 95%, 0,88-0,99) et 100% (confiance de 95% de l’intervalle, 0,97-1,00), respectivement. Les segments touchés par la MH sont souvent présents comme l’absence de l’expression de la calrétinine, de la protéine et du PGP 9.5, qui sont des marqueurs de l’hypertrophie neurale dans le tissu sous-muqueuse. Ce protocole décrit le processus d’exploitation détaillé de cette nouvelle méthode de diagnostic.
Introduction
La maladie de hirschspiral (MH) est une affection intestinale congénitale commune caractérisée par un manque de cellules ganglionnaires dans différents segments du tractus intestinal distal1. Le système nerveux entérique humain est formé lorsque l’invasion des cellules neuronales embryonnaires est achevée. S’il y a une perturbation du processus et que l’invasion ne parvient pas à se terminer, l’intestin distal du nouveau-né devient aganglionique2. Cette condition potentiellement fatale est appelée la maladie de Hirschspiral. La prolifération, la motilité et la croissance intestinale sont les trois composantes principales de la colonisation réussie.
La coloration traditionnelle de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) d’une biopsie submuqueuse limitée ne peut pas atteindre un résultat aussi satisfaisant que la coloration H & E d’un tissu d’épaisseur totale obtenu par chirurgie. En outre, la coloration de l’acétylcholinestérase (AChE) du tissu d’aspiration rectal est théoriquement difficile en raison de sa sensibilité inadéquate, qui est de 91%, et le traitement complexe des sections3,4congelées. Plusieurs autres marqueurs immunohistochimiques des cellules ganglionnaires et des fibres nerveuses qui peuvent être souillés dans des spécimens fixes et paraffines sont progressivement devenus les principaux diagnostics HD. La calrétinine est une protéine liant le calcium dépendante de la vitamine D qui n’est pas exprimée dans le plexus myentérique et sous-muqueuse des segments atteints de MH5. La protéine est exprimée dans les cellules dérivées de la crête neurale, comme les fibres nerveuses et les cellules gliales, qui présentent souvent une hypertrophie neuronale dans le tissu sous-muqueuse des segments atteints de MH6. Le produit du gène protéique 9,5 (PGP 9.5) colore de manière fiable les fibres nerveuses et les cellules ganglionnaires; La coloration PGP 9.5 agit comme un complément à la coloration de la calrétinine, en particulier dans les cas d’hypogangliose isolée. Une double coloration avec les résultats de 2, 9 et 9 peut diminuer le taux de faux-négatif et augmenter la sensibilité. Comme condition préalable, l’étude actuelle vise à assurer une spécificité et une sensibilité suffisantes de cette nouvelle méthode diagnostique. Notre protocole de roman a utilisé les trois marqueurs pour la discrimination de l’intestin aganglionique et des fibres nerveuses hypertrophiques. Une étude prospective de 318 enfants a été réalisée par notre laboratoire et publiée antérieurement sans protocole détaillé7. Le protocole détaillé et les précautions sont discutés dans cet article. Tous les nouveau-nés qui ont souffert d’un problème de défécation sévère depuis la naissance ou les enfants souffrant de constipation chronique excluant d’autres maladies courantes sont des candidats potentiels pour la biopsie d’aspiration rectale (RSB). Notre protocole novateur est adapté pour la coloration non seulement des RSBs mais aussi des biopsies d’épaisseur complète ou des spécimens chirurgicaux pour faire un diagnostic final.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole a été approuvé par le Conseil d’éthique de la recherche de l’hôpital de l’Union de l’Université de science et de technologie de Huazhong.
1. biopsie d’aspiration rectale
- Effectuer la biopsie d’aspiration rectale par un chirurgien pédiatrique bien formé et un assistant utilisant un système de biopsie rectale d’aspiration Rbi2 après avoir obtenu le consentement éclairé du tuteur.
- Effectuer des RSB sur les patients qui ont les indications suivantes: incapacité de passer le méconium chez les nourrissons ou les ballonnements à long terme avec ou sans constipation chez les enfants; les enfants souffrant de constipation à long terme qui ont besoin d’huile de paraffine pour terminer la défécation; occlusion intestinale ou perforation intestinale avec des raisons inconnues chez les enfants qui subissent une enterostomie.
Nota: les contre-indications pour le RSB sont les suivantes: les enfants qui présentent des symptômes sévères, qui sont en mauvais état physique, ou qui ne peuvent pas tolérer le RSB; les enfants présentant une entérocolite à stade aigu; les enfants subissant une anastomose intestinale sans guérison complète.
- Effectuer des RSB sur les patients qui ont les indications suivantes: incapacité de passer le méconium chez les nourrissons ou les ballonnements à long terme avec ou sans constipation chez les enfants; les enfants souffrant de constipation à long terme qui ont besoin d’huile de paraffine pour terminer la défécation; occlusion intestinale ou perforation intestinale avec des raisons inconnues chez les enfants qui subissent une enterostomie.
- Effectuer un lavement de rétention saline normale comme préparation intestinale 36 h avant la procédure pour éviter les selles molles et l’œdème excessif de la muqueuse. Ajouter la solution de sulfate de magnésium si l’enfant a une constipation sévère. Administrer la vitamine K (1 mg/kg) aux nouveau-nés.
Remarque: ne pas effectuer de tests sanguins préopératoires ou administrer des antibiotiques, car ils ne sont pas nécessaires. - Mettez le patient en position de lithotomie. Enduire la surface du tube d’huile de paraffine. Insérez le tube arrondi 4-7 cm dans le rectum avec le trou latéral orienté vers les parois postérieures ou latérales.
- Appliquez une pression douce sur le tube pour faciliter l’adhérence adéquate du trou latéral à la paroi rectale. Appuyez sur la gâchette et retirez immédiatement l’outil.
- Utiliser l’instrument de biopsie pour obtenir 4 biopsies d’aspiration d’un diamètre de 2 mm à 3 cm et 6 cm au-dessus de la ligne dentaire, antérieurement et postérieure. Utiliser une aiguille pour placer l’échantillon sur une gaze humidifiée avec une solution saline.
- Observez le patient jusqu’à 2 h après la procédure pour exclure les saignements rectaux. Évitez d’autres manipulations rectales et anales au cours des 24 premières heures après la RSB.
2. préparation des sections du RSB
- Placer les biopsies d’aspiration rectale dans 4% paraformaldéhyde pendant 6 h pour fixer le tissu. Utiliser un volume fixatif 5 fois plus que le volume tissulaire.
- Déshydrater le tissu à l’aide du déshydrateur tissulaire pathologique pendant 11 h. L’ensemble du processus programmé se compose des 5 étapes suivantes:
- Placer le tissu dans du formaldéhyde et le fixer pendant 1 h.
- Placer le tissu dans de l’éthanol à 75% pendant 4 h.
- Placer le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 1 h chacun).
- Placer le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 30 min chacun).
- Placer le tissu dans du xylène (trois changements, 1 h chacun).
- Placer le tissu dans de la cire de paraffine (58-60 ° c) (trois changements, 1 h chacun). Incorporer les tissus RSB dans des blocs de paraffine.
- Coupez les blocs de paraffine à l’aide d’un microtome jusqu’à ce que le tissu soit entièrement exposé avec un plan de coupe complet.
- Coupez les blocs en sections de 0,4 μm avec un microtome.
- Placer les sections dans de l’eau à 45-50 ° c pendant quelques secondes chacune pour permettre aux sections de se propager dans une assiette plate.
- Transférer les sections de paraffine sur les glissières.
- Cuire les lames dans un four à 60 ° c pour 3-5 h. Évitez de faire cuire trop longtemps, ce qui peut entraîner la perte des antigènes.
- Placer les lames déparaffinées dans le xylène (2 changements, 15 min chacun).
- Hydrater les lames dans de l’éthanol absolu, 95%, 80% et 75% d’éthanol pendant 5 min chacune. Ensuite, rincez-les à l’eau purifiée par osmose inverse (RO) pendant encore 5 min.
3. récupération d’antigènes
- Faire des dilutions de travail pour la récupération de la calrétinine en mélangeant 4 mL de tampon de récupération de l’antigène EDTA avec 200 mL d’eau purifiée au RO. Faire des dilutions de travail pour la récupération de l’acide citrique et du PGP 9.5 en mélangeant 1 mL de tampon de citrate de sodium (100X) avec 99 mL d’eau purifiée au RO.
Remarque: la Calrétinine peut être récupérée préférentiellement par la solution de récupération d’EDTA. Cependant, le tampon de citrate de sodium d’acide citrique est plus approprié pour la récupération de la solution et du PGP 9.5. - Placez les lames dans un bocal de coloration de Coplin. Remplissez le bocal avec une solution de récupération et placez-le dans un bain d’eau bouillante préchauffé. Après ébullition pendant 20 min, retirez le bocal du bain d’eau et laissez-le refroidir à température ambiante. Le processus de refroidissement dure environ 10 min. Retirez les lames et rincez-les délicatement une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Dessinez un cercle avec un stylo marqueur autour du tissu et préparez une boîte humide pour les procédures suivantes.
4. le blocage
- Faire des dilutions de travail en mélangeant 3 mL de 30% H2O2 avec 27 ml d’eau roupurifiée.
- Ajouter deux ou trois gouttes de 3% H2O2 solution goutte sur le tissu pour bloquer les peroxydates. Ajoutez rapidement la solution H2O2 pour vous assurer que la solution ne déborde pas du cercle. Effectuer le blocage des peroxydates dans un incubateur de 37 ° c pendant 20 min.
- Rincez doucement les lames avec du PBS (trois lavages, 5 min chacun).
- Bloquer les lames pendant 20 min à 37 ° c avec 5% d’albumine sérique bovine (BSA, préparée en mélangeant 1,5 g de poudre de BSA avec 30 mL d’eau purifiée au RO).
Remarque: le blocage avec 3% H2O2 peut empêcher 95% de coloration non spécifique et le blocage avec 5% de BSA peut empêcher les autres 5% de coloration non spécifique. Combinez les deux méthodes pour obtenir un résultat fiable.
5. réaction antigène-anticorps
- Retirer le 5% BSA et ajouter 50 μL d’anticorps primaires (calrétinine, 2, 8 ou PGP 9.5) à la diapositive. Incuber pendant la nuit à 4 ° c.
- Lavez la glissière avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).
- Ajouter 50 μL d’exhausteur de polymère (réactif A; voir tableau des matériaux) dans la section et incuber pendant 20 min dans un incubateur à 37 ° c. Ensuite, lavez la glissière avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).
- Ajouter 50 μL d’anticorps secondaire B (anticorps secondaire IgG de chèvre anti-lapin/souris) à la section et incuber pendant 30 min dans un incubateur à 37 ° c. Lavez la section avec du PBS (trois fois, 5 min chacune).
6.3, 3-diaminobenzidine et coloration de l’hématoxyline
- Ajouter 850 μL d’eau purifiée dans un tube de 1,5 mL et ajouter les réactifs de coloration (voir tableau des matériaux) dans l’ordre a, B et C. Ajouter 50 μl de chaque réactif pour obtenir un total de 1 ml de solution de travail à la 3,3-diaminobenzidine (DAB). S’il y a des précipités, utilisez la solution après filtration.
- Ajouter une goutte de solution de travail DAB à la section tissulaire et colorer pendant 3-10 min. Incuber les lames en DAB à température ambiante jusqu’à ce que la coloration brune soit détectée. Surveillez avec précaution à l’aide d’un microscope fond clair. Éloignez la solution de travail DAB de la lumière. Ensuite, lavez la lame avec du PBS pendant 5 min.
- Ajouter une goutte d’hématoxyline pour contrer la coloration des noyaux pendant environ 1 min. Ensuite, tenez le bocal de Coplin et lavez-le sous un filet d’eau pendant environ 30-40 s jusqu’à ce que l’excès de colorant soit enlevé. Veillez à ne pas endommager les sections tissulaires.
- Immerger les lames RSB dans un bocal de Coplin contenant du PBS pour 25-30 s. Ensuite, différencier dans 1% d’acide chlorhydrique-éthanol pendant 10 s. laver les lames avec du PBS pendant 1 min.
- Déshydrater les lames dans l’ordre inverse de l’hydratation: 75%, 80%, 95% et l’éthanol absolu (5 min chacun).
- Exposer les lames au xylène (2 changements, 5 min chacun).
- Montez la lamelle en utilisant un montage ultraclean. Laissez les lames sécher avant la visualisation à l’aide d’un microscope.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Au total, 318 patients ont été inscrits à notre étude. Tous les patients ont subi une RSB, et les tissus ont été colorés pour la calrétinine, le c-9 et le PGP 9.5. Le diagnostic basé sur notre protocole de roman a été HD dans 97 cas, non-HD dans 213 cas, et soupçonné de la MH dans 8 cas. Parmi les 132 patients chirurgicaux, 99 patients ont été diagnostiqués avec la MH en immunostant des spécimens de pleine épaisseur après la chirurgie. La coloration de la protéine et du PGP 9.5 a montré que 92% et 93% des 99 patients présentaient respectivement des troncs nerveux hypertrophiés. Les autres 83 de 186 patients ont subi des biopsies d’épaisseur totale et ont montré des cellules ganglionnaires. Un total de 103 patients ont été cliniquement guéris par des thérapies conservatrices, et la MH a été exclue. Sur les 8 patients atteints de la MH suspectée, 3 patients ont été classés en HD à court-segment, et les 5 autres patients ont été classés comme non-HD.
Selon nos résultats, 97 patients ont été diagnostiqués par RSB initialement. Des informations détaillées sont présentées dans le tableau 1. Le protocole de coloration immunohistochimique pour la calrétinine, le p-9 et le PGP 9.5, que nous avons effectué sur les RSBs, a des taux de sensibilité et de spécificité élevés de 96,49% (intervalle de confiance de 95% [IC], 0,88-0,99) et 100% (95% CI, 0,97-1,00), respectivement. La valeur prédictive positive est de 94,3% (95% IC, 0,87-0,99) et la valeur prédictive négative est de 99,1% (95% IC, 0,95-1,00).
Les figures 1a et 1b représentent des résultats typiques après immunocoloration pour la calrétinine. De nombreuses cellules ganglionnaires, qui expriment la calrétinine, peuvent être trouvées dans les tissus normaux. Cependant, aucune cellule ganglionnaires n’a été détectée dans une zone du tissu du segment MH. Comme le montre la figure 1c-F, l’immunocoloration du g-9 et du PGP 9.5 montre des troncs nerveux hypertrophiés dans la sous-muqueuse, alors que seule une coloration granulaire de quelques petites brindilles nerveuses a été observée dans l’intestin normalement innervé. Dans notre étude, les troncs nerveux hypertrophiques sont des fibres nerveuses d’un diamètre ≥ 40 μm.
Figure 1: immunostaining des biopsies d’aspiration rectale pour la calrétinine, PGP 9.5 et Immunostaining pour la calrétinine dans les tissus atteints de MH (A) et dans les cellules ganglionnaires de Plexis myentériques dansletissu normalement innervé (B). Aucune coloration de la calrétinine n’a été détectée dans les plexus myentériques du segment MH. La coloration PGP 9.5 dans les tissus atteints de MH a montré des fibres nerveuses hypertrophiques denses dans la sous-muqueuse (C), contrairement aux fibres nerveuses dans les tissus normaux (D). (E) l’immunocoloration dense et proéminent a montré des troncs nerveux hypertrophiques dans la sous-muqueuse des tissus atteints de MH. (F) fibres nerveuses normales dans la sous-muqueuse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| marqueurs protéiques | HD (99) | Non-HD (219) | ||
| cellules ganglionnaires (+) | Troncs nerveux hypertrophiques (+) | cellules ganglionnaires (+) | Troncs nerveux hypertrophiques (+) | |
| la calrétinine | 2 | — | 214 | — |
| S100 | — | 91 | — | 3 |
| PGP 9.5 | — | 92 | — | 4 |
Tableau 1: scores de coloration immunohistochimique pour les trois marqueurs protéiques dans les biopsies d’aspiration rectale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nous avons décrit ici une procédure utilisant trois anticorps immunohistochimiques différents pour colorer les sections RBS pour le diagnostic de la MH. La sensibilité de notre protocole diagnostique était de 96,49% (95% IC, 0,88-0,99), et la spécificité était de 100% (95% IC, 0,97-1,00).
Les étapes les plus critiques du protocole sont le RSB et la réaction antigène-anticorps. La taille de la biopsie détermine la précision de la coloration. Une petite biopsie ne fournira pas assez de tissu pour faire un diagnostic précis, tandis qu’une grande biopsie conduit à un risque plus élevé de saignement. En matière d’expérience, les biopsies d’un diamètre de 2 mm sont la taille optimale. Pour la réaction antigène-anticorps, la préservation correcte de l’anticorps ne peut pas être ignorée. Suivre le protocole étape par étape et travailler doucement sont nécessaires. L’eau purifiée par osmose inverse est recommandée dans toutes les étapes, ce qui donne un champ d’observation plus clair et permet aux pathologistes de faire un diagnostic précis.
Le lavement de contraste, la manométrie anorectale et la biopsie avec histologie sont trois méthodes diagnostiques préopératoires qui ont été utilisées ces dernières années. Selon Takawira et al. la recherche, la biopsie avec l’histologie a la sensibilité et la spécificité les plus élevées8. Meier-Ruge et al. First ont rapporté l’utilisation de la coloration de l’acétylcholinestérase (AChE) sur le tissu d’aspiration rectal congelé pour aider à diagnostiquer la mh dans 19729. Cette méthode de coloration détecte les troncs nerveux hypertrophiques dans la sous-muqueuse. Après ce rapport, de nombreuses institutions à travers le monde ont commencé à utiliser cette méthode comme un complément pour le diagnostic de la MH. en raison de ses limitations diagnostiques, les chercheurs ont commencé à se concentrer sur d’autres marqueurs qui peuvent également tacher les cellules ganglionnaires et les fibres nerveuses dans spécimens de formol-fixe et de paraffine-incorporé. En 2004, Barshack et coll. ont constaté que la perte d’expression de la calrétinine peut aider à diagnostiquer des segments aganglioniques en HD10. Kapur et coll. et Guinard-Samuel et coll. ont répété le protocole en 2009 et ont conclu que la coloration immunohistochimique de la calrétinine était supérieure à la coloration de l’acétylcholinestérase11,12. En 1988, le diagnostic de la MH a été introduit pour la première fois par Robey et coll. 13. Monforte-Muñoz et coll. ont répété la méthode en 1998 et ont constaté que 90% de leurs 20 cas de hirschspiral avaient des fibres nerveuses plus larges que 40 μm14. Par conséquent, l’immunocoloration est peut servir de méthode de diagnostic auxiliaire dans les cas sans cellules ganglionnaires. De plus, Bachmann et coll. ont remarqué que la coloration immunohistochimique de la map2, de la calrétinine, de la GLUT1 et du c. a pourrait obtenir un résultat fiable aussi précis que les techniques de section congelée15. Cependant, en 1992, Sams et coll. ont évalué la valeur de PGP 9.5 dans le diagnostic de la HD16. Bien qu’il puisse détecter plus de fibres nerveuses de lamina propria, il a un taux de faux négatif plus élevé. Par conséquent, nous avons opté pour le diagnostic immunohistochimique de la MH, comme l’ont recommandé les études précédentes. De nombreux cas de coloration pour l’énolase spécifique au Neuron dans les zones transitoires ont également montré des cellules ganglionnaires positives dans le plexus myentérique et sous-muqueuse, mais ces cellules étaient rares et petites12. De même, les cellules ganglionnaires positives de la calrétinine sont petites et ont une formation en grappes. Une étude précédente A indiqué que certains troncs nerveux légèrement épaissis pouvaient également être détectés dans les segments transitoires de la MH, mais avec l’aganglionose colonique totale, les troncs nerveux peuvent être dans des limites normales (< 40 μm)17. Nous devrions analyser les résultats cas par cas et combiner ces résultats avec des manifestations cliniques pour éviter le diagnostic erroné.
Ce protocole ne pouvait pas représenter le diagnostic pathologique final, nous avons donc effectué un minimum d’un an de suivi clinique approfondi pour chaque enfant. En outre, ce protocole nécessite plus d’échantillons pour prouver sa fiabilité.
En conclusion, le diagnostic de la MH par RSB est une méthode pratique qui fournit un diagnostic histologique idéal avec des blessures minimales acceptables. La sensibilité est étroitement liée à la question de savoir si le site d’échantillonnage est correct. La coloration immunohistochimique de la RSB pour la calrétinine, le c-9 et le PGP 9.5 est sensible et spécifique à la détection des cellules ganglionnaires et des troncs nerveux hypertrophiques. La combinaison de ces trois marqueurs offre une méthode de diagnostic plus fiable pour la MH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Weibing Tang pour sa grande aide dans la fourniture du laboratoire de tournage. Cet article est appuyé par la recherche sur le bien-être public, et des fonds spéciaux ont été reçus de la santé nationale et de la planification familiale de la Chine (Grant No. 201402007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| calretinin antibody | MXB Biotechnologies | MAB-0716 170416405c | antibody: primary antibody |
| S-100 antibody | MXB Biotechnologies | Kit-0007 | antibody: primary antibody |
| PGP9.5 antibody | Shanghai long island antibody Co. Ltd | R-0457-03 | antibody: primary antibody |
| enhancer reagent | MXB Biotechnologies | KIT-9902-A 170416405a | antibody: secondary antibody A |
| Goat anti-Rabbit/Mouse IgG Secondary Antibody | MXB Biotechnologies | KIT-9902-B | antibody: secondary antibody B |
| DAB staining kit (containing reagent A B and C) | MXB Biotechnologies | DAB-0031 | staining kit |
| Heat incubator | Shanghai yiheng instrument Co. Ltd | DHP-9082 | instrument |
| Rbi2 suction rectal biopsy system | Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia | CP1200 HP1000 SS1000 | instrument |
| microtome | Leica | leica RM2016 | instrument |
| citric acid sodium citrate buffer(100X) | MXB Biotechnologies | MVS-0101 | antigen retrieval buffer |
| pathological tissue dehydrator | wuhan junjie electronic Co. Ltd | JT-12F | instrument |
References
- Tam, P. K. Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery. Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).
- Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease. BMC Surgery. 17 (1), 71 (2017).
- Agrawal, R. K., et al. Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease. Diagnostic Pathology. 10 (1), 208 (2015).
- Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis. The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Jiang, M., et al. S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease. American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159 (2016).
- Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. Laboratory procedures update on Hirschsprung disease. Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598 (2015).
- Meier-Ruge, W., et al. Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).
- Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease. Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).
- Kapur, R. P. Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease. American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).
- Guinardsamuel, V., et al. Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease. Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).
- Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease. Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).
- Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a "positive" and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).
- Bachmann, L., et al. Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100. Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).
- Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease. Journal of Pathology. 168 (1), 55 (1992).
- Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis. International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303 (2011).
