Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Выделение и характеристика человека пуповины производные мезенхимальных стволовых клеток из доношенных и недоношенных новорожденных

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58806
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, , 4, 1, 1, 1, 5, 1, 1
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

Summary

Пуповина человека (UC) могут быть получены в течение перинатального периода в результате преждевременных, термин и postterm доставки. В этом протоколе мы описываем изоляции и характеристика UC-производные мезенхимальных стволовых клеток (UC-МСК) из плодов/младенцев на 19-40 недель гестации.

Abstract

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) имеют значительный терапевтический потенциал и привлечь все больший интерес в области биомедицины. MSCs первоначально изолирован и характеризуется из костного мозга (БМ), то приобрел от тканей, включая жировой ткани, синовиальной оболочки, кожи, пульпы зуба и плода придатки как плаценты, пуповины кровь (УКБ) и пуповины (UC). MSCs являются популяции гетерогенных клеток с емкостью для (1) соблюдения пластик в условиях стандартной культуры, (2) поверхность маркер выражения CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14–/CD19 –/HLA-DR– фенотипов и (3) trilineage дифференцировку в адипоциты, остеоциты и хрящевые клетки, как в настоящее время определяется международным обществом клеточной терапии (ИКСТ). Хотя BM является наиболее широко используемым источником MSCs, захватнический характер стремления BM этически ограничивает его доступность. Пролиферации и дифференцировки потенциала MSCs полученные от БМ в целом снижение с возрастом донора. В отличие от плода MSCs, полученные из UC имеют преимущества как энергичный распространения и дифференциации потенциал. Существует без этических озабоченность для UC выборки, как она обычно рассматривается как медицинские отходы. Человека UC начинает развиваться с продолжающийся рост амниотической полости в 4-8 недель гестации и продолжает расти до достижения 50-60 см в длину, и это может быть изолированы в период всей новорожденных доставки. Чтобы разобраться в патофизиологии сложных заболеваний, мы использовали UC-производные MSCs (UC-MSCs) от младенцев, роды на различных сроках гестации. В этом протоколе мы описываем, изоляции и характеристика UC-MSCs из плодов/младенцев в 19-40 недель гестации.

Introduction

Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) первоначально изолированы и характеризуется из костного мозга (БМ)1,2 , но также можно получить из различных тканей, включая жировой ткани, синовиальной оболочки, кожи, пульпы зуба и плода придатков 3. MSCs признаны популяции гетерогенных клеток, которые могут размножаться и дифференцироваться в адипоциты, остеоциты и хондроцитов. Кроме того, MSCs обладают способностью перейти на сайты травмы, подавлять и модуляции иммунного ответа, переделывать и ремонт повреждений. В настоящее время MSCs из разных источников привлекали растущий интерес как источник для клеточной терапии против целого ряда сложных заболеваний, включая трансплантат – versus – хост болезнь, инфаркт миокарда и ишемии миокарда4,5 .

Хотя BM является наиболее хорошо изученных источником MSCs, инвазивность BM аспирации этически ограничивает его доступность. Пролиферации и дифференцировки потенциала MSCs полученные от БМ в целом снижение с возрастом донора. В отличие от плода MSCs полученные от плода придатки как плаценты, пуповины кровь (УКБ), и пуповины (UC) имеют преимущества, включая менее этические соображения относительно отбора проб и надежное распространение и дифференциации потенциал6 , 7. среди плода придатки, которые обычно удаляются как медицинские отходы, UCB и UC считаются плода орган, в то время как плацента считается fetomaternal. Кроме того плаценты и UCB необходимо пробы и собранных в точный момент новорожденных доставки, тогда как плаценты и UC могут быть собраны и обработаны после родов новорожденных. Соответственно UC является многообещающим источником MSC для клетки терапии8,9.

Человека UC начинает развиваться с прогрессивной расширения амниотической полости в 4-8 недель гестации, продолжает расти до 50-60 см в длину и могут быть изолированы в течение всего периода новорожденного доставки10. Чтобы разобраться в патофизиологии сложных заболеваний, мы используем UC-производные MSCs (UC-MSCs) от младенцев, роды в различных сроках гестации11,12. В этом протоколе мы опишем, как изолировать и характеризуют UC-MSCs из плодов/младенцев в 19-40 недель гестации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Использование человеческой образцы для этого исследования был одобрен этическим Комитетом Кобе выпускник школы медицины университета (утверждение № 1370 и 1694) и в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. изоляция и культура UC-МСК

Примечание: UC-MSCs были успешно изолированные, культурный, и расширенный (более чем прохождения номер 4) из более чем 200 ПСК подвергается этот протокол. Среди более чем 200 ПСК, 100% показали успешный UC-MSC изоляции, менее 5% показали случайного загрязнения, меньше, чем 15% показали рост арест, и более чем 80% показали успешное расширение UC-MSC.

  1. Собирайте UC.
    1. Подготовьте пластиковый Тюбик 50 мл, асептических ножниц и бутылка 500 мл альфа изменение орла минимальных основных средних (альфа MEM) при 4 ° C.
    2. Асептически вырезать из UC с хирургические ножницы на приблизительно 5-10 см в длину и собирать его вскоре после рождения новорожденных путем операции кесарева сечения.
    3. Сразу же место UC в пластиковый Тюбик 50 мл и добавить 20-30 мл альфа мем в трубу.
    4. Храните UC при комнатной температуре (RT), до тех пор, пока он перевозится в лабораторию.
      Примечание: Асептический UC может храниться в сыворотки свободной среде RT до 2 дней. Таким образом UC, полученные из соседней больницы могут быть собраны, если он доставляется в лабораторию в течение 2 дней.
  2. Вскрыть UC.
    1. Подготовьте пластиковый лоток, стерилизованные ножницы, щипцы, пипетки 10 мл, 25 мл пипетки, два блюда культуры ткани 60 мм, фосфат амортизированное saline (PBS), очищенный фермента смеси (см. Таблицу материалов, воссоздана с стерильных PBS в концентрации 13 Wünsch единиц/мл и хранятся при температуре-80 ° C) и бутылка 500 мл среды сокращение сыворотке (см. Таблицу материалы).
    2. Разминка PBS, очищенный фермента смеси, ограничена RT. сыворотки среднего и среднего культуры [альфа-MEM содержащий 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1% раствора и антибиотик противогрибковое (AA) температуре 4 ° C]
    3. Взять из UC из трубки и поместите его в пластиковый лоток.
    4. Весят и вскрыть 5 g UC с стерилизованные ножниц.
    5. Залейте 10 мл 70% этанола UC для стерилизации с помощью пипетки 10 мл.
    6. Вымойте UC с 10 мл PBS, дважды с помощью пипетки 10 мл.
    7. Место UC в тканевой культуры блюдо стерилизованные 60 мм (см. рис. 1, шаг 1).
    8. Добавьте 10 мл среды сокращение сыворотке в блюдо.
    9. Добавьте 0,5 мл очищенной фермента смесей до конечной концентрации приблизительно 0,62 Wünsch единиц/мл.
      Примечание: Использование очищенных ферментных смеси вместо традиционных коллагеназы было показано для улучшения урожайности и жизнеспособности UC-MSCs изолированы от UC.
    10. Нарежьте UC 2-3 мм с стерилизованные ножницы и щипцы (см. рис. 1, шаг 2).
      Примечание: Этот процесс занимает около 30 минут.
    11. Инкубируйте UC штук при 37 ° C на 30 мин в 5% CO2 инкубатора.
    12. Вырежьте куски частично переваривается UC на более мелкие куски, которые легко проходят через пипетку 25 мл.
      Примечание: Этот процесс занимает около 30 минут.
    13. Инкубируйте мелкие UC при 37 ° C 15-45 минут в 5% CO2 инкубатора.
      Примечание: Инкубационный необходимо продолжать до тех пор, пока гомогенатах становятся вязкими. Общее пищеварение время составляет около 120 мин. В случае использования ПСК из недоношенных новорожденных, однако, время пищеварение может быть сокращен потому что те легко вырезать и переваривается.
  3. Изолируйте UC-MSCs.
    1. Подготовьте четыре пластиковых труб 50 мл и 500 мл бутылка питательной среды.
    2. Гомогенат трутневых UC делят на два 50 мл пластиковых трубок с помощью пипетки 25 мл, с примерно 7,5 мл в каждую пробирку.
    3. Добавить 20 мл питательной среды в каждую пробирку и хорошо перемешать.
    4. Фильтр каждый UC огневки через стрейнер ячейки 100 мкм, помещены в верхней части новой коллекции 50 мл трубки, с помощью пипетки 25 мл для сбора UC-производные клетки.
      Примечание: Этот процесс занимает около 15 минут каждый, как усваивается UC решение является липким.
    5. Центрифуга две трубы на 1000 x g за 5 мин.
    6. Тщательно удалить супернатант и отменить его.
    7. Ресуспензируйте клетки окатышей в две трубы с 5 мл питательной среды.
    8. Перевести суспензию клеток в новой пластины 60 мм и культуры при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора (см. рис. 1, шаг 3).
  4. Культура UC-MSCs.
    1. Разогреть PBS, трипсин ЭДТА (0,25 w/v%) и культура среднего (альфа MEM содержащий 10% FBS и 1% AA) для RT.
    2. Когда клетки прикреплены к плите 60 мм, удалите питательной среды и мыть с 5 мл PBS дважды, чтобы удалить мусор и красные кровяные клетки.
      Примечание: Прилагаемый клетки обычно появляются на 3-5 дней после первоначального покрытия (см. рис. 1, шаг 4).
    3. Заменить питательной среды дважды в неделю и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора до 90-100% confluency.
      Примечание: Это обычно занимает 7-14 дней после первоначального покрытия.
    4. Вымыть клетки с 5 мл PBS дважды, добавить 0,5 мл трипсина-ЭДТА и инкубировать при 37 ° C за 5-10 мин.
    5. Когда клетки становятся округлые и отсоединена, добавить 9 мл питательной среды и хорошо перемешайте до инактивирует трипсина.
    6. Перевести суспензию клеток в новой 100 мм пластины и культуры при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора (см. рис. 1, шаг 5).
    7. Заменить питательной среды дважды в неделю и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора до 90-100% confluency.
      Примечание: Это обычно занимает 4-8 дней после первоначального покрытия.
    8. Вымыть клетки с 10 мл PBS дважды, добавляют 1 мл трипсина ЭДТА и инкубировать при 37 ° C за 5-10 мин.
    9. Когда клетки становятся округлые и отсоединена, добавить 9 мл питательной среды и хорошо перемешайте до инактивирует трипсина.
    10. Перевести суспензию клеток в два новых 100 мм пластин и культуры при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора (см. рис. 1, шаг 5).
    11. Повторить субкультуры (1:2 расколы) до десятой проход (см. рис. 1, шаг 5).
      Примечание: Потому что клетки культивировали меньше вырожденная условиях склонны достичь ранее арест оружия, важно для прохода клетки с Сплит соотношении 1:2.
    12. Использование ячейки на пятый-восьмой проход для анализа клеток поверхности маркер, дифференциация assay клетки и других экспериментов.
      Примечание: Чтобы сохранить активные распространения для как можно дольше, клетки обычно культивировали в более чем 70-80% вырожденная условий.

2. поверхности маркер выражения UC-МСК

  1. Подготовка клетки в 100 мм пластины и разъединять их с 1 мл раствора трипсина ЭДТА при 37 ° C за 5-10 мин.
  2. Добавьте 9 мл питательной среды и центрифуги на 1000 x g за 5 мин.
  3. Аспирационная супернатант и выбросьте его.
  4. Ресуспензируйте клетки окатышей с 10 мл PBS и центрифуги на 1000 x g для 5 минут повторите этот шаг Стиральная дважды.
  5. Ресуспензируйте клетки с буфера потока цитометрии (FCM) (PBS, содержащие ЭДТА 2 мм и 10% блокировки реагент) на ~ 1 × 106 клеток/мл.
  6. Передача 50-100 мкл суспензии клеток в 1,5 мл; Добавить фикоэритрин (PE)-конъюгированных антител против CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 или HLA-DR; и инкубировать на льду по 45 мин.
  7. Вымыть клетки с ТСМ буфер дважды и 50-100 мкл 0,2% раствор красителя жизнеспособности (см. Таблицу материалы).
  8. Инкубируйте на RT 15 мин, вымыть клетки с ТСМ буфер дважды и фильтр клетки через стрейнер ячейки 70 мкм.
  9. Запустите клетки через плату FCM и анализировать полученные результаты, с использованием программного обеспечения ТСМ согласно инструкциям производителя.

3. Trilineage дифференциация UC-МСК

  1. Выполните adipogenesis.
    1. Готовят суспензию клеток в среде культуры в концентрации 5 × 103 клеток/мл.
    2. Пластина 1 мл суспензии клеток в пластине 12-Ну и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для ~ 24 h.
    3. Замените адипогенном дифференциации среднего питательной среды (см. Таблицу материалы) и инкубации при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 2-3 недели. Изменить адипогенном дифференциации среднего дважды в неделю.
    4. Вымойте клетки с PBS три раза.
    5. Инкубировать клетки в 4% раствор формальдегида для 30 мин на RT.
    6. Вымойте клетки с PBS три раза и с 60% изопропиловый спирт в три раза.
    7. Готовят 0,5% нефти красный O раствор путем растворения 84 мг нефти красный O в 10 мл 100% изопропиловый спирт и добавление 6,7 мл дистиллированной воды. Пятно клетки с 1 мл 0,5% раствора нефти красный O в РТ за 20 мин.
    8. Вымыть клетки с 60% изопропиловый спирт три раза и визуализировать под микроскопом.
  2. Выполните Остеогенез.
    1. Готовят суспензию клеток в среде культуры в концентрации 14 × 10 кл/мл.
    2. Пластина 1 мл суспензии клеток в пластине 12-Ну и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для ~ 24 h.
    3. Замените osteogeneic дифференциации среднего питательной среды (см. Таблицу материалы) и инкубации при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 1-2 недели. Смена Остеогенные дифференциации среднего дважды в неделю.
    4. Вымойте клетки с PBS три раза.
    5. Инкубировать клетки в 4% раствор формальдегида для 30 мин на RT.
    6. Вымойте клетки с PBS три раза.
    7. Подготовить раствор 2% ализарин красный S, растворяя 200 мг ализарин красный S с 10 мл дистиллированной воды. Пятно клеток в 1 мл 2% раствора ализарин красный S на RT на 3 мин.
    8. Промыть скважин с PBS три раза и визуализировать под микроскопом.
  3. Выполните chondrogenesis.
    1. Готовят суспензию клеток в среде культуры в концентрации 1.67 × 10 кл/мл.
    2. Положите капельку 5 мкл суспензии клеток на центр хорошо в 12-ну пластине (micromass культуры) и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 2-3 ч.
    3. Аккуратно добавить 1 мл хондрогенном дифференциация среды (см. Таблицу материалы) и инкубации при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора для 4-7 дней. Смена хондрогенном дифференциации среднего дважды в неделю.
    4. Вымойте клетки с PBS три раза.
    5. Инкубировать клетки в 4% раствор формальдегида для 30 мин на RT.
    6. Вымойте клетки с PBS три раза.
    7. Готовят раствор 0,05% толуидиновый синий растворяют 250 мг толуидиновый синий с 500 мл 0,1 М натрия ацетата буфер с рН 4.1. Пятно клетки с 1 мл 0,05% раствора толуидиновый синий на RT 30 мин.
    8. Вымыть клетки с PBS три раза и визуализировать под микроскопом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Процедуры из коллекции UC MSC культуре резюмируются в рисунке 1. UC приблизительно 5-10 см в длину могут быть собраны из всех новорожденных, доставлено путем операции кесарева сечения. UC начинает развиваться в 4-8 недель гестации и продолжает расти до 50-60 см в длину, как показано на рисунке 2. Существует две артерии (A), один из Вены (V), шнур накладки (CL) и Уортон желе (WJ) в UC, как показано на рис. 3 и рис. 4. UC-MSCs может быть изолирован от всех регионов шнур или весь шнур13. Потому что UC от младенцев с раннем гестационном возрасте является хрупкой и сложной для рассечения в регион один шнур, UC-MSCs изолированы от11,весь шнур12. Существует несколько способов изолировать MSCs из UC, которые включают в себя метод экспланта14 и ферментативного пищеварения метод15, а также их производные16. Из-за длительного цикла культуры, снижению урожайности и ранее арест распространения, связанные с экспланта метод17,18UC-MSCs культивированный методом ферментативного пищеварения, как показано на рисунке 5 и Рисунок 6.

Минимальные критерии для определения MSCs устанавливаются ИКСТ и включать их характеристик поверхности маркер19. Чтобы определить выражение поверхности маркер, UC-MSCs от преждевременных и срочных младенцев инкубировали с соответствующим PE-конъюгированных антител и проанализированы проточной цитометрии. Они являются позитивным для подписи маркеров MSC (CD73, CD90, CD105), но негативный для моноцитов/макрофагов (CD14), эндотелия (CD34), кроветворения (CD19, CD45) и комплекс гистосовместимости (HLA-DR) маркеры, как показано на рисунке 7.

Согласно критериям ИКСТ19MSC должны обладать потенциалом mesodermal дифференциация оценены пробирного дифференциация trilineage. Для оценки способности trilineage дифференциация, UC-MSCs от преждевременных и срочных младенцев наведены дифференцироваться в остеоциты, адипоциты и хондроцитов стандарта в vitro условиях дифференциации. Как показано на рисунке 8, они являются высокодифференцированных во всех трех видов mesodermal клеток.

Figure 1
Рисунок 1 : Схема изоляции и культуры UC-MSCs. Шаг 1. 5-10 см UC асептически собраны из плацентарной ткани. Шаг 2. Очищенная фермент смесь переваривается UC штук. Шаг 3. Культура UC-MSCs при 37 ° C в 5% CO2 инкубатора. Шаг 4. Прилагаемый UC-MSCs появился на 3 дней после первоначального покрытия. Шаг 5. Субкультура UC-MSCs. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : UC из плодов/младенцев доставлены на различных сроках гестации. Показываются ПСК из плодов/младенцев в 19-38 недель гестации. Размер UC увеличивается с гестационного возраста. Масштаб баров = 8 см. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Разрез UC преждевременных и срочных младенцев с. Существует две артерии (A), один из Вены (V), шнур накладки (CL) и Уортон желе (WJ) в UC от преждевременных и срочных младенцев. Размеры этих тканей зависит от гестационного возраста. Масштаб баров = 2 mm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Анатомия UC. (A) 5 см UC от термина младенца. (B) поперечное сечение UC. (C) частично расчлененный UC. Существует две артерии (A), один из Вены (V), шнур накладки (CL) и Whalton в желе (WJ). UC от младенцев ранее гестационном возрасте особенно хрупким и трудно быть расчленены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : UC диссекции с использованием очищенных ферментных смесей. (A) 5-10см UC. (B) 2-3 мм кусков UC. (C) очищенной фермент смесь переваривается UC штук. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Морфология UC-MSCs преждевременных и срочных младенцев с. (A и E) UC-MSCs на проход 1 (P1) перед заменой питательной среды (A: X40; E: X200). (B и F) UC-MSCs на P1 после замены культуры среднего (B: X40; F: X200). (C и G) UC-MSCs на P3 (C: X40; G: X200). (D и H) UC-MSCs на P5 (D: X40; H: X200). Масштаб баров = 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Поверхность маркер выражения UC-MSCs преждевременных и срочных младенцев с. CD73/CD90/CD105-позитивных и CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-отрицательных фенотипов находятся в UC-MSCs от недоношенных (22 недель гестации) и доношенных детей (37 недель гестации). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : Trilineage мезенхимы дифференциация UC-MSCs преждевременных и срочных младенцев с. UC-MSCs с недоношенными (22 недель гестации) и доношенных детей (37-40 недель гестации) продифференцируйте в Адипоцит (визуализация, масло красный O), остеоциты (визуализированное ализарин красный S) и хондроцитов (визуализированное толуидиновый синий). Изображения были взяты на 200 x. Масштаб баров = 50 мкм. Часть этой суммы была адаптирована Иватани et al.11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MSCs могут быть изолированы от различных тканей и являются гетерогенной популяция клеток, которые не все Экспресс же фенотипические маркеры. Здесь мы изложили протокол, который проведет сбор и рассечение UC от преждевременных и срочных младенцев и позволяет изоляции и культуры UC-MSCs. После этого протокол мы успешно изолированные UC-MSCs, которые удовлетворяют критериям ИКСТ19 из плодов/младенцев на 19-40 недель гестации и продемонстрировали, что они представляют некоторые аспекты патофизиологии трудноразрешимые заболевания во время пренатального развития11,12.

В БМ производные MSCs (БМ-MSCs) молодых доноров производные BM-MSCs обычно показывают более пролиферативных и differentiative потенциал, чем старые коллеги и удерживайте больше потенциал для клетки терапия20,21. Аналогичным образом недоношенных UC-MSCs, изолированных от прервана на 8-12 недель беременности плод сообщалось проявлять более энергичные пролиферации и дифференцировки, по сравнению с термином UC-MSCs изолированы от новорожденных, сделанное на 37-40 недель гестации22. Несмотря на различия в регионе шнур и гестационного возраста UC-MSCs изолированных с этот протокол также показали более энергичные увеличение числа преждевременных UC-MSCs чем термин UC-MSCs12.

Важнейшим шагом в рамках этого протокола является UC диссекции с очищенной фермента смесей, которые состоят из коллагеназы, I и II и dispase. Как указано в результатах представительных, жесткость UC резко изменяется с гестационного возраста (рис. 2). Для достижения оптимального рассечение UC, время инкубации очищенный фермента смеси необходимо скорректировать для жесткости отдельных UC. Как правило он обычно занимает больше времени на срок UC чем недоношенных UC. Среди существующих методов изолировать MSCs из UC мы выбираем метод ферментативного пищеварения15 над экспланта метод14 , что может привести к больше культуры цикла, снижению урожайности и более ранних распространения ареста17,18. Важное изменение метода Пищеварение энзима является использование очищенных ферментных смеси вместо традиционных коллагеназы, который позволяет эффективное и последовательное вскрытие UC от плодов/младенцев с переменной гестационном возрасте.

Ограничение этого протокола является использование всего шнур изолировать MSCs из UC. Потому что UC-MSCs может быть изолирован от всех регионов шнур или весь шнур13, UC-MSCs изолированы от весь шнур в настоящем Протоколе. Это объясняется целесообразность UC рассечение от недоношенных детей. Однако потенциальные изменения доли каждого региона шнур может ограничить строгого сравнения между UC-MSCs изолированные настоящим Протоколом.

UC-MSCs все шире используются как источник мезенхимальных стромальных клеток для доклинических и клинических исследований,8,9. Несмотря на это увеличение использования консенсус в отношении методов изоляции UC-MSCs отсутствует до сих пор, которые могут привести к различных клеточных популяций считаться же UC-MSCs. Этот протокол будет в конечном итоге помочь исследователей лучше понять функциональные характеристики UC-MSCs и наследования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана дотаций для Scientific Research (C) (номер гранта: 25461644) и молодых ученых (B) (предоставление номера: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) из JSP-страницы KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Tags

Биология развития проблема 143 Mesenchymal стволовых клеток пуповины недоношенных грудных детей младенец термином гестационного возраста поверхности маркер выражения дифференциации trilineage
Выделение и характеристика человека пуповины производные мезенхимальных стволовых клеток из доношенных и недоношенных новорожденных
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana,… More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter