Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og karakterisering af menneskelige navlestrengen-afledte mesenkymale stamceller fra præmature og fødte spædbørn

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58806
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, , 4, 1, 1, 1, 5, 1, 1
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

Summary

Menneskelige navlestrengen (UC) kan fås i den perinatale periode som følge af præmature, sigt og postterm levering. I denne protokol beskriver vi isolering og karakterisering af UC-afledte mesenkymale stamceller (UC-MSCs) fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.

Abstract

Mesenchymale stamceller (msc) har betydelige terapeutiske potentiale og tiltrække voksende interesse for det biomedicinske område. MSC'er er oprindeligt isoleret og karakteriseret fra knoglemarv (BM), så erhvervet fra væv, herunder fedtvæv, synovium, hud, dental pulp og føtal vedhæng som moderkagen, navlestrengsblod (UCB) og navlestrengen (UC). MSC'er er en heterogen celle population med kapacitet for (1) overholdelse af plast i standard dyrkningsbetingelser, (2) overflade markør udtryk for CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- fænotyper, og (3) trilineage differentiering adipocytter, osteocytes og chondrocytter, som i øjeblikket er defineret af International Society for cellulære terapi (ISCT). Selvom BM er den mest udbredte kilde til MSC'er, begrænser den invasive art af BM aspiration etisk dens tilgængelighed. Spredning og differentiering kapacitet af MSCs fremstillet af BM generelt forringes med alderen af donor. Derimod har føtal MSCs fremstillet af UC fordele såsom kraftige spredning og differentiering kapacitet. Der er ingen etiske bekymring for UC prøveudtagning, som det er typisk betragtes som medicinsk affald. Menneskelige UC begynder at udvikle med fortsat vækst af fostervand hulrummet på 4-8 uger af drægtighedsperioden og holder vokser indtil nå 50-60 cm i længden, og det kan isoleres i den hele nyfødte leveringsperiode. For at få indsigt i Patofysiologi af genstridig sygdomme, har vi brugt UC-afledte MSCs (UC-MSCs) fra spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre. I denne protokol beskriver vi isolering og karakterisering af UC-MSCs fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.

Introduction

Mesenchymale stamceller (msc) er oprindeligt isoleret og karakteriseret fra knoglemarv (BM)1,2 , men kan også fås fra en bred vifte af væv, herunder fedtvæv, synovium, hud, dental pulp og føtal vedhæng 3. MSCs er anerkendt som en heterogen celle population, der kan formere sig og differentiere i adipocytter, osteocytes og chondrocytter. Derudover MSCs besidder evnen til at overflytte til steder af skade, undertrykke og modulere immunrespons, ombygge og reparere skaden. I øjeblikket MSCs fra forskellige kilder har tiltrukket sig stigende interesse som en kilde til celleterapi mod en række genstridig sygdomme, herunder graft - versus klovesyge vært, myokardieinfarkt og cerebral infarkt4,5 .

Selvom BM er den mest godt karakteriseret kilde af MSC'er, begrænser invasionsevne af BM aspiration etisk dens tilgængelighed. Spredning og differentiering kapacitet af MSCs fremstillet af BM generelt forringes med alderen af donor. Derimod føtal MSCs fremstillet af føtal vedhæng som moderkagen, navlestrengsblod (UCB), og navlestrengen (UC) har fordele, herunder mindre etiske bekymringer med hensyn til prøveudtagning og robust spredning og differentiering kapacitet6 , 7. blandt føtal vedhæng, der som regel kasseres som medicinsk affald, UCB og UC betragtes en føtal orgel, mens placenta anses for fetomaternal. Derudover skal moderkagen og UCB stikprøven og indsamlet på det nøjagtige tidspunkt for nyfødte levering, der henviser til, at moderkagen og UC kan indsamles og behandles efter nyfødte levering. UC er derfor en lovende MSC-kilde til celle terapi8,9.

Menneskelige UC begynder at udvikle med gradvis udvidelse af fostervand hulrummet på 4-8 uger af drægtigheden, fortsætter med at vokse indtil 50-60 cm i længden og kan isoleres i hele perioden af nyfødte levering10. For at få indsigt i Patofysiologi af genstridig sygdomme, bruger vi UC-afledte MSCs (UC-MSCs) fra spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre11,12. I denne protokol beskriver vi hvordan man isolerer og karakteriserer UC-MSCs fra fostre/spædbørn på 19-40 uger af drægtigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brugen af menneskelige prøver for denne undersøgelse blev godkendt af det etiske udvalg af Kobe University Graduate School of Medicine (godkendelse no. 1370 og 1694) og udført i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer.

1. isolering og kultur af UC-MSCs

Bemærk: UC-MSCs har været succesfuldt isolerede, kulturperler, og udvidet (mere end passage nummer 4) fra mere end 200 UCs udsat for denne protokol. Blandt mere end 200 UCs, 100% har vist succesfuld UC-MSC isolation, mindre end 5% har vist utilsigtet forurening, mindre end 15% har vist vækst anholdelse, og mere end 80% har vist succesfuld UC-MSC ekspansion.

  1. Indsamle UC.
    1. Forberede en 50 mL plastikrør, en aseptisk saks og en 500 mL flaske alpha modificerede Eagles mindste afgørende medium (alpha MEM) ved 4 ° C.
    2. Aseptisk skære UC med en kirurgisk saks på ca 5-10 cm i længden og indsamle det snart efter nyfødte fødsel ved kejsersnit.
    3. Umiddelbart placerer UC i en 50 mL plastikrør og tilføje 20-30 mL af alpha MEM ind i røret.
    4. Opbevar UC ved stuetemperatur (RT), indtil det transporteres til laboratoriet.
      Bemærk: Aseptisk UC kan gemmes i serumfrit medium på RT for op til 2 dage. Derfor, UC fremstillet af nærliggende hospitaler kan indsamles hvis det er leveret til laboratoriet inden 2 dage.
  2. Dissekere UC.
    1. Forberede en plastik bakke, steriliseret saks og pincet, 10 mL pipetter, 25 mL pipetter, to 60 mm vævskultur retter, fosfatbufferet saltopløsning (PBS), renset enzym blander (Se Tabel af materialer, rekonstitueres med steril PBS i en koncentration 13 Wünsch enheder/ml og opbevares ved-80 ° C), og en 500 mL flaske nedsat serum medium (Se Tabel af materialer).
    2. Varm op PBS, renset enzym blander, nedsat serum medium og næringssubstratet [alpha MEM indeholdende 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% antibiotikum-antimykotikum løsning (AA) opbevares ved 4 ° C] til RT.
    3. Tag UC fra røret og anbringes i en plastik bakke.
    4. Vejer og dissekere 5 g af UC med en steriliseret saks.
    5. Hæld 10 mL i 70% ethanol over UC for sterilisation ved hjælp af 10 mL pipette.
    6. Vask UC med 10 mL PBS to gange med 10 mL pipette.
    7. Placer UC i en steriliseret 60 mm vævskultur parabol (Se figur 1, trin 1).
    8. Der tilsættes 10 mL af reducerede serum medium i skålen.
    9. Der tilsættes 0,5 mL renset enzym blandinger at nå frem til en endelig koncentration på ca 0,62 Wünsch enheder/mL.
      Bemærk: Brugen af renset enzym blandinger i stedet for traditionelle collagenase har vist sig at forbedre udbyttet og levedygtighed af UC-MSC'er isoleret fra UC.
    10. Skær UC i 2-3 mm stykker med steriliseret saks og pincet (Se figur 1, trin 2).
      Bemærk: Denne proces tager ca 30 min.
    11. Inkuber UC stykker ved 37 ° C i 30 min i en 5% CO2 inkubator.
    12. Skæres delvist fordøjet UC stykker i mindre stykker, der let løber gennem en 25 mL pipette.
      Bemærk: Denne proces tager ca 30 min.
    13. Inkuber de mindre UC stykker ved 37 ° C i 15-45 min i en 5% CO2 inkubator.
      Bemærk: Inkubationen skal fortsætte indtil homogeniseret blive tyktflydende. Den samlede fordøjelsestid er ca 120 min. Ved hjælp af UCs fra præmature spædbørn, dog kan fordøjelsestid afkortes, fordi de er nemt skæres og fordøjet.
  3. Isolere UC-MSCs.
    1. Forberede fire 50 mL plastik rør og 500 mL flaske af næringssubstratet.
    2. Opdele UC homogenatet i to 50 mL plastik rør med et 25 mL pipette, med cirka 7,5 mL i hver tube.
    3. Der tilsættes 20 mL af næringssubstratet i hver tube og bland godt.
    4. Filtrere hver UC homogenatet gennem en 100 µm celle si placeres oven på en ny 50 mL collection tube, bruger en 25 mL pipette til at indsamle UC-afledte celler.
      Bemærk: Denne proces tager omkring 15 min. hver, som de fordøjede UC-løsning er klistret.
    5. Der centrifugeres to rør på 1.000 x g i 5 min.
    6. Omhyggeligt Aspirér supernatanten og kassér den.
    7. Resuspend celle pellets i to reagensglas med 5 mL af næringssubstratet.
    8. Overføre cellesuspension til en ny 60 mm plade og kultur ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (Se figur 1, trin 3).
  4. Kultur UC-MSCs.
    1. Varme op PBS, trypsin-EDTA (0,25 w/v%), og kultur medium (alpha MEM som indeholder 10% FBS og 1% AA) til RT.
    2. Når cellerne er knyttet til en 60 mm plade, fjerne næringssubstratet og skylles med 5 mL PBS to gange for at fjerne snavs og røde blodlegemer.
      Bemærk: Vedlagte celler vises normalt 3-5 dage efter første plating (Se figur 1, trin 4).
    3. Erstatte næringssubstratet to gange om ugen og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator indtil 90-100% confluency.
      Bemærk: Dette tager normalt 7-14 dage efter første plating.
    4. Vask celler med 5 mL PBS to gange, der tilsættes 0,5 mL trypsin-EDTA, og der inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
    5. Når celler blive afrundet og parcelhus, tilføje 9 mL af næringssubstratet og bland godt at inaktivere trypsin.
    6. Overføre cellesuspension til en ny 100 mm plade og kultur ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (Se figur 1, trin 5).
    7. Erstatte næringssubstratet to gange om ugen og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator indtil 90-100% confluency.
      Bemærk: Dette tager normalt 4-8 dage efter første plating.
    8. Vask celler med 10 mL PBS to gange, tilsættes 1 mL trypsin-EDTA, og der inkuberes ved 37 ° C i 5-10 min.
    9. Når celler blive afrundet og parcelhus, tilføje 9 mL af næringssubstratet og bland godt at inaktivere trypsin.
    10. Overføre cellesuspension til to nye 100 mm plader og kultur ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (Se figur 1, trin 5).
    11. Gentag subkultur (1:2 spalter) indtil tiende passage (Se figur 1, trin 5).
      Bemærk: Fordi cellerne kulturperler mindre sammenflydende betingelser har tendens til at nå tidligere spredning anholdelse, er det vigtigt at passage celler med en split-forhold på 1:2.
    12. Bruge celler på femte til ottende passage for celle overflade markør analyse, celle differentiering assay og andre eksperimenter.
      Bemærk: For at holde den kraftige spredning for så længe som muligt, kulturperler celler generelt under mere end 70-80% sammenflydende betingelser.

2. overflade markør udtryk for UC-MSCs

  1. Forberede celler i en 100 mm plade og adskille dem med 1 mL trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5-10 min.
  2. Tilføje 9 mL af næringssubstratet og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min.
  3. Opsug supernatanten og kassér den.
  4. Resuspend celle pellets med 10 mL PBS og centrifugeres ved 1.000 x g i 5 min. Gentag trinnet vask to gange.
  5. Resuspend celler med flow flowcytometri (FCM) buffer (PBS indeholdende 2 mM EDTA og 10% blokerende reagens) på ~ 1 × 106 celler/mL.
  6. Overføre 50-100 µL af cellesuspension til en 1,5 mL tube; tilføje phycoerythrin (PE)-konjugerede antistoffer mod CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 eller HLA-DR; og der inkuberes i isbad i 45 min.
  7. Vask celler med FCM buffer to gange og tilsæt 50-100 µL af 0,2% levedygtighed farvestof løsning (Se Tabel af materialer).
  8. Der inkuberes ved RT i 15 min., vask celler med FCM bufferen to gange og filter celler gennem en 70 µm celle si.
  9. Køre celler gennem FCM og analysere de opnåede resultater ved hjælp af FCM software ifølge producentens anvisninger.

3. Trilineage differentiering af UC-MSCs

  1. Udføre adipogenesis.
    1. Forberede en cellesuspension dyrkningsmedium med en koncentration på 5 × 103 celler/mL.
    2. Plade 1 mL cellesuspension i en 12-godt plade og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for ~ 24 h.
    3. Erstatte næringssubstratet med adipogenic differentiering medium (Se Tabel af materialer) og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 2-3 uger. Ændre adipogenic differentiering mellem to gange om ugen.
    4. Vaske cellerne med PBS tre gange.
    5. Inkuber celler i 4% formaldehyd løsning for 30 min på RT.
    6. Vaske cellerne med PBS tre gange og med 60% isopropanol tre gange.
    7. Forberede 0,5% olie røde O løsning ved at opløse 84 mg olie røde O i 10 mL af 100% isopropanol og tilføje 6,7 mL destilleret vand. Pletten celler med 1 mL 0,5% olie røde O løsning på RT for 20 min.
    8. Vaske cellerne med 60% isopropanol tre gange og visualisere under et mikroskop.
  2. Udføre osteogenesis.
    1. Forberede en cellesuspension dyrkningsmedium med en koncentration på 1 × 104 celler/mL.
    2. Plade 1 mL cellesuspension i en 12-godt plade og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for ~ 24 h.
    3. Erstatte næringssubstratet med osteogeneic differentiering medium (Se Tabel af materialer) og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 1-2 uger. Ændre osteogenic differentiering mellem to gange om ugen.
    4. Vaske cellerne med PBS tre gange.
    5. Inkuber celler i 4% formaldehyd løsning for 30 min på RT.
    6. Vaske cellerne med PBS tre gange.
    7. Forberede 2% alizarin rød S løsning ved at opløse 200 mg af alizarin rød S med 10 mL destilleret vand. Pletten celler med 1 mL 2% alizarin rød S løsning på RT for 3 min.
    8. Vask brønde med PBS tre gange og visualisere under et mikroskop.
  3. Udføre chondrogenesis.
    1. Forberede en cellesuspension dyrkningsmedium med en koncentration af 1,6 × 107 celler/mL.
    2. Placer en 5 µL dråbe af cellesuspension på midten af godt i en 12-godt plade (micromass kulturer) og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 2-3 h.
    3. Forsigtigt tilsættes 1 mL chondrogenic differentiering medium (Se Tabel af materialer) og der inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 4-7 dage. Ændre chondrogenic differentiering mellem to gange om ugen.
    4. Vaske cellerne med PBS tre gange.
    5. Inkuber celler i 4% formaldehyd løsning for 30 min på RT.
    6. Vaske cellerne med PBS tre gange.
    7. Forberede 0,05% toluidin blå løsning ved at opløse 250 mg af toluidin blå med 500 mL af 0,1 M natrium acetat buffer med pH 4.1. Pletten celler med 1 mL 0,05% toluidin blå løsning på RT for 30 min.
    8. Vaske cellerne med PBS tre gange og visualisere under et mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Procedurer fra UC samling til MSC kultur er sammenfattet i figur 1. UC ca 5-10 cm i længden kan indsamles fra alle nyfødte leveret ved kejsersnit. UC begynder at udvikle på 4-8 uger af drægtighedsperioden og fortsætter med at vokse indtil 50-60 cm i længde, som vist i figur 2. Der er to arterier (A), en vene (V), ledning foring (CL) og Wharton's Jelly (WJ) i UC, som afbilledet i figur 3 og figur 4. UC-MSCs kan isoleres fra alle ledningen regioner eller hele ledningen13. Fordi UC fra spædbørn med tidlig svangerskabsuge aldre er skrøbelig og vanskelig for dissektion ind i en enkelt ledning region, er UC-MSC'er isoleret fra hele ledningen11,12. Der er flere metoder til at isolere MSCs fra UC, som omfatter eksplantat metode14 og enzymatiske fordøjelsen metode15plus deres derivater16. På grund af længere kultur cyklus, lavere udbytte og tidligere spredning anholdelse forbundet med eksplantat metode17,18, er UC-MSCs kulturperler af enzymatisk fordøjelsen metode som illustreret i figur 5 og Figur 6.

Minimal kriterierne for MSCs er etableret af ISCT og omfatter deres overflade markør karakterisering19. Bestem overflade markør udtryk er UC-MSCs fra præmature og udtrykket spædbørn inkuberes med passende PE-konjugerede antistoffer og analyseret ved flowcytometri. De er positive for MSC signatur markører (CD73, CD90, CD105), men negativ for monocyt/makrofag (CD14), endotel (CD34), hæmatopoietisk (CD19, CD45) og store histocompatibility komplekse (HLA-DR) markører, som vist i figur 7.

Ifølge ISCT kriterier19, skal MSC besidde mesodermale differentiering kapacitet vurderet af en trilineage differentiering assay. For at evaluere trilineage differentiering kapacitet, er UC-MSCs fra præmature og udtrykket spædbørn tilskyndet til at differentiere i osteocytes, adipocytter og chondrocytter under standard in vitro- differentiering betingelser. Som vist i figur 8, er de godt differentieret i alle tre typer af mesodermale celler.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk diagram af isolation og kultur af UC-MSCs. Trin 1. 5-10 cm af UC indsamles aseptisk fra moderkagen væv. Trin 2. Renset enzym blanding-fordøjet UC stykker. Trin 3. Kultur af UC-MSCs ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Trin 4. Vedlagte UC-MSCs dukkede op på 3 dage efter første plating. Trin 5. Subkultur af UC-MSCs. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : UC fra fostre/spædbørn leveret på forskellige svangerskabsuge aldre. UCs fra fostre/spædbørn på 19-38 uger af drægtigheden er vist. Størrelsen af UC stiger med gestationsalder. Skalere barer = 8 cm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Sektionsvisning af UC fra præmature og udtrykket spædbørn. Der er to arterier (A), en vene (V), ledning foring (CL) og Wharton's Jelly (WJ) i UC fra præmature og udtrykket spædbørn. Størrelser af disse væv varierer med svangerskabsuge aldre. Skalere barer = 2 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Anatomi af UC. (A) 5 cm af UC fra sigt spædbarn. (B) tværsnit af UC. (C) dissekeret delvist UC. Der er to arterier (A), en vene (V), ledning foring (CL) og Whalton's Jelly (WJ). UC fra spædbørn for tidligere svangerskabsuge aldre er særligt skrøbelige og vanskeligt at blive dissekeret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : UC dissektion ved hjælp af renset enzym blandinger. (A) 5-10 cm af UC. (B) 2-3 mm stykker af UC. (C) renset enzym blanding-fordøjet UC stykker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Morfologi af UC-MSCs fra præmature og udtrykket spædbørn. (A og E) UC-MSCs passage nummer 1 (P1) før udskiftning af næringssubstratet (A: X40; E: X200). (B og F) UC-MSCs på P1 efter udskiftning af næringssubstratet (B: X40; F: X200). (C og G) UC-MSCs på P3 (C: X40; G: X200). (D og H) UC-MSCs på P5 (D: X40; H: X200). Skalere barer = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Overflade markør udtryk for UC-MSCs fra præmature og udtrykket spædbørn. CD73/CD90/CD105-positive og CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negativ fænotyper er fundet i UC-MSCs fra både præmature (22 svangerskabsuge) og sigt (37 uger drægtighed) spædbørn. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8 : Trilineage mesenchymale differentiering af UC-MSCs fra præmature og udtrykket spædbørn. UC-MSCs fra præmature (22 svangerskabsuge) og sigt (37-40 svangerskabsuge) spædbørn er differentieret til adipocyt (visualiseret ved olie røde O), osteocyte (visualiseret ved alizarin rød S), og Chondrocyt (visualiseret med toluidin blå). Billeder blev taget på 200 x. Skalere barer = 50 µm. En del af denne figur er blevet tilpasset fra Iwatani et al.11. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MSC'er kan isoleres fra en række forskellige væv og er heterogene befolkning af celler, der gør ikke alle express de samme fænotypiske markører. Her, skitseret vi en protokol, der guider indsamling og dissektion af UC fra præmature og udtrykket spædbørn og muliggør isolation og kultur af UC-MSCs. Efter denne protokol, har vi med succes isoleret UC-MSC'er, der opfylder ISCT kriterier19 fra fostre/spædbørn leveret på 19-40 uger af drægtigheden og demonstreret, at de repræsenterer nogle aspekter af genstridig sygdom Patofysiologi under prænatal udvikling11,12.

I BM-afledte MSCs (BM-MSCs), yngre donor-stammer BM-MSCs generelt vise større proliferativ og differentiative potentiale end ældre kolleger og holde mere potentiale for celle terapi20,21. Ligeledes blev præmature UC-MSC'er isoleret fra fostre afbrudt på 8-12 uger af svangerskabet indberettet til udviser mere energisk spredning og differentiering i forhold til udtrykket UC-MSC'er isoleret fra nyfødte leveret på 37-40 uger af drægtigheden22. Trods forskelle i gestationsalder og ledningen region afslørede UC-MSC'er isoleret med denne protokol også en mere energisk spredning af præmature UC-MSCs end sigt UC-MSCs12.

Et kritisk trin i denne protokol er UC dissektion med renset enzym blandinger, der er sammensat af collagenase I og II og dispase. Som skitseret i de repræsentative resultater, varieret stivhed af UC dramatisk med gestationsalder (figur 2). For at opnå optimal dissektion af UC, blander inkubationstiden renset enzym skal justeres til stivhed af den enkelte UC. Generelt, det normalt tager til længere sigt UC end præmature UC. Blandt eksisterende metoder til at isolere MSCs fra UC, vælger vi enzymatisk fordøjelsen metode15 over eksplantat metode14 der kan føre til en længere kultur cyklus, lavere udbytte og tidligere spredning anholdelse17,18. En vigtig ændring af enzymet fordøjelsen metode er brugen af renset enzym blandinger i stedet for traditionelle collagenase, som muliggør en effektiv og konsekvent dissektion af UC fra fostre/spædbørn med variabel svangerskabsuge aldre.

En begrænsning af denne protokol er brugen af hele ledningen at isolere MSCs fra UC. Fordi UC-MSCs kan isoleres fra alle ledningen regioner eller hele ledningen13, er UC-MSCs isoleret fra hele ledningen i denne protokol. Dette skyldes muligheden for UC dissektion fra præmature spædbørn. Den potentielle variation i andelen af hver ledning region kan imidlertid begrænse den strenge sammenligning mellem UC-MSC'er isoleret af denne protokol.

UC-MSCs bliver i stigende grad brugt som en kilde til mesenchymale stromale celler til prækliniske og kliniske undersøgelser8,9. På trods af denne øgede forbrug er en konsensus om metoder til UC-MSC'er isoleret stadig mangler, som kan resultere i forskellige cellepopulationer anses for de samme UC-MSCs. Denne protokol vil i sidste ende hjælpe forskere med at bedre forstå afledning og funktionelle egenskaber af UC-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (giver nummer: 25461644) og unge forskere (B) (tildele numre: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) af JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 143 Mesenchymal stamceller celle navlestreng præmature spædbørn sigt spædbarn gestationsalder overflade markør udtryk trilineage differentiering
Isolering og karakterisering af menneskelige navlestrengen-afledte mesenkymale stamceller fra præmature og fødte spædbørn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana,… More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter