Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering og karakterisering av menneskelig navlestreng-avledet Mesenchymal stamceller fra premature og Term spedbarn

Published: January 26, 2019 doi: 10.3791/58806
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, , 4, 1, 1, 1, 5, 1, 1
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

Summary

Menneskelige navlestreng (UC) kan fås i perinatalperioden som følge av premature, sikt, og postterm levering. I denne protokollen beskriver vi isolering og karakterisering av UC-avledet stamceller (UC-MSCs) fra fostre/spedbarn på 19-40 uker av svangerskapet.

Abstract

Stamceller (MSCs) har betydelig terapeutiske potensial og tiltrekke økende interesse innen biomedisinsk. MSCs er opprinnelig isolert og preget fra benmargen (BM), så kjøpt fra tissues inkluderer fettvev, fagområder, hud, tannlegekontoret masse og fosterets vedheng som morkaken, navlestrengsblod (UCB) og navlestreng (UC). MSCs er en heterogen celle befolkning med kapasitet for (1) overholdelse av plast i standard oppdrettsforholdene, (2) overflate markør uttrykk for CD73+/CD90+/CD105+/CD45-/CD34-/CD14-/CD19 -/HLA-DR- fenotyper og (3) trilineage differensiering i adipocytter, osteocytes og chondrocytes, som er definert av International Society for mobilnettet terapi (ISCT). Selv om BM er den vanligste kilden til MSCs, begrenser invasiv art på BM aspirasjon etisk sin tilgjengelighet. Spredning og differensiering kapasitet på MSCs innhentet fra BM vanligvis avta med alderen av donor. Derimot har fosterets MSCs fra UC fordeler som energisk spredning og differensiering kapasitet. Det er ingen etiske bekymring for UC prøvetaking, som det er vanligvis betraktet som medisinsk avfall. Menneskelige UC begynner å utvikle med fortsatt vekst av amniotic hulrommet på 4-8 uker av svangerskapet og holder vokser fram 50-60 cm i lengde, og det kan isoleres under hele nyfødte leveransen periode. For å få innsikt i Patofysiologien ved vanskelige sykdommer, har vi brukt UC-avledet MSCs (UC-MSCs) fra spedbarn leveres i ulike svangerskapsdiabetes alder. I denne protokollen beskriver vi isolering og karakterisering av UC-MSCs fra fostre/spedbarn på 19-40 uker av svangerskapet.

Introduction

Stamceller (MSCs) er opprinnelig isolert og preget fra benmargen (BM)1,2 , men kan også fås fra en rekke tissues inkluderer fettvev, fagområder, hud, tannlegekontoret masse og fosterets vedheng 3. MSCs er anerkjent som en heterogen celle befolkningen som kan spre og differensiere i adipocytter, osteocytes og chondrocytes. I tillegg MSCs har muligheten til å migrere til stedene for skade, undertrykke og modulere immunreaksjoner, renovere og reparere skader. Foreløpig har MSCs fra ulike kilder fått økende interesse som kilde for cellen terapi mot en rekke vanskelige sykdommer, inkludert graft - versus - host sykdom, hjerteinfarkt og hjerneinfarkt4,5 .

Selv om BM er mest godt karakterisert MSCs, begrenser invasiveness av BM aspirasjon etisk sin tilgjengelighet. Spredning og differensiering kapasitet på MSCs innhentet fra BM vanligvis avta med alderen av donor. Derimot fosterets MSCs innhentet fra fosterets vedheng som morkaken, navlestrengsblod (UCB), og navlestreng (UC) har fordeler inkludert mindre Etiske bekymringene om prøvetaking og robust spredning og differensiering kapasitet6 , 7. blant fosterets vedheng som forkastes vanligvis som medisinsk avfall, UCB og UC anses en fosterets orgel, mens morkaken regnes fetomaternal. I tillegg må morkaken og UCB samplet og samlet på det nøyaktige tidspunktet for nyfødte levering, mens morkaken og UC kan samles inn og behandles etter nyfødte levering. Følgelig er UC en lovende MSC kilde for cellen terapi8,9.

Menneskelige UC begynner å utvikle med progressiv utvidelse av amniotic hulrommet på 4-8 uker av svangerskapet, fortsetter å vokse til 50-60 cm i lengde og kan isoleres i hele perioden av nyfødte levering10. For å få innsikt i Patofysiologien ved vanskelige sykdommer, bruker vi UC-avledet MSCs (UC-MSCs) fra spedbarn levert på ulike svangerskapsdiabetes alderen11,12. I denne protokollen beskriver vi hvordan å isolere og karakterisere UC-MSCs fra fostre/spedbarn på 19-40 uker av svangerskapet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bruk av menneskelige prøver for denne studien ble godkjent av den etiske komiteen av Kobe University Graduate School of Medicine (godkjenning nr 1370 og 1694) og gjennomført i henhold til godkjente veiledning.

1. isolering og kultur av UC-MSCs

Merk: UC-MSCs har vært vellykket isolert, kultivert, og utvidet (mer enn passering nummer 4) mer enn 200 UCs utsatt for denne protokollen. Blant mer enn 200 UCs, 100% har vist vellykket UC-MSC isolasjon, mindre enn 5% har vist utilsiktet forurensning, mindre enn 15% har vist vekst arrestasjon og mer enn 80% har vist vellykket UC-MSC ekspansjon.

  1. Samle UC.
    1. Forberede en 50 mL plastrør, en steril saks og en 500 mL flaske alpha endret Eagle's minimum viktig middels (alfa MEM) på 4 ° C.
    2. Tas aseptisk kuttet ut UC med en kirurgisk saks på ca 5-10 cm i lengde og samle det snart etter nyfødte fødsel etter keisersnitt.
    3. Umiddelbart plassere Høgskolen i et 50 mL plastrør og legge til 20-30 mL av alpha MEM inn i røret.
    4. Lagre UC ved romtemperatur (RT) før den transporteres til laboratoriet.
      Merk: Aseptiske UC kan lagres i serum-free medium på RT for opp til 2 dager. UC fra nærliggende sykehus kan derfor samles hvis den leveres til laboratoriet innen 2 dager.
  2. Dissekere UC.
    1. Forberede en plast brett, sterilisert saks og tang, 10 mL Pipetter, 25 mL Pipetter, to 60 mm vev kultur retter, fosfat-bufret saltvann (PBS), renset enzym blander (se Tabell av materialer, rekonstitueres med sterilt PBS i en konsentrasjon 13 Wünsch enheter/ml og lagret ved-80 ° C), og en 500 mL flaske redusert serum medium (se Tabell for materiale).
    2. Varm opp PBS renset enzym blander, redusert serum medium og kultur medium [alfa MEM inneholder 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% antibiotika-antimycotic løsning (AA) lagret på 4 ° C] til RT.
    3. Ta ut UC fra røret og plasserer den i en plast brett.
    4. Veier og dissekere 5 g av UC med en sterilisert saks.
    5. Hell 10 mL av 70% etanol over Høgskolen for sterilisering bruker en 10 mL pipette.
    6. Vask UC med 10 mL PBS to ganger med en 10 mL pipette.
    7. Plasser Høgskolen i steriliserte 60 mm vev kultur parabol (se figur 1, trinn 1).
    8. Legge til 10 mL av redusert serum medium i retten.
    9. Legg til 0,5 mL renset enzym blander å nå en siste konsentrasjon av ca 0.62 Wünsch enheter/mL.
      Merk: Bruk av renset enzym blander i stedet for tradisjonelle collagenase har vist seg å forbedre avkastningen og levedyktigheten til UC-MSCs isolert fra UC.
    10. Skjær Høgskolen i 2-3 mm stykker med sterilisert saks og tang (se figur 1, trinn 2).
      Merk: Prosessen tar ca 30 min.
    11. Inkuber UC brikkene på 37 ° C i 30 min i en 5% CO2 inkubator.
    12. Kuttet delvis fordøyd UC bitene i mindre biter som strømmer lett gjennom en 25 mL pipette.
      Merk: Prosessen tar ca 30 min.
    13. Inkuber mindre UC brikkene på 37 ° C i 15-45 min i en 5% CO2 inkubator.
      Merk: Inkubasjon må fortsette til homogenates blitt tyktflytende. Den totale fordøyelsen er ca 120 min. I tilfelle du bruker UCs fra premature spedbarn, men kan tiden fordøyelsen forkortes fordi de er lett kuttet og fordøyd.
  3. Isolere UC-MSCs.
    1. Forbered fire 50 mL plast rør og en 500 mL flaske kultur medium.
    2. Del UC-homogenate i to 50 mL plast rør med en 25 mL pipette, med ca 7,5 mL i hver retning.
    3. Legge til 20 mL kultur medium i hver rør og bland godt.
    4. Filtrere hver UC homogenate gjennom en 100 µm celle sil plasseres over en ny 50 mL samling rør, med en 25 mL pipette samle UC-avledet celler.
      Merk: Denne prosessen tar ca 15 minutter hver, den fordøyde UC-løsningen er klebrig.
    5. Sentrifuge to rør 1000 x g i 5 min.
    6. Nøye Sug opp nedbryting og kaste den.
    7. Resuspend celle pellets i to rør med 5 mL kultur medium.
    8. Overføre celle suspensjon i en ny 60 mm plate og kultur på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (se figur 1, trinn 3).
  4. Kultur UC-MSCs.
    1. Varme opp PBS trypsin-EDTA (0,25 w/v%), og kultur medium (alpha MEM inneholder 10% FBS og 1% AA) til RT.
    2. Når cellene er knyttet til en 60 mm plate, fjerne kultur medium og vask med 5 mL PBS å fjerne rusk og røde blodlegemer.
      Merk: Tilknyttede celler vises vanligvis på 3-5 dager etter første plating (se figur 1, trinn 4).
    3. Erstatt kultur medium to ganger per uke og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator inntil 90-100% confluency.
      Merk: Dette tar vanligvis 7-14 dager etter første plating.
    4. Vask celler med 5 mL PBS to ganger, Legg til 0,5 mL av trypsin-EDTA, og ruge på 37 ° C i 5-10 min.
    5. Når celler bli avrundet og enebolig, tilsett 9 mL kultur medium og bland godt å deaktivere trypsin.
    6. Overføre celle suspensjon i en ny 100 mm plate og kultur på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (se figur 1, trinn 5).
    7. Erstatt kultur medium to ganger per uke og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator inntil 90-100% confluency.
      Merk: Dette tar vanligvis 4-8 dager etter første plating.
    8. Vask celler med 10 mL PBS to ganger, Legg 1 mL av trypsin-EDTA, og ruge på 37 ° C i 5-10 min.
    9. Når celler bli avrundet og enebolig, tilsett 9 mL kultur medium og bland godt å deaktivere trypsin.
    10. Overføre celle suspensjon i to nye 100 mm plater og kultur på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator (se figur 1, trinn 5).
    11. Gjenta subkultur (1:2 deler) til tiende passasje (se figur 1, trinn 5).
      Merk: Fordi cellene kultivert under mindre confluent forhold til tidligere spredning arrestasjon, er det viktig å passering celler med en splitt 1:2.
    12. Bruke celler på femte til åttende passage for celle overflaten markør analyse, celle differensiering analysen og andre eksperimenter.
      Merk: For å holde energisk spredning så lenge som mulig, er cellene vanligvis kultivert under mer enn 70-80% confluent forhold.

2. overflate markør uttrykk for UC-MSCs

  1. Forberede celler i en 100 mm plate og dissociate dem med 1 mL av trypsin-EDTA ved 37 ° C i 5-10 min.
  2. Legge til 9 mL kultur medium og sentrifuger 1000 x g i 5 min.
  3. Sug opp nedbryting og kaste den.
  4. Resuspend celle pellets med 10 mL PBS sentrifuge 1000 x g for 5 min. Gjenta denne vask trinn to ganger.
  5. Resuspend celler med flyt cytometri (FCM) buffer (PBS inneholder 2 mM EDTA og 10% blokkerer reagens) på ~ 1 × 106 celler/mL.
  6. Overføre 50-100 µL av cellen suspensjon i en 1,5 mL tube; legge til phycoerythrin (PE)-konjugerte antistoffer mot CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 eller HLA-DR; og ruge på is 45 min.
  7. Vask celler med FCM bufre to ganger og legge til 50-100 µL 0,2% levedyktighet fargestoff løsning (se Tabell for materiale).
  8. Ruge på RT for 15 min, vask celler med FCM buffer to ganger og filteret celler gjennom en 70 µm celle sil.
  9. Kjøre celler gjennom FCM og analysere fått resultatene med FCM programvare i henhold til produsentens instruksjoner.

3. Trilineage differensiering av UC-MSCs

  1. Utføre adipogenesis.
    1. Forberede en celle suspensjon i kultur medium i en konsentrasjon av 5 × 103 celler/mL.
    2. Plate 1 mL av cellen suspensjon i en 12-vel plate og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator ~ 24 h.
    3. Erstatte kultur medium med adipogenic differensiering medium (se Tabell for materiale) og Inkuber på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 2-3 uker. Endre adipogenic differensiering middels to ganger i uken.
    4. Vask celler med PBS tre ganger.
    5. Inkuber celler i 4% formaldehyd løsning for 30 min på RT.
    6. Vask celler med PBS tre ganger og med 60% isopropanol tre ganger.
    7. Forberede 0,5% olje røde O løsning ved å løse opp 84 mg olje røde O i 10 mL av 100% isopropanol og legge 6,7 mL destillert vann. Stain celler med 1 mL av 0,5% olje røde O løsning på RT for 20 min.
    8. Vask celler med 60% isopropanol tre ganger og visualisere under et mikroskop.
  2. Utføre osteogenesis.
    1. Forberede en celle suspensjon i kultur medium i en konsentrasjon av 1 × 104 celler/mL.
    2. Plate 1 mL av cellen suspensjon i en 12-vel plate og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator ~ 24 h.
    3. Erstatte kultur medium med osteogeneic differensiering medium (se Tabell for materiale) og Inkuber på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 1-2 uker. Endre osteogenic differensiering middels to ganger i uken.
    4. Vask celler med PBS tre ganger.
    5. Inkuber celler i 4% formaldehyd løsning for 30 min på RT.
    6. Vask celler med PBS tre ganger.
    7. Forberede 2% alizarin rød S løsning ved å løse opp 200 mg alizarin rød S med 10 mL destillert vann. Stain celler med 1 mL av 2% alizarin rød S løsning på RT 3 min.
    8. Vask brønner med PBS tre ganger og visualisere under et mikroskop.
  3. Utføre chondrogenesis.
    1. Forberede en celle suspensjon i kultur medium i en konsentrasjon av 1.6 × 107 celler/mL.
    2. Plasser en 5 µL dråpe celle suspensjon på midten av godt i en 12-vel plate (micromass kulturer) og ruge på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 2-3 h.
    3. Forsiktig legge 1 mL av chondrogenic differensiering medium (se Tabell for materiale) og Inkuber på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 4-7 dager. Endre chondrogenic differensiering middels to ganger i uken.
    4. Vask celler med PBS tre ganger.
    5. Inkuber celler i 4% formaldehyd løsning for 30 min på RT.
    6. Vask celler med PBS tre ganger.
    7. Klargjør 0,05% toluidine blå løsning ved oppløsning 250 mg toluidine blå med 500 mL 0.1 M natrium acetate buffer med pH 4.1. Stain celler med 1 mL av 0,05% toluidine blå løsning på RT 30 min.
    8. Vask celler med PBS tre ganger og visualisere under et mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Prosedyrene fra UC samling MSC kultur oppsummeres i figur 1. UC på ca 5-10 cm i lengde kan hentes fra alle nyfødte levert av keisersnitt. UC begynner å utvikle 4-8 uker av svangerskapet, og fortsetter å vokse til 50-60 cm i lengde, som vist i figur 2. Det er to arteriene (A), en blodåre (V), ledningen fôr (CL) og Wharton's Jelly (WJ) i UC, som vist i Figur 3 og Figur 4. UC-MSCs kan isoleres fra alle ledningen regioner eller hele ledningen13. UC fra spedbarn med tidlig svangerskapsdiabetes alder er skjøre og vanskelige for disseksjon i en enkelt ledning region, er UC-MSCs isolert fra hele ledningen11,12. Det er adskillige metoder å isolere MSCs fra UC, inkluderer explant metode14 og enzymatiske fordøyelsen metoden15, pluss deres derivater16. På grunn av lengre kultur syklus, lavere avkastning, og tidligere spredning arrestasjonen knyttet explant metoden17,18, er UC-MSCs kultivert av enzymatisk fordøyelsen metoden som vist i figur 5 og Figur 6.

Minimal kriteriene for å definere MSCs er etablert av ISCT og inkluderer deres overflate markør karakterisering19. For å bestemme overflaten markør uttrykk, UC-MSCs fra premature og begrepet spedbarn inkubert med passende PE-konjugerte antistoffer og analysert av flowcytometri. De er positivt for MSC signatur markører (CD73, CD90, CD105) men negativ for monocytt/macrophage (CD14), endothelial (CD34), blodkreft (CD19, CD45), og store histocompatibility kompleks (HLA-DR) markører, som vist i figur 7.

Ifølge ISCT kriterier19, må MSC ha mesodermal differensiering kapasitet vurdert av en trilineage differensiering analysen. For å evaluere trilineage differensiering kapasitet, er UC-MSCs fra premature og begrepet spedbarn overtalt til å skille i osteocytes, adipocytter og chondrocytes under standard i vitro differensiering forhold. Som vist i Figur 8, er de godt differensiert i alle tre typer mesodermal celler.

Figure 1
Figur 1 : Skjematisk diagram av isolasjon og kultur av UC-MSCs. Trinn 1. 5-10 cm UC samlet tas aseptisk fra placental vev. Trinn 2. Renset enzym blanding-fordøyd UC stykker. Trinn 3. Kultur av UC-MSCs på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator. Trinn 4. Vedlagte UC-MSCs dukket opp på 3 dager etter første plating. Trinn 5. Subkultur av UC-MSCs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : UC fra fostre/spedbarn leveres i ulike svangerskapsdiabetes alder. UCs fra fostre/spedbarn på 19-38 uker av svangerskapet vises. Størrelsen på UC øker med gestasjonsalder. Skalere barer = 8 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Inndelingsvisning ved UC fra premature og begrepet spedbarn. Det er to arteriene (A), en blodåre (V), ledningen fôr (CL) og Wharton's Jelly (WJ) i UC fra premature og begrepet spedbarn. Størrelsen på disse vev varierer med svangerskapsdiabetes alder. Skalere barer = 2 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Anatomi av UC. (A) 5 cm av UC fra begrepet spedbarn. (B) tverrsnitt av UC. (C) dissekert delvis UC. Det er to arteriene (A), en blodåre (V), ledningen fôr (CL) og Whalton's Jelly (WJ). UC fra spedbarn på tidligere svangerskapsdiabetes alder er spesielt sårbare og vanskelig å være dissekert. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : UC disseksjon bruker renset enzym blander. (A) 5-10 cm ved UC. (B) 2-3 mm stykker av UC. (C) renset enzym blanding-fordøyd UC stykker. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Morfologi av UC-MSCs fra premature og begrepet spedbarn. (A og E) UC-MSCs passasje nummer 1 (P1) før utskifting av kultur medium (A: X40; E: X200). (B og F) UC-MSCs på P1 etter utskifting av kultur medium (B: X40; F: X200). (C og G) UC-MSCs på P3 (C: X40; G: X200). (D og H) UC-MSCs på P5 (D: X40; H: X200). Skalere barer = 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Overflaten markør uttrykk for UC-MSCs fra premature og begrepet spedbarn. CD73/CD90/CD105-positiv og CD14/CD19/CD34/CD45/HLA-DR-negative fenotyper finnes i UC-MSCs fra både premature (22 svangerskapsuke) og begrepet (37 svangerskapsuke) spedbarn. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : Trilineage mesenchymal differensiering av UC-MSCs fra premature og begrepet spedbarn. UC-MSCs fra premature (22 svangerskapsuke) og begrepet (37-40 svangerskapsuke) spedbarn skilles i adipocyte (visualisert ved olje røde O), osteocyte (visualisert ved alizarin røde S), og chondrocyte (visualisert ved toluidine blå). Bildene ble tatt på 200 x. Skalere barer = 50 µm. En del av dette tallet har blitt tilpasset fra Iwatani et al.11. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MSCs kan isoleres fra en rekke vev og er heterogen befolkning som gjør ikke alle express samme fenotypiske markører. Her skissert vi en protokoll som styrer innsamling og Disseksjon av UC fra premature og begrepet spedbarn og aktiverer isolasjon og kultur av UC-MSCs. Etter denne protokollen, har vi lykkes isolert UC-MSCs som oppfyller ISCT kriterier19 fra fostre/spedbarn levert på 19-40 uker av svangerskapet og viste at de representerer noen aspekter av uløselige sykdom patofysiologi under prenatal utvikling11,12.

I BM-avledet MSCs (BM-MSCs), yngre donor-avledet BM-MSCs generelt viser større proliferativ og differentiative potensial enn eldre kolleger og hold mer potensial for cellen terapi20,21. Tilsvarende ble premature UC-MSCs isolert fra fostre avbrutt på 8-12 uker av svangerskapet rapportert til å vise mer energisk spredning og differensiering sammenlignet med begrepet UC-MSCs isolert fra nyfødte levert på 37-40 uker av svangerskapet22. Til tross for forskjellene i gestasjonsalder og ledningen regionen avdekket UC-MSCs isolert med denne protokollen også en mer energisk spredning av premature UC-MSCs enn begrepet UC-MSCs12.

Et viktig skritt i denne protokollen er UC dissection med renset enzym blander som er sammensatt av collagenase I og II og dispase. Som representant resultatene, variert stivhet av UC dramatisk med gestasjonsalder (figur 2). For å oppnå optimal Disseksjon av UC, blander inkubasjon da renset enzym må justeres til stivhet av personlige Høgskolen. Vanligvis tar det vanligvis lengre sikt UC enn premature UC. Blant eksisterende metoder å isolere MSCs fra UC, velger vi de enzymatiske fordøyelsen metoden15 over explant metode14 som kan føre til en lengre kultur syklus, lavere avkastning og tidligere spredning arrestasjonen17,18. En viktig endring av enzymet fordøyelsen metoden er bruken av renset enzym blander i stedet for tradisjonelle collagenase, som gir en effektiv og konsekvent Disseksjon av UC fra fostre/spedbarn med variabel svangerskapsdiabetes alder.

En begrensning av denne protokollen er bruken av hele ledningen isolere MSCs fra UC. UC-MSCs kan være isolert fra alle ledningen regioner eller hele ledningen13, er UC-MSCs isolert fra hele ledningen i denne protokollen. Dette er muligheten for UC disseksjon fra premature spedbarn. Potensielle variasjonen i andelen av hver ledning region kan imidlertid begrense den strenge sammenligningen mellom UC-MSCs isolert av denne protokollen.

UC-MSCs blir stadig mer brukt som en kilde til mesenchymal stromal celler til prekliniske og kliniske studier8,9. Til tross for dette økt bruk er en konsensus om metoder for UC-MSCs isolasjon fortsatt mangler, som kan føre til ulike celle populasjoner anses de samme UC-MSCs. Denne protokollen vil til slutt hjelpe forskere bedre forstå avledning og funksjonelle egenskaper av UC-MSCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (C) (gi nummer: 25461644) og unge forskere (B) (gi tall: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) av JSPS KAKENHI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic tube AS One Coporation, Osaka, Japan Violamo 1-3500-22
12-well plate AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3815-012
60 mm dish AGC Techno Glass, Tokyo, Japan Iwaki 3010-060
Cell strainer (100 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2360
Cell strainer (70 μm) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Falcon 35-2350
Alpha MEM Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 135-15175
Fetal bovine serum Sigma Aldrich, St. Louis, MO 172012
Reduced serum medium Thermo Fisher Scientific, waltham, MA OPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA  Gibco 15240-062
Trypsin-EDTA Wako Pure Chemical, Osaka, Japan 209-16941
PBS Takara BIO, Shiga,Japan T900
Purified enzyme blends Roche, Mannheim, Germany Liberase DH Research Grade 05401054001
PE-conjugated mouse primary antibody against CD14 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347497 Lot: 3220644, RRID: AB_400312
PE-conjugated mouse primary antibody against CD19 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 340364 Lot: 3198741, RRID: AB_400018
PE-conjugated mouse primary antibody against CD34 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555822 Lot: 3079912, RRID: AB_396151
PE-conjugated mouse primary antibody against CD45 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555483 Lot: 2300520, RRID: AB_395875
PE-conjugated mouse primary antibody against CD73 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 550257 Lot: 3057778, RRID: AB_393561
PE-conjugated mouse primary antibody against CD90 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555596 Lot: 3128616, RRID: AB_395970
PE-conjugated mouse primary antibody against CD105 BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 560839 Lot: 4339624, RRID: AB_2033932
PE-conjugated mouse primary antibody against HLA-DR BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 347367 Lot: 3219843, RRID: AB_400293
PE-conjugated mouse IgG1 k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555749 Lot: 3046675, RRID: AB_396091
PE-conjugated mouse IgG2a k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555574 Lot: 3035934, RRID: AB_395953
PE-conjugated mouse IgG2b k isotype BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ 555743 Lot: 3098896, RRID: AB_396086
Viability dye BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ Fixable Viability Stain 450 562247
Blocking reagent Dainippon Pharmaceutical, Osaka, Japan Block Ace UKB80
FCM BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSAria  III Cell Sorter
FCM software BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ BD FACSDiva
Adipogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Adipogenesis Differentiation kit A10070-01
Osteogenic differentiation medium Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Osteogenesis Differentiation kit A10072-01
Chondrogenic differentiation medium  Invitrogen, Carlsbad, CA StemPro Chondrogenesis Differentiation kit A10071-01
Formaldehyde Polyscience, Warrigton, PA 16% UltraPure Formaldehyde EM Grade #18814
Oil Red O Sigma Aldrich, St. Louis, MO O0625
Arizarin Red S Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5533
Toluidine Blue Sigma Aldrich, St. Louis, MO 198161
Microscope Keyence, Osaka, Japan BZ-X700

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Friedenstein, A. J., Petrakova, K. V., Kurolesova, A. I., Frolova, G. P. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6 (2), 230-247 (1968).
  2. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. Journal of Orthopaedic Research. 9 (5), 641-650 (1991).
  3. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  4. Bianco, P., Robey, P. G., Simmons, P. J. Mesenchymal Stem Cells: Revisiting History, Concepts, and Assays. Cell Stem Cell. 2 (4), 313-319 (2008).
  5. Bianco, P. 34;Mesenchymal" stem cells. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30 (1), 677-704 (2014).
  6. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  7. Manochantr, S., et al. Immunosuppressive properties of mesenchymal stromal cells derived from amnion, placenta, Wharton's jelly and umbilical cord. Internal Medicine Journal. 43 (4), 430-439 (2013).
  8. Arutyunyan, I., et al. Umbilical Cord as Prospective Source for Mesenchymal Stem Cell-Based Therapy. Stem Cells International. 6901286, (2016).
  9. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise Review: Wharton's Jelly: The Rich, but Enigmatic, Source of Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  10. Zhu, D., Wallace, E. M., Lim, R. Cell-based therapies for the preterm infant. Cytotherapy. 16 (12), 1614-1628 (2014).
  11. Iwatani, S., et al. Gestational Age-Dependent Increase of Survival Motor Neuron Protein in Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells. Frontiers in Pediatrics. 5, 194 (2017).
  12. Iwatani, S., et al. Involvement of WNT Signaling in the Regulation of Gestational Age-Dependent Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cell Proliferation. Stem Cells International. , 8749751 (2017).
  13. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 916136, (2013).
  14. Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
  15. Lu, L. L., et al. Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis-supportive function and other potentials. Haematologica. 91 (8), 1017-1026 (2006).
  16. Tong, C. K., et al. Generation of mesenchymal stem cell from human umbilical cord tissue using a combination enzymatic and mechanical disassociation method. Cell Biology International. 35 (3), 221-226 (2011).
  17. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  18. Paladino, F. V., Peixoto-Cruz, J. S., Santacruz-Perez, C., Goldberg, A. C. Comparison between isolation protocols highlights intrinsic variability of human umbilical cord mesenchymal cells. Cell Tissue Bank. 17 (1), 123-136 (2016).
  19. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  20. Mareschi, K., et al. Expansion of mesenchymal stem cells isolated from pediatric and adult donor bone marrow. Journal of Cellular Biochemistry. 97 (4), 744-754 (2006).
  21. Choumerianou, D. M., et al. Comparative study of stemness characteristics of mesenchymal cells from bone marrow of children and adults. Cytotherapy. 12 (7), 881-887 (2010).
  22. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells and Development. 22 (17), 2425-2439 (2013).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 143 Mesenchymal stem celle navlestreng premature spedbarn begrepet spedbarn gestasjonsalder overflate markør uttrykk trilineage differensiering
Isolering og karakterisering av menneskelig navlestreng-avledet Mesenchymal stamceller fra premature og Term spedbarn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana,… More

Iwatani, S., Yoshida, M., Yamana, K., Kurokawa, D., Kuroda, J., Thwin, K. K. M., Uemura, S., Takafuji, S., Nino, N., Koda, T., Mizobuchi, M., Nishiyama, M., Fujioka, K., Nagase, H., Morioka, I., Iijima, K., Nishimura, N. Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants. J. Vis. Exp. (143), e58806, doi:10.3791/58806 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter